Stabilitas Perakitan Sendiri dan Variabilitas Protein Mikrokompartemen Mikro Bakteri dalam Menanggapi Perubahan Lingkungan
Abstrak
Mikrokompartemen mikro bakteri (BMC) adalah organel rakitan protein yang tersebar luas di antara kerajaan prokariotik. Dengan mensegmentasi enzim dan jalur metabolisme utama menggunakan cangkang polihedral, BMC memainkan peran penting dalam asimilasi karbon, patogenesis, dan ekologi mikroba. Shell BMC terdiri dari beberapa homolog protein yang dirakit sendiri untuk membentuk arsitektur yang ditentukan. Ada minat yang luar biasa dalam rekayasa BMC untuk mengembangkan nanobioreaktor dan perancah molekuler baru. Di sini, kami melaporkan karakterisasi kuantitatif dari pembentukan dan dinamika perakitan mandiri protein cangkang BMC di bawah berbagai kondisi pH dan garam menggunakan mikroskop kekuatan atom berkecepatan tinggi (HS-AFM). Kami menunjukkan bahwa konsentrasi garam 400-mM cenderung menghasilkan patch cangkang berlapis tunggal yang lebih besar yang dibentuk oleh heksamer cangkang, dan tingkat dinamis yang lebih tinggi dari perakitan mandiri heksamer diamati pada pH netral. Kami juga memvisualisasikan variabilitas protein cangkang dari rakitan heksamerik hingga susunan seperti serat. Studi ini memajukan pengetahuan kita tentang stabilitas dan variabilitas perakitan mandiri protein BMC dalam menanggapi perubahan lingkungan mikro, yang akan menginformasikan desain rasional dan konstruksi struktur BMC sintetis dengan kapasitas merombak perakitan mandiri dan ketahanan strukturalnya. Ini juga menawarkan kotak peralatan yang kuat untuk menilai secara kuantitatif perakitan mandiri dan pembentukan struktur nano berbasis BMC dalam aplikasi bioteknologi.
Pengantar
Bakteri mikrokompartemen (BMCs) adalah organel protein, secara struktural menyerupai kapsid virus, yang partisi sitoplasma bakteri [1]. Mereka tersebar luas di antara filum bakteri [2] dan memungkinkan bakteri untuk mengkotak-kotakkan jalur metabolisme kunci tanpa adanya organel terikat membran yang ditemukan pada eukariota [3, 4]. BMC dibentuk oleh cangkang protein semi-permeabel yang mengenkapsulasi inti enzim luminal. Cangkang terdiri dari tiga jenis komponen protein struktural, termasuk BMC-H (mengandung domain Pfam00936), BMC-T (mengandung dua domain Pfam00936), dan BMC-P (dengan domain Pfam03319) [5,6,7, 8,9]. Komponen utama cangkang adalah BMC-H, yang muncul sebagai heksamer dengan permukaan cembung dan cekung dan melapisi sisi cangkang dengan sisi cekungnya menghadap ke luar [10] (Gbr. 1). BMC-P membentuk pentamer yang diusulkan untuk menutupi simpul dari bentuk ikosahedral, dan BMC-T membentuk pseudohexamer yang terletak di segi cangkang yang mungkin bertanggung jawab atas permeabilitas cangkang.
Kompartemen mikro bakteri, organisasi cangkang, dan perakitan mandiri. a Ratusan salinan homolog protein cangkang BMC berkumpul sendiri untuk membentuk organel protein ikosahedral. Protein BMC-H, berwarna kuning, membentuk faset dan protein BMC-P, berwarna merah, menempati simpul. b Topografi AFM dari segi cangkang yang terdiri dari heksamer Hoch_5815 BMC-H. Peristiwa dinamis (lingkaran) diamati dalam hitungan detik menggunakan HS-AFM
Interaksi protein-protein spesifik memastikan perakitan mandiri protein BMC untuk membentuk arsitektur yang sangat terdefinisi untuk memenuhi fungsi metabolismenya. Interaksi lateral antara protein cangkang diasumsikan sebagai faktor utama untuk menentukan sifat perakitan sendiri dari cangkang ikosahedral [10]. Telah diamati bahwa homolog BMC-H dapat membentuk berbagai bentuk, termasuk lembaran dua dimensi [11, 12], nanotube [13,14,15,16,17], dan struktur filamen [15, 18,19,20] .
Berdasarkan perakitan mandiri, permeabilitas selektif, dan sifat enkapsulasi enzim dari organel yang terjadi secara alami, BMC telah dianggap sebagai sistem ideal dengan potensi besar dalam bioteknologi, termasuk konstruksi bioreaktor skala nano yang diilhami dengan membungkus enzim metabolik dan generasi perancah molekul baru dengan fungsi baru [21,22,23,24,25,26]. Namun, beberapa masalah utama tetap harus ditangani dalam bioteknologi BMC, misalnya, seberapa stabil struktur BMC dan bagaimana memanipulasi dan menilai secara efektif perakitan mandiri dan pembentukan agregat protein BMC. Investigasi struktur dan perakitan cangkang BMC dan seluruh BMC telah dilakukan menggunakan kristalografi sinar-X, mikroskop elektron (EM), mikroskop fluoresensi, dan hamburan cahaya dinamis (DSL) [10, 11, 16, 22, 27,28 ,29,30,31]. Baru-baru ini, kami telah mengeksploitasi AFM berkecepatan tinggi (HS-AFM) untuk melakukan visualisasi pertama dari proses perakitan mandiri protein BMC-H yang dinamis [12].
Dalam karya ini, kami menggunakan HS-AFM untuk memantau dinamika struktural tambalan BMC-H di bawah berbagai kondisi pH dan ion, yang memberikan wawasan tentang modulasi perakitan protein cangkang BMC dan menawarkan alat yang ampuh untuk penilaian kuantitatif, pada resolusi molekuler , tentang stabilitas dan variabilitas perakitan mandiri protein cangkang BMC.
Metode
Persiapan Sampel
Protein BMC-H murni (Hoch_5815) dari Haliangium ocraceum disediakan oleh Dr. Kerfeld (Lawrence Berkeley National Laboratory). Untuk pertukaran buffer, sampel stok di ~ 80 mg mL
−1
dalam buffer Tris (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 ) diencerkan menjadi 0,5 mg mL
−1
menggunakan buffer yang diinginkan sebelum pencitraan AFM (File tambahan 1:Gambar S1). Buffer kontrol adalah 50-mM Tris-HCl (pH 7.8) dan 10 mM MgCl2 .
Mikroskopi Gaya Atom
Buffer yang diinginkan digunakan untuk penyerapan sampel pada pencitraan mika dan AFM. Setelah 5 menit penyerapan pada mika, Hoch_5815 dibilas dengan buffer yang diinginkan untuk menghilangkan protein amobil dan kemudian dicitrakan menggunakan AFM (File tambahan 1:Gambar S1). Gambar HS-AFM ditangkap pada 30 atau 40 Hz dalam larutan dalam mode AC menggunakan JPK NanoWizard ULTRA speed AFM yang dilengkapi dengan pemindai ULTRA Speed 2.8 μm dan Ultra-Short Cantilever USC-0.3 MHz probe (NanoWorld). Kekuatan pemuatan minimal ~ 100 picoNewton diterapkan selama pencitraan AFM untuk mengurangi gangguan perakitan protein [12, 32,33,34,35,36].
Pemrosesan dan Analisis Gambar
Analisis citra awalnya dilakukan dengan menggunakan JPK SPM Data Processing (JPK). Analisis gambar HS-AFM dilakukan menggunakan makro khusus pada Image SXM (http://www.ImageSXM.org.uk), seperti yang dijelaskan sebelumnya [12]. Untuk menganalisis ukuran patch Hoch_5815, gambar 512 × 512 piksel yang ditangkap pada kecepatan pemindaian 30 Hz diratakan untuk menghilangkan kemiringan XY dan ambang batas Z, diikuti dengan konversi biner untuk menampilkan protein versus bukan protein. Analisis partikel digunakan untuk menghitung luas permukaan protein dalam gambar biner ini. Patch didefinisikan sebagai objek yang dipisahkan oleh> 3 piksel (~ 2 nm), untuk mengidentifikasi patch individual versus patch yang berdekatan. Pengujian awal menunjukkan bahwa jika jumlah piksel yang lebih besar ditetapkan, tambalan yang berdekatan dapat dihitung sebagai tambalan kontinu tunggal, sedangkan dengan menggunakan jumlah piksel yang lebih kecil, celah antara heksamer individu dalam tambalan dapat salah dihitung sebagai batas antara tambalan. Untuk menganalisis dinamika protein, rangkaian gambar 256 × 256 piksel yang ditangkap pada kecepatan pemindaian 40-Hz dianalisis memberikan resolusi temporal sekitar 6,4 s per frame. Gambar biner dikurangi dari gambar sebelumnya dalam seri untuk menunjukkan perbedaan gambar AFM. Analisis partikel dari gambar perbedaan digunakan untuk menghitung area protein yang dirakit dan dibongkar. Persamaan yang digunakan untuk menghitung laju dinamis ditunjukkan sebagai berikut:
dimana N mewakili jumlah piksel putih dan hitam dalam gambar perbedaan ambang dibagi dengan jumlah piksel yang sesuai dengan satu heksamer pada skala tersebut (File tambahan 1:Gambar S3, Gambar S5). Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA multivariat atau ANOVA dua arah seperti yang ditentukan.
Hasil
Kami menggunakan protein BMC-H (Hoch_5815) dari myxobacterium Haliangium ocraceum , yang diekspresikan dalam Escherichia coli dan dicirikan sebagai heksamer dengan simetri enam kali lipat [12]. Hexamer Hoch_5815 dapat merakit sendiri untuk membentuk lembaran berlapis tunggal pada skala waktu kedua, yang mewakili komponen struktural dasar arsitektur BMC ikosahedral (Gbr. 1a). Pencitraan HS-AFM memungkinkan kami untuk memvisualisasikan perakitan dinamis dan fleksibilitas organisasi dari fragmen lembaran (Gbr. 1b) dan secara kuantitatif memperkirakan ukuran patch dan laju dinamis protein BMC-H menggunakan analisis pencitraan yang dikembangkan (lihat bagian “Metode”).
Respons terhadap Variasi pH
Kami mengukur perubahan ukuran tambalan sebagai indikasi kemampuan keseluruhan Hoch_5815 untuk merakit sendiri. Ukuran patch meningkat dengan kenaikan pH dari 3 menjadi 10 (Gbr. 2a; File tambahan 1:Gambar S2, Tabel S1), menunjukkan bahwa pH tinggi lebih menguntungkan untuk perakitan mandiri protein Hoch_5815 daripada kondisi pH rendah. Ini agak berbeda dari perilaku perakitan protein RmmH, yang ditemukan tidak larut pada pH-6, membentuk susunan nanotube pada pH-8, dan rentan untuk dibongkar pada pH-10 [13]. Selain itu, kami mengamati tingkat variabilitas struktural yang tinggi dari rakitan mandiri HOCH_5815 (seperti yang ditunjukkan oleh SD besar pada Gambar. 2a, File tambahan 1:Gambar S2).
Pengaruh pH lingkungan pada perakitan mandiri Hoch_5815. a Luas permukaan rata-rata dari patch individu Hoch_5815 ditentukan oleh AFM (n = 50) (File tambahan 1:Gambar S2). b Tingkat rata-rata peristiwa dinamis ditentukan oleh HS-AFM (n = 50). *p < 0,05, n tidak signifikan (ANOVA multivariat)
Pencitraan AFM pada perakitan mandiri protein Hoch_5815 dalam lembaran cangkang telah mengungkapkan bahwa pembentukan lembaran cangkang dianggap berasal dari kombinasi perakitan dan pembongkaran heksamer [12]. Kami selanjutnya memeriksa tingkat dinamika perakitan mandiri dan peristiwa dinamis Hoch_5815 di bawah pH yang berbeda (File tambahan 1:Tabel S2) untuk mengeksplorasi stabilitas interaksi protein-protein Hoch_5815. Laju dinamika perakitan mandiri adalah yang tertinggi pada pH 7 dan menurun dalam kondisi asam dan basa (Gbr. 2b; File tambahan 1:Gambar S3). Secara khusus, ia menurun dengan cepat dalam kondisi asam, terutama dari pH 7 ke pH 6 dan tampak relatif konstan antara pH 4 dan pH 3, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b.
Kemungkinan pH memiliki dampak besar pada sifat elektrostatik residu asam amino yang terletak di antarmuka heksamer-heksamer. Dinamika yang menurun dan ukuran tambalan cangkang yang lebih kecil yang diamati dalam kondisi asam menggambarkan bahwa Hoch_5815 memiliki kemampuan merakit sendiri yang berkurang. Dinamika yang berkurang dan ukuran patch cangkang yang lebih besar yang diamati dalam kondisi basa menunjukkan interaksi heksamer-heksamer yang stabil, sedangkan peningkatan dinamika heksamer Hoch_5815 menyiratkan interaksi heksamer-heksamer yang fleksibel dalam kondisi pH netral.
Respon terhadap Variasi Konsentrasi Garam
Kami juga memverifikasi apakah konsentrasi garam buffer berdampak pada perakitan Hoch_5815. Pada konsentrasi rendah (100–200 mM) MgCl2 , CaCl2 , dan KCl, protein Hoch_5815 membentuk tambalan yang relatif lebih kecil daripada yang berkumpul pada konsentrasi yang lebih tinggi (300–500 mM) (Gbr. 3a; File tambahan 1:Gambar S4). Pada 500 mM, kami mengamati lembar Hoch_5815 berlapis ganda atau berlapis (File tambahan 1:Gambar S4). Pengamatan ini konsisten dengan temuan sebelumnya bahwa kekuatan ionik yang lebih tinggi dapat memfasilitasi pembentukan kristal 2D yang lebih ekstensif dan tertata dengan baik oleh CcmK, protein cangkang karboksisome untuk asimilasi karbon [37]. Namun, nanotube yang sangat teratur yang dibentuk oleh RmmH dibongkar ketika konsentrasi NaCl meningkat dari 50 menjadi 500 mM [13], menunjukkan mekanisme yang berpotensi berbeda yang memediasi pembentukan lembaran datar dan bentuk tabung oleh heksamer cangkang.
Pengaruh konsentrasi garam pada self-assembly Hoch_5815. a Area patch rata-rata diukur dengan AFM di bawah kisaran 100–500 mM CaCl2 , MgCl2 , dan KCl (n = 50). Kenaikan konsentrasi garam mengakibatkan peningkatan ukuran patch. Perubahan signifikan pada area patch diamati antara 200 dan 300 mM (***p < 0.001, *p < 0,05, n tidak signifikan, ANOVA dua arah). b Laju rata-rata peristiwa dinamis ditentukan dari rangkaian gambar AFM berkecepatan tinggi di bawah kisaran 100–500 mM CaCl2 , MgCl2 , dan KCl (n = 50). Setiap perubahan 100 mM dalam konsentrasi garam menyebabkan perubahan signifikan dalam laju peristiwa dinamis (***p < 0.001, *p < 0,05, n tidak signifikan, ANOVA dua arah)
Selain itu, variasi perakitan mandiri Hoch_5815 disebabkan oleh perubahan MgCl2 dan konsentrasi KCl relatif sama. Sebaliknya, perubahan ukuran patch paling menonjol (meningkat hingga 3000 kali lipat) ketika CaCl2 konsentrasi dinaikkan dari 200 menjadi 300 mM (Gbr. 3a), menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi dari perakitan mandiri Hoch_5815 terhadap CaCl2 daripada ke MgCl2 atau KCl.
Laju dinamis perakitan mandiri Hoch_5815 juga dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi garam penyangga. Peningkatan MgCl2 , CaCl2 , atau konsentrasi KCl dapat mengakibatkan penurunan laju dinamis Hoch_5815 (Gbr. 3b; File tambahan 1:Gambar S5). Mengingat peningkatan ukuran patch yang diamati di bawah konsentrasi garam yang lebih tinggi (Gbr. 3a), tampak bahwa interaksi lateral antara heksamer Hoch_5815 lebih stabil di bawah konsentrasi garam yang tinggi. Perubahan CaCl2 konsentrasi memiliki respons yang lebih nyata, dan ada perubahan signifikan dalam laju peristiwa dinamis antara 200 dan 300 mM (Gbr. 3b), sedangkan respons terhadap perubahan MgCl2 dan KCl relatif sama, konsisten dengan perubahan ukuran patch (Gbr. 3a). Menariknya, proporsi tertinggi dari peristiwa perakitan versus peristiwa pembongkaran diamati di bawah 400 mM MgCl2 , CaCl2 , atau KCl (File tambahan 1:Tabel S2). Hal ini menyebabkan pembentukan rakitan Hoch_5815 lapisan tunggal yang besar dan stabil di bawah garam 400 mM (File tambahan 1:Gambar S4). Rakitan lapisan ganda yang diamati pada 500 mM juga stabil dan menunjukkan tingkat pergerakan heksamer yang rendah.
Fleksibilitas Perakitan Protein BMC-H
Dengan mengurangi gaya pemindaian hingga 100 pN, kami meminimalkan efek pemindaian ujung AFM pada perakitan protein BMC dan memperoleh gambar AFM resolusi molekuler dari masing-masing heksamer (Gbr. 4). Peristiwa perakitan dan pembongkaran dapat dilihat dalam tampilan yang sama, memverifikasi sifat dinamis dari rakitan shell BMC alih-alih artefak pemindaian ujung [12]. Pencitraan HS-AFM juga mengungkapkan variabilitas agregasi protein Hoch_5815. Saat mencitrakan sampel pada pH 7,5 dengan hanya 10 mM MgCl2 , yang mengejutkan, kami kadang-kadang mengamati pembentukan struktur seperti serat bersama dengan pembongkaran heksamer Hoch_5815 pada skala waktu kedua (Gbr. 4a). Struktur seperti serat ini bisa padat dikemas secara paralel, mirip dengan bundel nanotube dirakit oleh hexamers shell [13,14,15,16]. Namun, jarak antara dua serat adalah 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) dan tinggi rata-rata mereka adalah 2,46 ± 0,22 nm (n = 30), kurang dari lembaran kulit yang dibentuk oleh heksamer Hoch_5815 (3,45 ± 0,16 nm, n = 25) (Gbr. 4b–f). Struktur serat ini cukup fleksibel dan dinamis selama pencitraan dan dapat menampilkan arsitektur lurus atau melingkar dengan ukuran berbeda. Mengingat munculnya struktur serat secara bersamaan dengan pembongkaran heksamer Hoch_5815 dan ketinggiannya yang berkurang dibandingkan dengan lembaran heksamer satu lapis, kami berspekulasi bahwa struktur seperti serat ini dibentuk oleh peptida Hoch_5815 individu yang dibongkar dari heksamer (Gbr. 4g) . Kemungkinan penyerapan substrat dalam kondisi buffer tertentu (seperti kekuatan ionik rendah) dapat menyebabkan pelekatan sisi alfa-heliks peptida Hoch_5815 ke permukaan substrat dan ikatan linier peptida dengan peptida tetangga, meskipun diasumsikan bahwa interaksi intra-heksamer kemungkinan kuat [5]. Mekanisme rinci yang mendasari variabilitas agregasi protein cangkang masih harus dijelaskan lebih lanjut.
Pembentukan dan dinamika struktur berserat bersama dengan rakitan lembaran cangkang di bawah HS-AFM. a Penampilan struktur seperti serat selama pembongkaran lembaran cangkang yang terdiri dari heksamer Hoch_5815, seperti yang ditunjukkan oleh seri gambar AFM. b Topografi AFM dari struktur serat. c Analisis penampang (garis putus-putus di panel b ) menunjukkan jarak 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) antara struktur serat yang berdekatan, dan tinggi rata-rata adalah 2,46 ± 0,22 nm (n = 30). d Topografi AFM dari patch shell terdiri dari heksamer Hoch_5815. e Analisis penampang (garis putus-putus di panel d ) mengungkapkan bahwa tinggi rata-rata heksamer Hoch_5815 adalah 3,45 ± 0,16 nm (n = 25). f Struktur seperti serat menyajikan ketinggian yang berkurang dibandingkan dengan lembaran datar yang terdiri dari heksamer Hoch_5815 (*p < 0,05, ANOVA dua arah). g Usulan organisasi dan pembentukan struktur seperti serat, yang mewakili rangkaian monomer Hoch_5815
Diskusi
BMC terdiri dari ratusan protein yang merakit sendiri untuk membentuk struktur yang lebih tinggi. Cangkang BMC, yang terdiri dari banyak homolog protein, adalah sistem yang ideal untuk mempelajari perakitan sendiri dan interaksi protein. Sebagai teknik yang kuat untuk menganalisis organisasi biomembran, perakitan protein, dan interaksi fisik yang sangat relevan dengan peran fisiologis sistem biologis [32, 35, 38, 39], AFM telah dieksploitasi untuk memvisualisasikan organisasi dan dinamika perakitan mandiri dari Protein cangkang BMC dan arsitektur dan fitur mekanik struktur BMC [12, 30, 31, 40,41,42]. Pekerjaan ini mewakili, sepengetahuan kami, penentuan kuantitatif pertama dari dinamika perakitan mandiri protein cangkang BMC dalam pembentukan lembaran dua dimensi sebagai respons terhadap perubahan lingkungan menggunakan AFM. Hasilnya menyoroti variabilitas yang melekat dan ketergantungan lingkungan dari perakitan mandiri protein BMC-H. Dibandingkan dengan EM dan DSL, AFM menunjukkan potensi besar dalam memantau aksi dinamis perakitan mandiri protein BMC secara real time dengan detail molekuler.
Interaksi protein-protein sangat penting dalam membentuk dan membentuk cangkang BMC [10]. Konsentrasi protein juga telah didokumentasikan sebagai faktor penting untuk mendorong pembentukan cangkang [41, 43]. Selain itu, studi kelarutan in vitro telah menggambarkan bahwa pH dan kekuatan ionik dalam larutan dapat mempengaruhi stabilitas struktural BMC [17, 27] serta perilaku perakitan protein cangkang BMC dalam pembentukan lembaran dua dimensi [37, 41 ], nanotube [13, 17], dan nanocage [28], mengingatkan dampaknya pada perakitan kapsid virus [44, 45]. Kami juga menemukan pengendapan protein dan tidak ada tambalan yang terbentuk ketika pH > 10 dan < 3 atau konsentrasi garam < 10 mM atau> 600 mM (data tidak dipublikasikan). Di sini, kami selanjutnya menunjukkan bahwa kecenderungan dan dinamika perakitan bergantung pada pH dan konsentrasi garam. Meskipun protein cangkang dapat merakit sendiri pada kisaran pH yang luas, lingkungan pH netral tampaknya mampu meningkatkan dinamika perakitan (Gbr. 2b). Kation dengan konsentrasi 300 mM ditemukan mendorong pembentukan lembaran dua dimensi; Kation 400 mM tampaknya diinginkan untuk pembentukan lembaran berlapis tunggal yang besar dan stabil (Gbr. 3). Kondisi ini selaras dengan kondisi sitosol sel bakteri dan secara fisiologis relevan. Misalnya, di bawah kondisi yang paling relevan secara fisiologis, pH E. koli sitosol sekitar 7,4-7,8 [46] dan konsentrasi ion sekitar 100-400 mM, yang penting untuk interaksi protein, pengikatan protein-ligan, pensinyalan, mempertahankan potensi elektrostatik membran, dan gradien protein melintasi membran [47, 48]. Meskipun bagaimana interaksi antara sampel dan substrat mika mempengaruhi perakitan mandiri protein BMC masih harus diselidiki lebih lanjut, pencitraan AFM memberikan kesempatan bagi kami untuk menganalisis secara kuantitatif perubahan dinamis perakitan mandiri protein BMC dalam menanggapi variasi lingkungan.
Dinamika perakitan protein BMC yang bergantung pada lingkungan dalam pembentukan fragmen cangkang yang dijelaskan di sini mungkin mewakili perilaku mereka dalam pembentukan seluruh BMC. Faktanya, struktur BMC 3D tampaknya merupakan organel yang dipelihara secara dinamis yang dirancang di alam. BMC menghadirkan fleksibilitas dan heterogenitas struktural yang menonjol; kelembutan mekanik struktur cangkang BMC ditentukan oleh nanoindentasi AFM [30] dan dinamika nonequilibrium perakitan BMC diungkapkan oleh simulasi komputasi [49] menyoroti perbedaan antara BMC dan rakitan virus yang kuat. Demikian juga, biosintesis karboksisome telah dijelaskan untuk berkorelasi dengan cahaya dan pendamping [50, 51]. Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahwa CcmK3 dan CcmK4 dapat membentuk heterohexamers dan tutup pada cangkang karboksisome dengan cara yang bergantung pada pH, mungkin menyediakan sarana untuk mengatur permeabilitas cangkang karboksisome dan CO2 asimilasi dalam lingkungan mikro yang sangat dinamis [52]. Mekanisme yang tepat yang mendasari bagaimana kondisi lingkungan dalam larutan mempengaruhi perakitan termodinamika protein BMC masih harus diselidiki, misalnya, menggunakan kombinasi studi eksperimental dan simulasi komputasi.
Mengingat perakitan sendiri struktur BMC, ada minat yang signifikan dalam rekayasa BMC dan desain nanobioreaktor berbasis BMC baru, perancah molekuler, dan biomaterial dalam aplikasi bioteknologi, misalnya, meningkatkan metabolisme sel, enkapsulasi enzim, pengiriman molekuler, dan terapi . Pengetahuan lanjutan tentang ketahanan struktural dan variabilitas BMC dalam menanggapi perubahan lingkungan tidak hanya akan menginformasikan strategi untuk memproduksi struktur nano berbasis BMC yang kuat di host heterolog, yaitu, E. koli atau tanaman [31, 53, 54], tetapi juga membuka jalan untuk memodulasi pembentukan bahan nano 2D serta pembukaan dan penutupan kandang protein berbasis cangkang BMC, sehingga memfasilitasi regulasi fungsional dan pengiriman molekuler yang ditargetkan. Sebelumnya, kami telah menunjukkan kelayakan menggunakan pendekatan modifikasi genetik untuk memanipulasi kontak spesifik pada antarmuka protein cangkang dan perilaku perakitan sendiri [12]. Studi ini memperkuat kotak peralatan kami untuk menilai dan memanipulasi perakitan mandiri shell BMC di berbagai lingkungan.
Kesimpulan
Singkatnya, kami mengeksploitasi HS-AFM untuk melakukan penyelidikan kuantitatif perakitan mandiri protein cangkang BMC di bawah kondisi pH dan garam yang berbeda. Pembentukan patch hexamer shell berlapis tunggal yang lebih besar terbukti dipromosikan pada konsentrasi garam 400 mM, dan pH netral menghasilkan tingkat dinamis yang lebih tinggi dari self-assembly hexamer. Transisi organisasi protein cangkang dari rakitan heksamerik ke susunan seperti serat juga divisualisasikan. Studi ini menggambarkan bahwa kondisi lingkungan memainkan peran penting dalam menentukan organisasi dan perakitan mandiri protein cangkang BMC.
