rGO Modifikasi HBP Hidrofilik Mengizinkan Pelepasan DOX Terpicu pH/NIR Dual untuk Terapi Kemio-Fototermal Sinergis

Abstrak

Kami melaporkan jalur mudah untuk sintesis grafit oksida teredam hidrofilik (NrGO) dengan mengurangi grafit oksida (GO) menggunakan polimer hiperbranched berakhiri amino (NHBP). NrGO menunjukkan dispersibilitas air yang baik, serapan dekat inframerah (NIR) yang kuat, konversi fototermal yang efisien, dan stabilitas kimia. Pemuatan agen kemoterapi doksorubicin (DOX) ke dalam NrGO menghasilkan carrier obat dual-responsif yang melepaskan DOX lebih cepat dalam kondisi asam mirip tumor atau setelah sinaran laser NIR. Studi in vitro mengonfirmasi bahwa NrGO kompatibel biologis, dan DOX@NrGO mencapai inhibi sel tumor yang lebih baik dibandingkan DOX bebas, menunjukkan sinergi kemio-fototermal yang efisien. Temuan ini menyoroti DOX@NrGO sebagai platform yang menjanjikan untuk terapi kanker gabungan dan aplikasi biomedis lainnya.

Pendahuluan

Terapi fototermal dekat inframerah (NIR PTT) telah muncul sebagai strategi minim invasif untuk pengobatan kanker karena cahaya NIR (700–1100 nm) menembusi jaringan dengan serapan rendah, menyelamatkan sel sehat sambil memungkinkan pemanasan lokal. Untuk PTT, agen terapeutik harus menggabungkan efisiensi konversi fototermal tinggi, kompatibilitas biologis yang baik, dan stabilitas koloidal dalam lingkungan air.

Material berbasis grafit telah menarik perhatian sebagai agen PTT karena struktur dua dimensi, luas permukaan besar, dan properti optik yang dapat disesuaikan. Namun, grafit oksida teredam (rGO) konvensional yang dihasilkan melalui metode kimia atau hidrotermal sering mempertahankan karakter hidrofobik, yang membatasi penerapannya dalam sistem biologis.

Kami mengatasi keterbatasan ini dengan menggunakan polimer hiperbranched berakhiri amino yang larut dalam air (NHBP) untuk mengubah GO menjadi rGO hidrofilik dan stabil (NrGO). Kerja sebelumnya telah menunjukkan kemampuan NHBP untuk fungsionalisasi nanopartikel logam sambil mempertahankan dispersibilitas.

Selain itu, pemuatan obat sitotoksik pada carrier fototermal dapat mensinergikan kemoterapi dengan PTT, karena panas tidak hanya membunuh sel tumor tetapi juga mempercepat pelepasan obat. Di sini, kami menjelaskan sintesis rGO modifikasi NHBP, properti fototermalnya, pemuatan DOX, pelepasan obat yang dipicu pH/NIR, dan efikasi kemio-fototermal yang dihasilkan terhadap sel HeLa.

Bahan dan Metode

Bahan

Grafit oksida (GO, 0,8–1,2 nm tebal, 0,5–5 µm lebar) diperoleh dari XFNANO Co., Ltd. Doksorubicin (DOX) dibeli dari HuaFeng United Technology Co., Ltd. Media tumbuh Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM), serum bayi sapi (FBS), tripsin, penicilin (100 U/mL), dan streptomisin (100 µg/mL) disuplai oleh Thermo Fisher Scientific. Reagen MTT, DAPI, dan PI dari Beyotime Biotechnology. Semua bahan kimia lainnya adalah grade analitik dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Persiapan Polimer Hiperbranched Berakhiri Amino (NHBP)

Polimer hiperbranched berakhiri amino (NHBP) disintesis sesuai protokol kami sebelumnya. Singkatnya, tetrafenilpentamina (94 mL, 0,5 mol) diaduk dalam nitrogen dalam labu bulat leher tiga 250 mL. Larutan metanol akrilat metil (43 mL, 0,5 mol) ditambahkan secara tetesan, kemudian campuran dipanaskan dan dinginkan secara bergantir, diikuti dengan pengadukan 4 jam pada suhu ruang. Produk diisolasi melalui evaporasi rotatif pada 150 °C, menghasilkan polimer viskus kekuningan dengan berat molekul rata-rata bobot ~7759.

Persiapan Grafit Oksida Teredam NHBP (NrGO)

GO dispersi dalam air deion dan diultrasonik dengan NHBP pada rasio berat 1:10, 1:20, dan 1:30 selama 10 menit, kemudian diaduk pada 90 °C selama 1 jam. Suspensi yang dihasilkan (NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) dikomfugasi dan dicuci tiga kali dengan air.

Persiapan DOX-Termuat NrGO (DOX@NrGO)

Suspensi NrGO dicampur dengan larutan DOX pada rasio berat 1:1 dan diaduk pada suhu ruang selama 24 jam. Komposit dikumpulkan melalui komfugasi dan dicuci untuk mendapatkan DOX@NrGO.

Karakterisasi dan Pengukuran

Mikroskopi elektron transmisi (TEM, JEOL JEM-2100) digunakan untuk memeriksa morfologi. Spektra Fourier-transform inframerah (FTIR, Nicolet iS10) direkam pada 400–4000 cm⁻¹ (resolusi 4 cm⁻¹). Potensial zeta dan ukuran hidrodinamik diukur dengan analyzer NanoBrook 90plus Zeta. Serapan UV-vis-NIR (400–900 nm, resolusi 1 cm⁻¹) direkam pada Thermo Fisher Evolution 300. Performa fototermal dievaluasi menggunakan laser 808-nm (SFOLT Co.) dan termometer termokopel (DT-8891E). Sampel (0,2 mL) pada titik 0,25 cm² diiradiasi pada 1 W cm⁻² selama 5 menit, dan perubahan suhu dicatat secara real-time.

Assay Pelepasan Obat

DOX@NrGO ditempatkan dalam kantong dialisis (MWCO 8000) yang berisi PBS (pH 7,4 atau 4,0) dan diinkubasi pada 37 °C dengan pengadukan 100 rpm. Untuk grup NIR, kantong diiradiasi selama 5 menit setelah setiap titik sampel. Pada setiap interval, 10 mL PBS diambil, diganti dengan buffer segar, dan konsentrasi DOX ditentukan dengan spektrofotometri UV-vis.

Evaluasi Sitotoksisitas Seluler dan Terapi Kemio-Fototermal

Sel HeLa ditanam pada 5 × 10³ sel per lubang pada plate 96-lubang dan diinkubasi hingga ~80 % konfluensi. Sel diobati dengan NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹) selama 24 dan 48 jam, kemudian viabilitas diukur dengan assay MTT sesuai Persamaan (1). Setelah inkubasi 4 jam dengan DOX@NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹), sel HeLa diiradiasi dengan laser 808-nm (0,5 W cm⁻²) selama 5 menit dan dibudidayakan selama 20 jam tambahan. Viabilitas dievaluasi dengan MTT, dan morfologi sel diperiksa dengan pewarnaan DAPI dan PI di bawah mikroskopi konfokal.

Viabilitas sel (%) = (OD_sample / OD_control) × 100%.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Fisik dan Kimia

Pengurangan GO dengan NHBP mengubah suspensi cokelat menjadi solusi hitam yang dapat dispersi dalam air, mengonfirmasi konversi yang berhasil. Gambar TEM (Gambar 2) menunjukkan bahwa NrGO-30 mempertahankan struktur lembaran monolaer tanpa agregasi, menunjukkan bahwa NHBP tidak mengganggu morfologi grafit. Spektra FTIR (Gambar 3) menunjukkan hilangnya puncak C=O 1725 cm⁻¹ dari GO dan munculnya sinyal C–N amida 1633 cm⁻¹, mengonfirmasi penambatan kovalen NHBP. Pengukuran potensial zeta (Gambar 4) menunjukkan pergeseran dari negatif (GO) ke positif (NrGO), mendukung fungsionalisasi permukaan lebih lanjut. Spektra UV-vis-NIR (Gambar 5) menunjukkan serapan yang kuat di seluruh jendela NIR untuk semua sampel NrGO, sedangkan GO dan NHBP sendirian menunjukkan respons NIR yang tidak signifikan. Ukuran hidrodinamik (Gambar 6) tetap konsisten di berbagai rasio NHBP, menunjukkan stabilitas ukuran.

Properti Fototermal

Pada sinaran 808-nm, air menunjukkan pemanasan yang tidak signifikan, sementara GO menaikkan <5 °C. Sebaliknya, sampel NrGO mencapai 40–45 °C pada 200 µg mL⁻¹, dengan rasio NHBP yang lebih tinggi menghasilkan elevasi suhu yang lebih besar (Gambar 7). Suhu naik proporsional dengan konsentrasi NrGO dan daya laser, mencapai jendela terapeutik (~41–43 °C) tanpa merusak sel normal. Siklus fototermal (Gambar 7d) dan UV-vis pasca-iradiasi (Gambar 8) mengonfirmasi stabilitas yang baik dan retensi properti optik.

Perilaku Pengiriman Obat

Pelepasan DOX dari DOX@NrGO ditingkatkan secara signifikan dalam kondisi asam (pH 4,0) dan sinaran NIR (Gambar 9). pH asam mengionkan grup amino NHBP, mengurangi binding elektrostatis ke DOX dan mempromosikan pelepasan. Pemanasan NIR mempercepat gerakan molekuler, mempercepat difusi obat lebih lanjut. Oleh karena itu, DOX@NrGO menawarkan responsivitas dual yang cocok untuk mikroenvironment tumor.

Sitotoksisitas NrGO

Assay MTT (Gambar 10a) menunjukkan >80 % viabilitas sel pada 50 µg mL⁻¹ setelah 24 jam, mengonfirmasi toksisitas intrinsik rendah dan kesesuaian sebagai carrier obat.

Inhibi Sel Tumor Sinergis

Pengobatan dengan DOX@NrGO sendirian mengurangi viabilitas HeLa secara bergantung pada dosis (Gambar 10b). Ketika digabungkan dengan sinaran NIR (0,5 W cm⁻², 5 menit), viabilitas sel turun secara signifikan lebih banyak, menunjukkan sinergi kemio-fototermal. Gambar konfokal (Gambar 11) menunjukkan inti terdisperse dengan DOX@NrGO, sementara sinaran menyebabkan pelepasan sel yang luas. Pewarnaan PI (Gambar 12) mengungkapkan lebih banyak sel mati setelah terapi gabungan, mengonfirmasi efek sitotoksik yang ditingkatkan.

Kesimpulan

Secara ringkasan, kami mengembangkan rGO modifikasi NHBP yang larut dalam air dan sederhana dengan konversi fototermal yang kuat dan stabilitas koloidal. Pemuatan DOX memberikan pelepasan yang dipicu pH dan NIR, dan sistem DOX@NrGO mencapai inhibi sel tumor kemio-fototermal yang superior in vitro. Hasil ini menunjukkan janji DOX@NrGO sebagai platform serbaguna untuk terapi kanker dan aplikasi biomedis lainnya.

Singkatan

CLSM:

Mikroskopi konfokal laser pemindaian

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenilindol

DOX:

Doksorubicin

DOX@NrGO:

DOX-termuat NrGO

FTIR:

Fourier-transform inframerah

GO:

Grafit oksida

HBP:

Polimer hiperbranched

MTT:

Metil tiazolil tetrazolium

NHBP:

NHBP berakhiri amino

NIR:

Dekat inframerah

NrGO:

Grafit oksida teredam polimer hiperbranched berakhiri amino

PI:

Propidium iodida

PTT:

Terapi fototermal

rGO:

Grafit oksida teredam

SEM:

Mikroskopi elektron pemindai

TEM:

Mikroskopi elektron transmisi