Peran ROS dan penghentian siklus sel dalam genotoksisitas yang diinduksi oleh struktur nano inti emas/kulit perak

Bahan dan metode

Kultur dan pengobatan sel

Garis sel hepatoma manusia HepaRG (Thermo Fisher Scientific) digunakan dalam penelitian ini. Sel dikultur dalam RPMI 1640 yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Australia Origin, Gibco) dan 1% larutan penisilin-streptomisin-glutamin (Gibco) dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO₂ pada 37 °C. Sel diperlakukan dengan peningkatan konsentrasi Au@Ag NR masing-masing selama 24 jam atau 72 jam, dan konsentrasi ditentukan sesuai dengan IC₅₀ diperkirakan dengan uji viabilitas sel. Untuk menyelidiki peran ROS dalam genotoksisitas, 1 mM N -Acetyl-l-cysteine ​​(NAC, Sigma-Aldrich) diterapkan selama 1 jam sebelum pengobatan dengan Au@Ag NR.

Uji pertumbuhan/viabilitas sel ATP

Sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10 ³ /dengan baik. Setelah inkubasi 24 jam, media diaspirasi dan sel-sel diekspos ke konsentrasi Au@Ag NR yang berbeda masing-masing selama 24 jam atau 48 jam. Spektrum konsentrasi yang luas disiapkan, dan empat sumur per perlakuan dilakukan dalam satu periode perlakuan. Sitotoksisitas Au@Ag NR diperiksa dengan uji adenosin trifosfat (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega), yang mengukur aktivitas metabolisme seluler dengan menghitung jumlah ATP, parameter metabolisme penting dalam sel yang hidup. Sinyal luminescent, yang mencerminkan jumlah sel yang hidup, dideteksi menggunakan VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer), dan IC₅₀ nilai diperkirakan sebagai konsentrasi Au@Ag NR untuk viabilitas setengah maksimal oleh Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA). Rasio viabilitas dihitung menggunakan persamaan berikut:

di mana RLU adalah unit cahaya relatif yang direpresentasikan sebagai nilai rata-rata dari empat sumur, RLU_kendaraan sel yang diwakili tidak diperlakukan dengan nanorod, dan RLU_sampel mewakili sel yang diperlakukan dengan konsentrasi Au@Ag NR yang berbeda.

Penentuan konsentrasi perak dan emas dalam sel

Sampel sel dicerna dalam asam nitrat menggunakan sistem pencernaan gelombang mikro. Setelah pencernaan, sampel disiapkan dengan campuran yang mengandung 1% asam nitrat dan asam klorida. Jumlah Ag dan Au dalam larutan ditentukan oleh ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). Analisis TEM digunakan untuk menentukan keberadaan Au NR dan Au@Ag NR di dalam sel. Sampel sel difiksasi dalam campuran 2,5% glutaraldehid dan 2% paraformaldehida selama 2 jam pada 4 °C. Pelet sel difiksasi dan dibilas tiga kali dalam buffer fosfat (pH 7,4) dan pasca-fiksasi dalam 1% osmium tetroksida selama 2 jam pada 4°C. Sampel kemudian dibilas dalam air suling tiga kali dan didehidrasi selama 15 menit dalam konsentrasi etanol yang berbeda (masing-masing 50%, 70%, 90% dan 100% etanol) satu demi satu. Selanjutnya, propilen oksida pada pengenceran 1:1 dan 1:3 diaplikasikan pada resin pada 20–26 °C selama 2 jam. Polimerisasi dilakukan dengan pemanasan bertingkat pada suhu 35 °C selama 16 jam, 45 °C selama 8 jam, 55 °C selama 14 jam dan 65 °C selama 48 jam. Bagian ultra tipis diwarnai selama 25 menit dengan uranil asetat dan timbal sitrat dan dianalisis dengan mikroskop elektron transmisi (H-7650, HITACHI, Jepang).

Pengujian komet konvensional dan modifikasi

Sel-sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 2 × 10 ⁵ /well atau 3 × 10 ⁵ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing. Hidrogen peroksida (H₂ O₂ ) pada konsentrasi 200 mol diekspos ke sel sebagai kontrol positif selama satu jam. Untuk setiap sampel, dua sumur disiapkan untuk perlakuan konvensional dan perlakuan formamidopirimidin glikosilase (Fpg). Uji komet konvensional dilakukan dalam kondisi basa (pH > 13) seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Untuk sumur yang diberi perlakuan Fpg, perlakuan Fpg tambahan diterapkan sebelum prosedur pelepasan DNA, dan slide direndam dalam buffer enzim (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL ⁻¹ BSA) tiga kali masing-masing selama 5 menit. Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) diencerkan pada 1:50.000 dengan buffer enzim. Seratus mililiter alikuot dari enzim yang diencerkan ditambahkan ke setiap gel pada slide mikroskop dan diinkubasi dalam ruang kelembaban pada 37 °C selama 30 menit. Langkah-langkah yang tersisa sama dengan perlakuan konvensional. Tes komet dilakukan dalam rangkap tiga. Setidaknya 50 sel per sampel dinilai secara independen menggunakan mikroskop fluoresen Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokyo, Jepang), sedangkan Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, UK) digunakan untuk menganalisis nilai sedang persentase DNA di ekor dan ekor zaitun momen (OTM) dari setiap sampel.

Kualifikasi fokus -H2AX berdasarkan flow cytometry dan penyaringan konten tinggi

Untuk kuantifikasi menggunakan flow cytometry, sel-sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 2 × 10 ⁵ /well atau 3 × 10 ⁵ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing, sedangkan untuk uji penyaringan konten tinggi, sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 6 × 10 ³ /well atau 1 × 10 ⁴ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing. Sebagai kontrol positif, 2 μM metil metanasulfonat (MMS, Sigma-Aldrich) diterapkan secara paralel dengan sel selama satu jam. Sel-sel dibilas dalam tris-buffered saline (TBS) dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 15 menit pada suhu kamar. Setelah dicuci dengan TBS, sel diinkubasi dengan 50 L metanol dingin selama 30 menit pada -20 °C. Sel dibilas lebih lanjut dalam TBS tiga kali, dan reagen penghambat (TBS yang mengandung 0,3% Triton X-100 dan 10% serum kambing) diterapkan selama 1 jam. Antibodi primer (anti-fosfo-H2AX tikus Ser139, Millipore) diencerkan menjadi 1:200 dengan reagen pemblokiran dan diinkubasi dengan sel semalaman pada suhu 4 °C. Plate kemudian dibilas lagi dengan TBS tiga kali, dan antibodi sekunder (anti-tikus kambing Alexa Fluor 488, Life Technologies), yang diencerkan dengan reagen pemblokiran dalam rasio 1:20, ditambahkan kemudian. Sampel disimpan di tempat gelap pada suhu kamar selama 1 jam, dan 2 μg mL ⁻¹ (20 μL/sumur) DAPI (Invitrogen) ditambahkan ke setiap sumur. Fluoresensi diukur menggunakan flow cytometry (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) atau Sistem Analisis Konten Tinggi (Operetta CLS, PerkinElmer). Untuk uji aliran cytometry, data dari setidaknya 10.000 sel per kelompok dianalisis, dan percobaan dilakukan dalam rangkap tiga; untuk analisis konten tinggi, 20 bidang visual di setiap sumur dan setidaknya lima sumur di setiap kelompok dianalisis.

Uji sitokinesis-blok mikronukleus cytome (CBMN-cyt)

CBMN-cyt dilakukan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan oleh Fenech et al. [22]. Sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 2 × 10 ⁵ /well atau 3 × 10 ⁵ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing. 0,2 μg mL ⁻¹ Mitomycin C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japan) diekspos ke sel sebagai kontrol positif selama 24 jam. 3 μg mL ⁻¹ cytochalasin B diterapkan setelah perawatan 24 atau 72 jam untuk memblokir proses sitokinesis, dan sel dipanen setelah 40 jam. Sampel diwarnai dengan 5% Giemsa setelah hipotonisitas dengan 0,075 mol L ⁻¹ yang telah dihangatkan sebelumnya KCl dan fiksasi dengan campuran 3:1 metanol dan asam asetat. Sumur rangkap tiga per kelompok disiapkan, dan setidaknya 1000 sel berinti dua per sumur diperiksa.

Pengukuran MDA, total konten GSH dan SOD

Sel-sel dikultur dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 5 × 10 ⁵ /well atau 3 × 10 ⁵ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing. Selanjutnya, sel dipanen dan dibilas tiga kali dengan fosfat buffer saline (PBS). Jumlah malondialdehid (MDA) dalam homogenat sel ditentukan menggunakan metode berbasis asam tiobarbiturat (Institut Bio-engineering Nanjing Jiancheng, Nanjing, Cina). Jumlah glutathione total (GSH) dan superoksida dismutase (SOD) ditentukan dengan menggunakan kuantifikasi glutathione total dan kit uji SOD (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Jepang). Densitas optik (OD) masing-masing sumur diukur menggunakan VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer).

Alur analisis sitometrik untuk siklus sel

Sel-sel dikultur dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 1 × 10 ⁶ /well atau 5 × 10 ⁵ /well masing-masing selama 24 atau 72 jam, dan selanjutnya difiksasi dengan etanol 70% pada 4 °C semalaman. Sampel dibilas dengan PBS tiga kali dan diwarnai dengan buffer pewarnaan PI/Rnase (BD Biosciences) selama 15 menit pada suhu kamar. Populasi sel di bawah fase G0/G1, S dan G2/M di antara 20.000 sel ditentukan dengan menggunakan daerah dengan luas FL2 versus lebar FL2. Analisis dilakukan dengan flow cytometry (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) dan FlowJo (BD Bioscience), dan percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.

Alur analisis sitometrik apoptosis sel

Sel-sel dikultur dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 1 × 10 ⁶ /well atau 5 × 10 ⁵ /well untuk perawatan 24- atau 72-jam, masing-masing. Mereka kemudian dibilas dua kali dengan PBS dan diencerkan dengan 500 μL 1 × binding buffer (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) untuk menyesuaikan suspensi menjadi sekitar 1 × 10 ⁶ sel/mL, dan kemudian pengenceran 100 L dicampur dengan 5 L FITC Annexin V dan 5 L PI. Sampel diwarnai pada suhu kamar selama 15 menit, dan setidaknya 10.000 sel dianalisis untuk menentukan populasi sel di bawah apoptosis awal dan akhir dengan menggunakan daerah dengan FL1H versus FL2H menggunakan flow cytometry (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) dan FlowJo (BD Biosains). Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.

Analisis Western blot

Sel-sel dikultur dalam ukuran 75 cm ² labu dengan massa jenis 1 × 10 ⁷ /well dan 6 × 10 ⁶ /well untuk perawatan 24- dan 72-jam, masing-masing. Sel-sel dilisiskan dengan buffer lisis RIPA yang mengandung protease inhibitor (PMSF), dan konsentrasi protein ditentukan menggunakan kit kuantifikasi protein BCA (Beyotime Biotechnology, China). Konsentrasi sampel disesuaikan menggunakan buffer lisis RIPA sebelum denaturasi dengan pemanasan pada 95 °C selama 3 menit. Sampel protein dipisahkan dengan elektroforesis pada gel poliakrilamida SDS 12% dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (Millipore). Membran diblokir dengan susu skim 5% selama 30 menit dan diinkubasi dengan p53 primer (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) dan -aktin (sc-47778, Santa Cruz) dan antibodi sekunder kambing anti-tikus IgG(H+L)-HRP(SE131, solabio), masing-masing. Tingkat ekspresi protein target dalam sampel divisualisasikan menggunakan metode Enhanced chemiluminescence (ECL) dan dianalisis dengan sistem ImageJ (National Institutes of Health).

Analisis statistik

Data disajikan sebagai mean ± SEM. Analisis varians satu arah (ANOVA) digunakan untuk menguji signifikansi statistik perbedaan antara kontrol negatif dan kelompok perlakuan, diikuti oleh uji perbandingan berganda Dunnett menggunakan SPSS (versi 22, IBM, Armonk, NY, USA), dan data dipertimbangkan signifikan secara statistik pada P < 0,05. Angka-angka disiapkan menggunakan GraphPad Prism 7 untuk Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Hasil

Karakterisasi Au NR dan Au@Ag NR

Nanorod emas (Au NRs), inti nanorod emas dan struktur nano cangkang perak (Au@Ag NR) direkayasa, disiapkan, dan dikarakterisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Secara singkat, diameter dan panjang rata-rata adalah 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm untuk Au NR dan 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm untuk Au@Ag NR. Ketebalan cangkang Ag sekitar 5 nm. Potensi zeta dari Au NRs berlapis PDDAC dan Au@Ag NRs yang terdispersi dalam air masing-masing adalah 37,7 ± 1,6 mV dan 52,5 ± 1,4 mV. Rasio berat Ag/Au dari Au@Ag NR yang disiapkan diperkirakan sebesar 2,3. Hasil karakterisasi ditunjukkan pada Gambar. 1.

Karakterisasi Au NR dan Au@Ag NR. a Diagram struktur Au NR dan Au@Ag NR; b Spektrum kepunahan UV–Vis–NIR dari Au NR dan Au@Ag NR yang terdispersi dalam air; c gambar TEM representatif dari Au NR; d gambar TEM representatif dari Au @Ag NR

Kelangsungan hidup sel

Sitotoksisitas Au@Ag NR terhadap sel HepaRG diselidiki dengan uji viabilitas ATP (Tabel 1), dan sel diekspos ke Au@Ag NR selama 24 atau 48 jam pada konsentrasi yang bervariasi dari 0,125 hingga 160 μg mL ⁻¹ . Au@Ag NR menginduksi efek sitotoksik yang signifikan baik dalam waktu dan cara tergantung dosis setelah paparan 24 dan 48 jam, dengan % viabilitas IC₅₀ pada 20 µg mL ⁻¹ dan 6 µg mL ⁻¹ , masing-masing dilengkapi oleh perangkat lunak GraphPad Prism 7.0. Mempertimbangkan sitotoksisitas secara keseluruhan, periode pengobatan disesuaikan menjadi 24 jam dan 72 jam, sedangkan konsentrasi yang diterapkan ditentukan menjadi 0,8 µg mL ⁻¹ , 4 µg mL ⁻¹ dan 20 µg mL ⁻¹ . Selain itu, Au NR disertakan sebagai kontrol inert, dan konten Au dalam grup AuNR sama dengan 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR, yaitu 16 µg mL ⁻¹ . Sebaliknya, perlakuan awal NAC 1 mM diadopsi pada kelompok Au@Ag NR + NAC sebagai kontrol untuk respons stres oksidatif (konsentrasi Au@Ag NR adalah 20 µg mL ⁻¹ ).

Distribusi sel Au NR dan Au@Ag NR

Distribusi kandungan Au dan Ag dalam sel HepaRG dianalisis dengan ICP-MS. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2 dan 3, kandungan Ag meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis. Namun, antioksidan N -Acetyl-l-cysteine ​​(NAC) sebagai pemulung radikal bebas dapat membatasi penyerapan seluler nanopartikel, karena kandungan Ag yang lebih rendah diamati meskipun konsentrasi Au@Ag NR yang sama (20 µg mL ⁻¹ ) diterapkan dalam grup ini. Penurunan rasio Ag/Au dari 24 menjadi 72 jam menunjukkan pelepasan Ag ⁺ yang berkelanjutan dari cangkang Au@Ag NR. Juga, serapan seluler Ag jauh lebih banyak daripada Au (Tabel 4). Selanjutnya, data TEM menunjukkan bahwa sebagian besar Au NR dan Au@Ag NR dipertahankan dalam sel sebagai aglomerat. Struktur nanorod terlihat jelas di dalam sel yang terpapar Au NR atau Au@Ag NR tanpa memasuki nukleus (Gbr. 2).

Internalisasi Au NR dan Au@Ag NR:HepaRG oleh TEM pada 80 kV setelah 24 jam paparan 16 μg mL ⁻¹ Au NR dan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR. a Kontrol kendaraan; b Au NR; c Au@Ag NR

Kerusakan DNA

Kerusakan DNA yang dipicu oleh Au@Ag NR dievaluasi dengan uji komet dan uji H2AX (Gbr. 3). Diamati dari uji komet bahwa 0,8 hingga 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR dapat menyebabkan kerusakan DNA yang signifikan. Setelah 24 atau 72 jam paparan Au@Ag NR, baik % ekor DNA dan OTM sel meningkat baik dalam cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi. Selain itu, kerusakan DNA yang terkait dengan induksi stres oksidatif diamati pada sel yang diobati dengan 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR dengan uji komet termodifikasi enzim Fgp (Gbr. 3a, b). Untuk mengevaluasi tingkat kerusakan untai ganda yang mewakili korelasi yang lebih tinggi dengan asal-usul kanker, baik sel -H2AX-positif dan intensitas fluoresensi rata-rata dalam sel -H2AX-positif dianalisis. Setelah paparan 24 jam terhadap Au@Ag NR, tidak ada perbedaan yang ditemukan di antara kelompok-kelompok dalam sel-sel positif--H2AX. Namun, 4 μg mL ⁻¹ Kelompok Au@Ag NR menyebabkan peningkatan yang signifikan setelah pengobatan 72 jam. Peningkatan intensitas fluoresensi yang signifikan diamati pada semua kelompok Au@Ag NR setelah 72 jam dibandingkan dengan kontrol kendaraan (Gbr. 3c–e, P < 0.05).

Kerusakan DNA yang diinduksi oleh Au@Ag NR. Sel HepaGR terpapar Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda (0,8 hingga 20 μg mL ⁻¹ ) masing-masing selama 24 jam dan 72 jam. a Rata-rata % DNA ekor setelah terpapar Au@Ag NR selama 24 jam; b rata-rata % DNA Ekor setelah terpapar Au@Ag NR selama 72 jam; c persentase sel positif dengan fokus -H2AX diperkirakan menggunakan flow cytometry; d intensitas fluoresensi rata-rata dalam sel dengan fokus -H2AX diperkirakan menggunakan pewarnaan imunofluoresen. ^* P < 0,05 versus kontrol kendaraan; ^a P < 0,05 versus Au NR. 2 μM mL ⁻¹ MMS digunakan sebagai kontrol positif

Kerusakan kromosom

Pembentukan mikronukleus adalah biomarker yang signifikan untuk mengidentifikasi kerusakan kromosom, yang merupakan kerusakan yang lebih kritis pada materi genetik daripada kerusakan DNA. Rasio sel berinti dua yang mengandung mikronukleus diberi skor seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c. Au@Ag NR meningkatkan pembentukan mikronukleus dalam pola yang bergantung pada konsentrasi. Setelah paparan 24 jam, rasio mikronukleus yang diamati pada sel yang diobati dengan 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR dan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR masing-masing adalah 1,133 ± 0,145% dan 1,567 ± 0,318%, keduanya secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol kendaraan. Setelah paparan 72 jam, rasio mikronukleus dalam sel yang diobati dengan 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR adalah 1,767 ± 0,233%, yang secara signifikan lebih tinggi dari kelompok kontrol kendaraan; rasio mikronukleus dalam sel yang diobati dengan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR adalah 2,167 ± 0,252%, yang secara signifikan lebih tinggi daripada yang diamati pada kedua kelompok kontrol kendaraan dan 16 μg mL ⁻¹ Kelompok Au NR (0,700 ± 0,153%). Sebaliknya, tidak ada perbedaan yang ditemukan antara sel yang diobati dengan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC dan kontrol kendaraan, menunjukkan partisipasi ROS dalam kerusakan kromosom yang disebabkan oleh Au@Ag NR.

Kerusakan kromosom yang disebabkan oleh Au@Ag NR. Sel HepaGR terpapar Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda dari 0,8 μg mL ⁻¹ hingga 20 μg mL ⁻¹ selama 24 jam dan 72 jam. a , b Gambar representatif mikronukleus (panah merah); c frekuensi mikronukleus (%). ^* P < 0,05 versus kontrol kendaraan; ^a P < 0,05 versus Au NR. 0,2 μg mL ⁻¹ mitomycin C digunakan sebagai kontrol positif

Pengaruh Au@Ag NR pada Formasi ROS

Untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran pembentukan ROS dalam kerusakan DNA dan kromosom yang diinduksi Au@Ag NR, tingkat MDA, GSH dan SOD diperkirakan. Peningkatan signifikan dalam pembentukan MDA (P < 0.05) diamati setelah terpapar 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR untuk 24 dan 72 jam (Gbr. 5a). Selanjutnya, tingkat GSH dan SOD dalam sel yang terpapar Au@Ag NR menunjukkan penurunan yang signifikan (P < 0,05) dengan cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi. Hasil ini menunjukkan ketidakseimbangan antara oksidasi dan anti-oksidasi, yang dihasilkan oleh paparan Au@Ag NR (Gbr. 5b, c).

Efek Au@Ag NR pada pembentukan ROS. Sel HepaGR terpapar Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda dari 0,8 μg mL ⁻¹ hingga 20 μg mL ⁻¹ selama 24 jam dan 72 jam. a tingkat MDA; b tingkat GSH; c tingkat SOD. ^* P < 0,05 versus kontrol kendaraan; ^a P < 0,05 versus Au NR

Efek Au@Ag NR pada siklus sel dan apoptosis

Setelah 72 jam terpapar Au@Ag NR, peningkatan jumlah sel pada fase G2/M diamati pada 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR, 20 μg mL ⁻¹ Kelompok Au@Ag NR dan Au@Ag NR + NAC, dengan proporsi masing-masing 32,63% ± 1,77%, 32,267% ± 2,17% dan 32,967% ± 4,25% (Gbr. 6a, b), yang secara signifikan lebih besar daripada yang ada di kelompok kontrol kendaraan (22,37% ± 0,92%). Sementara itu, apoptosis sel yang diinduksi oleh Au@Ag NR dapat diamati setelah paparan 72 jam, dan tingkat apoptosis akhir sel yang diobati dengan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR dan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC masing-masing adalah 78,90 ± 1,19% dan 70,20 ± 4,50% (Gbr. 6c, d). Au@Ag NR menginduksi lebih banyak apoptosis akhir daripada apoptosis awal, dan pengobatan NAC dapat mengurangi laju sel dari apoptosis akhir yang dipicu oleh Au@Ag NR.

Efek Au@Ag NR pada siklus sel dan apoptosis. Efek Au@Ag NR pada siklus sel (a , b ) dan apoptosis (c , d ) setelah terpapar selama 24 jam dan 72 jam, masing-masing; data perwakilan tingkat ekspresi p53 dan p21 dalam sel HepaRG dari kelompok yang berbeda (e , f Jalur 1:kontrol kendaraan; Jalur 2:Au NR; Jalur 3:Au@Ag NR + NAC; Jalur 4:Au@Ag NR 20 μg mL ⁻¹ ; Jalur 5:Au@Ag NR 4 μg mL ⁻¹ ; Jalur 6:Au@Ag NR 0.8 μg mL ⁻¹ ); rata-rata tingkat ekspresi relatif p53 dan p21 terhadap -aktin dalam kelompok yang berbeda diringkas dalam (g , f ). ^* P < 0,05 versus kontrol kendaraan; ^a P < 0,05 versus Au NR

Tingkat ekspresi p21 dan p53 dideteksi oleh Western blot, dan pola serupa diamati. Tingkat ekspresi p53 dan p21 dalam sel yang diobati dengan 4 μg mL ⁻¹ dan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR meningkat tajam (P < 0,05) dan menurun secara signifikan pada sel yang diobati dengan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR dan NAC (P < 0,05, dibandingkan dengan 20 μg mL ⁻¹ Grup Au@Ag NR, Gbr. 6e–h). Diketahui bahwa protein p53 adalah molekul inti yang memediasi aktivasi pos pemeriksaan G2/M sebagai respons terhadap kerusakan DNA, dan p21 dikenal sebagai penghambat siklus sel yang bergantung pada p53. Dengan demikian, Au@Ag NR dapat mengganggu replikasi DNA dan menghambat perbaikan DNA melalui penghentian siklus sel.

Diskusi

Saat ini, peran Ag ⁺ . yang dirilis dan AgNP dalam menghasilkan genotoksisitas masih jauh dari jelas. Studi sebelumnya dari kelompok kami [21] dan lainnya [13] telah menunjukkan bahwa sementara Ag ⁺ adalah sumber utama untuk memperkenalkan toksisitas, nanopartikel juga bisa sangat beracun. Misalnya, AgNPs dapat berkontribusi pada genotoksisitas dengan menginduksi pembentukan radikal hidroksil [13]. Selanjutnya, kerusakan kromosom yang lebih parah, stres oksidatif dan apoptosis diperkenalkan oleh AgNP dibandingkan dengan Ag ⁺ alone [23], suggesting that different pathways might be involved. We employed Au@Ag NR as a model material to understand the forms and distributions of AgNPs in cells, and the amounts of intracellular Ag and Au were determined by ICP-MS. The Ag/Au weight ratio of prepared Au@Ag NR was estimated as 2.3. However, after a 24-h exposure, it sharply increased to 16.5 in the cells treated with Au@Ag NR, suggesting that large amount of Ag was released from the shell of Au@Ag NR within that period. When the exposure period of Au@Ag NR was extended to 72 h, the Au/Ag weight ratio was decreased to 1.7, indicating that the Ag ⁺ was released from the cell and the nanorod was the major form of Au@Ag NR in the cell at that stage. Therefore, it could be deduced that once the Au@Ag NR entered the cell, Ag ⁺ rapidly dissolved from its shell within 24 h and gradually released to the extracellular environment, while the Au@Ag NR itself retained in the cell for a longer period.

Oxidative stress is deemed as one of the most important toxicological mechanisms of nanoparticles [24]. N-acetylcysteine (NAC) is a thiol, a mucolytic agent and precursor of l-cysteine which reduced glutathione. NAC is also a source of sulfhydryl groups in cells and exerts the ROS scavenger activity by interacting with OH ^· dan H₂ O₂ [25]. In this study, the GSH and SOD levels were significantly decreased after exposure to Au@Ag NR, while the MDA level increased in a concentration- and time-dependent manner, indicating that the Au@Ag NR introduced the oxidative stress in the cells.

The potentials of Ag and Au@Ag NR in interfering with the genetic materials were further investigated by a series of genotoxicity assays. It is noteworthy that co-culturing the NAC with Au@Ag NR could ameliorate the ROS formation, which in turn supports the participation of oxidative stress in the genotoxicity triggered by Au@Ag NR. In this study, comet and γ-H2AX assays were performed to confirm that Au@Ag NR could interact with DNA and induce certain DNA damage, and the repair endonuclease Fpg was included in the comet assay to identify the oxidative DNA damage [26]. The Fgp could recognize oxidized pyrimidines and remove oxidized purines, e.g., 8-hydroguanine, so as to create apurinic or apyrimidinic sites that could introduce gaps in the DNA strands. The oxidative stress-induced DNA breakage could be determined subsequently by another comet assay [27]. The further DNA breakage detected by the additional Fgp in the comet assay suggested that the Au@Ag NR could cause DNA damage. Mei et al. [28] observed that 5-nm-sized AgNPs induced oxidative lesion-specific DNA damage by employing the hOGG1, EndoIII and Fpg endonucleases in the comet assay. Li dkk. [29] also suggested that both PVP- and silica-coated AgNPs (15–100 nm and 10–80 nm, respectively) could lead to a significant increase in DNA breakage in mice hepatocytes in the presence of hOGG1and EndoIII. The formation of γ-H2AX foci, which represents an early cellular response to genotoxic stress, is the most sensitive and specific biomarker for detecting DSBs [30]. As demonstrated in this study, γ-H2AX foci in cells exposed to Au@Ag NR were markedly increased after 24 h, and a further increase could be observed after 72 h. The reduction in the 20 µg mL ⁻¹ group might be due to the cytotoxicity to the HepaRG cells at higher concentration. Similar results were observed for AgNPs with different coatings [31, 32]. Further, our results suggest that Au@Ag NR could induce chromosome damage in HepaRG cells, as the micronucleus rates were significantly increased. This is consistent with previous studies, where AgNPs-induced increased micronucleus rate was reported in HaCaT and TK6 cells [33]. In contrast, the addition of oxidative radical scavenger NAC could inhibit the formation of micronucleus induced by Au@Ag NR. Taken together, these data suggest the participation of oxidative stress in AgNP-introduced clastogenicity risk in vitro.

Previous studies have investigated the cell cycle arrest and cytotoxicity induced by AgNPs [33,34,35]. With prolonging the exposure time, the impact of AgNPs on cell cycle and apoptosis might be enhanced and in turn aggravate the cytotoxicity and genotoxicity. Usually, the cell cycle checkpoints (e.g., G2/M) were initiated by cells when experiencing DNA damage, and this mechanism serves to prevent the cell from entering mitosis (M phase). The G2/M cell cycle arrest indicates that an increasing percentage of cells is hindered in G2 phase for DNA repairing. Cells experiencing successful DNA repairing would further proceed to mitosis; however, for those with fatal damages, irreversible G2/M cell cycle arrest and cells apoptosis would take place [36]. We observed that Au@Ag NR could arrest the majority of HepaRG cells in G2/M phase, induce late cell apoptosis and increase the expression levels of p53 and p21, which are important proteins associated with the regulation of cell cycles [37]. As p53 could also induce apoptosis, when the DNA cannot be repaired properly [38], the p21 might indirectly participate in cell apoptosis by cell cycle arrest in a p53-dependent pathway via down-regulating the nuclear protein ICBP90 for DNA replication and cell cycle regulation [39]. Furthermore, apoptosis and a G2/M arrest induced by activation of the p53/p21 system have been reported in HepG2 cells following the administration of garlic extracts [40]. Thus, it could be inferred that the oxidative stress-triggered DNA/chromosome damages might facilitate the expression of p53 and p21, which subsequently induces cell cycle arrest. Extending the exposure period of Au@Ag NRs to the DNA/chromosome during replication may further aggravate the genotoxicity or apoptosis.

Conclusion

Genotoxicity induced by AgNPs may be attributed to the oxidative stress induced by the nanoparticles as well as the released ions [41]. This study employed Au@Ag NR as a model to determine the distribution and release behavior of Ag after the nanoparticles enter into the cells. Considering the disparate forms of Au@Ag NR in the cell, after its exposure the Ag ⁺ was rapidly dissolved from the silver shell. Ag ⁺ and Au@Ag NR could introduce cytotoxicity and genotoxicity (clastogenicity) in the cells, and the Au@Ag NR retained in the nucleus may further release Ag ⁺ to aggravate the damage, which are mainly caused by cell cycle arrest and ROS formation (summarized in Fig. 7). Collectively, these data reveal the correlation between the intracellular accumulation, Ag ⁺ release as well as the potential genotoxicity of AgNPs.

Schematic diagram of the possible mechanism of genotoxicity introduced by AgNP in vitro

Ketersediaan data dan materi

All data and materials are available without restriction.

Growth and Selective Etch of Phosphor-Doped Silicon/Silicon–Germanium Multilayers Structures for Vertical Transistors Application Broadband THz Penyerapan Array Mikrobolometer Terintegrasi dengan Split-Ring Resonator