Vesikel Etosomal Beban ALA/Nanopartikel Emas Kompatibel Biologis: Strategi Transdermal Sinergi Fotodinamik/Fototermal untuk Pengobatan Luk Bekas Hipertrofis
Abstrak
Kami melaporkan vesikel etosomal (A/A-ES) yang kompatibel secara biologis dan dibeban bersama 5-aminolevulinat (ALA) serta nanopartikel emas (AuNPs) yang disiapkan melalui ultrasonikasi tanpa reagen toksik. A/A-ES menunjukkan pita absorpsi plasmonik yang terprona pada 600–650 nm, yang memungkinkan aktivasi fotodinamik (PDT) dan fototermal (PTT) bersamaan menggunakan laser 632 nm. Studi transdermal in vitro mengonfirmasi bahwa A/A-ES menyampaikan ALA dan AuNPs secara efisien ke jaringan luka bekas hipertrofis (HS), mencapai retensi ALA 48 % setelah 2 jam. Uji selular dengan fibroblast luka bekas hipertrofis (HSF) menunjukkan bahwa A/A-ES secara signifikan meningkatkan produksi spesies reaktif oksigen (ROS) dan generasi panas, yang mengarah pada apoptosis dan nekrosis yang ditingkatkan dibandingkan PDT atau PTT sendirian. Hasil ini menyoroti A/A-ES sebagai platform topikal yang menjanjikan untuk PDT/PTT sinergis pada HS.
Latar Belakang
Luka bekas hipertrofis (HS) timbul dari deponesi kolagen dermis yang berlebihan dan ditandai dengan kulit tebal dan fibrotik yang dapat mengganggu fungsi dan estetika. Pengobatan konvensional—termasuk suntikan intralesi, pakaian tekanan, dan terapi laser—sering menderita efisiensi terbatas, ketidaknyamanan, atau efek samping seperti hipopigmentasi dan atrofi jaringan. Terapi fotodinamik (PDT) menggunakan 5-aminolevulinat (ALA) menawarkan sitotoksisitas selektif melalui generasi ROS, namun kegunaan klinisnya terhambat oleh penetrasi kulit yang buruk dan hasil ROS yang rendah. Terapi fototermal (PTT), terutama dengan nanopartikel emas (AuNPs) yang mengonversi cahaya menjadi panas melalui resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR), dapat meningkatkan produksi ROS dan secara selektif menghancurkan jaringan luka bekas, namun daya laser tinggi berisiko merusak kulit di sekitarnya.
Menggabungkan PDT dan PTT dalam satu platform menjanjikan manfaat sinergis: generasi ROS yang diedarkan ALA dapat diperkuat oleh panas dari AuNPs, sementara efek fototermal dapat meningkatkan suhu lokal, yang lebih meningkatkan hasil ROS. Vesikel etosomal (ES) menyediakan pembawa berbasis lipid yang dapat diubah yang meningkatkan pengiriman transdermal obat hidrofilik dan lipofilik. Pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa ES yang dibeban ALA (ALA-ES) secara signifikan outperforming larutan air dalam pengiriman ALA ke jaringan HS. Namun, integrasi AuNPs ke dalam ES sambil mempertahankan kompatibilitas biologis dan pengiriman yang efisien tetap tantangan. Di sini, kami menyajikan sintesis A/A-ES yang mudah berbasis ultrasonikasi yang secara bersamaan mengenkapsulasi ALA dan AuNPs tanpa pelarut toksik, mencapai entrapment ALA yang tinggi (≈20 %) dan absorpsi yang kuat pada 600–650 nm.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi A/A-ES
Ultrasonikasi melayani dua tujuan: (1) menghasilkan AuNPs in-situ melalui reduksi radikal dari AuCl₄⁻, sehingga menghilangkan agen reduksi toksik; (2) menginduksi reorganisasi lapisan lipid, menghasilkan vesikel kecil berukuran seragam dengan inti internal yang luas untuk pemuatan obat. Spektroskopi UV-Vis mengonfirmasi puncak absorpsi yang kuat pada 600–650 nm (Gambar 1a), yang disebabkan oleh kopling plasmonik antara AuNPs yang berdekatan. Pencaran cahaya dinamis menunjukkan distribusi ukuran yang sempit yang berpusat pada 166 ± 83 nm (Gambar 1b), sementara gambar SEM/TEM menunjukkan vesikel bulat utuh (~200 nm) dengan AuNPs yang terlihat jelas tertanam dalam lapisan (Gambar 1c,d). Efisiensi entrapment (EE) ALA mencapai 20 %, melebihi nilai yang dilaporkan untuk formulasi ES konvensional (<10 %). Karakteristik ini menunjukkan bahwa A/A-ES sangat cocok untuk melintasi matriks kolagen padat dari HS.
a Spektrum UV-Vis ES, ALA, dan A/A-ES. b Distribusi ukuran A/A-ES. c, d Gambar SEM dan TEM A/A-ES
Studi Penetrabilitas Transdermal In Vitro A/A-ES
Menggunakan sel difusi Franz, kami mengukur retensi ALA dan AuNPs dalam jaringan HS yang baru diangkut. Keduanya mencapai puncak pada 2 jam, mencapai 48 % dosis ALA yang diterapkan dalam jaringan (Gambar 2a). Penurunan serentak setelahnya mencerminkan permeasi transdermal yang lengkap. Gambar TEM (Gambar 2b–d) mengonfirmasi vesikel utuh dalam dermis, diikuti oleh pelepasan AuNPs yang mengagregasi in-situ—menguntungkan untuk generasi panas pada iradiasi laser. Data ini menginisiasi A/A-ES sebagai pembawa yang efektif untuk pengiriman gabungan ALA dan AuNPs ke dalam jaringan HS.
a Retensi ALA dan AuNPs. b Distribusi A/A-ES dalam jaringan HS. c Distribusi ES dan AuNPs. d Akumulasi AuNP dalam jaringan HS
PDT/PTT In Vitro pada HSF
Uji Kompatibilitas Biologis
Uji keberadaan sel menunjukkan tidak ada sitotoksisitas yang signifikan untuk A/A-ES pada konsentrasi ≤2,0 mM, dengan kelangsungan >90 % setelah 12 jam (Gambar 3). Dosis yang lebih tinggi hanya menyebabkan penurunan kecil, mengonfirmasi profil keamanan formulasi dan memandu konsentrasi terapeutik sebesar 2,0 mM (≈14 % v/v) untuk eksperimen selanjutnya.
Keberadaan sel HSF setelah paparan 12 jam dengan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES dalam kegelapan.
PDT/PTT untuk HSF
Mikroskopi konfokal menunjukkan akumulasi protoporfirin IX (PpIX) yang kuat pada HSF yang diobati ALA-ES dan A/A-ES; Au-ES menghasilkan PpIX yang tidak signifikan (Gambar 4). Pada iradiasi laser 632 nm, fluoresensi PpIX berkurang sementara sinyal ROS bertambah, terutama pada sel yang diobati A/A-ES—bukti peningkatan generasi ROS melalui LSPR AuNP. Perubahan morfologi, seperti membrane blebbing, terlihat jelas pada sel yang diobati A/A-ES, menunjukkan kematian sel. Termografi inframerah mengonfirmasi bahwa ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES meningkatkan suhu lokal menjadi 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) dan 36,5 °C (ALA-ES) pada iradiasi, dengan pendinginan yang cepat setelahnya (Gambar 5). Temuan ini menekankan tindakan fotodinamik dan fototermal ganda dari A/A-ES.
Gambar konfokal HSF yang diobati ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES sebelum dan setelah iradiasi laser 632 nm.
Pemetaan inframerah HSF yang diobati ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES selama dan setelah iradiasi.
Uji Apoptosis dan Nekrosis
Citometri aliran sel yang diwarnai Annexin V/PI mengungkapkan bahwa A/A-ES yang diiradiasi laser menginduksi fraksi nekrosis tertinggi (61,8 %) dibandingkan ALA-ES (47,7 %) dan Au-ES (24,3 %) (Gambar 6). Apoptosis awal dan akhir juga ditingkatkan pada A/A-ES, mencerminkan efek sinergi dari amplifikasi ROS dan stres fototermal. Hasil ini secara kuantitatif menunjukkan keunggulan pendekatan PDT/PTT gabungan dibandingkan modalitas tunggal.
Uji apoptosis HSF yang diobati ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES dengan/ tanpa laser. Analisis statistik sel hidup, apoptosis awal, apoptosis akhir, dan sel nekrotik.
Visualisasi A/A-ES dalam HSF
Mikroskopi elektron transmisi mengungkapkan agregasi AuNPs yang ekstensif dalam sitoplasma HSF yang diobati A/A-ES, konsisten dengan fusi vesikel yang efisien dan pelepasan beban. Gambar pasca-iradiasi menunjukkan membrane blechs karakteristik, mitochondria bengkak, dan membran luar yang pecah—ciri khas kematian sel (Gambar 7). Perubahan ultrastruktur ini mengonfirmasi bahwa A/A-ES efektif menyampaikan ALA dan AuNPs ke HSF, yang mengarah pada pembunuhan sel fotodinamik dan fototermal yang sinergis.
Mikroskopi cahaya HSF sebelum dan setelah iradiasi (a,b). Gambar TEM sebelum dan setelah iradiasi (c,d).
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan vesikel etosomal (A/A-ES) yang kompatibel secara biologis dan disintesis secara ultrasonik dengan beban 5-ALA/AuNP yang menunjukkan absorpsi kuat pada 600–650 nm, entrapment ALA yang tinggi (~20 %), dan pengiriman transdermal yang efisien ke jaringan HS. Studi in vitro mengonfirmasi bahwa A/A-ES meningkatkan produksi ROS dan pemanasan fototermal, yang menghasilkan apoptosis dan nekrosis HSF yang unggul dibandingkan PDT atau PTT sendirian. Temuan ini mendukung A/A-ES sebagai platform topikal yang menjanjikan untuk terapi fotodinamik/fototermal sinergis pada luka bekas hipertrofis, yang memerlukan evaluasi in vivo di masa depan.
Eksperimen dan Metode
Persiapan A/A-ES
Fosfatidilkolin (180 mg) dilarutkan dalam 1,8 mL etanol, 0,6 mL 10 mM HAuCl₄, dan 3,6 mL 0,01 M larutan sitrat ALA (pH 4,0, 12 mg ALA). Campuran diaduk pada 700 rpm selama 10 menit, kemudian di-sonikasi pada 200 W selama 30 menit sampai warna merah anggur muncul. Sentrifugasi (8000 rpm, 20 menit) menghilangkan reagen yang tidak bereaksi, dan pelet didispersikan kembali dalam 3 mL larutan ALA hidroalkoholik 2 mg/mL. Metode pemuatan gradien pH transmembran diterapkan untuk menangkap ALA dalam inti vesikel, menghasilkan A/A-ES akhir. Untuk perbandingan, ALA-ES dan Au-ES disiapkan dengan konsentrasi ALA atau AuNP yang identik tetapi tanpa komponen lain.
Karakterisasi A/A-ES
Morfologi dievaluasi dengan TEM (JEOL, 120 kV) setelah pewarnaan negatif dengan 1,5 wt % asam fostotungstik. SEM (JEOL, 10 kV) mengevaluasi fitur permukaan. Distribusi ukuran diukur dengan DLS (Nicomp 380ZLS). Kandungan ALA dikuantifikasi melalui derivatisasi fluoresamin, dan EE dihitung dengan ultrafiltraasi. Spektrum UV-Vis direkam pada spektrofotometer Varian Cary 50.
Studi Penetrabilitas In Vitro dengan Sel Difusi Franz
Jaringan HS (≤24 jam pasca-angkut) dipasang pada sel Franz dengan stratum corneum menghadap kompartemen donatur. Satu mililiter A/A-ES diterapkan, dan reseptor dipertahankan pada 37 °C. Setelah interval yang ditentukan, jaringan dicuci, dihomogenkan, dan ALA diekstraksi melalui dialisis selama 24 jam. Retensi AuNP dikuantifikasi dengan ICP-MS. Setelah paparan 2 jam, jaringan diproses untuk pengirisan tipis dan citra TEM.
PDT/PTT In Vitro untuk HSF
Budidaya Sel
HSF diisolasi dari biopsi luka bekas hipertrofis pasien menggunakan pencernaan kolagenase I dan dibudidayakan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 % FBS pada 37 °C, 5 % CO₂. Sel digunakan pada pasase 2–3.
Uji Kompatibilitas Biologis
HSF (2 × 10³ sel/well) diekspos kepada pengenceran berurutan ALA-ES, Au-ES, atau A/A-ES dalam medium bebas FBS selama 12 jam. Keberadaan sel diukur dengan CCK-8.
Prosedur PDT/PTT
HSF (4 × 10⁴ sel/well) diinkubasi dengan 14 % v/v A/A-ES atau kontrol selama 6 jam, kemudian dicuci dan diiradiasi dengan laser He-Ne 632 nm, 40 mW/cm² selama 20 menit. Pasca-iradiasi, sel dibudidayakan dalam DMEM dengan 10 % FBS selama 24 jam sebelum uji selanjutnya.
Uji Generasi PpIX dan ROS Intrakeluler
PpIX dan ROS divisualisasikan dengan CLSM (Leica TCS SP5). Pewarnaan DCFH-DA mengukur ROS, sementara fluoresensi PpIX ditangkap pada eksitasi 405 nm/emisi 635 nm.
Uji Apoptosis dan Nekrosis
Pewarnaan ganda Annexin V-FITC/PI diikuti oleh citometri aliran BD FACSCalibur menentukan tingkat apoptosis dan nekrosis. Data dianalisis dengan FlowJo 7.6.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai rata-rata ± SD. Uji t Student menentukan signifikansi (P < 0,05).
Singkatan
A/A-ES:
Vesikel etosomal yang dibeban 5-aminolevulinat/nanopartikel emas
