Penyelidikan ROS dan Penghentian Siklus Sel dalam Efek Genotoksik Nanostruktur Core Emas/C Shell Perak
Abstrak
Untuk memahami genotoksik yang diinduksi di hati oleh nanopartikel perak (AgNPs) dan ion perak, nanostruktur core emas/shell perak yang direkayasa (Au@Ag NR) dan sel hepatosit manusia HepaRG digunakan dalam penelitian ini. Keterlibatan stres oksidatif dan penghentian siklus sel dalam kerusakan DNA dan kromosom yang diinduksi oleh 0,4–20 µg mL−1 Au@Ag NR ditelidiki dengan tes komet, tes γ-H2AX, dan tes mikronukleus. Lebih lanjut, distribusi Au@Ag NR dianalisis. Hasil kami menunjukkan bahwa baik Ag+ maupun Au@Ag NR menyebabkan patahnya DNA dan kerusakan kromosom (klastogenisitas) dalam sel HepaRG dan bahwa Au@Ag NR yang tersimpan di inti sel dapat lebih lanjut melepaskan Ag+, yang membebani kerusakan, yang terutama disebabkan oleh penghentian siklus sel dan pembentukan ROS. Hasil ini mengungkapkan korelasi antara akumulasi intrakeluler, pelepasan ion Ag+ dan potensi genotoksik AgNPs.
Pendahuluan
Nanopartikel perak (AgNPs), berukuran 1 hingga 100 nm, dapat menunjukkan spektrum luas properti antimikroba dengan menembus patogen dan menonaktifkan grup sulfhidril dalam enzim metabolisme mereka [1]. Mereka telah menunjukkan efek bakteriostasis dan bakterisida yang kuat pada Escherichia Coli, Neisseria gonorrhoeae dan Chlamydia trachomatis, dan banyak digunakan sebagai lapisan medis, produk rumah tangga [2] serta pengelap luka [3]. Bukti yang kuat menunjukkan bahwa nanopartikel mampu masuk ke dalam inti sel dan mengganggu proses sintesis dan transkripsi DNA [4]. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami melaporkan bahwa satu dosis intravenous 5 mg/kg AgNPs dapat menyebabkan patah kromosom yang signifikan pada sel sumsum tulang tikus Sprague–Dawley [5]. Satu injeksi intraperitoneal 10 mg/kg atau lebih AgNPs menyebabkan kerusakan DNA dan kromosom [6]. Flower et al. [7] menyarankan bahwa AgNPs pada dosis 50 dan 100 μg mL−1 dapat memicu kerusakan DNA dalam lima menit setelah pemberian, menyoroti genotoksik perak (Ag) yang dirilis dengan cepat. Mempertimbangkan risiko paparan berlebihan, investigasi NanoGenotoxicology atau kerusakan DNA dan potensi karsinogenik nanomaterial yang direkayasa telah mendapat banyak perhatian [8].
Mekanisme utama untuk cedera genetik yang diinduksi oleh AgNPs dianggap sebagai produksi berlebihan spesies oksigen reaktif, inflamasi, dan gangguan siklus sel [9, 10]. Seperti yang disarankan dalam studi sebelumnya, AgNPs dapat langsung berinteraksi dengan DNA melalui kerusakan oksidasi [11] dan mengganggu interfase pada tingkat DNA dan mitosis pada tingkat kromosom, atau berinteraksi dengan nucleoprotein dan aparatus spindel mitotik untuk mengganggu titik kontrol siklus sel [12]. Namun, apakah genotoksik yang diinduksi oleh AgNPs sebagian dapat diatribusikan pada nanopartikel [13, 14] atau sepenuhnya pada ion Ag+ yang dirilis masih belum jelas [15, 16].
Menelidiki genotoksik AgNPs sulit karena rilis perak yang tidak stabil dan tidak terhenti dalam jaringan, yang mengakibatkan kesulitan dalam melokalkan AgNPs dan membedakan nanocore dari Ag. Kelompok kami baru-baru ini mengembangkan nanostruktur core emas/shell perak (Au@Ag NR) untuk mempelajari toksisitas yang diinduksi oleh nanopartikel [17]. Core emas Au@Ag NR fisiologis bawa dalam jaringan dan dapat digunakan sebagai standar internal untuk memantau rilis ion Ag+ dari batang dengan memantau perubahan rasio Ag/Au, yang diukur menggunakan spektrometri massa plasma terhubung inductif (ICP-MS) [18]. Dengan metode ini, asal yang berbeda dari toksisitas dapat diidentifikasi. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ion Ag+ yang dirilis dari shell Au@Ag NR menyebabkan kerusakan oksidatif ginjal dan akhirnya mengakibatkan perubahan morfologi dan gangguan fungsi filtrasi glomerulus [19]. Jiang et al. [20] menyarankan bahwa aktivitas spesifik partikel dan rilis ion perak intrakeluler oleh Au@Ag NR berkontribusi pada respons toksik sel granulosa. Kami juga mengadopsi Au@Ag NR sebagai model untuk mempelajari potensi genotoksik in vivo AgNPs dan menunjukkan bahwa klastogenisitas, dan bukan mutagenisitas, adalah bentuk utama genotoksik yang diinduksi oleh shell Ag dan ion Ag+ yang dirilis, sementara tidak ada perbedaan dalam pola toksisitas mereka [21].
Hidup adalah salah satu organ utama yang rentan terhadap akumulasi AgNPs dan dikenal sebagai organ/jaringan target untuk genotoksik yang diinduksi oleh AgNPs. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa sejumlah perak (8,26 ± 3,90 μg/g) dan emas (80,07 ± 64,72 μg/g) tersisa di hati tikus SD delapan minggu setelah pemberian satu dosis Au@Ag NR secara intravena [21]. Dalam penelitian ini, kami mencoba untuk mengidentifikasi peran penghentian siklus sel dan stres oksidatif reaktif pada kerusakan kromosom dan DNA yang diinduksi oleh AgNPs menggunakan Au@Ag NR dalam sel HepaRG yang berasal dari hepatoma manusia. Tes genotoksik, termasuk tes komet, tes γ-H2AX dan tes mikronukleus, dilakukan secara paralel dengan penangkap radikal oksidatif untuk menyelidiki kontribusi spesies oksigen reaktif (ROS) dalam kerusakan DNA/kromosom, sementara apoptosis sel, siklus sel dan protein terkait ditentukan untuk mengeksplorasi mekanisme dengan cara AgNPs mengganggu sintesis dan replikasi DNA. Lebih lanjut, akumulasi dan distribusi intrakeluler Au@Ag NR ditelidiki dengan menggabungkan ICP-MS dan mikroskopi elektron transmisi (TEM) untuk membedakan peran nanopartikel dan ion Ag yang dirilis.
Bahan dan Metode
Kultur sel dan perawatan
Baris sel hepatoma manusia HepaRG (Thermo Fisher Scientific) digunakan dalam penelitian ini. Sel dibudidayakan dalam RPMI 1640 yang mengandung 10% serum fetal sapi (FBS, asal Australia, Gibco) dan 1% larutan penitsin–streptomisin–glutamin (Gibco) dalam atmosfer lembap 5% CO2 pada 37 °C. Sel diobati dengan konsentrasi Au@Ag NR yang bervariasi selama 24 jam atau 72 jam, masing-masing, dan konsentrasi ditentukan berdasarkan IC50 yang diestimasi dengan uji viabilitas sel. Untuk menelidiki peran ROS dalam genotoksik, 1 mM N-Asetil-l-cistein (NAC, Sigma-Aldrich) diterapkan selama 1 jam sebelum perawatan dengan Au@Ag NR.
Uji pertumbuhan/viabilitas sel ATP
Sel ditanam dalam plate 96-lubang dengan kepadatan 5 × 103/lubang. Setelah 24 jam inkubasi, medium disap dan sel diekspos ke berbagai konsentrasi Au@Ag NR selama 24 jam atau 48 jam, masing-masing. Rentang konsentrasi yang luas disiapkan, dan empat lubang per perawatan dilakukan dalam satu periode perawatan. Sitotoksisitas Au@Ag NR diperiksa dengan uji adenosin trifosfat (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega), yang mengukur aktivitas metabolisme sel dengan mengkuantifikasi jumlah ATP, parameter metabolisme penting dalam sel yang hidup. Sinyal luminesens, yang mencerminkan jumlah sel yang hidup, terdeteksi menggunakan VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer), dan nilai IC50 diestimasi sebagai konsentrasi Au@Ag NR untuk setengah viabilitas maksimal dengan Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA). Rasio viabilitas dihitung menggunakan persamaan berikut:
di mana RLU adalah unit cahaya relatif yang diwakili sebagai nilai rata-rata dari empat lubang, RLUvehicle mewakili sel yang tidak diobati nanorod, dan RLUsample mewakili sel yang diobati dengan berbagai konsentrasi Au@Ag NR.
Penentuan konsentrasi perak dan emas dalam sel
Sampel sel dicerna dalam asam nitrat menggunakan sistem pencernaan mikrogelombang. Setelah pencernaan, sampel disiapkan dengan campuran yang mengandung 1% asam nitrat dan asam klorida. Jumlah Ag dan Au dalam larutan ditentukan oleh ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). Analisis TEM digunakan untuk menentukan kehadiran Au NR dan Au@Ag NR dalam sel. Sampel sel diperbaiki dalam campuran 2,5% gluteraldehida dan 2% paraformaldehida selama 2 jam pada 4 °C. Pelet sel diperbaiki dan dicuci tiga kali dalam fosfat buffer (pH 7,4) dan post-diperbaiki dalam 1% oksida osmium selama 2 jam pada 4 °C. Sampel kemudian dicuci dalam air tislat tiga kali dan dikeringkan selama 15 min dalam berbagai konsentrasi etanol (50%, 70%, 90% dan 100% etanol, masing-masing) satu per satu. Selanjutnya, oksida propilena dengan pengenceran 1:1 dan 1:3 diterapkan pada resin pada 20–26 °C selama 2 jam. Polimerisasi dilakukan dengan pemanasan bertahap pada 35 °C selama 16 jam, 45 °C selama 8 jam, 55 °C selama 14 jam dan 65 °C selama 48 jam. Potongan tipis diwarnai selama 25 min dengan asetat uranil dan sitrat timbal dan dianalisis dengan mikroskopi elektron transmisi (H-7650, HITACHI, Jepang).
Tes komet konvensional dan modifikasi
Sel ditanam dalam plate 12-lubang dengan kepadatan 2 × 105/lubang atau 3 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing. Peroksida hidrogen (H2O2) pada konsentrasi 200 μmol diekspos pada sel sebagai kontrol positif selama satu jam. Untuk setiap sampel, dua lubang disiapkan untuk perawatan konvensional dan perawatan formamidopirimina glikosilase (Fpg). Tes komet konvensional dilakukan dalam kondisi alkaline (pH > 13) seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Untuk lubang yang dirawat Fpg, perawatan Fpg tambahan dilakukan sebelum prosedur pelarutan DNA, dan slide direndam dalam buffer enzim (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL−1 BSA) tiga kali selama 5 min setiap. Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) dicairkan 1:50.000 dengan buffer enzim. Aliquot 100 mililiter enzim yang dicairkan ditambahkan ke setiap gel pada slide mikroskop dan diinkubasi dalam ruang lembap pada 37 °C selama 30 min. Langkah yang tersisa sama dengan perawatan konvensional. Tes komet dilakukan tiga kali. Kurangnya 50 sel per sampel secara independen dinilai menggunakan mikroskop fluresens Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokyo, Jepang), sementara Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, Inggris) digunakan untuk menganalisis nilai tengah persentase DNA di ekor dan momen ekor zaitun (OTM) dari setiap sampel.
Kualifikasi fokus γ-H2AX dengan sitometri alir dan pemeriksaan konten tinggi
Untuk kuantifikasi menggunakan sitometri alir, sel ditanam dalam plate 12-lubang dengan kepadatan 2 × 105/lubang atau 3 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing, sementara untuk uji pemeriksaan konten tinggi, sel ditanam dalam plate 96-lubang dengan kepadatan 6 × 103/lubang atau 1 × 104/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing. Sebagai kontrol positif, 2 μM metana metansulfonat (MMS, Sigma-Aldrich) diterapkan secara paralel dengan sel selama satu jam. Sel dicuci dalam tris-buffered saline (TBS) dan diperbaiki dengan 4% paraformaldehida selama 15 min pada suhu kamar. Setelah dicuci dengan TBS, sel diinkubasi dengan 50 μL metanol dingin selama 30 min pada −20 °C. Sel kemudian dicuci lagi dengan TBS tiga kali, dan agen pemblokiran (TBS yang mengandung 0,3% Triton X-100 dan 10% serum kambing) diterapkan selama 1 jam. Antibodi primer (mouse anti-phospho-H2AX Ser139, Millipore) dicairkan 1:200 dengan agen pemblokiran dan diinkubasi dengan sel selama malam hari pada 4 °C. Plate kemudian dicuci lagi dengan TBS tiga kali, dan antibodi sekunder (Alexa Fluor 488 kambing anti-mouse, Life Technologies), dicairkan dengan agen pemblokiran dalam rasio 1:20, ditambahkan selanjutnya. Sampel disimpan dalam gelap pada suhu kamar selama 1 jam, dan 2 μg mL−1 (20 μL/lubang) DAPI (Invitrogen) ditambahkan ke setiap lubang. Fluresensi diukur menggunakan sitometri alir (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, AS) atau Sistem Analisis Konten Tinggi (Operetta CLS, PerkinElmer). Untuk uji sitometri alir, data dari paling sedikit 10.000 sel per grup dianalisis, dan eksperimen dilakukan tiga kali; untuk analisis konten tinggi, 20 bidang visual dalam setiap lubang dan paling sedikit lima lubang dalam setiap grup dianalisis.
CBMN-cyt dilakukan sesuai prosedur yang dijelaskan oleh Fenech et al. [22]. Sel ditanam dalam plate 12-lubang dengan kepadatan 2 × 105/lubang atau 3 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing. 0,2 μg mL−1 Mitomisin C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Jepang) diekspos pada sel sebagai kontrol positif selama 24 jam. 3 μg mL−1 sitokalasin B diterapkan setelah perawatan 24 atau 72 jam untuk memblokir proses sitokinesis, dan sel dipanen setelah 40 jam. Sampel diwarnai dengan 5% Giemsa setelah hipotoni dengan KCl 0,075 mol L−1 yang telah dipanaskan dan fixasi dengan campuran 3:1 metanol dan asam asetat. Tiga lubang per grup disiapkan, dan paling sedikit 1000 sel binukleat per lubang diperiksa.
Pengukuran MDA, total GSH dan isi SOD
Sel dibudidayakan dalam plate 12-lubang dengan kepadatan 5 × 105/lubang atau 3 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing. Selanjutnya, sel dipanen dan dicuci tiga kali dengan fosfat buffer saline (PBS). Jumlah malondialdehida (MDA) dalam homogen sel ditentukan menggunakan metode berbasis asam tiobarbiturat (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, Cina). Jumlah total glutation (GSH) dan superoksida dismutase (SOD) ditentukan menggunakan kit kuantifikasi total glution dan uji SOD (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Jepang), masing-masing. Kepadatan optik (O.D) dari setiap lubang diukur menggunakan VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer).
Analisis sitometri alir untuk siklus sel
Sel dibudidayakan dalam plate 6-lubang dengan kepadatan 1 × 106/lubang atau 5 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing, dan kemudian diperbaiki dengan 70% etanol pada 4 °C selama malam hari. Sampel dicuci dengan PBS tiga kali dan diwarnai dengan buffer pewarnaan PI/Rnase (BD Biosciences) selama 15 min pada suhu kamar. Populasi sel di bawah fase G0/G1, S dan G2/M dari 20.000 sel ditentukan dengan menggunakan daerah FL2 area versus FL2 width. Analisis dilakukan oleh sitometri alir (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, AS) dan FlowJo (BD Bioscience), dan eksperimen dilakukan tiga kali.
Analisis sitometri alir apoptosis sel
Sel dibudidayakan dalam plate 6-lubang dengan kepadatan 1 × 106/lubang atau 5 × 105/lubang untuk perawatan 24 atau 72 jam, masing-masing. Mereka kemudian dicuci dua kali dengan PBS dan dicairkan dengan 500 μL 1 × buffer binding (Kit Deteksi Apoptosis FITC Annexin V I, BD Bioscience) untuk menyesuaikan suspensi menjadi sekitar 1 × 106 sel/mL, dan kemudian 100 μL pengenceran dicampur dengan 5 µL FITC Annexin V dan 5 µL PI. Sampel diwarnai pada suhu kamar selama 15 min, dan paling sedikit 10.000 sel dianalisis untuk menentukan populasi sel di bawah apoptosis awal dan akhir dengan menggunakan daerah FL1H versus FL2H menggunakan sitometri alir (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, AS) dan FlowJo (BD Bioscience). Eksperimen dilakukan tiga kali.
Analisis Western blot
Sel dibudidayakan dalam kolong 75-cm2 dengan kepadatan 1 × 107/lubang dan 6 × 106/lubang untuk perawatan 24 dan 72 jam, masing-masing. Sel dilisis dengan buffer lisis RIPA yang mengandung inhibi protease (PMSF), dan konsentrasi protein ditentukan menggunakan kit kuantifikasi protein BCA (Beyotime Biotechnology, Cina). Konsentrasi sampel disesuaikan menggunakan buffer lisis RIPA sebelum denaturasi dengan memanaskan pada 95 °C selama 3 min. Sampel protein dipisahkan oleh elektroforesis pada gel poliakrilamida SDS 12% dan ditransfer ke membran nitroselulosa (Millipore). Membran diblokir dengan 5% susu skim selama 30 min dan diinkubasi dengan antibodi primer p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) dan β-actin (sc-47778, Santa Cruz) dan antibodi sekunder kambing anti-mouse IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio), masing-masing. Level ekspresi protein target dalam sampel divisualisasikan menggunakan metode kemiluminesens yang ditingkatkan (ECL) dan dianalisis oleh sistem ImageJ (National Institutes of Health).
Analisis statistik
Data disajikan sebagai rata-rata ± SEM. Analisis variansi satu arah (ANOVA) digunakan untuk menguji signifikansi statistik perbedaan antara kontrol negatif dan grup yang diobati, diikuti oleh uji perbandingan berganda Dunnett menggunakan SPSS (versi 22, IBM, Armonk, NY, AS), dan data dianggap signifikan secara statistik pada P < 0,05. Gambar disiapkan menggunakan GraphPad Prism 7 untuk Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, AS).
Hasil
Karakterisasi Au NR dan Au@Ag NR
Nanorod emas (Au NRs), core nanorod emas dan nanostruktur shell perak (Au@Ag NR) direkayasa, disiapkan dan dikarakterisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Secara singkat, diameter dan panjang rata-rata adalah 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm untuk Au NRs dan 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm untuk Au@Ag NRs. Ketebalan shell Ag sekitar 5 nm. Potensi zeta PDDAC-coated Au NRs dan Au@Ag NR yang terdisersi dalam air adalah 37,7 ± 1,6 mV dan 52,5 ± 1,4 mV, masing-masing. Rasio berat Ag/Au dari Au@Ag NR yang disiapkan diperkirakan sebesar 2,3. Hasil karakterisasi ditunjukkan dalam Gambar 1.
Karakterisasi Au NR dan Au@Ag NR. a Diagram struktural Au NR dan Au@Ag NR; b Spektrum eliminasi UV–Vis–NIR Au NR dan Au@Ag NR yang terdisersi dalam air; c Gambar TEM representatif Au NR; d Gambar TEM representatif Au @Ag NR
Viabilitas sel
Sitotoksisitas Au@Ag NR terhadap sel HepaRG ditelidiki dengan uji viabilitas ATP (Tabel 1), dan sel diekspos ke Au@Ag NR selama 24 atau 48 jam pada konsentrasi yang bervariasi dari 0,125 hingga 160 μg mL−1. Au@Ag NR menyebabkan efek sitotoksik yang signifikan secara bergantung pada waktu dan dosis setelah paparan 24 dan 48 jam, dengan % viabilitas IC50 pada 20 µg mL−1 dan 6 µg mL−1, masing-masing, yang di-fit oleh perangkat lunak GraphPad Prism 7.0. Mempertimbangkan sitotoksisitas secara keseluruhan, periode perawatan disesuaikan menjadi 24 jam dan 72 jam, sementara konsentrasi yang diterapkan ditetapkan pada 0,8 µg mL−1, 4 µg mL−1 dan 20 µg mL−1. Selain itu, Au NR disertakan sebagai kontrol iners, dan konten Au dalam grup AuNR sama dengan 20 µg mL−1 Au@Ag NR, yaitu 16 µg mL−1. Sebaliknya, 1 mM praprawatan NAC diadopsi dalam grup Au@Ag NR + NAC sebagai kontrol respons stres oksidatif (konsentrasi Au@Ag NR adalah 20 µg mL−1).
Distribusi sel Au NR dan Au@Ag NR
Distribusi konten Au dan Ag dalam sel HepaRG dianalisis oleh ICP-MS. Seperti yang ditunjukkan dalam Tabel 2 dan 3, konten Ag meningkat secara bergantung pada dosis. Namun, antioksidan N-Asetil-l-cistein (NAC) sebagai penangkap radikal bebas dapat membatasi penyerapan sel nanopartikel, karena konten Ag yang lebih rendah diamati meskipun konsentrasi Au@Ag NR yang sama (20 µg mL−1) diterapkan dalam grup ini. Penurunan rasio Ag/Au dari 24 hingga 72 jam menunjukkan rilis Ag+ yang berkelanjutan dari shell Au@Ag NR. Selain itu, penyerapan sel Ag jauh lebih banyak daripada Au (Tabel 4). Selain itu, data TEM menunjukkan bahwa sebagian besar Au NR dan Au@Ag NR tersimpan dalam sel sebagai aglomerat. Struktur nanorod terlihat jelas di dalam sel yang diekspos kepada Au NR atau Au@Ag NR tanpa masuk ke dalam inti sel (Gambar 2).
Internalisasi Au NR dan Au@Ag NR: HepaRG oleh TEM pada 80 kV setelah 24 jam paparan kepada 16 μg mL−1 Au NR dan 20 μg mL−1 Au@Ag NR. a Kontrol kendaraan; b Au NR; c Au@Ag NR
Kerusakan DNA
Kerusakan DNA yang dipicu oleh Au@Ag NR dievaluasi dengan baik tes komet dan tes γH2AX (Gambar 3). Terlihat dari tes komet bahwa 0,8 hingga 20 µg mL−1 Au@Ag NR dapat menyebabkan kerusakan DNA yang signifikan. Setelah paparan 24 atau 72 jam kepada Au@Ag NR, baik % DNA ekor maupun OTM sel meningkat secara bergantung pada waktu dan konsentrasi. Selain itu, kerusakan DNA yang terkait dengan indiksi stres oksidatif diamati dalam sel yang diobati dengan 20 µg mL−1 Au@Ag NR oleh tes komet modifikasi enzim Fgp (Gambar 3a, b). Untuk mengevaluasi tingkat patah rantai ganda yang memiliki korelasi yang lebih tinggi dengan genesa kanker, baik sel positif γ-H2AX maupun intensitas fluresensi rata-rata dalam sel positif γ-H2AX dianalisis. Setelah paparan 24 jam kepada Au@Ag NR, tidak ada perbedaan yang ditemukan di antara grup dalam sel positif γ-H2AX. Namun, grup 4 μg mL−1 Au@Ag NR menyebabkan peningkatan yang signifikan setelah perawatan 72 jam. Peningkatan yang signifikan dalam intensitas fluresensi diamati dalam semua grup Au@Ag NR setelah 72 jam dibandingkan kontrol kendaraan (Gambar 3c–e, P < 0,05).
Kerusakan DNA yang diinduksi oleh Au@Ag NR. Sel HepaGR diexpos ke Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda (0,8 hingga 20 μg mL−1) selama 24 jam dan 72 jam, masing-masing. a Rata-rata % DNA ekor setelah diexpos kepada Au@Ag NR selama 24 jam; b rata-rata % DNA ekor setelah diexpos kepada Au@Ag NR selama 72 jam; c persentase sel positif dengan fokus γ-H2AX yang diestimasi menggunakan sitometri alir; d intensitas fluresensi rata-rata dalam sel dengan fokus γ-H2AX yang diestimasi menggunakan pewarnaan imunofluresens.*P < 0,05 versus kontrol kendaraan; aP < 0,05 versus Au NR. 2 μM mL−1 MMS digunakan sebagai kontrol positif
Kerusakan kromosom
Pembentukan mikronukleus adalah biomarker signifikan untuk mengidentifikasi kerusakan kromosom, yang merupakan kerusakan yang lebih kritis pada materi genetik daripada patahnya DNA. Rasio sel binukleat yang mengandung mikronukleus dinilai seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4c. Au@Ag NR meningkatkan pembentukan mikronukleus dalam pola bergantung pada konsentrasi. Setelah paparan 24 jam, rasio mikronukleus yang diamati dalam sel yang diobati dengan 4 μg mL−1 Au@Ag NR dan 20 μg mL−1 Au@Ag NR adalah 1,133 ± 0,145% dan 1,567 ± 0,318%, masing-masing, keduanya signifikan lebih tinggi dari pada grup kontrol kendaraan. Setelah paparan 72 jam, rasio mikronukleus dalam sel yang diobati dengan 4 μg mL−1 Au@Ag NR adalah 1,767 ± 0,233%, yang signifikan lebih tinggi dari pada grup kontrol kendaraan; rasio mikronukleus dalam sel yang diobati dengan 20 μg mL−1 Au@Ag NR adalah 2,167 ± 0,252%, yang signifikan lebih tinggi dari pada yang diamati dalam grup kontrol kendaraan dan grup 16 μg mL−1 Au NR (0,700 ± 0,153%). Sebaliknya, tidak ada perbedaan yang ditemukan antara sel yang diobati dengan 20 μg mL−1 Au@Ag NR + NAC dan kontrol kendaraan, yang menunjukkan partisipasi ROS dalam patah kromosom yang diinduksi oleh Au@Ag NR.
Kerusakan kromosom yang diinduksi oleh Au@Ag NR. Sel HepaGR diexpos ke Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda dari 0,8 μg mL−1 hingga 20 μg mL−1 selama 24 jam dan 72 jam. a, b Gambar representatif mikronukleus (panah merah); c frekuensi mikronukleus (%). *P < 0,05 versus kontrol kendaraan; aP < 0,05 versus Au NR. 0,2 μg mL−1 mitomisin C digunakan sebagai kontrol positif
Efek Au@Ag NR terhadap pembentukan ROS
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran pembentukan ROS dalam kerusakan DNA dan kromosom yang diinduksi oleh Au@Ag NR, level MDA, GSH dan SOD diperkirakan. Peningkatan yang signifikan dalam pembentukan MDA (P < 0,05) diamati setelah paparan 20 μg mL−1 Au@Ag NR untuk 24 dan 72 jam (Gambar 5a). Lebih lanjut, level GSH dan SOD dalam sel yang diexpos kepada Au@Ag NR menunjukkan penurunan yang signifikan (P < 0,05) secara bergantung pada waktu dan konsentrasi. Hasil ini menunjukkan ketidakseimbangan antara oksidasi dan antioksidasi yang dihasilkan oleh paparan Au@Ag NR (Gambar 5b, c).
Efek Au@Ag NR terhadap pembentukan ROS. Sel HepaGR diexpos kepada Au@Ag NR pada konsentrasi yang berbeda dari 0,8 μg mL−1 hingga 20 μg mL−1 selama 24 jam dan 72 jam. a Level MDA; b Level GSH; c Level SOD. *P < 0,05 versus kontrol kendaraan; aP < 0,05 versus Au NR
Efek Au@Ag NR terhadap siklus sel dan apoptosis
Setelah paparan 72 jam kepada Au@Ag NR, peningkatan jumlah sel dalam fase G2/M diamati pada 4 μg mL−1 Au@Ag NR, 20 μg mL−1 Au@Ag NR dan grup Au@Ag NR + NAC, dengan proporsi 32,63% ± 1,77%, 32,267% ± 2,17% dan 32,967% ± 4,25%, masing-masing (Gambar 6a, b), yang signifikan lebih tinggi dari pada kontrol kendaraan (22,37% ± 0,92%). Sementara itu, apoptosis sel yang diinduksi oleh Au@Ag NR dapat diamati setelah paparan 72 jam, dan tingkat apoptosis akhir sel yang diobati dengan 20 μg mL−1 Au@Ag NR dan 20 μg mL−1 Au@Ag NR + NAC adalah 78,90 ± 1,19% dan 70,20 ± 4,50%, masing-masing (Gambar 6c, d). Au@Ag NR menyebabkan lebih banyak apoptosis akhir daripada apoptosis awal, dan perawatan NAC dapat mengurangi tingkat apoptosis akhir yang dipicu oleh Au@Ag NR.
Efek Au@Ag NR terhadap siklus sel dan apoptosis. Efek Au@Ag NR terhadap siklus sel (a, b) dan apoptosis (c, d) setelah diexpos selama 24 jam dan 72 jam, masing-masing; data representatif dari level ekspresi p53 dan p21 dalam sel HepaRG dari berbagai grup (e, f Lane 1: kontrol kendaraan; Lane 2: Au NR; Lane 3: Au@Ag NR + NAC; Lane 4: Au@Ag NR 20 μg mL−1; Lane 5: Au@Ag NR 4 μg mL−1; Lane 6: Au@Ag NR 0,8 μg mL−1); level ekspresi relatif rata-rata p53 dan p21 terhadap β-actin dalam berbagai grup diringkas dalam (g, f).*P < 0,05 versus kontrol kendaraan; aP < 0,05 versus Au NR
Level ekspresi p21 dan p53 terdeteksi dengan Western blot, dan pola yang sama diamati. Level ekspresi p53 dan p21 dalam sel yang diobati dengan 4 μg mL−1 dan 20 μg mL−1 Au@Ag NR secara signifikan meningkat (P < 0,05) dan secara signifikan menurun dalam sel yang diobati dengan baik 20 μg mL−1 Au@Ag NR dan NAC (P < 0,05, dibandingkan grup 20 μg mL−1 Au@Ag NR, Gambar 6e–h). Diketahui bahwa protein p53 adalah molekul inti yang memediasi aktivasi titik kontrol G2/M sebagai respons terhadap kerusakan DNA, dan p21 dikenal sebagai inhibitor siklus sel yang bergantung pada p53. Dengan demikian, Au@Ag NR dapat mengganggu replikasi DNA dan menghambat perbaikan DNA oleh sel melalui penghentian siklus sel.
Pembahasan
Saat ini, peran Ag+ yang dirilis dan AgNPs dalam menghasilkan genotoksik masih belum jelas. Studi sebelumnya dari kelompok kami [21] dan lainnya [13] telah menunjukkan bahwa sementara Ag+ adalah sumber utama untuk memperkenalkan toksisitas, nanopartikel juga dapat sangat toksik. Misalnya, AgNPs dapat berkontribusi pada genotoksik dengan menginduksi pembentukan radikal hidroksil [13]. Lebih lanjut, kerusakan kromosom yang lebih parah, stres oksidatif dan apoptosis diperkenalkan oleh AgNPs dibandingkan Ag+ saja [23], yang menunjukkan bahwa berbagai jalur mungkin terlibat. Kami menggunakan Au@Ag NR sebagai bahan model untuk memahami bentuk dan distribusi AgNPs dalam sel, dan jumlah Ag dan Au intrakeluler ditentukan oleh ICP-MS. Rasio berat Ag/Au dari Au@Ag NR yang disiapkan diperkirakan sebesar 2,3. Namun, setelah paparan 24 jam, rasio ini meningkat tajam menjadi 16,5 dalam sel yang diobati dengan Au@Ag NR, yang menunjukkan bahwa sejumlah besar Ag dirilis dari shell Au@Ag NR dalam periode tersebut. Ketika periode paparan Au@Ag NR diperpanjang menjadi 72 jam, rasio berat Au/Au menurun menjadi 1,7, yang menunjukkan bahwa Ag+ dirilis dari sel dan nanorod adalah bentuk utama Au@Ag NR dalam sel pada tahap itu. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa saat Au@Ag NR masuk ke sel, Ag+ dengan cepat terlarut dari shell-nya dalam 24 jam dan secara bertahap dirilis ke lingkungan ekstraseluler, sementara Au@Ag NR itu sendiri tetap tersimpan dalam sel untuk periode yang lebih lama.
Stres oksidatif dianggap sebagai salah satu mekanisme toksikologis paling penting dari nanopartikel [24]. Asetil-sistein N (NAC) adalah tioil, agen pelarut dan prekursor l-sistein yang mengurangi glutation. NAC juga merupakan sumber grup sulfhidril dalam sel dan menyela aktivitas penangkap ROS dengan berinteraksi dengan OH· dan H2O2[25]. Dalam penelitian ini, level GSH dan SOD secara signifikan menurun setelah paparan Au@Ag NR, sementara level MDA meningkat secara bergantung pada konsentrasi dan waktu, yang menunjukkan bahwa Au@Ag NR memperkenalkan stres oksidatif dalam sel.
Potensi Ag dan Au@Ag NR dalam mengganggu materi genetik ditelidiki lebih lanjut dengan serangkaian tes genotoksik. Layak untuk diperhatikan bahwa pembudayaan NAC bersama dengan Au@Ag NR dapat mengurangi pembentukan ROS, yang sebaliknya mendukung partisipasi stres oksidatif dalam genotoksik yang dipicu oleh Au@Ag NR. Dalam penelitian ini, tes komet dan γ-H2AX dilakukan untuk mengonfirmasi bahwa Au@Ag NR dapat berinteraksi dengan DNA dan menyebabkan beberapa kerusakan DNA, dan enzim perbaikan endonuklease Fpg disertakan dalam tes komet untuk mengidentifikasi kerusakan DNA oksidatif [26]. Fgp dapat mengenali pirimidin yang teroksidasi dan menghapus purin yang teroksidasi, misalnya, 8-hidroguanin, sehingga menciptakan situs apurinik atau apirimidinik yang dapat memperkenalkan celah pada rantai DNA. Patah rantai DNA yang diinduksi oleh stres oksidatif dapat ditentukan kemudian oleh tes komet lainnya [27]. Patah rantai DNA yang lebih lanjut yang terdeteksi oleh Fpg tambahan dalam tes komet menunjukkan bahwa Au@Ag NR dapat menyebabkan kerusakan DNA. Mei et al. [28] mengamati bahwa AgNPs berukuran 5 nm menyebabkan kerusakan DNA spesifik leksi oksidatif dengan menggunakan endonuklease hOGG1, EndoIII dan Fpg dalam tes komet. Li et al. [29] juga menyarankan bahwa baik AgNPs yang dilapisi PVP maupun silica (15–100 nm dan 10–80 nm, masing-masing) dapat menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam patah rantai DNA dalam hepatosit tikus dalam kehadiran hOGG1 dan EndoIII. Pembentukan fokus γ-H2AX, yang merupakan respon sel awal terhadap stres genotoksik, adalah biomarker yang paling sensitif dan spesifik untuk mendeteksi patah rantai ganda (DSBs) [30]. Seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini, fokus γ-H2AX dalam sel yang diexpos kepada Au@Ag NR secara signifikan meningkat setelah 24 jam, dan peningkatan lebih lanjut dapat diamati setelah 72 jam. Penurunan dalam grup 20 µg mL−1 mungkin disebabkan oleh sitotoksisitas terhadap sel HepaRG pada konsentrasi yang lebih tinggi. Hasil serupa diamati untuk AgNPs dengan lapisan yang berbeda [31, 32]. Lebih lanjut, hasil kami menunjukkan bahwa Au@Ag NR dapat menyebabkan kerusakan kromosom dalam sel HepaRG, karena tingkat mikronukleus secara signifikan meningkat. Ini konsisten dengan studi sebelumnya, di mana peningkatan tingkat mikronukleus yang diinduksi oleh AgNPs dilaporkan dalam sel HaCaT dan TK6 [33]. Sebaliknya, penambahan penangkap radikal oksidatif NAC dapat menghambat pembentukan mikronukleus yang diinduksi oleh Au@Ag NR. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan partisipasi stres oksidatif dalam risiko klastogenisitas AgNPs in vitro.
Studi sebelumnya telah menyelidiki penghentian siklus sel dan sitotoksisitas yang diinduksi oleh AgNPs [33,34,35]. Seiring dengan perpanjangan waktu paparan, dampak AgNPs terhadap siklus sel dan apoptosis mungkin ditingkatkan dan sebaliknya membebani sitotoksisitas dan genotoksik. Biasanya, titik kontrol siklus sel (misalnya, G2/M) diinisiasi oleh sel saat mengalami kerusakan DNA, dan mekanisme ini bertujuan untuk mencegah sel memasuki mitosis (fase M). Penghentian siklus sel G2/M menunjukkan bahwa persentase sel yang meningkat terhambat dalam fase G2 untuk perbaikan DNA. Sel yang mengalami perbaikan DNA yang berhasil akan melanjutkan ke mitosis; namun, bagi mereka dengan cedera fatal, penghentian siklus sel G2/M yang tidak dapat diubah dan apoptosis sel akan terjadi [36]. Kami mengamati bahwa Au@Ag NR dapat menghentikan sebagian besar sel HepaRG dalam fase G2/M, menginduksi apoptosis sel akhir dan meningkatkan level ekspresi p53 dan p21, yang merupakan protein penting yang terkait dengan regulasi siklus sel [37]. Karena p53 juga dapat menginduksi apoptosis, ketika DNA tidak dapat diperbaiki dengan baik [38], p21 mungkin secara tidak langsung berpartisipasi dalam apoptosis sel melalui penghentian siklus sel dalam jalur yang bergantung pada p53 dengan menurunkan regulasi protein nuklir ICBP90 untuk replikasi DNA dan regulasi siklus sel [39]. Lebih lanjut, apoptosis dan penghentian G2/M yang diinduksi oleh aktivasi sistem p53/p21 telah dilaporkan dalam sel HepG2 setelah pemberian ekstrak bawang putih [40]. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa kerusakan DNA/kromosom yang dipicu oleh stres oksidatif dapat memfasilitasi ekspresi p53 dan p21, yang kemudian menginduksi penghentian siklus sel. Memperpanjang periode paparan Au@Ag NRs terhadap DNA/kromosom selama replikasi dapat lebih membebani genotoksik atau apoptosis.
Kesimpulan
Genotoksik yang diinduksi oleh AgNPs dapat diatribusikan pada stres oksidatif yang diinduksi oleh nanopartikel serta ion yang dirilis [41]. Penelitian ini menggunakan Au@Ag NR sebagai model untuk menentukan distribusi dan perilaku rilis Ag setelah nanopartikel masuk ke dalam sel. Mempertimbangkan bentuk yang berbeda dari Au@Ag NR dalam sel, setelah paparan Ag+ dengan cepat terlarut dari shell perak. Ag+ dan Au@Ag NR dapat memperkenalkan sitotoksisitas dan genotoksik (klastogenisitas) dalam sel, dan Au@Ag NR yang tersimpan dalam inti sel dapat lebih lanjut melepaskan Ag+ untuk membebani kerusakan, yang terutama disebabkan oleh penghentian siklus sel dan pembentukan ROS (diringkas dalam Gambar 7). Secara kolektif, data ini mengungkapkan korelasi antara akumulasi intrakeluler, rilis Ag+ serta potensi genotoksik AgNPs.
Diagram skematis dari mekanisme yang mungkin dari genotoksik yang diperkenalkan oleh AgNP in vitro
