Agen Kontras Baru Berbasis Nanopartikel Magnetik untuk Deteksi Kolesterol sebagai Biomarker Penyakit Alzheimer
Abstrak
Latar Belakang
Mempertimbangkan tingginya insiden penyakit Alzheimer di antara populasi dunia selama bertahun-tahun, dan biaya yang ditimbulkan penyakit ini dalam hal sanitasi dan sosial ke negara-negara, perlu untuk mengembangkan tes diagnostik non-invasif yang memungkinkan untuk mendeteksi biomarker awal penyakit. Dalam metode diagnosis dini, pengembangan agen kontras untuk pencitraan resonansi magnetik menjadi sangat berguna.
Mengumpulkan bukti menunjukkan bahwa kolesterol mungkin memainkan peran dalam patogenesis penyakit Alzheimer karena deposit kolesterol abnormal di sekitar plak pikun telah dijelaskan pada model transgenik hewan dan pasien dengan penyakit Alzheimer. Eksperimen in vivo juga menunjukkan bahwa hiperkolesterolemia akibat diet meningkatkan akumulasi protein -amiloid intraneuronal disertai dengan mikrogliosis dan mempercepat deposisi -amiloid di otak.
Penyajian Hipotesis
Dalam penelitian ini, kami mengusulkan untuk pertama kalinya sintesis nanokonjugat baru yang terdiri dari nanopartikel magnetik yang terikat pada antibodi anti-kolesterol, untuk mendeteksi simpanan kolesterol abnormal yang diamati pada plak pikun pada penyakit Alzheimer dengan pencitraan resonansi magnetik. Nanoplatform juga dapat mengungkapkan penurunan kolesterol yang diamati pada membran plasma saraf yang terkait dengan patologi ini.
Menguji Hipotesis
Desain eksperimental untuk menguji hipotesis akan dilakukan terlebih dahulu secara in vitro kemudian studi in ex vivo dan in vivo pada tahap kedua.
Implikasi Hipotesis
Oleh karena itu, nanoplatform yang dirancang dapat mendeteksi deposit kolesterol di tingkat otak. Deteksi biomarker ini di area yang bertepatan dengan akumulasi plak senilis dapat memberikan informasi awal tentang awitan dan perkembangan penyakit Alzheimer.
Latar Belakang
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa keberadaan kolesterol (CHO) dalam jumlah yang tepat dalam membran plasma neuron memainkan peran kunci dalam melindungi sel-sel saraf terhadap toksisitas protein -amyloid pada penyakit Alzheimer (AD) menangkal produksi berlebihan protein ini. [1,2,3]; neuron yang diperkaya CHO lebih tahan terhadap stres oksidatif dan toksisitas protein -amiloid [4, 5].
Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa jumlah CHO yang ada di membran plasma neuron, dan tidak hanya kadar plasmanya, dapat berperan dalam patogenesis penyakit neurodegeneratif [6]. Faktanya, data eksperimental mendukung gagasan bahwa jumlah optimal CHO dalam membran sel diperlukan untuk menciptakan penghalang pelindung terhadap agen beracun. Penurunan jumlah CHO seluler dalam membran plasma mengubah penghalang pelindung ini, mengurangi perlindungan terhadap agen toksik, termasuk protein -amiloid [7]. Menariknya, neuron di korteks serebral tikus AD transgenik mengandung lebih sedikit CHO dalam membran plasma dibandingkan dengan tikus tipe liar [8].
Mori dkk. [9] menunjukkan bahwa baik pada manusia dan tikus protein prekursor amiloid transgenik (APP), CHO secara abnormal terakumulasi dalam plak amiloid matang tetapi tidak dalam plak difus atau belum matang, menunjukkan bahwa CHO dapat berperan dalam pembentukan dan perkembangan plak pikun. Studi selanjutnya lainnya menemukan bahwa CHO dan apolipoprotein E hadir di inti plak fibrilar, tetapi tidak pada plak difus pada tahap awal. Pada stadium penyakit yang lebih lanjut, jumlah plak fibrilar yang lebih tinggi yang imunopositif untuk kolesterol oksidase dijelaskan [10]. Jumlah CHO bebas per plak pikun, ditentukan oleh spektrometri massa, mirip dengan beban protein -amiloid [8]. Peningkatan bersama dalam konsentrasi CHO dan plak senilis di AD bisa menyarankan mekanisme patogen baru penyakit [11]. Selain itu, pada jaringan otak pasien AD, deposit lipid yang terlokalisasi bersama dengan plak senilis fibrilar telah dijelaskan menggunakan hamburan anti-Stokes Raman dan mikroskop fluoresensi 2-foton dalam sampel yang diwarnai Thioflavin-S [10]. Dua morfologi lipid dapat diamati:struktur pipih dan penggabungan makro-agregat ukuran sub-mikron. Karena komposisi/organisasi lipid bervariasi di seluruh plak, ada bukti jelas tentang interaksi amiloid-lipid yang erat pada plak pikun fibrilar, menjadikannya komposisi yang lebih dinamis daripada yang diperkirakan sebelumnya [12].
Selanjutnya, untuk mendeteksi biomarker DA pada tahap awal penyakit, beberapa penelitian telah mengusulkan penggunaan nanopartikel oksida besi magnetik fungsional (MNPs) sebagai agen kontras spesifik untuk pencitraan resonansi magnetik (MRI) untuk plak senilis [13,14, 15] dan deteksi protein feritin [16]. Efek hypointense yang ditunjukkan oleh partikel-partikel ini dalam urutan pembobotan T2 dan T2* memberikan kontras yang lebih besar pada gambar MRI. Oleh karena itu, penggunaan MNPs sebagai agen kontras untuk MRI adalah metode yang menjanjikan untuk diagnosis dini AD.
Karya ini menyajikan hipotesis penggunaan kontras baru berdasarkan MNP biofungsional, untuk deteksi oleh MRI akumulasi abnormal CHO dalam plak senilis, yang dapat digunakan sebagai biomarker potensial AD.
Karya ini menyajikan untuk pertama kalinya, sejauh pengetahuan kami, desain agen kontras baru berdasarkan MNP biofungsional untuk deteksi oleh MRI akumulasi abnormal CHO dalam plak senilis, yang dapat digunakan sebagai biomarker potensial AD .
Hipotesis
Karena tingginya insiden DA di antara populasi dunia selama bertahun-tahun [17], dan biaya terkait patologi dalam istilah kesehatan dan sosial untuk negara-negara [17], sangat mendesak untuk mengembangkan alat noninvasif yang memungkinkan deteksi biomarker dini untuk diagnosis dan evolusi penyakit.
Dalam metode diagnosis awal, pengembangan agen kontras untuk pencitraan molekuler (MI) menjadi sangat berguna. MI menggabungkan teknologi pencitraan konvensional dengan probe molekuler, yang dirancang untuk mendeteksi aspek biokimia dan biologi sel yang mendasari perkembangan penyakit dan respons pengobatan [18,19,20].
Kami mengusulkan sintesis zat kontras berdasarkan MNP yang dilapisi dengan polietilen glikol (PEG) dan difungsikan dengan streptavidin (Gbr. 1a) untuk memungkinkan penautan terarah antibodi terbiotinilasi yang secara khusus mengenali CHO yang ada dalam plak pikun (NANOCHOAD) ( Gambar 1b). Antibodi juga akan mengenali CHO yang ada di membran plasma seluler sehingga mendeteksi penurunan CHO di membran plasma neuron. MNP akan dilapisi dengan rantai PEG untuk meningkatkan stabilitas koloid nanoplatform, memfasilitasi dispersinya dalam aliran darah dan melewati sawar darah-otak (BBB) [21].
Diagram skema dari nanoplatform yang dirancang dan mekanisme aksinya. a struktur MNP, dan fungsionalisasi dengan antibodi anti-CHO (NANOCHOAD), b strategi penetrasi nanoplatform melalui BBB, c Mekanisme persilangan melalui BBB dari NANOCHOAD. d nanoconjugate anti-CHO-MNP menargetkan deposit CHO pada plak amiloid
BBB merupakan salah satu hambatan biologis paling eksklusif yang dihadapi dalam pengobatan dan diagnosis penyakit neurologis, membatasi akses sebagian besar agen diagnostik dan terapeutik ke otak melalui rute sistemik [22, 23]. Oleh karena itu, tantangan dalam diagnosis dan pengobatan sejumlah besar gangguan otak adalah mengatasi kesulitan memberikan agen terapeutik dan kontras melalui BBB untuk menargetkan wilayah konkret otak. Untungnya, sel-sel endotel kapiler otak menunjukkan beberapa mekanisme transpor yang diperantarai reseptor spesifik. Telah didokumentasikan bahwa sejumlah besar reseptor transferin diekspresikan oleh sel-sel endotel kapiler otak, yang terlibat dalam transcytosis yang dimediasi reseptor melalui BBB [24].
Oleh karena itu, untuk memecahkan masalah melewatkan agen kontras melalui BBB, kami mengusulkan tiga strategi alternatif:(i) untuk mengkonjugasi anti-CHO-MNPs dengan transferin [25], yang memungkinkannya melewati BBB; (ii) pemberian konjugat anti-CHO-MNPs intranasal. Rute intranasal, yang non-invasif dan melewati BBB, adalah rute alternatif untuk memberikan nanoconjugates ke otak [26, 27]; dan (iii) penerapan medan magnet eksternal untuk memfasilitasi nanokonjugat melintasi BBB (Gbr. 2c). Teknik pengiriman baru ini dapat memberikan dosis yang relevan secara klinis ke otak (daerah penciuman, korteks, hipokampus...) melalui BBB [28,29,30] (Gbr. 1c). Selanjutnya, perjalanan nanokonjugat melalui BBB juga akan disukai oleh penggunaan MNP berlapis PEG dan kerusakan BBB karena patologi itu sendiri. Nanokonjugat secara khusus akan mengenali deposit abnormal CHO pada plak pikun, melalui afinitas antigen-antibodi (Gbr. 1c, d). Akumulasi nanopartikel dalam struktur patologis di parenkim otak sebagai plak senilis akan menunjukkan perubahan lokalisasi CHO di parenkim otak AD. Oleh karena itu, kehadiran anti-CHO-MNPs yang terkait dengan plak pikun akan menunjukkan sinyal hipointens pada MRI berbobot T2*, memungkinkan deteksi CHO terkait dengan ciri khas AD lainnya, seperti plak senilis, dan dengan demikian pencitraan MR CHO otak bisa menjadi biomarker baru penyakit ini. Selain itu, perubahan MRI karena penurunan membran plasma CHO diharapkan.
Desain eksperimental untuk menguji hipotesis. Pertama, in vitro (a ):penentuan biokompatibilitas nanokonjugat yang disintesis. Uji ex vivo (b ):menguji spesifisitas nanokonjugat anti-CHO-MNPs dengan inkubasi nanoplatform pada irisan otak tetap dari tikus transgenik 5XFAD. Studi in vivo (c ):nanoplatform akan disuntikkan secara intravena atau melalui rute alternatif sebagai pengiriman intranasal/aplikasi medan magnet eksternal, dan efektivitasnya (penargetan) akan dievaluasi oleh MRI
Pembersihan zat kontras dari parenkim otak dapat dicapai dengan internalisasi MNPs oleh sel mikroglial dan pemrosesan lisosomal berikutnya, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian sebelumnya [16, 31, 32]. MNP akan dieliminasi melalui jalur umum yang digunakan untuk metabolisme besi endogen. Namun demikian, jalur eliminasi zat kontras, berdasarkan ukuran dan muatan permukaannya, dan potensi toksisitasnya akan ditentukan selama pengembangan hipotesis yang diajukan, seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Menguji Hipotesis
Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel Magnetik
Sintesis nanopartikel oksida besi akan dilakukan dengan metode kopresipitasi terkontrol, yaitu dengan mencampurkan ion besi (Fe2+) dan ion besi (Fe3+) dalam larutan basa mengikuti kerja dari Predescu et al. [33]. MNP akan dilapisi dengan cangkang PEG mengikuti protokol yang sebelumnya dibuat oleh Liu et al. [34].
Struktur, morfologi, dan magnet dari nanopartikel besi yang dilapisi dengan PEG akan diselidiki menggunakan difraksi sinar-X (XRD), pemindaian mikroskop elektron (SEM), mikroskop elektron transmisi (TEM), spektroskopi inframerah Fourier-transform (FTIR), dan magnetometri perangkat interferensi kuantum superkonduktor (SQUID).
Setelah dilakukan karakterisasi bahan nano magnetik hasil sintesis, selanjutnya akan difungsionalisasikan dengan (1) protein streptavidin dengan metode NHS/EDC. Setelah ini, ia akan digabungkan dengan antibodi anti-CHO terbiotinilasi dan (2) protein transferin. Konjugasi transferin akan dilakukan dengan menggabungkan gugus karboksilat yang ada pada permukaan ligan dan gugus hidroksil yang ada pada lapisan PEG [35].
Pengujian In Vitro
Pada langkah pertama, biokompatibilitas nanoplatform akan diuji secara in vitro (Gbr. 2a). Nanoconjugate akan ditambahkan ke co-kultur neuron dan astrosit dan kultur sel endotel [36] untuk menentukan kompatibilitas nanoconjugate dengan sel-sel otak yang khas. Jika sitokompatibilitas MNP yang difungsikan benar, efektivitas sistem akan diuji dalam model penyakit ex vivo (Gbr. 2b). Model yang dipilih adalah tikus transgenik ganda APP/(presenilin-1) PS1 yang mengekspres bersama lima mutasi AD familial (5XFAD) dan menunjukkan patologi plak amiloid yang serupa dengan yang ditemukan pada AD [37].
Akumulasi CHO di sekitar plak pikun pada model transgenik 5XFAD akan dievaluasi dengan imunohistokimia.
Jika modelnya valid, setelah akumulasi CHO dalam plak senilis ditunjukkan, diusulkan untuk menguji spesifisitas nanokonjugat yang disintesis. Untuk itu, pertama, irisan otak tetap akan diperoleh dari tikus transgenik 5XFAD, dan kemudian, akan dicoba pada mereka penyatuan nanokonjugat, menginkubasi anti-CHO-MNPs pada bagian otak tetap dari tikus 5XFAD. Spesifisitas nanokonjugat akan ditentukan, dengan mengevaluasi kolokalisasi anti-CHO-MNPs dengan deposit CHO dan plak pikun yang ada di bagian otak 5XFAD, melakukan kontrol yang sesuai. Jika tidak ada akumulasi kolesterol yang jelas di 5XFAD yang terdeteksi, mutasi Swedia alternatif pada model tikus protein prekursor amiloid (APPsw ), model tikus AD, akan digunakan, karena dalam model ini, akumulasi CHO yang jelas terkait dengan plak amiloid telah dijelaskan di hipokampus [9].
Pengujian Di Vivo
Setelah spesifisitas konjugat ditunjukkan, analisis biokompatibilitas nanokojugat in vivo akan dilakukan. Nanoplatform akan disuntikkan secara intravena pada dosis yang berbeda (berkisar dari 25 sampai 100 mg/kg [38]) (Gbr. 2c), dan toksisitas sub-akut selama penelitian akan dianalisis dengan mengamati kematian, bukti atrofi , kemacetan, peradangan, atau perubahan perilaku kotor pada tikus. Koefisien berat masing-masing organ terhadap tubuh akan dihitung. Toksisitas ginjal akan ditentukan oleh kadar urea nitrogen dan kreatinin dalam darah. Tingkat bilirubin total dan alkaline phosphatase dalam darah dapat diuji sebagai ukuran fungsi hati dan bilier. Selain itu, kadar asam urat dan studi hematologi untuk menilai perubahan kadar sel darah merah, sel darah putih, dan hemoglobin akan ditentukan. Akhirnya, untuk mencari lebih detail kemungkinan efek toksik, pemeriksaan histologis berbagai jaringan (ginjal, hati, limpa, otak, atau paru-paru) akan dilakukan [39]. Lokasi MNP yang difungsikan dalam darah, urin, dan organ yang berbeda akan dianalisis pada 24 jam, 72 jam, 1 minggu, 2 minggu, dan 1 bulan setelah injeksi anti-CHO-MNP.
Setelah konsentrasi MNP yang tepat ditentukan, platform nano akan disuntikkan pada tikus kontrol dan 5XFAD, dan efektivitasnya akan dievaluasi oleh MRI (Gbr. 2c). Jika antibodi dari nanoplatform tidak mengenali antigen dalam sistem in vivo, maka MNPs dapat difungsikan dengan fenil-diyne kolesterol, suatu senyawa yang dalam penelitian sebelumnya telah ditemukan mampu mengikat akumulasi CHO secara in vivo [40] . Biokompatibilitas nanokonjugat ini akan dinilai seperti yang dijelaskan di atas untuk nanokonjugat MNP-CHO. Jika rute pemberian intravena tidak efektif melintasi BBB, diusulkan rute pemberian alternatif sebagai pengiriman intranasal atau penerapan medan magnet eksternal (Gbr. 2c).
Implikasi Hipotesis
Penggunaan MNPs biofungsional untuk mendeteksi AD in vivo oleh MRI telah banyak ditunjukkan dalam banyak penelitian sebelumnya, dengan mengkonjugasikan MNP ke peptida yang berbeda:Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15] , dan antibodi anti-Aβ-1-42 [43]. Setelah pemberian intravena pada model hewan DA, baik plak pikun dan deposit amiloid vaskular (angiopati kongofilik) dideteksi oleh MRI. Namun, nanokonjugat ini sendiri beracun karena fragmen peptida amiloid yang digunakan bersifat neurotoksik (Aβ1-40, Aβ 1-42). Selain itu, karena ukurannya, mereka memerlukan pemberian bersama senyawa yang memfasilitasi perjalanan mereka melalui BBB.
NANOCHOAD akan bekerja sebagai agen kontras yang akan memungkinkan lokalisasi simultan dari dua biomarker spesifik AD:plak amiloid dan hilangnya CHO dalam materi putih otak [44], menghindari toksisitas. Karena adanya PEG dalam strukturnya, itu juga akan memfasilitasi perjalanan nanoplatform melalui BBB [43].
Seperti dapat dilihat, sebagian besar penelitian tentang karakteristik ini berorientasi pada deteksi plak senilis, salah satu biomarker utama DA tetapi bukan satu-satunya. Baru-baru ini, sebuah makalah di mana feritin dan oleh karena itu deposit besi dideteksi oleh nanokonjugat berdasarkan MNP telah diterbitkan [16]. Namun, zat kontras untuk deteksi feritin ini memiliki sensitivitas yang rendah karena tidak terdeteksi oleh MRI dan hanya dengan kuantifikasi di lokasi tertentu di otak. Hilangnya materi putih di otak adalah fenomena besar [44], tidak terlokalisasi; oleh karena itu, diperkirakan bahwa agen kontras yang diusulkan bisa lebih sensitif untuk deteksi dini biomarker AD. Perlu untuk mempromosikan pengembangan agen kontras baru yang dapat secara efisien mendeteksi biomarker lain yang terkait dengan DA pada tahap awal penyakit.
Di sisi lain, komposisi nanokonjugat yang diusulkan dapat mengatasi dua kendala utama untuk mengatasi kemanjuran agen kontras yang disuntikkan secara intravena:stabilitas koloid dalam aliran darah dan kemampuan untuk berhasil melewati BBB untuk mencapai target. Fungsionalisasi nanoplatform dengan rantai PEG akan memastikan stabilitas koloid nanokonjugat dalam aliran darah [15, 21]. Di sisi lain, sebagai strategi untuk melintasi BBB, konjugasi MNPs dengan transferin peptida [25] akan memfasilitasi pengenalan transferin oleh reseptor spesifik yang terletak di BBB yang memungkinkan nanokonjugat melintasi BBB dan mengikat target akhirnya. . Fakta ini dikombinasikan dengan pengurangan ukuran sistem nano dan perubahan BBB pada pasien dengan AD akan memfasilitasi perjalanan nanokonjugat melalui BBB.
Karena kebaruan dalam desain nanokonjugat yang dijelaskan, akan diperlukan untuk mempelajari secara mendalam biokompatibilitas dan dosis yang diberikan dari platform nano, terutama untuk menentukan rute eliminasi agen kontras organisme.
