Target Tumor dan Biokompatibel MoSe2 Nanodots@Albumin Nanospheres sebagai Agen Terapi Modalitas Ganda untuk Radioterapi Fototermal Sinergis
Abstrak
Mengintegrasikan beberapa fungsi terapi tumor ke dalam satu nanoplatform telah menjadi strategi terapi tumor baru dalam beberapa tahun terakhir. Di sini, agen terapi modalitas ganda yang terdiri dari molibdenum selenide nanodots (MoSe2 NDs) dan bovine serum albumin (BSA) merakit nanospheres (MoSe2 @BSA NSs) berhasil disintesis. Setelah konjugasi molekul asam folat (FA) melalui “jembatan” polietilen glikol (PEG), FA-MoSe2 @BSA NS dilengkapi dengan fungsi penargetan tumor. Modifikasi BSA dan PEG memberikan MoSe yang tidak stabil2 ND dengan stabilitas fisiologis yang sangat baik. Sejak FA-MoSe produk akhir2 @BSA NSs memiliki sifat serapan inframerah dekat (NIR) dan sinar-X yang kuat, mereka menunjukkan sifat fototermal yang baik dengan stabilitas fototermal yang sangat baik dan kemampuan sensitisasi radio, oleh karena itu, dieksplorasi sebagai agen radioterapi fototermal. Eksperimen in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs memiliki efek penargetan tumor yang sangat efisien, biokompatibilitas yang hebat, dan efek radioterapi fototermal sinergis. Pekerjaan ini menunjukkan bahwa FA-MoSe yang biokompatibel2 @BSA NSs mungkin merupakan agen terapi tumor modalitas ganda multifungsi yang menjanjikan untuk digunakan dalam terapi tumor kombinasi.
Latar Belakang
Secara global, kanker payudara terjadi pada tingkat insiden yang sangat tinggi pada wanita dan terkenal dengan tingkat kelangsungan hidup yang rendah dan tingkat metastasis dan kekambuhan yang tinggi [1,2,3]. Reseksi bedah, radioterapi (RT), dan kemoterapi merupakan strategi pengobatan yang umum digunakan dalam praktik meskipun terapi ini memiliki kelemahan [4]. RT adalah terapi yang sangat efektif tetapi juga berbahaya bagi jaringan normal. RT telah dieksplorasi untuk meningkatkan efek terapeutik sambil mengurangi efek berbahayanya. RT menggunakan radiasi pengion (misalnya, -ray, X-ray) untuk mengionisasi molekul air menjadi radikal bebas reaktif yang merusak DNA dalam sel kanker secara lokal, bahkan di daerah yang dalam [5]. Sejak lingkungan mikro tumor dilaporkan hipoksia, ini dianggap sebagai salah satu hambatan utama untuk RT [6, 7]. Mengingat kelemahan ini, menggabungkan RT dengan strategi terapi modalitas lain dilaporkan efisien dalam menambah efek terapeutik. Sampai saat ini, terapi fototermal (PTT) telah dieksplorasi secara luas sebagai pengobatan kanker invasif minimal karena efek samping yang lebih sedikit, spesifisitas tinggi, dan efek samping minimal pada jaringan normal [8,9,10,11,12,13,14,15] ]. Namun, PTT saja seringkali tidak mencukupi, karena penekanan tumor yang tidak lengkap, terutama untuk tumor yang tidak dapat diakses, yang berpotensi menyebabkan kekambuhan tumor [16,17,18]. Menariknya, PTT dilaporkan menyebabkan hipertermia yang diinduksi near-infrared (NIR) yang meningkatkan sirkulasi darah intratumor, dan selanjutnya meningkatkan ketersediaan oksigen di lingkungan mikro tumor, menyebabkan sel menjadi lebih sensitif terhadap RT [19,20,21]. Menggabungkan RT dengan PTT dapat menggabungkan keuntungan dari keduanya yang lebih disukai untuk meningkatkan hasil terapi kanker.
Baru-baru ini, dichalcogenides logam transisi (TMD) berlapis dua dimensi (2D), seperti MoS2 , WS2 , ReS2 , dan seterusnya, telah digunakan sebagai agen penyerap NIR atau sensitizer radio untuk meningkatkan kemanjuran PTT atau RT karena sifat fisiknya [7, 19, 21]. Shen dan rekan penulis telah melaporkan persiapan bottom-up dari ReS ultra tipis yang seragam2 nanosheet untuk PTT dan RT yang sangat efektif dipandu gambar [21]. Selain TMD ini, molibdenum selenide (MoSe2 ) telah dilaporkan sebagai transduser fototermal NIR untuk PTT [22, 23]. Karena PTT sendiri memiliki kelemahan, ada lebih banyak alasan untuk eksploitasi MoSe2 properti seperti radiosensitisasi untuk terapi kanker yang lebih baik.
Dalam pekerjaan ini, pertama-tama kami menyiapkan MoSe ultra-kecil2 nanodots, yang kemudian dirakit dengan bovine serum albumin (BSA) menjadi nanospheres (NSs) dan akhirnya dikonjugasikan dengan molekul penargetan tumor asam folat (FA) melalui "jembatan" polietilen glikol (PEG). Selain efek fototermal yang luar biasa, FA-MoSe yang diperoleh2 @BSA NSs ditemukan memiliki properti sensitisasi radio yang sangat baik. Modifikasi BSA memberikan MoSe2 nanodots (NDs) dengan stabilitas fisiologis dan biokompatibilitas yang sangat baik. Eksperimen in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs menunjukkan efek penargetan tumor yang sangat baik, sekaligus berfungsi sebagai agen fototermal NIR dan radio-sensitizer untuk radioterapi fototermal sinergis tanpa toksisitas pada jaringan kesehatan.
Metode
Materi
FA-PEG5000 -NHS dan CH3 -PEG5000 -NHS diperoleh dari Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Fluorescein isothiocyanate (FITC), bovine serum albumin (BSA, purified 98.0%), MoSe massal2 bubuk, dan pewarna Calcein-AM (CA)-propidium iodida (PI) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA). 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) diperoleh dari Aladdin (Shanghai, Cina). Reagen kultur sel semuanya disediakan oleh Corning Inc. Kit penghitungan sel-8 (CCK-8) dipasok oleh Dojindo Laboratories (Jepang). Antibodi -H2AX dipasok oleh Millipore (Temecula, CA).
Persiapan FA-MoSe2 @BSA NSs
Pertama, dalam prosedur umum, 50 mg MoSe2 bubuk ditambahkan ke dalam 25 mL air suling dengan pengadukan 20 menit dan kemudian disonikasi dalam penangas es dengan menggunakan tip sonikasi (Scientz-IID, 950 W, 25 kHz). Sonikasi berdenyut selama 2 detik dan 3 detik untuk total waktu sonikasi 12 jam dengan amplitudo 70%. Setelah itu, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 25 menit. Supernatan dikumpulkan dan disentrifugasi lagi pada 12.000 rpm selama 30 menit, menghasilkan MoSe2 nanodots (MoSe2 ND) solusi. Setelah itu, 25 mg bubuk BSA ditambahkan ke dalam supernatan di atas dengan sedikit pengadukan, membentuk koaservat yang mengeras setelah diaduk selama 6 jam pada suhu 25 °C dan pH = 7.4, kemudian diproses dengan ikatan silang dengan 0,5% glutaraldehid (250 μL). Selanjutnya glutaraldehid dihilangkan dengan cara dialisis dalam air selama 1 hari, menghasilkan MoSe2 @BSA nanospheres (MoSe2 @BSA NSs). Selanjutnya, MoSe2 @BSA nanospheres dibagi menjadi dua bagian, yang satu dicampur dengan FA-PEG5000 -NHS (8 mg), dan yang lainnya dicampur dengan CH3 -PEG5000 -larutan NHS (8 mg) dan diaduk selama 2 jam. Terakhir, larutan didialisis dalam air untuk menghasilkan FA-MoSe yang murni2 @BSA NSs dan MoSe2 @BSA NSs solusi. Larutan yang telah disiapkan disimpan pada suhu 4°C. Selain itu, spektrometer UV-VIS digunakan untuk mengukur FA pada FA-MoSe2 @BSA NS. Secara detail, setelah mencampur MoSe2 @BSA nanospheres dengan FA-PEG5000 -NHS (8 mg) dan bereaksi selama 2 jam, campuran disentrifugasi untuk menghilangkan FA yang tidak terikat. Supernate dikumpulkan untuk deteksi penyerapan. Konsentrasi FA dideteksi oleh spektrometer UV-vis pada panjang gelombang puncak serapan FA (280 nm). Efisiensi enkapsulasi FA (EE) dihitung seperti yang dijelaskan dalam persamaan berikut:
Morfologi sampel diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEOL JEM2011, Tokyo, Jepang) dan mikroskop elektron pemindaian (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK) digunakan untuk ukuran dan potensi zeta. Spektrum serapan ultraviolet-tampak (UV-Vis) direkam pada spektrofotometer ultraviolet-tampak UV2550 (Shimadzu, Kyoto, Jepang). Spektrum Fourier transform infrared (FTIR) dideteksi oleh spektrometer FTIR (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Jerman). Difraksi serbuk sinar-X (XRD) dari nanospheres direkam oleh difraktometer sinar-X (Seifert Jso-Debyerex-2002, Jerman). Kandungan Mo dalam sel dan jaringan diukur dengan spektrometri emisi atom plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-AES, Hitachi P4010, Jepang). Selama penyinaran NIR, variasi suhu dicatat setiap 30 detik menggunakan termometer termokopel (Fluke, USA).
Kultur Sel dan Serapan Seluler
Sel tumor mammae tikus 4T1 dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC) dan dikultur dalam media DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin pada 37 °C dengan 5% CO2 .
Untuk penyerapan seluler, FITC digunakan untuk memberi label NS melalui penyerapan fisik. Sel 4T1 melekat pada slide kaca di piring 6-sumur dan diinkubasi dengan FITC gratis, MoSe2 @BSA NSs, FA-MoSe2 @BSA NSs + FA, dan FA-MoSe2 @BSA NS pada konsentrasi FITC yang sama (0,05 mg/mL) masing-masing selama 3 jam. Sel kemudian dicuci dengan PBS tiga kali dan difiksasi dengan 0,2 mL glutaraldehid, diikuti dengan pewarnaan dengan DAPI selama 10 menit. Gambar fluoresensi sel ditangkap menggunakan mikroskop pemindaian laser. Untuk mengamati lebih lanjut penyerapan seluler, sel 4T1 (2 × 10
5
sel/sumur) dikultur dalam pelat kultur sel 6-sumur selama 24 jam dan kemudian diinkubasi dengan MoSe2 @BSA NSs, FA-MoSe2 @BSA NSs + FA, dan FA-MoSe2 @BSA NSs untuk tambahan 3 jam. Setelah itu, sel yang diberi perlakuan dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali, dihomogenkan, dan diberi 1 mL larutan aqua regia selama 4 jam. ICP-AES digunakan untuk mendeteksi konten Mo di dalam sel. Rasio serapan =\( \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} \)× 100%, di mana Ma adalah massa Mo di dalam sel, dan Mb adalah massa total Mo yang ditambahkan.
Biokompatibilitas In Vitro
Pertama, seluruh darah tikus kesehatan dikumpulkan untuk mendeteksi hemolisis in vitro dari FA-MoSe2 @BSA NS. Secara rinci, sel darah merah (RBC) dikumpulkan dengan sentrifugasi. Membuang supernatan, sel darah merah yang terkumpul dicampur dengan FA-MoSe2 @BSA NSs (dalam PBS, 1:4) pada konsentrasi yang telah ditentukan (50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, dan 400 μg/mL). Sebagai kontrol positif atau negatif, sel darah merah diinkubasi dengan air deionisasi atau PBS. Setelah diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam, kumpulan suspensi di atas disentrifugasi (10.000 rpm, 1 menit) dan absorbansi supernatan pada 541 nm dipantau dengan spektrometer UV-Vis. Rasio hemolisis dihitung menggunakan persamaan berikut.
dimana At , Apc , dan Anc adalah absorbansi supernatan masing-masing pada 541 nm sampel uji, kontrol positif dan negatif.
Selain itu, sitotoksisitas MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NSs terdeteksi oleh uji CCK-8 standar. Sel 4T1 (1 × 10
5
sel/mL, 0,5 mL) diunggulkan di piring 96-sumur dan dikultur selama 24 jam. Setelah membuang media lama, media baru yang mengandung 0,01, 0,1, 0,15, 0,3, dan 0,4 mg/mL MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS diinkubasi dengan sel 4T1 selama 24 jam. PBS digunakan untuk sedikit mencuci sel tiga kali. Larutan kerja 100 μL CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) kemudian ditambahkan ke setiap sumur, diikuti dengan inkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam. Nilai absorbansi pada 450 nm dideteksi menggunakan pembaca pelat mikro (Labtech, Inc., Durham, North Carolina).
Radioterapi Fototermal In Vitro
Pertama, kinerja fototermal in vitro dari NS diselidiki. MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS dengan konsentrasi Mo yang sama dikultur dengan sel selama 3 jam dan kemudian disinari dengan penyinaran NIR selama 5 menit (808 nm, 1 W/cm
2
). Suhu sel yang dirawat di setiap sumur dideteksi dengan kamera termal inframerah (Fluke TI25, USA), masing-masing.
Selanjutnya, untuk terapi fototermal in vitro, sel 4T1 yang melekat dikultur dengan konsentrasi MoSe2 yang berbeda. @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NSs selama 3 jam. NS di luar sel dihilangkan. Sel kemudian diperlakukan dengan atau tanpa NIR (808 nm, 1 W/cm
2
, 5 mnt) dan dosis penyinaran sinar-X yang berbeda (RT, 0–5 Gy, 0,084 Gy/s). Setelah inkubasi 24 jam lagi, viabilitas sel dideteksi dengan uji CCK-8 standar. Sel-sel yang dirawat di atas selanjutnya diwarnai bersama oleh calcein-AM/PI untuk mendeteksi sel hidup dan mati dan kemudian dicitrakan oleh mikroskop pemindaian laser confocal (calcein-AM:Ex = 488 nm, Em = 515 nm; PI:Ex =535 nm, Em = 617 nm). Selain itu, sel-sel yang dirawat juga dianalisis dengan imunofluoresensi -H2AX. Setelah perlakuan di atas, sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 10 menit dan ditembus dengan metanol selama 15 menit pada -20 °C dan dicuci dengan PBS. Setelah itu, sel-sel dicampur dengan buffer pemblokiran (1% BSA dalam larutan PBS) selama 1 jam pada 25 °C dan selanjutnya diinkubasi dengan antibodi monoklonal tikus anti-fosfo-histone -H2AX (pengenceran 1:500) semalaman pada suhu 4 ° C. Setelah pencucian PBS, fluoresensi sel diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal.
Model Hewan
Tikus telanjang Balb/c (5-8 minggu) disediakan dari Charles River Laboratories (Beijing, Cina). Untuk membuat model tumor 4T1 hewan, 150 μL dari 10
6
sel suspensi disuntikkan secara subkutan ke bagian belakang tikus. Tikus diberi makan di ruang hewan dan diamati setiap 2 hari sekali. Semua prosedur kesejahteraan dan eksperimental dalam penelitian ini dilakukan sesuai dengan kebijakan Kementerian Kesehatan Nasional dan disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Rakyat Pertama Kota Shangqiu. Saat volume tumor mencapai 100 mm
3
, tikus diterapkan untuk eksperimen in vivo.
In Vivo Biodistribusi dan Sirkulasi Darah
Biodistribusi sistemik NS diselidiki pada tikus yang mengandung tumor 4T1. Pada 1 jam, 1 hari, 7 hari, dan 24 hari setelah injeksi MoSe secara intravena2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA (10 mg/kg), tumor dan organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal) ditimbang dan dicerna dengan larutan aqua regia 12 jam. Kandungan Mo dan Se dalam jaringan ini dianalisis dengan ICP-AES. Selain itu, tikus Balb/c yang sehat disuntik secara intravena dengan FA-MoSe2 @BSA (10 mg/kg). Sekitar 10 μL darah dari ekor tikus dikumpulkan dan dianalisis oleh ICP-AES untuk sirkulasi darah.
Radioterapi Fototermal Vivo
Untuk radioterapi fototermal in vivo, tikus yang mengandung tumor (n = 5 per kelompok) diobati dengan PBS + NIR, PBS + RT, MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, dan FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT (dengan 5 mg/kg MoSe2 ). Dosis radioterapi adalah 5 Gy. Pada 24 jam pasca injeksi intravena, daerah tumor diradiasi dengan penyinaran NIR 5 menit (808 nm, 1 W/cm
2
). Selama iradiasi, gambar termal tikus direkam oleh kamera termal inframerah. Dalam 30 hari berikutnya, panjang dan lebar tumor dipantau setiap 4 hari. Volume tumor relatif dihitung sebagai V /V0 , di mana V0 mewakili volume tumor ketika pengobatan dimulai. Sementara itu, berat badan masing-masing tikus juga dipantau setiap 4 hari.
Biokompatibilitas Di Vivo
Untuk biokompatibilitas in vivo, 150 μL FA-MoSe2 @BSA NSs (15 mg/kg) disuntikkan secara intravena ke tikus telanjang Balb/c yang sehat. Sebelum injeksi dan setelah 30 hari, darah dikumpulkan untuk evaluasi jumlah darah lengkap termasuk sel darah putih (WBC), sel darah merah (RBC), hemoglobin (HGB), volume trombosit rata-rata (MPV), hemoglobin sel darah rata-rata (MCH), hematokrit (HCT), mean corpuscular hemoglobin konsentrasi (MCHC), mean corpuscular volume (MCV), dan trombosit (PLT). Pada saat yang sama, tikus dikorbankan dan jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dikumpulkan. Organ yang diperoleh difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dan dipotong menjadi irisan 5 m dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Bagian yang diwarnai dicitrakan dengan mikroskop digital.
Analisis Statistik
Data ditampilkan sebagai mean ± SD. t . Siswa Dua Sisi tes digunakan untuk menganalisis signifikansi statistik dari dua kelompok. Perbedaannya dianggap signifikan untuk *P < 0.05 dan sangat signifikan untuk **P < 0.01.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi FA-MoSe2 @BSA NSs
Prosedur persiapan FA-MoSe2 @BSA NSs digambarkan pada Gambar. 1a. Singkatnya, MoSe tidak stabil2 nanodot dibuat dari MoSe massal2 di bawah ultrasonikasi, kemudian distabilkan dan dirakit oleh protein BSA, dan dikonjugasikan secara bersamaan ke molekul target FA melalui "jembatan" PEG. MoSe yang disiapkan2 ND adalah nanodot ultra-kecil seperti yang diamati pada TEM (Gbr. 1b). Pola XRD MoSe2 ND ditampilkan di File tambahan 1:Gambar S1. Puncak difraksi pada 13,1° termasuk dalam bidang (002), cocok dengan posisi puncak MoSe curah2 . Puncak (002) yang berbeda menunjukkan adanya beberapa lapisan di sumbu c MoSe2 ND. Puncak difraksi bidang (100) untuk MoSe2 ND meluas secara signifikan dibandingkan dengan MoSe massal2 , yang mungkin berasal dari pengurangan ukuran MoSe2 ND [23]. Setelah perakitan dan konjugasi dengan protein BSA dan FA, nanokomposit membentuk partikel seperti bola (Gbr. 1c). Spektrum FTIR menunjukkan adanya ikatan –CONH- pada FA-MoSe2 @BSA NSs, menunjukkan bahwa FA kemungkinan terkonjugasi ke MoSe2 melalui ikatan ester (File tambahan 1:Gambar S2). Selain itu, kami telah menghitung FA pada FA-MoSe2 @BSA nanospheres, yaitu 10,5 ± 0,11%. Analisis DLS mengungkapkan bahwa diameter rata-rata MoSe2 ND dan FA-MoSe2 @BSA NS masing-masing sekitar 3,8 nm dan 139,8 nm (Gbr. 1d). Setelah 7 hari penyimpanan, ukuran MoSe2 ND meningkat dari 3,8 menjadi 63,2 nm, sementara FA-MoSe2 @BSA NS tidak menunjukkan perubahan ukuran yang jelas (Gbr. 1e), yang menunjukkan agregasi dan stabilitas MoSe yang rendah2 ND dalam penyimpanan jangka panjang. Selain itu, ketika tersebar di media yang berbeda seperti air, PBS, dan media sel, FA-MoSe2 @BSA NS menampilkan distribusi ukuran yang serupa (Gbr. 1f). Hasil ini menunjukkan FA-MoSe2 @BSA NS stabil dalam kondisi fisiologis dan peningkatan stabilitas MoSe2 ND kemungkinan dikaitkan dengan perakitan BSA dan pelapisan PEG [24, 25]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1g, spektrum ultraviolet-tampak (UV-Vis) dari MoSe2 ND dan FA-MoSe2 @BSA NSs memiliki karakteristik absorbansi NIR yang sama tinggi, menunjukkan bahwa modifikasi BSA dan FA tidak mempengaruhi absorbansi MoSe2 .
a Skema FA-MoSe2 Sintesis @BSA NS.b Gambar TEM MoSe2 ND. Inset adalah gambar TEM resolusi tinggi. c Gambar TEM dan SEM FA-MoSe2 @BSA NS. d Distribusi ukuran MoSe2 ND dan FA-MoSe2 @BSA NS. e Perubahan ukuran MoSe2 ND dan FA-MoSe2 @BSA NSs dalam air selama 7 hari. f Distribusi ukuran FA-MoSe2 @BSA NSs dalam air, PBS, dan medium, masing-masing. g Spektrum absorbansi MoSe2 ND dan FA-MoSe2 @BSA NSs
Efek Fototermal FA-MoSe2 @BSA NSs
Gambar 2a menunjukkan bahwa suhu FA-MoSe2 Larutan @BSA NSs meningkat dengan meningkatnya konsentrasi (0–200 μg/mL). Setelah penyinaran NIR (808 nm, 1 W/cm
2
) selama 5 mnt, perubahan suhu FA-MoSe2 Larutan @BSA NSs pada 200 μg/mL mencapai sekitar 41 °C, sedangkan suhu air murni hanya meningkat sekitar 1,5 °C dalam kondisi yang sama. Selain itu, perubahan suhu FA-MoSe2 @BSA NS disinari di bawah intensitas daya yang berbeda (0,5–2,0 W/cm
2
) selama 5 menit juga direkam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, suhu meningkat hingga maksimum 40,6°C dengan meningkatnya intensitas daya laser. Gambar 2c menggambarkan fotostabilitas FA-MoSe2 @BSA NSs, menyiratkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs mempertahankan efek fototermal yang sangat baik tanpa pelemahan kenaikan suhu setelah tiga siklus penyinaran NIR. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs memiliki fotostabilitas yang signifikan dan sifat fototermal yang sangat baik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2d, nilai unit Hounsfield (HU) FA-MoSe2 Gambar NS @BSA yang diperoleh dengan computed tomography (CT) berkorelasi positif dengan konsentrasinya, menunjukkan bahwa NS berpotensi digunakan sebagai radio-sensitizer.
a Kurva pemanasan fototermal FA-MoSe2 Solusi @BSA NS pada konsentrasi yang berbeda (0, 50, 100, dan 200 μg/mL) di bawah penyinaran laser 808 nm pada kerapatan daya 1 W/cm
2
. b Kurva pemanasan fototermal FA-MoSe2 Solusi @BSA NS pada 100 μg/mL di bawah penyinaran laser 808 nm pada kepadatan daya yang berbeda (0,5, 1, 1,5, dan 2 W/cm
2
). c Variasi suhu FA-MoSe2 @BSA NS di bawah tiga siklus penyinaran laser 808 nm pada kerapatan daya 1 W/cm
2
. d Gambar CT (inset) dan nilai HU FA-MoSe2 @BSA NS dengan konsentrasi berbeda
Serapan Seluler dan Biokompatibilitas In Vitro
Untuk mengevaluasi serapan seluler, MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS diberi label oleh FITC. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 3a, fluoresensi FITC yang jauh lebih kuat diamati di dalam sitoplasma di FA-MoSe2 Sel yang dirawat @BSA NSs, dibandingkan dengan MoSe2 @BSA NSs- dan sel yang diobati dengan FITC gratis. Analisis kuantitatif ICP-AES menunjukkan penyerapan seluler FA-MoSe yang lebih tinggi2 @BSA NS daripada MoSe2 @BSA NSs (Gbr. 3b). Hasil ini menunjukkan bahwa FA meningkatkan penyerapan seluler FA-MoSe2 @BSA NS. Menariknya, setelah pemblokiran FA, FA-MoSe2 Sel yang dirawat @BSA NSs menunjukkan fluoresensi FITC hijau yang lebih lemah di dalam sitoplasma dibandingkan dengan tanpa pemblokiran FA. Sejalan dengan itu, tingkat penyerapan sel FA-MoSe2 @BSA NSs + sel yang diberi FA lebih kecil dari FA-MoSe2 @BSA sel yang dirawat NSs. Ini menunjukkan bahwa reseptor FA pada membran sel dihalangi (oleh FA bebas), pada gilirannya, mengurangi kemampuan penargetan dan aksesibilitas FA-MoSe2 @BSA NS. Lebih lanjut menunjukkan bahwa reseptor FA diekspresikan secara berlebihan dalam sel 4T1 dan NS FA-MoSe2@BSA memasuki sel mungkin melalui jalur endositosis yang dimediasi reseptor [26, 27].
a Gambar fluoresensi confocal dari sel 4T1 setelah inkubasi dengan FITC gratis, dan MoSe berlabel FITC2 @BSA NSs, FA-MoSe2 @BSA NSs + pemblokiran FA, dan FA-MoSe2 @BSA NS. Warna merah dan biru masing-masing mewakili fluoresensi FITC dan inti sel bernoda DAPI. b Analisis kuantitatif ICP-AES sel 4T1 terhadap MoSe2 @BSA NSs, FA-MoSe2 @BSA NSs + pemblokiran FA, dan FA-MoSe2 @BSA NSs
Biokompatibilitas in vitro dari NS dievaluasi dengan analisis hemolisis dan sitotoksisitas. Gambar 4a tidak menunjukkan hemolisis yang jelas untuk FA-MoSe2 @BSA sel darah merah (sel darah merah) yang diobati dengan NSs atau sel darah merah yang diobati dengan PBS. Selain itu, ketika konsentrasi hingga 0,4 mg/mL MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS diinkubasi dengan sel selama 24 jam, ada penekanan viabilitas kurang dari 10%. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NS memiliki biokompatibilitas in vitro yang hebat.
a Rasio hemolisis sel darah merah setelah inkubasi 1 jam dengan FA-MoSe2 @BSA NSs pada konsentrasi yang berbeda. Sisipan menunjukkan foto sel darah merah yang terpapar air suling, PBS, dan FA-MoSe2 @BSA NSs dengan konsentrasi yang berbeda diikuti dengan sentrifugasi. b Viabilitas sel sel 4T1 setelah pengobatan dengan MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS pada konsentrasi yang berbeda selama 24 jam
Radioterapi Fototermal In Vitro
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, b, sel yang diperlakukan dengan FA-MoSe2 @BSA NSs menunjukkan peningkatan suhu tertinggi (ΔT = 23.6 °C) setelah 5 menit penyinaran NIR (808 nm, 1 W/cm
2
) dibandingkan dengan MoSe2 @BSA NSs- dan sel yang dirawat PBS. Gambar 5c menunjukkan peningkatan kemanjuran RT dengan penambahan FA-MoSe2 @BSA NS. Dengan meningkatnya dosis sinar-X, kemanjuran RT FA-MoSe2 @BSA NS meningkat lebih dari MoSe2 @BSA NS. Ditunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs dapat meningkatkan efek radioterapi, mungkin karena kemampuan redaman sinar-X mereka yang dapat memusatkan energi radiasi sinar-X di dalam sel tumor dan menghasilkan elektron Auger sekunder, yang mengakibatkan kerusakan DNA dan penekanan pertumbuhan sel [28, 29].
a Gambar termal PBS, MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NSs merawat sel, dan b kurva perubahan suhu yang sesuai di bawah penyinaran berkelanjutan dengan laser 808 nm (1 W/cm
2
). c Viabilitas sel dari sel 4 T1 yang diobati dengan PBS, MoSe2 @BSA NSs, dan FA-MoSe2 @BSA NSs dikombinasikan dengan dosis iradiasi sinar-X yang berbeda (0–5 Gy). d Viabilitas sel dari sel 4T1 yang dirawat dengan sampel berbeda di bawah laser NIR 808 nm (5 mnt, 1 W/cm
2
) dan penyinaran sinar-X (5 Gy)
Untuk evaluasi lebih lanjut dari efek terapi gabungan RT dan PTT, sel 4T1 diobati dengan hanya NIR atau RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, atau FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5d, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + kelompok yang diobati dengan RT menunjukkan kematian sel yang bergantung pada konsentrasi yang paling signifikan, dengan tingkat penekanan 92,8%. Efek terapeutik yang sangat baik dari FA-MoSe2 @BSA NS kemungkinan karena (1) ablasi fototermal PTT dan kerusakan DNA oleh RT FA-MoSe2 @BSA NSs, dan (2) Penargetan FA meningkatkan internalisasi sel FA-MoSe2 @BSA NSs dan dengan demikian menghasilkan lebih banyak panas dan sinar-X untuk membunuh sel.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, beberapa sel mati dapat diamati pada kelompok kontrol PBS + NIR dan PBS + RT. Meskipun sel-sel mati ditemukan di FA-MoSe2 @BSA NSs + RT atau FA-MoSe2 Grup @BSA NSs + NIR, tetapi sel hidup masih ada. Sebaliknya, di FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + kelompok RT, lebih dari 95% sel rusak dan menunjukkan fluoresensi merah, menunjukkan bahwa gabungan RT dan PTT FA-MoSe2 @BSA NS dapat meningkatkan efisiensi terapi.
a Hidup-mati dan b Gambar pewarnaan -H2AX dari sel 4T1 yang dirawat dengan PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, dan FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, masing-masing
Sejak FA-MoSe2 @BSA NSs memiliki absorbansi sinar-X yang tinggi, berpotensi memiliki kemampuan untuk meningkatkan RT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, tingkat sinyal -H2AX yang sangat rendah diamati pada kelompok yang diberi perlakuan PBS, FA-MoSe2 @BSA NS saja, dan FA-MoSe2 @BSA NSs + kelompok yang diobati dengan NIR. Sementara itu, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + kelompok yang diberi RT menunjukkan tingkat sinyal -H2AX yang lebih tinggi, menunjukkan kerusakan DNA yang lebih signifikan di dalam inti sel. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-MoSe2 @BSA NSs dapat meningkatkan efek RT yang dikaitkan dengan kemampuan redaman sinar-X, yang akan memusatkan energi radiasi sinar-X di dalam sel tumor dan menghasilkan elektron sekunder dan Auger untuk menyebabkan kerusakan DNA dan penekanan pertumbuhan sel [30–32].
Biodistribusi dan Sirkulasi Darah Di Vivo
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7a, b, pada 24 jam pasca injeksi, elemen Mo dan Se terakumulasi dalam tumor kecuali hati dan ginjal. Kandungan unsur Mo dalam jaringan tumor pasca injeksi MoSe2 @BSA NSs dan FA-MoSe2 @BSA NS juga dievaluasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7c, kadar Mo dalam jaringan tumor untuk FA-MoSe2 Kelompok yang diobati dengan NSs @BSA meningkat seiring waktu dan mencapai puncaknya pada 24 jam setelah injeksi, yang lebih tinggi daripada MoSe2 @BSA grup yang dirawat NS. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs. The Mo t1/2 α (blood distribution half-life) and t1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe2 @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe2 @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.
a Mo dan b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs
In Vivo Photothermal Radiotherapy
As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm
2
) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe2 @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe2 @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe2 @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe2 was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm
2
). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe2 @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe2 @BSA NSs (Fig. 8d).
a In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm
2
). b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P < 0.01 vs control group and other groups
In Vivo Biocompatibility
As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe2 @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe2 @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.
a H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe2 @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe2 @BSA NSs
Conclusions
In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe2 @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe2 @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe2 NDs, FA-MoSe2 @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe2 @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe2 @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe2 @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.
