Investigasi Karakteristik Fisikokimia Sistem Berbasis Nanoliposom untuk Penghantaran Obat Ganda

Hasil dan Diskusi

Pengaruh Proses Preparasi pada Karakteristik Nanoliposom

Nanoliposom yang dienkapsulasi obat ganda disiapkan dengan mengenkapsulasi ERL ke dalam membran bilayer lipid dan DOX ke dalam kompartemen bagian dalam nanoliposom. Liposom yang dienkapsulasi dengan ERL saja disiapkan dengan menghidrasi membran lipid yang digabungkan dengan ERL dengan larutan AS berair. Selama proses ini, molekul ERL dimasukkan ke dalam membran lipid melalui atraksi hidrofobik dan kemudian secara spontan dienkapsulasi ke dalam membran lipid bilayer dari liposom. Setelah hidrasi, suspensi liposom diultrasonikasi menggunakan sonikator probe tipe tanduk untuk mengurangi diameter liposom. Untuk menyelidiki efek dari ultrasonikasi dan metode pendinginan pada diameter liposom, liposom diperlakukan dengan peningkatan waktu sonikasi di bawah kondisi pendinginan yang berbeda dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2a mewakili efek waktu ultrasonikasi pada diameter dan indeks polidispersitas (PDI) dari liposom yang dirawat di bawah kondisi pendinginan penangas air es. Diameter liposom yang dienkapsulasi ERL yang tidak diobati dengan ultrasonikasi adalah 759 ± 44 nm. Namun, hingga 10 menit ultrasonikasi, diameter liposom menurun drastis menjadi 222 ± 40 nm, dan setelah 10 menit, tidak ada perubahan diameter yang signifikan seiring dengan bertambahnya waktu ultrasonikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa liposom yang dienkapsulasi ERL yang dibentuk oleh hidrasi sebagian besar adalah vesikel multilamelar (MLV). Energi tinggi yang dikirim ke liposom tipe MLV melalui ultrasonikasi mengelupas multilayer MLV dan membongkar liposom besar. Dalam larutan berair, lipid yang dipisahkan dari MLV dirakit sendiri melalui atraksi hidrofobik dan dengan demikian diubah menjadi vesikel unilamellar besar (LUV) – atau nanoliposom tipe UV (SUV) kecil. Seperti fenomena ini berulang, diameter nanoliposom rata-rata secara bertahap menurun [24,25,26]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, diameter liposom sangat berkurang dalam waktu singkat ultrasonikasi. Diperkirakan bahwa selama periode ini, sebagian besar liposom tipe MLV diubah menjadi liposom tipe LUV atau SUV [27]. Ultrasonication lebih lama dari 10 menit menyebabkan sedikit penurunan diameter liposom, menunjukkan lebih sedikit transformasi jenis vesikel dengan waktu ultrasonikasi. PDI diameter liposom menurun dengan peningkatan waktu ultrasonikasi, menunjukkan bahwa diameter liposom menjadi seragam dengan waktu meskipun sedikit peningkatan PDI setelah 20 menit. Gambar 2b menunjukkan efek waktu ultrasonikasi pada diameter dan PDI liposom yang dirawat dalam kondisi pendinginan penangas air. Diameter liposom yang tidak diberi perlakuan ultrasonikasi adalah 1433 ± 143 nm. Diameter liposom menurun secara signifikan menjadi 337 ± 67 nm hingga 5 menit ultrasonikasi, dan setelah 5 menit terjadi penurunan diameter secara bertahap hingga 15 menit, diikuti dengan sedikit perubahan diameter. PDI diameter liposom bervariasi dengan waktu ultrasonikasi hingga 15 menit dan mencapai dataran tinggi setelahnya. Di bawah kondisi penangas air, waktu yang dihabiskan untuk mengurangi diameter liposom hingga di bawah 30% dari diameter liposom yang tidak diberi perlakuan lebih pendek daripada waktu yang dihabiskan di bawah kondisi penangas air es. Diperkirakan bahwa pengurangan diameter liposom dibuat dengan transfer energi panas yang dihasilkan oleh ultrasonikasi ke liposom tipe MLV. Dibandingkan dengan kondisi penangas air es, suhu suspensi liposom yang disonikasi di bawah kondisi penangas air dinaikkan terlalu tinggi, menyiratkan bahwa panas suspensi liposom yang terjadi karena pemanasan massal oleh kavitasi ultrasonik kurang efisien dilepaskan. Untuk menjaga suspensi liposom dari efek samping seperti penguapan sedang dan kemungkinan kerusakan molekul lipid yang disebabkan oleh panas berlebih, penangas air es dipilih sebagai kondisi pendinginan untuk ultrasonikasi. Di sisi lain, liposom ultrasonik didialisis untuk menghilangkan AS yang tidak dienkapsulasi. Nanoliposom yang dienkapsulasi ERL dan AS disiapkan menggunakan ultrasonikasi dan dialisis memiliki sekitar 140 nm dari diameter nanoliposom rata-rata, menunjukkan sedikit penurunan diameter nanoliposom melalui dialisis. Nanoliposom yang dienkapsulasi ERL dan AS digunakan untuk enkapsulasi DOX ke dalam kompartemen bagian dalam nanoliposom menggunakan metode gradien AS.

Pengaruh waktu sonikasi probe pada diameter dan indeks polidispersitas nanoliposom yang dienkapsulasi ERL:penangas air es (a ) atau pemandian air (b ) pendinginan suspensi liposom dalam wadah selama ultrasonikasi (n = 3, data disajikan sebagai mean ± SEM)

Gambar 3 menunjukkan diameter nanoliposom yang dienkapsulasi DOX dan ERL menurut waktu ultrasonikasi menggunakan bath sonicator selama proses pemuatan DOX. Variasi diameter yang rendah serupa dengan yang setelah 10 menit ultrasonikasi nanoliposom yang dienkapsulasi ERL seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a. Terlepas dari peningkatan waktu ultrasonikasi, diameter nanoliposom tidak berubah secara signifikan sampai 45 menit ultrasonikasi. Hasil ini dapat dikaitkan dengan fakta bahwa nanoliposom yang dienkapsulasi DOX dan ERL adalah LUV atau SUV [27]. Sedangkan ketika waktu ultrasonikasi lebih dari 45 menit, terjadi peningkatan SEM rata-rata diameter nanoliposom yang menunjukkan peningkatan perbedaan antar sampel liposom. PDI diameter menurun seiring dengan meningkatnya waktu ultrasonikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa keseragaman diameter liposom meningkat dengan waktu ultrasonikasi meskipun ada sedikit peningkatan PDI setelah 60 menit ultrasonikasi. Singkatnya, perubahan diameter nanoliposom dengan ultrasonikasi adalah yang tertinggi dalam tahap transformasi di mana liposom akan dikonversi dari MLV ke LUV atau SUV. Oleh karena itu, ultrasonikasi untuk pengurangan diameter liposom adalah yang paling efektif ketika perawatan dilakukan antara hidrasi membran lipid dan enkapsulasi DOX ke dalam kompartemen bagian dalam nanoliposom yang dienkapsulasi ERL untuk durasi yang relatif singkat.

Pengaruh waktu sonikasi mandi pada diameter dan indeks polidispersitas nanoliposom yang dienkapsulasi DOX dan ERL (n = 3, data disajikan sebagai mean ± SEM)

Pengaruh Metode Pemuatan Obat pada EE

Nanoliposom yang dienkapsulasi obat ganda disiapkan menggunakan pemuatan DOX ke dalam nanoliposom yang dienkapsulasi ERL dengan sekitar 30% EE ERL dan diameter nanoliposom 140 nm. Jumlah DOX atau ERL yang dienkapsulasi dalam liposom diukur setelah penghancuran liposom dengan surfaktan untuk pelepasan lengkap obat dari liposom. Intensitas fluoresensi DOX dan absorbansi ERL masing-masing diukur dengan spektrofluorometri dan spektrometri UV-Vis. Untuk menyelidiki efek metode pemuatan DOX pada EE DOX dalam nanoliposom yang dienkapsulasi ERL dan DOX, metode pemuatan aktif seperti metode gradien pH atau gradien AS digunakan untuk enkapsulasi DOX ke dalam liposom. Perbedaan EE antara dua metode pemuatan obat diselidiki, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 4. EE DOX dengan menggunakan metode gradien AS adalah 90% atau lebih, dan EE dengan menggunakan gradien pH sekitar 17%, menunjukkan bahwa metode gradien AS jauh lebih efektif dalam enkapsulasi DOX daripada metode gradien pH [28].

Efisiensi enkapsulasi DOX dalam nanoliposom yang dienkapsulasi ganda menurut metode pemuatan DOX dan konsentrasi amonium sulfat (AS):asam sitrat CA (n = 3, data disajikan sebagai mean ± SEM)

Ketika perubahan EE DOX menurut konsentrasi AS dibandingkan, EE tertinggi dan SEM EE terendah pada 350 mM AS. Metode AS-gradient atau pH-gradient menggunakan mekanisme translokasi obat, yang menginduksi obat di luar nanoliposom untuk bermigrasi ke kompartemen bagian dalam nanoliposom karena kekuatan pendorong yang dihasilkan dari gradien konsentrasi ion transmembran dari nanoliposom [29, 30]. EE DOX dengan metode gradien-AS, bagaimanapun, cukup tinggi daripada metode gradien-pH. Hasil ini dapat dianggap berasal dari fakta bahwa metode gradien AS lebih efektif dalam mengembangkan kompleks kristal daripada metode gradien pH karena kemampuan kristalisasi yang lebih tinggi antara DOX terionisasi dan ion lawan di dalam nanoliposom [31, 32].

Pengaruh Kondisi Pemuatan Obat pada EE

Untuk menyelidiki pengaruh kondisi perlakuan untuk campuran larutan DOX dan nanoliposom yang dienkapsulasi ERL pada EE DOX selama proses pemuatan DOX, empat kelompok eksperimen yang ditunjukkan pada Gambar 5a dirancang dan dicoba sesuai dengan kondisi perlakuan yang berbeda. Kelompok 1 adalah campuran yang diperlakukan dalam urutan inkubasi, sonikasi, dan dialisis semalam. Dalam kelompok 2, untuk menyelidiki efek dari kesetimbangan campuran sonikasi pada EE, campuran diinkubasi, disonikasi, diseimbangkan selama 30 menit di RT, dan kemudian didialisis semalaman. Sebagai kelompok untuk menyelidiki efek sonikasi jangka panjang pada EE, kelompok 3 adalah campuran yang diinkubasi, disonikasi pada 65 °C selama 15 menit, dan kemudian didialisis semalaman. Selain itu, sebagai kelompok untuk menyelidiki efek sonikasi jangka panjang dan kesetimbangan pada EE, kelompok 4 adalah campuran yang diinkubasi, disonikasi pada 65 °C selama 15 menit, diseimbangkan selama 30 menit di RT, dan kemudian didialisis semalaman. Pada semua kelompok dilakukan pembebanan DOX menggunakan metode AS-gradient. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, EE DOX dari kelompok 1, 2, 3, dan 4 masing-masing adalah 93 ± 7.8, 98 ± 2.5, 83 ± 4.9, dan 59 ± 4.2%. Dibandingkan dengan EE kelompok 3, EE kelompok 1 lebih tinggi, menunjukkan bahwa durasi sonikasi mandi yang lebih pendek adalah pengobatan yang lebih efektif untuk meningkatkan EE dalam nanoliposom. Jika dibandingkan dengan EE kelompok 1, kelompok 2 memiliki EE DOX yang lebih tinggi. EE kelompok 4 adalah yang terendah di antara semua kelompok yang dicoba. Berbeda dengan peningkatan EE dengan ekuilibrasi setelah sonikasi jangka pendek yang diterapkan pada grup 2, ekuilibrasi setelah sonikasi jangka panjang yang diterapkan pada grup 4 tidak efektif untuk peningkatan EE. Hasil ini mungkin disebabkan oleh jumlah energi yang berlebihan yang dikirim ke suspensi, yang dapat mengganggu nanoliposom selama sonikasi mandi yang dijelaskan di atas. Juga, diperkirakan bahwa dengan sonikasi mandi jangka panjang pada kelompok 3 dan 4, EE diturunkan karena penurunan konten AS dalam nanoliposom. Karena suhu suspensi nanoliposom meningkat jauh melampaui suhu transisi fase (T _c ) dengan sonikasi mandi jangka panjang, fluiditas lipid bilayer meningkat dan karena itu menginduksi pelepasan AS dari liposom. Sampel nanoliposom kelompok 3 didialisis segera setelah sonikasi mandi, menunjukkan pendinginan sampel yang cepat. Sebaliknya, sampel nanoliposom dari kelompok 4 diperlakukan dengan sonikasi mandi jangka panjang diikuti dengan keseimbangan, yang mungkin mempertahankan pelepasan AS, meningkatkan pembentukan kompleks DOX-sulfat di luar liposom, dan karenanya menurunkan EE. Meskipun keseimbangan setelah sonikasi jangka panjang tidak efektif, hasil ini menunjukkan bahwa proses pemuatan DOX seperti perlakuan berurutan campuran larutan DOX dan nanoliposom yang dienkapsulasi ERL – inkubasi di atas T _c fosfolipid, sonikasi mandi, keseimbangan di bawah T _c , misalnya, di RT, dan dialisis semalam-adalah metode yang lebih efektif untuk meningkatkan EE daripada proses lain tanpa perlakuan ekuilibrasi [33,34,35].

Efisiensi enkapsulasi DOX dalam nanoliposom yang dienkapsulasi ganda menurut berbagai kondisi pemuatan obat:kondisi pemuatan obat untuk setiap kelompok eksperimen (a ) dan efisiensi enkapsulasi obat dari kelompok eksperimen (b ) (n = 3, data disajikan sebagai mean ± SEM)

Morfologi dan Stabilitas Fisik Nanoliposom Terenkapsulasi Obat Ganda

Gambar 6 menunjukkan morfologi nanoliposom yang diamati oleh TEM. Sampel untuk pengamatan TEM disiapkan menggunakan drop-casting nanoliposom yang dienkapsulasi ERL dan DOX ke dalam kisi tembaga berlapis karbon dan dikeringkan di udara di RT. Untuk membandingkan karakteristik liposom yang dienkapsulasi obat ganda dengan liposom yang dienkapsulasi obat tunggal, morfologi nanoliposom yang dienkapsulasi ERL atau yang dienkapsulasi DOX diamati oleh TEM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, diameter nanoliposom yang dienkapsulasi obat ganda kurang dari 200 nm dan bentuknya hampir bulat. Diameter liposom yang diamati melalui analisis TEM bertepatan dengan nilai yang diukur menggunakan penganalisis ukuran partikel yang memanfaatkan hamburan cahaya dinamis. Gambar 6b ​​menunjukkan gambar nanoliposom tunggal yang mengandung kompleks DOX-sulfat di dalam liposom. Kompleks diasumsikan sebagai kristal yang dibentuk oleh gaya tarik antara kation DOX terprotonasi dan anion sulfat divalen [36]. Gambar 6c menunjukkan gambar TEM resolusi tinggi (HR-), yang menunjukkan kristal obat di wilayah terluar nanoliposom yang ada pada Gambar 6b. Gambar mengungkapkan bahwa kisi yang sangat kristalin di kompartemen bagian dalam nanoliposom dan domain kurang kristal memiliki domain amorf yang dekat dengan karbon di grid [37]. Domain amorf di wilayah terluar nanoliposom mungkin disebabkan oleh ketidakstabilan lapisan ganda lipid setelah terpapar berkas elektron dengan energi tinggi. Difraksi elektron area terpilih (SAED) pola hadir pada Gambar. 6d menunjukkan keteraturan titik difraksi terang, menunjukkan bahwa kristal yang ditunjukkan pada Gambar. 6c memiliki kisi kristal yang sangat teratur [38]. Untuk membandingkan hasil analisis TEM dari nanoliposom yang dienkapsulasi obat ganda dengan nanoliposom yang dienkapsulasi obat tunggal, nanoliposom yang dienkapsulasi ERL diamati oleh TEM dan gambarnya ditunjukkan pada Gambar. 6e. Wilayah terluar dari nanoliposom yang ada pada Gambar 6e diamati oleh HR-TEM, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.