Curcumin-loaded chitosan–bovine serum albumin nanopartikel berpotensi meningkatkan fagositosis Aβ 42 dan polarisasi makrofag termodulasi pada penyakit Alzheimer
Abstrak
Penyakit Alzheimer (AD) adalah gangguan neurodegeneratif yang paling umum pada populasi lanjut usia. Dalam pengobatan DA, beberapa kendala, termasuk kesulitan penetrasi obat melalui sawar darah-otak (BBB), pembersihan peptida Aβ yang tidak memadai, dan pelepasan besar-besaran faktor inflamasi, harus segera diatasi. Untuk mengatasi masalah ini, kami mengembangkan nanopartikel (NP) khusus dan baru yang terbuat dari kitosan (CS) dan albumin serum sapi (BSA) untuk meningkatkan penetrasi obat melalui BBB. Kurkumin sebagai agen anti-inflamasi yang kuat digunakan untuk meningkatkan fagositosis peptida Aβ. Hasilnya menunjukkan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin secara efektif meningkatkan penetrasi obat melalui BBB, mendorong aktivasi mikroglia, dan selanjutnya mempercepat fagositosis peptida Aβ. Lebih lanjut, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menghambat jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB dan selanjutnya menurunkan regulasi polarisasi makrofag M1. Studi ini menyarankan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin memiliki potensi untuk meningkatkan fagositosis Aβ 42 melalui modulasi polarisasi makrofag di AD.
Pengantar
Penyakit Alzheimer (AD) adalah gangguan neurodegeneratif yang ditandai dengan onset berbahaya dan perkembangan penurunan kognitif. Secara histopatologi, amiloid-β (Aβ) 42 sebagai peptida yang mengandung 42 asam amino diagregasi menjadi filbril -peptida amiloid yang ditandai dengan “plak pikun” ekstraseluler pada DA, sehingga menginduksi apoptosis neuron dan hilangnya sinapsis [1,2,3] . Umumnya, monomer Aβ42 larut secara fisiologis dan tidak beracun, sedangkan oligomernya lebih beracun secara in vitro dan in vivo [4, 5]. Oleh karena itu, intervensi agregasi Aβ 42 dengan membersihkan monomer Aβ 42 secara luas dianggap sebagai target terapi yang paling tepat untuk AD [6,7,8,9]. Telah diketahui dengan baik bahwa peptida Aβ dapat memicu aktivasi mikroglial dengan berinteraksi dengan beberapa reseptor seperti Toll (TLR), termasuk TLR4, dan mereka juga mempromosikan fagositosis yang bergantung pada CD14-, TLR4-, atau TLR2 dan pembersihan Aβ42 [10, 11,12]. Meskipun aktivasi mikroglial dapat meningkatkan pembersihan Aβ 42, sel mikroglial—sejenis makrofag mononuklear—mungkin terlalu aktif dan terpolarisasi ke fenotipe M1 (ditandai dengan pelepasan faktor terlarut yang berpotensi neurotoksik dan sitokin pro-inflamasi), sehingga menyebabkan kematian neuronal dan memperburuk perkembangan AD. Sebaliknya, beberapa sel mikroglia adalah fenotipe yang diaktifkan secara klasik (M2) yang dicirikan oleh produksi sitokin anti-inflamasi; ini memperbaiki disfungsi kognitif pada AD [13,14,15,16]. Oleh karena itu, rasio makrofag tipe M1/M2 dapat secara signifikan mempengaruhi perkembangan DA [17, 18]; lebih lanjut, peningkatan regulasi yang diperlukan untuk mengubah M1 proinflamasi menjadi makrofag M2 antiinflamasi akan menunjukkan potensi yang menjanjikan dalam pencegahan dan pengobatan DA.
Kurkumin, yang berasal dari komponen kunyit rempah India (Curcumin longa)—sejenis jahe—adalah agen antiinflamasi yang ampuh yang dapat mengurangi peradangan dan bahkan mungkin berperan dalam pengobatan AD [19]. Dalam beberapa tahun terakhir, ditemukan bahwa kurkumin dilaporkan memiliki sifat anti-amiloidogenik, anti-inflamasi, anti-oksidatif, dan pengkhelat logam yang mungkin memiliki efek neuroprotektif potensial [20, 21]. Kurkumin memodulasi polarisasi makrofag melalui penghambatan jalur toll-like receptor 4-mitogen-activated protein kinase (TLR4-MAPK)/NF-κB [22,23,24]. Namun, stabilitas dan bioavailabilitas kurkumin yang buruk membatasi aplikasi klinisnya. Selain itu, adanya sawar darah otak (BBB) juga mencegah penetrasi kurkumin dalam pengobatan AD [25,26,27].
Untuk meningkatkan transportasi obat dari darah ke otak, nanopartikel (NP) dengan permukaan yang difungsikan dengan peptida [28] dan antibodi [29] membantu pengiriman obat melintasi BBB dan efisiensi penetrasi BBB dari NP dapat ditingkatkan secara signifikan melalui mekanisme transpor aktif lainnya. daripada difusi pasif sederhana [30]. Kitosan (CS) NP—pembawa nano untuk berasosiasi dengan Aβ—dapat menembus BBB dan bersifat non-imunogenik [31]. Selain itu, albumin serum ditemukan dalam plasma sirkulasi tubuh manusia pada konsentrasi 50 g/L serum, dan tidak beracun dan ditoleransi dengan baik oleh sistem kekebalan [32, 33]. Juga dilaporkan bahwa nanopartikel yang diturunkan dari bovine serum albumin (BSA) memiliki sifat pelepasan berkelanjutan yang dapat meningkatkan waktu paruh obat, sehingga menurunkan frekuensi pemberian dan meningkatkan kepatuhan pasien [34]. Oleh karena itu, kami menggunakan CS dan BSA sebagai dua biomaterial untuk menyiapkan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin untuk mencapai penetrasi BBB terbaik. Efek kurkumin pada fagositosis Aβ 42, sekresi sitokin inflamasi, dan regulasi jalur TLR4-MAPK/ NF-κB diselidiki untuk mengkonfirmasi lebih lanjut mekanisme molekuler kurkumin pada polarisasi makrofag.
Materi
CS dengan tingkat deasetilasi 80% dan berat molekul sekitar 400 kDa dibeli dari Haixin Biological Product Co., Ltd. (Ningbo, Republik Rakyat Tiongkok). BSA dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA), dan kurkumin dibeli dari Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, Republik Rakyat Tiongkok). FITC-β-amyloid (1–42) dibeli dari Chinese Peptide Co., Ltd. (Hangzhou, Republik Rakyat Tiongkok). Bahan kimia lain yang dibeli memiliki tingkat analitis dan diperoleh dari Sigma-Aldrich Co. Garis sel makrofag, RAW 264.7 (garis sel makrofag monosit leukemia tikus), dan garis sel endotel mikrovaskular otak (hCMEC/D3), yang berfungsi sebagai model BBB manusia, didirikan oleh Institut Biologi Sel Shanghai, Akademi Ilmu Pengetahuan China, Shanghai (Republik Rakyat China). Kedua sel dipertahankan pada suhu 37 °C, dan dengan 5% CO2 atmosfer, dalam Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) yang dilengkapi dengan 10% (volume/volume) serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas dan antibiotik (100 U/mL penisilin dan 100 mg/mL streptomisin). Dilaporkan bahwa sel RAW 264,7 yang diobati dengan lipopolisakarida (LPS) merekapitulasi aspek sel mikroglial yang diamati pada penyakit neurodegeneratif yang dicontohkan oleh AD [35, 36]. Oleh karena itu, sel makrofag RAW 264,7 sel terpolarisasi ke fenotipe M1 oleh lipopolisakarida (LPS; 1 μg/ml) selanjutnya diterapkan untuk mensimulasikan sel mikroglial di AD.
Persiapan NP CS-BSA yang mengandung curcumin
Menurut laporan kami sebelumnya [37], di bawah interaksi elektrostatik, CS bermuatan positif dapat berkonjugasi dengan BSA bermuatan negatif untuk membentuk NP. Metode preparasi adalah sebagai berikut:0,1% asam asetat digunakan untuk melarutkan CS untuk mendapatkan larutan pada 0,5 mg/mL CS dan 100 μL DMSO yang mengandung 0,05 mg/mL kurkumin ditambahkan ke dalam larutan CS untuk pencampuran menyeluruh di bawah magnet. pengadukan pada suhu kamar. Sebagai larutan BSA dalam jumlah yang tepat, 1,0 mg/mL secara perlahan diteteskan ke dalam campuran CS dan kurkumin; pada titik ini, fenomena opalescence muncul dan NP CS-BSA selanjutnya dikondensasi menjadi partikel padat. Selain itu, ukuran, polidispersitas, potensi zeta, dan morfologi NP diselidiki. Pelepasan obat in vitro dari NP diperkirakan menggunakan metode yang dilaporkan sebelumnya [37]. Efisiensi enkapsulasi (EE, %) kurkumin dalam NP dihitung menggunakan persamaan di bawah ini.
Ajumlah adalah jumlah kurkumin yang awalnya ditambahkan, Wgratis adalah jumlah kurkumin yang tersisa di supernatan.
Evaluasi apoptosis sel oleh MTT
Untuk menentukan keamanan NP CS-BSA pada apoptosis sel, uji MTT digunakan untuk mengevaluasi viabilitas sel. Menurut protokol penelitian kami sebelumnya, jumlah yang berbeda dari NP CS-BSA kosong digunakan untuk mengobati sel RAW 264,7 (fenotipe M1) dan sel hCMEC/D3 selama 24 jam pada 37°C untuk analisis lebih lanjut.
Studi penetrasi menggunakan model BBB in vitro
Kultur transwell monolayer menggunakan garis sel endotel mikrovaskular otak, hCMEC/D3, adalah model BBB in vitro umum yang digunakan untuk mempelajari pengiriman NP otak. Campuran sel hCMEC/D3 (dalam 0,5–1,0 mL volume total) ditambahkan ke dalam sisipan di ruang atas pelat transwell 12-sumur untuk kultur sel monolayer dengan hambatan listrik transendotel> 300 Ω; PBS pada tingkat pH 7,4 ditambahkan ke ruang bawah. Kurkumin gratis dan suspensi NP CS-BSA yang mengandung kurkumin ditempatkan di ruang atas untuk inkubasi terus menerus selama 3 jam dalam inkubator yang disetel pada suhu 37 °C, CO 5%2 . Setelah itu, NP CS-BSA kurkumin bebas dan kurkumin yang dimuat ditransfer melintasi sel dan dimasukkan di ruang bawah. Kuantifikasi NP yang ditembus terdeteksi menggunakan pembaca lempeng mikro (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) dengan memeriksa intensitas fluoresensi kurkumin, yang tereksitasi pada 425 nm dan dipancarkan pada 530 nm. Rasio fluoresensi relatif (RFR, %), yang mewakili tingkat penetrasi NP, dihitung dengan menentukan rasio intensitas fluoresensi dari NP CS-BSA yang mengandung kurkumin yang ditembus di ruang bawah dengan kurkumin yang ditambahkan awalnya. memuat NP CS-BSA di ruang atas. Inhibitor endositik yang berbeda, seperti klorpromazin (yang menghambat penyerapan yang dimediasi klatrin) pada 10 g/mL, genistein (penyerapan yang dimediasi caveolae) pada 1 g/mL, sitokhalasin D (30 μM, makropinositosis), dan 20 μg/mL natrium azide (penghambat energi), digunakan untuk memastikan berbagai jalur endositik yang terlibat dalam berbagai mekanisme penetrasi. Rasio penetrasi relatif ditentukan dengan membandingkan tingkat penetrasi NP yang diobati dengan inhibitor dengan NP yang diobati dengan non-inhibitor.
Serapan seluler dari NP CS-BSA yang mengandung kurkumin
Distribusi dan lokasi NP CS-BSA yang mengandung kurkumin dalam sel RAW 264,7 (fenotipe M1) diamati menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Jepang). Campuran sel hCMEC/D3 (dalam 0,5–1,0 mL volume total) ditambahkan ke dalam sisipan di ruang atas pelat Transwell 12-sumur untuk kultur sel monolayer dengan hambatan listrik transendotel> 300 Ω. Sel RAW 264,7 (fenotipe M1) diunggulkan di ruang bawah. Kurkumin gratis dan suspensi NP CS-BSA yang mengandung kurkumin ditempatkan ke dalam ruang atas untuk inkubasi terus menerus dalam inkubator yang diatur pada 37 °C, 5% CO2 . Pada interval yang telah ditentukan, distribusi seluler kurkumin bebas dan NP CS-BSA bermuatan kurkumin dalam sel RAW 264,7 (fenotipe M1) diamati dengan mendeteksi fluoresensi hijau yang dipancarkan oleh kurkumin menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal.
Deteksi fagositosis Aβ 42 yang diinduksi oleh NP CS-BSA curcumin bebas dan curcumin-loaded
Sel RAW 264,7 (fenotipe M1) dalam media pertumbuhan penuh diunggulkan dalam pelat 12-sumur (1 × 10
5
sel/sumur) dan diobati dengan NP CS-BSA curcumin dan curcumin-loaded gratis selama 24 jam pada 37°C. Untuk menghilangkan kurkumin yang tidak terinternalisasi dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin, air suling digunakan untuk mencuci sel dalam waktu singkat dua kali. Ditemukan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin dan kurkumin sepenuhnya dihilangkan dari media, dan tidak ada risiko yang jelas dari sel-sel dari air suling yang menginduksi osmolaritas rendah karena morfologi sel yang dicuci dengan air suling masih utuh dan tidak ada ledakan sel. diamati. Terakhir, Aβ 42 bebas berlabel FITC yang dilarutkan dalam PBS (pH 7,4) ditambahkan ke dalam cawan untuk inkubasi terus menerus selama 3 jam. Fagositosis Aβ 42 berlabel FITC ke dalam sel RAW 264,7 (fenotipe M1) diwakili dengan mendeteksi fluoresensi hijau yang dipancarkan oleh FITC. Fagositosis intraseluler dan lokasi Aβ 42 di dalam sel dipelajari lebih lanjut menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (FluoView FV10i; Olympus Corporation).
uji Western blot
Untuk mengeksplorasi mekanisme molekuler yang mungkin dari polarisasi makrofag yang dimediasi kurkumin, kami memeriksa tingkat ekspresi sitokin pro-inflamasi, seperti faktor nekrosis tumor (TNF)-α dan interleukin (IL)-6, dan tingkat fosforilasi ERK, JNK , p38, dan NF-κB dengan Western blotting untuk mempelajari lebih lanjut efek spesifik kurkumin pada jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB.
Hasil
Karakterisasi NP CS-BSA yang mengandung kurkumin
Karakteristik NP diselidiki untuk menentukan ukuran partikel, potensi zeta, dan morfologinya menggunakan Zetasizer (Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, UK) dan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Jeol, Tokyo, Jepang) pada tegangan percepatan 200 kV. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar. 1 menunjukkan bahwa NP CS-BSA menunjukkan ukuran rata-rata pada 143,5 nm, potensi zeta negatif pada 10.8 mV, dan polidispersitas pada 0,021, masing-masing. Diamati bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin berbentuk bulat dan monodispersi. Suspensi yang dihasilkan mengandung NP CS-BSA yang mengandung kurkumin disentrifugasi untuk mendapatkan larutan supernatan untuk menentukan absorbansi kurkumin dan untuk menghitung kandungan kurkumin bebas dalam larutan supernatan sesuai dengan kurva standar. Efisiensi enkapsulasi (EE,%) dari kurkumin di NP senilai 95,4%. Dalam hal proses pelepasan obat dari NP, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menunjukkan pola pelepasan bifasik dalam media dengan tingkat pH 7,4. Sekitar 11,3% dari semua obat dilepaskan dalam 3 jam pertama, menunjukkan bahwa ketika NP memasuki sirkulasi darah sebelum mencapai BBB, kurkumin terlindungi dengan baik dan dikemas dalam inti NP. Selanjutnya, beberapa obat bocor dari NP dan dilepaskan ke dalam darah dalam 3 jam pertama. Mayoritas NP CS-BSA yang mengandung kurkumin dapat diangkut di sekitar BBB dan meningkatkan konsentrasi obat di sekitar otak.
Karakterisasi NP CS-BSA yang dimuat kurkumin. a Gambar TEM dari NP CS-BSA yang dimuat kurkumin. b Analisis hamburan cahaya dinamis (DLS) dari NP CS-BSA yang dimuat kurkumin yang diperoleh. c Analisis potensi zeta dari NP CS-BSA yang dimuat kurkumin yang diperoleh. d Profil pelepasan in vitro dari NP CS-BSA mengandung kurkumin yang diperoleh dalam saline buffer fosfat dengan pH 7,4 pada 37 °C selama 48 jam
Studi penetrasi menggunakan model BBB in vitro
Tingkat penetrasi kurkumin bebas dan NP dinilai dengan memeriksa intensitas fluoresensi kurkumin di ruang bawah menggunakan pembaca lempeng mikro (Synergy-2; Instrumen BioTek), dan dihitung dengan menentukan rasio intensitas fluoresensi kurkumin terpenetrasi NP CS-BSA yang dimuat di ruang bawah dengan NP CS-BSA yang awalnya ditambahkan kurkumin di ruang atas. Hasil (Gbr. 2) menunjukkan bahwa proses penetrasi kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin mengikuti pola yang bergantung waktu, dan laju penetrasi meningkat seiring waktu. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat penetrasi kurkumin bebas adalah 12,3% pada 1 jam, 20,3% pada 2 jam, dan 29,8% pada 3 jam. Dibandingkan dengan kurkumin bebas, efisiensi penetrasi NP CS-BSA yang mengandung kurkumin ditingkatkan, seperti yang ditunjukkan oleh tingkat penetrasi yang meningkat; tingkat penetrasi meningkat menjadi 37,7% pada 1 jam, 45,6% pada 2 jam, dan 60,2% pada 3 jam. Hal ini menunjukkan bahwa kurkumin bebas dapat mengalami kesulitan dalam menembus sel dan menunjukkan permeabilitas yang buruk terhadap BBB [38, 39]. Pengamatan ini juga menunjukkan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin dapat secara efektif meningkatkan penetrasi obat melalui sel, menunjukkan peran yang dimainkan oleh berbagai jalur endositik. Tes penghambatan endositosis menunjukkan bahwa konsisten dengan laporan sebelumnya [40], kurkumin bebas tergantung pada difusi pasif untuk penetrasi dan bahwa tidak ada variasi yang jelas dalam efisiensi penetrasi kurkumin bebas, terlepas dari apakah inhibitor ditambahkan atau tidak. Sebaliknya, penetrasi NP bergantung pada energi, dan rasio penetrasi relatif yang diobati dengan natrium azida adalah 55,6%. Lebih lanjut, baik caveolae dan macropinocytosis terutama memediasi jalur endositik NP. Dibandingkan dengan pengobatan dengan noninhibitor, rasio penetrasi relatif dalam sel yang diobati dengan genistein dan cytochalasin D masing-masing adalah 67,8% dan 60,3%.
Analisis mekanisme penetrasi kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin melalui sel hCMEC/D3. a Analisis spektrum fluoresensi dari tingkat penetrasi kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin. Hasil dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (n = 3). *P < 0,05, **P < 0.01 vs tingkat penetrasi kurkumin gratis pada 1 jam.
##P < 0,01 vs tingkat penetrasi NP CS-BSA yang dimuat kurkumin pada 1 jam. b Efek inhibitor endositik pada kemampuan penetrasi kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin. Hasil dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (n = 3).
##P < 0,01 vs rasio penetrasi relatif dari NP CS-BSA yang mengandung kurkumin yang diobati dengan klorpromazin
Evaluasi apoptosis sel oleh MTT
Efek sitotoksik NP CS-BSA kosong terhadap sel RAW 264,7 (M1) dan hCMEC/D3 diperkirakan secara in vitro dengan uji MTT. Sel diperlakukan dengan berbagai konsentrasi NP CS-BSA yang berkisar dari 0 hingga 2,0 mg/mL. Uji viabilitas sel pada Gambar. 3 menunjukkan bahwa tidak ada aktivitas sitotoksik yang terlihat jelas pada sel RAW 264,7 dan sel hCMEC/D3 saat diobati dengan NP CS-BSA kosong [37].
Viabilitas sel RAW 264,7 (M1) dan sel hCMEC/D3 setelah inkubasi dengan jumlah NP CS-BSA telanjang yang berbeda selama 24 jam (n = 3)
Distribusi dan penyerapan seluler NP
Kurkumin gratis dan NP CS-BSA bermuatan kurkumin yang mengandung jumlah kurkumin yang sama pada 100 g/mL digunakan untuk mengobati sel RAW 264,7 (M1), dan distribusi serta serapan seluler kurkumin diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal (FluoView FV10i; Olympus). Dapat dilihat pada Gambar. 4 bahwa distribusi intraseluler kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang mengandung kurkumin mengikuti pola yang bergantung pada waktu dan bahwa fluoresensi hijau kurkumin telah terakumulasi di dalam sel dan tersebar di seluruh sitoplasma. Dengan berlalunya waktu, intensitas fluoresensi hijau di dalam sel ditingkatkan. Hal ini menunjukkan bahwa fluoresensi hijau yang dipancarkan oleh kurkumin bebas di dalam sel sangat lemah, yang menunjukkan bahwa sebagian besar kurkumin bebas tidak diambil oleh garis sel makrofag, RAW 264,7. Karena NP mungkin memiliki potensi yang menjanjikan untuk pengiriman obat intraseluler yang sangat efisien [41, 42], diamati bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menunjukkan peningkatan intensitas fluoresensi bila dibandingkan dengan sel yang diobati dengan kurkumin gratis, menunjukkan bahwa CS-BSA NP dapat meningkatkan penyerapan seluler kurkumin. Di sini, pengamatan ini menunjukkan bahwa NP CS-BSA dapat secara efektif meningkatkan akumulasi obat di dalam sel.
Penyerapan kurkumin gratis dan kurkumin memuat NP CS-BSA dalam sel RAW 264,7 (M1) selama 6 jam. Kurkumin menunjukkan warna fluoresen hijau dan menunjukkan lokasi intraseluler kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang dimuat kurkumin. Nukleus diwarnai dengan Hoechst (biru) selama 15 menit pada 37 °C. Bilah skala adalah 50 μm dan berlaku untuk semua bagian gambar
Fagositosis Aβ 42 yang diinduksi oleh NP CS-BSA curcumin bebas dan curcumin-loaded
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, kurkumin menampilkan fluoresensi merah pada panjang gelombang eksitasi 550 nm dan panjang gelombang emisi 570 nm. Selain itu, juga menunjukkan fluoresensi hijau pada panjang gelombang eksitasi dan emisi FITC. Oleh karena itu, setelah Aβ 42 berlabel kurkumin dan FITC difagosit ke dalam sel RAW 264,7 (M1), mereka semua menunjukkan fluoresensi hijau pada panjang gelombang eksitasi dan emisi FITC. Dalam percobaan co-lokalisasi, fluoresensi merah dan fluoresensi hijau (mewakili kurkumin) digabungkan dan titik-titik kuning mewakili keberadaan intraseluler dan lokasi kurkumin; beberapa titik hijau tidak ditempatkan bersama dengan titik fluoresen merah, mewakili keberadaan dan fagositosis Aβ 42 berlabel FITC dalam sel RAW 264,7 (M1). Diamati bahwa beberapa jumlah Aβ 42 difagositosis oleh mikroglia [43], yang dibuktikan dengan pengamatan intraseluler fluoresensi hijau dalam sel. Seperti yang ditunjukkan pada gambar overlay pada Gambar. 5, dibandingkan dengan kurkumin bebas, lebih banyak titik fluoresen kuning kurkumin telah terakumulasi di dalam sel, menunjukkan bahwa sejumlah besar NP CS-BSA yang mengandung kurkumin, seperti yang diwakili oleh fluoresen kuning intensitas, telah terakumulasi dalam sel karena interaksi antara NP dan sel RAW 264,7 (M1). Ini menginduksi konsentrasi kurkumin intraseluler yang lebih tinggi, yang mengarah pada peningkatan fagositosis Aβ 42 [44], yang diwakili oleh intensitas fluoresen hijau yang lebih tinggi. Seharusnya NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menginduksi polarisasi makrofag, serta efek anti-inflamasi dan neuroprotektif berkontribusi pada peningkatan fagositosis.
Fagositosis Aβ 42 yang diinduksi oleh kurkumin bebas dan NP CS-BSA yang dimuat kurkumin. Bilah skala adalah 50 μm dan berlaku untuk semua bagian gambar
uji Western blot
Untuk mengeksplorasi mekanisme molekuler yang mungkin dari polarisasi makrofag yang dimediasi kurkumin, kami memeriksa tingkat keseluruhan TNF-α, IL-6, dan TLR4 serta tingkat fosforilasi p38, ERK, JNK, dan IκBα oleh Western blotting untuk mempelajari lebih lanjut efek spesifik kurkumin pada jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB.
Gambar 6 menunjukkan bahwa jika dibandingkan dengan sel RAW 264,7 normal sebagai kelompok kontrol, sel RAW 264,7 (fenotipe M1) melepaskan lebih banyak faktor larut neurotoksik dan sitokin pro-inflamasi yang ditandai dengan tingkat ekspresi TNF-α dan IL-6 yang lebih tinggi, sehingga menyebabkan kematian neuron dan memperburuk perkembangan AD. Dibandingkan dengan kontrol dan kurkumin bebas, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin tampaknya menghambat polarisasi makrofag M1 dan menginduksi ekspresi terendah TNF-α dan IL-6 dalam sel RAW 264,7 (fenotipe M1). Lebih lanjut, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin juga menurunkan ekspresi TLR4, yang mengatur polarisasi makrofag M1 dan fosforilasi ERK, JNK, p38, dan NF-κB tampaknya berkurang. Hal ini menunjukkan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin secara efektif mendorong akumulasi kurkumin—dan konsentrasi intraseluler berikutnya—di dalam sel, sehingga meningkatkan efek pemblokirannya pada jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB dan selanjutnya menghambat polarisasi makrofag M1.
Analisis Western blot dari tingkat ekspresi TNF-α, IL-6, TLR4, dan fosforilasi ERK, JNK, p38, dan faktor nuklir (NF)-κB dalam sel RAW 264,7 (fenotipe M1) setelah perawatan dengan kurkumin dan kurkumin gratis memuat NP CS-BSA
Diskusi
DA merupakan salah satu gangguan neurodegeneratif yang paling umum dan penyebab utama kematian di negara maju. Sehubungan dengan pengobatan DA, kemampuan BBB untuk mencegah masuknya sebagian besar zat eksogen ke otak merupakan kendala utama yang mencegah penggunaannya. Untuk mengatasi masalah ini, kami merancang NP CS-BSA untuk meningkatkan transportasi kurkumin melalui BBB. Hasilnya menunjukkan bahwa konsisten dengan penelitian sebelumnya [45], kurkumin bebas sulit menembus sel dan melewati BBB, sehingga menghasilkan efek penetrasi yang lebih rendah. CS-BSA NP yang mengandung kurkumin dapat secara efektif meningkatkan penetrasi obat melalui BBB dengan mediasi jalur yang dimediasi caveolae dan micropinocytosis. Peradangan saraf yang disebabkan oleh agregasi A adalah salah satu faktor penting yang mendasari mekanisme patologis AD [46]. Tingkat Aβ di otak ditentukan oleh keseimbangan dinamis antara pembentukan dan pembersihan Aβ; oleh karena itu, penghilangan Aβ juga penting dalam menentukan levelnya di otak. Kemampuan fagositosis mikroglia menunjukkan signifikansi fisiologis penting dalam pencegahan DA. Mikroglia terutama bertanggung jawab untuk pembersihan target-Aβ dan cenderung berkumpul secara dominan di sekitar zona deposisi Aβ42, sehingga selanjutnya mencegah akumulasi Aβ42 melalui fagositosis [47, 48]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa efek fagositosis sel RAW 264.7 sel CS-BSA NP yang diberi kurkumin (fenotipe M1) pada Aβ 42 meningkat dan bahwa akumulasi dan deposisi Aβ 42 berkurang, yang dapat memperbaiki perkembangan AD.
Mikroglia (fenotipe M1) melepaskan faktor terlarut yang berpotensi neurotoksik dan sitokin pro-inflamasi seperti TNF-α dan IL-6, sehingga menyebabkan kematian neuron dan memperburuk perkembangan DA [49]. Ditemukan bahwa polarisasi makrofag M1 bergantung pada aktivasi jalur pensinyalan TLR4-MAPK /NF-κB dan bahwa memblokir jalur pensinyalan TLR4-MAPK /NF-κB dapat menghambat polarisasi makrofag M1 dan mendorong polarisasi makrofag dari tipe M1 ke tipe M2 [50]. Hasil kami menunjukkan bahwa kurkumin sebagai komponen rempah-rempah India, kunyit (Curcumin longa)—sejenis jahe—adalah agen anti-inflamasi yang ampuh yang dapat mengurangi peradangan dan bahkan mungkin berperan dalam pengobatan AD. CS-BSA NP berfungsi sebagai alat yang ampuh untuk penetrasi kurkumin bertarget BBB yang efisien. Dibandingkan dengan kurkumin bebas, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menginduksi efek fagositosis dan sejumlah besar Aβ 42 difagosit oleh sel RAW 264,7. Selain itu, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menginduksi tingkat ekspresi protein TNF-α, IL-6, dan TLR4 yang lebih rendah daripada kurkumin bebas, dan fosforilasi ERK, JNK, p38, dan NF-κB juga dihambat. Ini menunjukkan bahwa NP CS-BSA yang mengandung kurkumin dapat meningkatkan fagositosis makrofag yang diinduksi kurkumin dengan menghambat polarisasi makrofag M1 melalui pemblokiran jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB, sehingga meningkatkan efek anti-inflamasi dan neuroprotektif kurkumin.
Kesimpulan
Data kami menunjukkan bahwa kurkumin dapat digunakan sebagai agen terapeutik dalam pengobatan DA. CS-BSA NPs yang mengandung kurkumin memicu fagositosis Aβ 42 yang diinduksi sel RAW 264,7 oleh penetrasi BBB yang ditingkatkan dari kurkumin dan konsentrasi obat intraseluler yang lebih tinggi. Selain itu, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menginduksi efek anti-inflamasi dan neuroprotektif dengan menghambat polarisasi makrofag M1 dan memblokir jalur pensinyalan TLR4-MAPK/NF-κB. Secara keseluruhan, NP CS-BSA yang mengandung kurkumin menunjukkan potensinya dalam meningkatkan pengobatan AD.
