Nanopartikel Chitosan–Albumin Sapi Terkurasin Meningkatkan Penyisihan Amiloid-β42 dan Memodulasi Polarisasi Makrofag dalam Penyakit Alzheimer

Abstrak

Penyakit Alzheimer (AD) tetap menjadi gangguan neurodegeneratif terkemuka di kalangan orang tua, namun terapi yang efektif terbatas oleh baris darah-otak (BBB), penyisihan amiloid-β (Aβ) yang buruk, dan neuroinflamasi kronis. Kami merancang nanopartikel (NP) chitosan (CS)–albumin sapi (BSA) untuk mengirimkan kurkumin—polifenol anti-inflamasi dan anti-amiloidogen yang kuat—secara langsung ke otak. NP terkurasin CS-BSA mencapai efisiensi kapsulasi 95,4 %, diameter rata-rata 143,5 nm, dan muatan permukaan negatif –10,8 mV, yang memastikan stabilitas dan permeabilitas BBB yang menguntungkan. Model BBB in vitro menunjukkan penetrasi NP sebesar 60,2 % setelah 3 jam, yang jauh lebih tinggi dibandingkan kurkumin bebas (29,8 %). Studi penyerapan seluler mengungkapkan tingkat kurkumin seluler yang ditingkatkan dalam makrofag RAW 264.7, yang pada gilirannya meningkatkan fagositosis Aβ42. Secara mekanisme, NP menekan sumbu TLR4–MAPK/NF-κB, menurunkan sitokin pro-inflamasi (TNF-α, IL-6), dan menggeser makrofag dari fenotipe M1 neurotoksik menjadi M2 yang melindungi. Temuan ini menunjukkan bahwa NP terkurasin CS-BSA memperkuat penyisihan Aβ42 sambil memodulasi neuroinflamasi, menawarkan platform nanomedis yang menjanjikan untuk terapi AD.

Pendahuluan

AD ditandai dengan penurunan kognitif progresif dan penumpukan karakteristik fibril Aβ42 ekstraseluler. Sementara Aβ42 monomer fisik tidak berbahaya, agregat oligomer sangat neurotoksik dan mendorong progresi penyakit. Menargetkan agregasi Aβ42 dan mempromosikan penyisaannya adalah inti dari strategi terapeutik. Sel mikroglia, makrofag residan otak, mengenali Aβ melalui reseptor toll-like (TLR) dan fagositosis peptida. Namun, aktivasi kronis memolarisasi mikroglia menuju fenotipe M1 pro-inflamasi, yang memparah cedera neuron. Mempromosikan pergeseran ke fenotipe M2 anti-inflamasi telah muncul sebagai pendekatan modifikasi penyakit yang viable.

Kurkumin, yang berasal dari kunyit (Curcuma longa), menunjukkan properti anti-amiloidogen, anti-okidatif, dan pengelapan logam. Ia dapat memodulasi polarisasi makrofag dengan menghambat kaskad sinyal TLR4–MAPK/NF-κB. Sayangnya, kelebihan larutkurkumin yang buruk, metabolisme cepat, dan permeabilitas BBB yang terbatas membatasi kegunaan klinisnya.

Pembawa nanopartikel dapat mengatasi hambatan ini. CS adalah polisakarida kationik yang biocompatibel mampu membentuk kompleks stabil dengan protein anionik seperti BSA. BSA melimpah dalam plasma, non-imunogenik, dan memberikan karakteristik peluncuran berkelanjutan pada nanopartikel. Dengan menggabungkan CS dan BSA, kami memproduksi NP terkurasin yang dioptimalkan untuk lintasan BBB dan pengiriman terpadu ke mikroglia.

Bahan

CS (deasetilasi 80 %, ~400 kDa) diperoleh dari Haixin Biological Product Co., Ltd. BSA (Sigma-Aldrich), kurkumin (Dalian Meilun Biotechnology), dan Aβ42 berlabel FITC (Chinese Peptide Co.) dibeli secara komersial. Garis sel RAW 264.7 (monosit-makrofag tikus) dan hCMEC/D3 (sel endotel mikrovaskular otak manusia) dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 % serum fetus sapi dan antibiotik. LPS (1 µg/ml) digunakan untuk memolarisasi sel RAW 264.7 ke fenotipe M1, yang meniru aktivasi mikroglia dalam AD.

Persiapan NP terkurasin CS-BSA

CS dilarutkan dalam asam asetat 0,1 % (0,5 mg/ml). Kurkumin (0,05 mg/ml dalam 100 µl DMSO) dicampur ke dalam larutan CS di bawah pengadukan magnet pada suhu ruangan. Larutan BSA (1,0 mg/ml) kemudian ditambahkan secara tumpah, menghasilkan suspensi opalesen yang mendens menjadi nanopartikel padat melalui interaksi elektrostatis. Ukuran partikel, potensial zeta, dan morfologi dikarakterisasi oleh pencaran cahaya dinamis dan TEM. Peluncuran in vitro dievaluasi dalam larutan fosfat (pH 7,4) pada 37 °C, dan efisiensi kapsulasi (EE) dihitung sebagai EE % = (W_total – W_free)/W_total × 100 % di mana W_total adalah jumlah kurkumin awal dan W_free adalah supnatan.

Evaluasi Apoptosis Sel dengan MTT

NP CS-BSA polos (0–2,0 mg/ml) diinkubasi dengan sel RAW 264.7 (M1) dan hCMEC/D3 selama 24 jam untuk mengevaluasi sitotoksisitas melalui uji MTT.

Studi Penetrasi menggunakan Model BBB in vitro

Monolayer sel hCMEC/D3 (TEER > 300 Ω) dikultur pada sisip Transwell. Kurkumin bebas atau NP terkurasin CS-BSA (kurkumin setara 100 µg/ml) ditambahkan ke ruang atas. Setelah inkubasi 3 jam pada 37 °C, intensitas fluoresensi kurkumin (eksitasi 425 nm, emisi 530 nm) di ruang bawah diukur. Rasio fluoresensi relatif (RFR %) mengkuantifikasi efisiensi penetrasi. Inhibitor endositosis (klorpromazin, genistein, sitokalasin D, azida natrium) diterapkan untuk menguraikan mekanisme transportasi.

Penyerapan Seluler NP terkurasin CS-BSA

Mikroskop skaning konfokal laser (CLSM) mengevaluasi distribusi seluler kurkumin dalam sel RAW 264.7 (M1) setelah paparan dengan kurkumin bebas atau NP terkurasin melalui sistem Transwell. Fluoresensi hijau dari kurkumin dipantau pada interval 6, 12, dan 24 jam.

Deteksi Fagositosis Aβ 42 yang Diinduksi oleh Kurkumin Bebas dan NP terkurasin CS-BSA

Sel RAW 264.7 (M1) yang di-pretritasi dengan kurkumin bebas atau NP terkurasin diinkubasi dengan Aβ42 berlabel FITC selama 3 jam. Fagositosis dikuantifikasi oleh fluoresensi CLSM dan sitometria aliran.

Uji Western Blot

Tingkat ekspresi TNF-α, IL-6, TLR4, dan status fosforilasi ERK, JNK, p38, IκBα, dan NF-κB diperiksa oleh Western blot untuk menguraikan dampak NP terkurasin terhadap sumbu TLR4–MAPK/NF-κB.

Hasil

Karakterisasi NP terkurasin CS-BSA

Pencaran cahaya dinamis mengungkapkan diameter rata-rata 143,5 nm, potensial zeta –10,8 mV, dan indeks polidispersi 0,021. Citra TEM mengonfirmasi partikel sferis, monodispersi (Gambar 1). Efisiensi kapsulasi mencapai 95,4 %. Profil peluncuran menunjukkan ledakan awal 11,3 % dalam 3 jam, diikuti oleh peluncuran berkelanjutan selama 48 jam, yang menunjukkan perlindungan kurkumin yang efektif selama sirkulasi.

Penetrasi melalui model BBB in vitro

Penetrasi kurkumin bebas adalah 12,3 % (1 jam), 20,3 % (2 jam), dan 29,8 % (3 jam). NP terkurasin kurkumin mencapai 37,7 %, 45,6 %, dan 60,2 % penetrasi pada titik waktu yang sama, masing-masing (Gambar 2). Eksperimen inhibisi endositosis menunjukkan bahwa NP bergantung pada jalur endositosis bergantung energi, caveolae, dan makropinocytosis, sedangkan kurkumin bebas masuk ke sel terutama melalui difusi pasif.

Penilaian Sitotoksisitas

Uji MTT mengonfirmasi bahwa NP CS-BSA polos tidak sitotoksik terhadap sel RAW 264.7 (M1) dan hCMEC/D3 pada konsentrasi hingga 2,0 mg/ml (Gambar 3).

Penyerapan Seluler

Citra CLSM menunjukkan akuumulasi kurkumin yang bergantung pada waktu dalam sel RAW 264.7 (M1). NP terkurasin kurkumin menghasilkan fluoresensi seluler yang jauh lebih tinggi dibandingkan kurkumin bebas, yang menunjukkan pengiriman yang ditingkatkan (Gambar 4).

Fagositosis Aβ 42 yang Ditingkatkan

Kolokalisasi kurkumin (merah) dan FITC-Aβ42 (hijau) menunjukkan bahwa NP terkurasin kurkumin meningkatkan kehadiran seluler Aβ42 dalam sel RAW 264.7 (M1), seperti yang dibuktikan oleh densitas fluoresensi hijau yang lebih tinggi (Gambar 5). Ini menunjukkan bahwa tingkat kurkumin seluler yang ditingkatkan meningkatkan kapasitas fagositik mikroglia.

Analisis Western Blot

Dibandingkan kontrol yang tidak diobati, sel RAW 264.7 (M1) yang dipolarisasi LPS menunjukkan ekspresi TNF-α, IL-6, dan TLR4 yang ditingkatkan, dan peningkatan fosforilasi ERK, JNK, p38, dan NF-κB. NP terkurasin kurkumin secara signifikan mengurangi marker pro-inflamasi dan peristiwa sinyal ini, menekankan kapasitas mereka untuk menghambat polarisasi M1 (Gambar 6).

Pembahasan

Hasil kami mengonfirmasi bahwa NP CS-BSA secara signifikan meningkatkan pengiriman kurkumin melalui BBB, terutama melalui jalur endositosis caveolae dan makropinocytosis. Penetrasi otak yang ditingkatkan diterjemahkan menjadi konsentrasi kurkumin seluler yang lebih tinggi, yang pada gilirannya meningkatkan fagositosis Aβ42 mikroglia dan mengurangi beban patologis plak amiloid.

Efek anti-inflamasi NP terkurasin kurkumin terlihat melalui penahanan kaskad TLR4–MAPK/NF-κB dan pengregulasi turun TNF-α, IL-6, dan TLR4. Modulasi sitokin ini memolarisasi ulang makrofag dari fenotipe M1 neurotoksik menuju keadaan M2 anti-inflamasi, strategi terapeutik yang semakin diakui untuk modifikasi penyakit dalam AD.

Secara kolektif, temuan ini memposisikan NP terkurasin CS-BSA sebagai platform nanomedis multifaset yang secara bersamaan mengatasi pengiriman obat, penyisihan amiloid, dan neuroinflamasi—hambatan kunci dalam pengobatan AD.

Kesimpulan

NP terkurasin CS-BSA secara efektif menembus BBB, meningkatkan akuumulasi kurkumin seluler, dan mempromosikan fagositosis Aβ42 oleh mikroglia. Mereka juga mengurangi neuroinflamasi dengan menghambat jalur TLR4–MAPK/NF-κB dan mendukung polarisasi makrofag M2. Atribut ini secara kolektif menekankan janji terapeutik platform nano ini untuk penyakit Alzheimer.

Singkatan

AD

Penyakit Alzheimer

BBB

Baris darah-otak

BSA

Albumin sapi

CS

Chitosan

LPS

Lipopolisakarida

NPs

Nanopartikel

TLRs

Reseptor toll-like