Co-delivery Dacarbazine dan All-Trans Retinoic Acid (ATRA) Menggunakan Lipid Nanoformulations untuk Khasiat Antitumor Sinergis Melawan Melanoma Maligna
Abstrak
Melanoma maligna adalah kanker kulit yang sangat agresif yang bertanggung jawab atas 80% kematian, dan kelangsungan hidup rata-rata keseluruhan pada pasien dengan melanoma metastatik hanya 6-9 bulan. Pengobatan kombinasi melalui pemberian simultan obat ganda dalam nanocarrier tunggal telah terbukti elegan dan efektif dalam memerangi kanker. Di sini, kami menggunakan terapi kombinasi berdasarkan dacarbazine (DBZ), obat yang disetujui FDA untuk melanoma dan all-trans retinoic acid (ATRA), agen antikanker yang menjanjikan yang dimuat pada lipid nanoformulations (RD-LNF) sebagai strategi pengobatan baru untuk melanoma ganas. Kami telah berhasil mengenkapsulasi kedua obat dalam nanoformulasi lipid dan menunjukkan pelepasan muatan yang terkontrol dari waktu ke waktu. Kami menunjukkan bahwa pengiriman DBZ dan ATRA secara bersamaan dapat secara efektif mengurangi proliferasi sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Nanopartikel kombinasional secara signifikan mengurangi kemampuan pembentukan koloni sel melanoma B16F10. Analisis flow cytometer menunjukkan bahwa RD-LNF menginduksi proporsi sel apoptosis yang lebih besar dengan penghambatan yang signifikan terhadap perkembangan siklus sel dan migrasi sel. Hasil ini menunjukkan potensi RD-LNF yang menjanjikan dalam pengobatan melanoma maligna dengan kemanjuran tinggi.
Pengantar
Melanoma maligna merupakan salah satu keganasan agresif yang terjadi terutama pada kulit manusia [1]. Melanoma menyumbang 4% dari semua kanker dermatologis namun bertanggung jawab atas 80% kematian akibat kanker kulit dan menjadi perhatian yang berkembang di negara-negara terbelakang dan berkembang [2, 3]. Melanoma memiliki kecenderungan tinggi untuk bermetastasis ke berbagai bagian tubuh termasuk otak, jantung, dan paru-paru menjadikannya salah satu bentuk keganasan yang agresif [4]. Jika didiagnosis pada tahap awal, eksisi bedah merupakan pilihan terapi potensial. Namun, intervensi bedah tidak menjamin pemulihan lengkap dari melanoma [5]. Selain itu, fase pertumbuhan radial keganasan ini menjadi resisten terhadap sebagian besar pilihan pengobatan lain termasuk kemoterapi dan radioterapi [6]. Secara spesifik, reseptor peptida diekspresikan secara berlebihan pada permukaan kanker melanoma sehingga menjadikannya prospek yang menarik. Reseptor somatostatin subtipe-2 (SSTR2) telah terbukti sangat terekspresi dalam sel melanoma [7].
Dacarbazine (DBZ) atau dimethyl-triazeno-imidazole carboxamide (DTIC), agen alkilasi DNA adalah satu-satunya dan pilihan lini pertama obat kemoterapi yang disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) [8]. DBZ adalah agen alkylating kuat yang membunuh sel kanker dengan menambahkan gugus alkil pada DNA atau bahan inti sel kanker [9]. Meskipun aksinya yang kuat, DBZ menderita kelarutan air yang buruk dan waktu paruh yang pendek (41 menit) dalam sirkulasi darah sehingga mengurangi efek terapeutiknya dalam pengobatan keganasan melanoma [10]. Selain itu, tingkat respons yang mengecewakan antara 10 dan 25% diamati dengan pemulihan kanker lengkap kurang dari 5% yang menunjukkan keterbatasan terapi agen tunggal [11, 12]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan strategi alternatif untuk meningkatkan kemanjuran pengobatan DBZ.
Co-pengiriman beberapa agen terapeutik dalam administrasi tunggal terbukti lebih efektif dibandingkan dengan agen terapeutik individu [13]. Co-pengiriman agen terapeutik dalam sistem pembawa tunggal akan memberikan aktivitas sinergis, sifat farmakokinetik serupa, dan kemanjuran antikanker yang lebih tinggi [14]. All-trans-retinoic acid (ATRA) adalah agen antikanker yang menjanjikan yang digunakan dalam pengobatan beberapa kanker [15]. ATRA menunjukkan kemanjuran terapeutiknya dengan mengikat reseptor asam retinoat dalam inti sel kanker yang mengakibatkan penghambatan pertumbuhan, proliferasi, diferensiasi, dan akhirnya kematian sel [16]. Tidak seperti agen kemoterapi lainnya, ATRA tidak menyebabkan efek samping seperti kardiotoksisitas atau hipoplasia sumsum tulang. ATRA telah dilaporkan untuk meningkatkan kemanjuran antikanker bila digunakan dalam kombinasi dengan agen kemoterapi yang tepat. Sekali lagi, ATRA lipofilik mengalami kelarutan air yang buruk dan pembersihan sistemik yang cepat sehingga memerlukan sistem pengiriman yang stabil [17].
Sistem pengiriman nanopartikulat telah terbukti meningkatkan kemanjuran terapeutik dari terapi yang dienkapsulasi dengan melepaskannya di jaringan tumor target dan dengan menghindari efek di luar target dalam sirkulasi sistemik menggunakan efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR) [18, 19]. Nanopartikel lipid padat (SLN) dianggap sebagai alternatif untuk banyak pembawa yang ada termasuk liposom atau misel karena fitur yang menonjol seperti peningkatan stabilitas, pelepasan obat terkontrol, efisiensi pemuatan tinggi, dan kemudahan persiapan / peningkatan skala [20] . Salah satu aspek penting dari SLN sebagai pembawa penghantaran obat adalah profil keamanan lipid yang berstatus GRAS, ditoleransi dengan baik, dan lipid fisiologis [21]. Penggabungan obat yang stabil dalam inti lipid meningkatkan kelarutan dalam air dan meningkatkan profil farmakokinetik dan memperluas stabilitas fisiologis dalam sirkulasi sistemik [22].
Dalam penelitian ini, kami membahas strategi pengiriman bersama DBZ dan ATRA yang menjanjikan menggunakan nanoformulasi lipid untuk pengobatan kombinasi pada keganasan melanoma. DBZ diharapkan dimuat di inti lipid sementara ATRA diharapkan menjadi bagian dari struktur nanopartikel. Kami mempelajari sifat fisikokimia, serapan seluler, dan sitotoksisitas in vitro dari nanopartikel gabungan. Selain itu, efek antikanker dievaluasi lebih lanjut dengan uji apoptosis, analisis siklus sel, pembentukan koloni, dan analisis migrasi sel.
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami telah berhasil memformulasi dacarbazine dan all-trans retinoic acid-loaded lipid nanoformulations. Hasil kami dengan jelas menunjukkan bahwa RD-LNF menghambat proliferasi sel melanoma, menginduksi apoptosis yang luar biasa, dan menghambat perkembangan siklus sel dan migrasi sel. Pekerjaan futuristik akan fokus pada mempelajari kemanjuran antikanker pada model hewan yang relevan secara klinis dan mengembangkan terapi yang ditargetkan terhadap keganasan melanoma. Ini adalah studi pendahuluan yang dilakukan pada sel melanoma dan studi rentang luas pada model hewan yang relevan secara klinis berbeda adalah bagian selanjutnya dari pekerjaan penelitian kami.
Bahan dan Metode
Persiapan DBZ/ATRA-Loaded Lipid Nanoformulations
Nanopartikel lipid yang mengandung obat disiapkan dengan metode sonikasi. Secara singkat, 10 mg DBZ dan 10 mg ATRA dilarutkan dalam 2 ml larutan kloroform yang mengandung 50 mg Egg l-α-phosphatidylcholine (PC) dan 2 mg DSPE-methyl(polyethylene glycol)-2000 (mPEG2000 ). Pelarut organik dikeringkan menggunakan paparan gas argon selama 20 menit. Campuran obat + lipid kering ditambahkan dengan 80 mg trimiristin (Tm) dan diinkubasi pada suhu 65 °C selama 1 jam. Ke dalam campuran minyak ini, 5 ml larutan poloxamer 4% ditambahkan dan segera disonikasi pada 80 W selama 6 menit. Emulsi yang dihasilkan didinginkan pada es selama 30 menit. Nanopartikel menjadi sasaran unit filter sentrifugal Amicon Ultra 0.5 (cutoff 3 kDa; Merck, Jerman) pada 12000×g selama 20 menit. Jumlah DBZ dan ATRA bebas dalam filtrat dievaluasi dengan metode HPLC dan efisiensi pemuatan dan kapasitas pemuatan dihitung. Sistem HPLC Waters yang terdiri dari pompa biner Waters 1525, detektor UV Waters 2487, detektor fluoresensi Waters 2475, pemanas kolom 1500, dan kolom Simetri C18 digunakan untuk analisis obat. Untuk ATRA, fase gerak terdiri dari asetonitril dan asam trifluoroasetat dalam rasio 90/10 v/v pada laju aliran 1 ml/menit dan terdeteksi pada 348 nm. Untuk DBZ, digunakan asetonitril dan dinatrium hidrogen fosfat 0,05 M dalam rasio 30/70 v/v yang mengandung 0,5% TEA. PH fase gerak dipertahankan pada pH 3,7 dan laju aliran 1 ml/menit digunakan.
Ukuran Partikel dan Analisis Morfologi
Distribusi ukuran partikel nanopartikel gabungan dievaluasi oleh Malvern Zetasizer Nano ZS90 dengan laser He-Ne (633 nm). Semua sampel diencerkan dengan air suling dan percobaan dilakukan pada 24 ° C dalam rangkap tiga. Morfologi nanopartikel dievaluasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM; JEOL JEM200CX pada 120 kV). Partikel yang diencerkan diwarnai dengan asam fosfotungstat 2%, dikeringkan, dan diamati di bawah TEM.
Pelepasan Obat In Vitro dari Formulasi Nano Drug-Loaded
Pelepasan obat yang dienkapsulasi dievaluasi dengan metode dialisis. Dua mililiter nanopartikel berisi obat yang mengandung setara dengan 1 mg ATRA dan 1 mg DBZ disegel dalam membran dialisis (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa). Tabung dialisis ditempatkan dalam 25 ml buffer rilis dan disimpan pada rotasi 100 rpm pada 37 ° C. Pada interval waktu yang telah ditentukan hingga 72 jam, 1 ml sampel diambil dan diganti dengan buffer segar dengan jumlah yang sama. Jumlah DBZ dan ATRA dievaluasi dengan metode HPLC seperti dijelaskan di atas.
Kultur Sel dan Analisis Serapan Seluler
Sel melanoma kulit murine (B16F10) dibeli dari China Infrastructure of Cell Line Resources (Beijing, China). Sel-sel dikultur dalam media RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% campuran antibiotik. Medium diganti secara teratur setiap 2 hari dan dibiakkan setelah konfluensi 90%. Untuk analisis serapan seluler, sel B16F10 diunggulkan dalam pelat 6-sumur selama inkubasi 24 jam. Nanopartikel dimuat dengan Coumarin-6 sebagai pelacak fluoresen. Media lama telah dihapus dan diganti dengan media baru yang mengandung nanopartikel Coumarin-6-lipid dan diinkubasi selama 1-3 jam dalam urutan terbalik. Sel-sel dicuci dan dibuang dengan scrapper sel. Sel-sel disentrifugasi pada 1200 rpm selama 5 menit dan pelet sel disuspensikan kembali dalam 1 ml PBS dingin. Sampel dinilai dengan flow cytometer AccuriTM C6 (BD Co., USA).
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Efek sitotoksik ATRA bebas, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF pada sel B16F10 dievaluasi dengan uji MTT. Sel (1 × 10
4
) diunggulkan di setiap sumur dari pelat 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel pertama kali diobati dengan konsentrasi ATRA dan DBZ bebas yang berbeda dan menguji efek antikankernya pada sel melanoma. Diikuti oleh, sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi tetap ATRA bebas, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF masing-masing pada 25 g/ml dan 50 g/ml. Sel-sel diinkubasi selama 24 jam dan kemudian media dikeluarkan dengan hati-hati dan dicuci dua kali dengan PBS. Pada akhirnya, sel diperlakukan dengan 100 l larutan MTT 5 mg/ml dan diinkubasi selama 4 jam. Media kultur dikeluarkan dengan hati-hati dan 100 l isopropanol ditambahkan dan diinkubasi selama 15 menit dalam kondisi pengocokan. Kristal formazan terlarut dipelajari pada 570 nm menggunakan pembaca lempeng mikro. Sel yang tidak diberi perlakuan digunakan sebagai kontrol dan perhitungan dibuat berdasarkan viabilitas sel kontrol.
Pengujian Apoptosis—Flow Cytometer
Efek apoptosis dari ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas dalam sel B16F10 dievaluasi setelah pewarnaan dengan kit apoptosis berbasis PE annexin V dan 7AAD. Sel-sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan sel 2 × 10
5
sel/sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diperlakukan dengan 25 g/ml setara dengan formulasi ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF gratis dan sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Setelah 24 jam paparan pengobatan, sel diwarnai sesuai dengan protokol pabrikan. Flow cytometer AccuriTM C6 digunakan untuk ekspresi PE dan 7AAD dan minimal 10.000 kejadian diperoleh dalam flow cytometer. Sel PE-positif dan 7AAD-negatif mengalami apoptosis awal; Sel PE-positif dan 7AAD-positif mengalami apoptosis yang terlambat.
Analisis Siklus Sel—Flow Cytometer
Sel-sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan sel 2 × 10
5
sel/sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diperlakukan dengan 25 g/ml setara dengan formulasi ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF gratis dan sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Setelah 24 jam, sel-sel yang dirawat dicuci dan dikumpulkan dengan tripsinisasi dan difiksasi dengan etanol 70% selama 2 jam pada suhu 4 °C. Sel kemudian diperlakukan dengan ribonuklease untuk menghilangkan kontaminasi RNA. Sekarang, sel-sel diwarnai dengan propidium iodida (PI) selama 30 menit pada 37 ° C dalam inkubator. Fluoresensi sel yang diwarnai PI ditentukan oleh flow cytometer AccuriTM C6. Fase siklus sel dibagi menjadi fase subG1, G1, S, dan G2/M.
Pengujian Pembentukan Koloni
Sel-sel diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan sel 2 × 10
5
sel/sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diperlakukan dengan 25 g/ml setara dengan formulasi ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF gratis. Sel-sel yang dirawat ditripsinisasi, dicuci dan dihitung menggunakan penghitung sel. Sel-sel tersebut kemudian disemai di piring 6-sumur dengan kepadatan 1500 sel / sumur. Sel-sel kemudian diinkubasi dalam kondisi lingkungan 37 ° C selama 12 hari sampai koloni terlihat. Sel-sel dicuci dengan PBS dan difiksasi dengan metanol menjadi asam asetat hingga air (1:1:8) selama 10 menit, diikuti dengan pewarnaan dengan pewarna kristal violet 0,1% selama 45 menit. Sel-sel yang diwarnai kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya.
Uji Migrasi Sel
Ruang transwell dua belas sumur dengan ukuran pori 8 m digunakan untuk pengujian ini. Untuk memulai studi, 5 × 10
4
sel / sumur diunggulkan di ruang atas. Medium atas tidak memiliki FBS sedangkan medium ruang bawah terdiri dari 10% FBS. Setelah 24 jam, jumlah sel yang bermigrasi ke permukaan membran bawah difiksasi dan diwarnai dengan pewarna kristal violet 0,5%. Jumlah sel dihitung dalam lima bidang yang dipilih secara acak di bawah mikroskop cahaya; jumlah rata-rata sel dicatat dan dianalisis.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± SD dan dilakukan dalam rangkap tiga kecuali dan disebutkan secara terpisah. Dua kelompok dibandingkan menggunakan t . yang tidak berpasangan sedangkan perbandingan lebih dari dua kelompok dilakukan menggunakan one way ANOVA dengan uji perbandingan ganda Turki. Statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism dan perbedaan p <0,05 dianggap signifikan.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi Formulasi Nano Lipid yang Diisi DBZ/ATRA
Pengobatan melanoma tetap menjadi tantangan utama dan pilihan pengobatan standar termasuk kemoterapi atau radioterapi atau reseksi bedah hanya akan efektif pada tumor padat yang disertai dengan prognosis yang buruk. FDA telah menyetujui obat-obatan seperti paclitaxel atau kombinasinya, tetapi gagal meningkatkan dampak keseluruhan pada kelangsungan hidup pasien dan penyembuhan kanker. Dacarbazine (DBZ) adalah pilihan obat kemoterapi lini pertama yang disetujui oleh FDA; namun, DBZ memiliki sifat fisikokimia yang buruk dan menghasilkan tingkat respons yang mengecewakan antara 10 dan 25%. Untuk menghadapi tantangan ini, kami telah mengembangkan strategi terapi baru kombinasi dengan ATRA dan DBZ dalam nanoformulasi lipid (Gbr. 1). Kami berhipotesis bahwa kombinasi dua komponen terapeutik akan meningkatkan kemanjuran antitumor pada keganasan melanoma. Perlu dicatat bahwa ATRA meskipun menunjukkan sifat antikanker, tidak mengakibatkan efek buruk pada lingkungan sistemik [23]. Karena DBZ bersifat hidrofobik, kami telah merancang formulasi nano lipid yang dapat secara stabil menggabungkan obat hidrofobik dalam inti lipid dan ATRA akan dimuat sebagai komponen struktural nanopartikel. Nanopartikel lipid yang membawa komponen terapeutik akan membantu mengantarkan tumor jauh ke dalam tubuh. Efisiensi pemuatan DBZ dan ATRA masing-masing adalah 91,2 ± 1,25% dan 95,8 ± 1,14%. Kapasitas pemuatan DBZ dan ATRA di RD-LNF masing-masing adalah 7,07 ± 0,65% b/b dan 7,48 ± 1,05% b/b. Ukuran partikel D-LNF teramati 121,5 ± 1,65 nm dengan indeks polidispersitas (PDI) 0,134 dan potensial zeta -23,5 ± 0,85 mV. Ukuran partikel RD-LNF adalah 138,2 ± 1,28 nm dengan PDI 0,159 dan potensial zeta 25,4 ± 0,58 mV. Peningkatan ukuran partikel secara keseluruhan terutama disebabkan oleh beban struktural ATRA; namun, ukuran akhir RD-LNF kurang dari 150 nm yang memungkinkan akumulasi tumor melanoma maligna karena efek EPR. Selain itu, keberadaan PEG hidrofilik akan mencegah agregasi partikel dan mengurangi penyerapannya oleh sistem retikuloendotelial (RES) dan dengan demikian meningkatkan kinerja sistemiknya di dalam tubuh. Muatan permukaan sekitar – 25 mV akan memberikan stabilitas penyimpanan yang sangat baik. Morfologi partikel diselidiki dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gbr. 2). Seperti yang terlihat, baik D-LNF dan RD-LNF berukuran bulat sempurna dan terdistribusi secara merata dalam jaringan tembaga. Perbedaan ukuran antara D-LNF dan RD-LNF konsisten dengan pengamatan DLS. Kurangnya puing-puing partikel, partikel kecil, dan agregasi menunjukkan keberhasilan proses formulasi.
Struktur dacarbazine (DBZ) dan all-trans retinoic acid (ATRA). Ilustrasi skema dari DBZ/ATRA-loaded lipid nanoformulations disajikan. Nanoformulasi lipid dibuat dengan metode ultrasonikasi. Baik DBZ dan ATRA adalah molekul hidrofobik dengan berat molekul kurang dari 300 g/mol. Molekul hidrofobik diharapkan terkonsentrasi di inti nanopartikel yang distabilkan oleh surfaktan
Analisis morfologi D-LNF dan RD-LNF menggunakan mikroskop elektron transmisi. Gambar representatif yang menggambarkan morfologi yang akurat disajikan
Analisis Stabilitas dan Pelepasan Obat In Vitro dari D-LNF dan RD-LNF
RD-LNF menunjukkan stabilitas yang sangat baik pada kondisi pH 7,4 (PBS) dan serum (10% FBS) (Gbr. 3a). Ukuran partikel tidak menunjukkan peningkatan yang signifikan pada kedua kondisi selama periode penelitian yang menunjukkan stabilitas nanopartikel. Kemampuan pelepasan obat secara tepat waktu menentukan efektivitas sistem nanopartikel yang memuat obat. Kami telah melakukan kinetika pelepasan DBZ dan ATRA dari D-LNF dan RD-LNF dalam saline buffer fosfat (PBS, pH 7,4). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, tidak ada pelepasan meledak atau pelepasan bertahap obat yang diamati dari salah satu sistem dua nanopartikel yang menunjukkan pemuatan stabil di inti nanopartikel dan tidak di permukaan nanopartikel. Tidak ada perbedaan signifikan dalam pelepasan DBZ yang diamati dari D-LNF dan RD-LNF yang menunjukkan bahwa keberadaan ATRA tidak memperlambat atau mengubah pola pelepasan obat. Sedikit keterlambatan dalam pelepasan obat DBZ dari RD-LNF mungkin dikaitkan dengan peningkatan panjang jalur yang dikaitkan dengan ATRA dalam struktur lipid. Sangat menarik untuk dicatat bahwa ATRA dirilis secara signifikan lebih lambat dibandingkan dengan DBZ dalam sistem pembawa RD-LNF. Perbedaan yang signifikan mulai muncul setelah 24 jam sampai 72 jam terutama disebabkan oleh sifat hidrofobik ekstrim dari ATRA dan menjadi bagian dari komponen struktural. Secara keseluruhan, kurangnya pelepasan meledak dan pelepasan komponen terapeutik yang terkontrol akan menguntungkan pengobatan kanker melanoma.
a Analisis stabilitas RD-LNF pada kondisi pH 7,4 dan serum (10% FBS). b Pelepasan obat in vitro DBZ dari D-LNF; dan pelepasan obat in vitro DBZ dan ATRA dari RD-LNF. Studi pelepasan dilakukan dalam saline buffer fosfat (pH 7,4) selama 72 jam masa studi. Hasil disajikan sebagai mean ± standar deviasi (n =4)
Serapan Seluler In Vitro
Serapan seluler yang lebih tinggi atau ditingkatkan dari nanopartikel menentukan kemanjuran terapeutik dalam sel kanker. Kami telah melakukan pengambilan seluler RD-LNF dalam sel kanker B16F10 dan Coumarin-6 digunakan sebagai pelacak fluoresen. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, internalisasi nanopartikel yang luar biasa diamati setelah 1 jam inkubasi nanopartikel dan penyerapan meningkat secara konsisten hingga 3 jam. Penyerapan nanoformulasi lipid yang luar biasa konsisten dengan serapan seluler yang lebih tinggi dari sistem pembawa berbasis lipid. Itu berspekulasi difusi pasif dan mekanisme berbasis endositosis mungkin bertanggung jawab atas serapan seluler yang lebih tinggi. Nanopartikel setelah endositosis akan mencapai lisosom tempat obat yang dienkapsulasi dibebaskan dan menunjukkan tindakan farmakologisnya masing-masing.
Analisis serapan seluler in vitro sel melanoma B16F10. Sel-sel kanker diobati dengan RD-LNF dan waktu inkubasi bervariasi dari 1 jam hingga 3 jam dan serapan seluler dianalisis menggunakan flow cytometer. Coumarin-6 digunakan sebagai pelacak fluoresen
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Uji MTT dilakukan pada sel B16F10 setelah pengobatan dengan formulasi masing-masing untuk mengevaluasi efek antikanker dari agen terapeutik individu (Gbr. 5a). Pada awalnya, sitotoksisitas DBZ dan ATRA bebas individu dievaluasi. DBZ menunjukkan efek sitotoksik yang bergantung pada konsentrasi dalam sel kanker melanoma sementara ATRA menunjukkan efek sitotoksik yang lebih tinggi secara signifikan dalam sel B16F10. Pada 100 g/ml, DBZ menunjukkan ~ 45% viabilitas sel dibandingkan dengan ~ 22% viabilitas sel untuk ATRA yang menunjukkan kemanjuran terapeutik ATRA yang sangat baik. Untuk membuktikan pengiriman bersama DBZ dan ATRA berpotensi menghambat perkembangan kanker, DBZ + ATRA-loaded lipid nanoformulations (RD-LNF) diperlakukan ke sel melanoma. DBZ-loaded lipid nanoformulations (D-LNF) yang mengandung obat entitas tunggal digunakan sebagai kelompok referensi untuk menyoroti kemanjuran sinergis ATRA (Gbr. 5b). Seperti yang diharapkan, pada 25 g/ml konsentrasi tetap, ATRA menunjukkan viabilitas sel yang sedikit lebih rendah dibandingkan dengan DBZ sementara D-LNF berbasis nanopartikel tidak meningkatkan efek antikanker DBZ dan tetap jauh dari efektif. Seperti yang diharapkan, RD-LNF menunjukkan viabilitas sel yang secara signifikan lebih rendah dan efek antikanker yang lebih tinggi dibandingkan dengan D-LNF yang menunjukkan efek terapeutik sinergis yang nyata dari komponen ganda terhadap kematian sel kanker melanoma. RD-LNF menunjukkan efek antikanker yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok pengobatan lainnya. Mungkin diharapkan bahwa pelepasan DBZ yang lambat dan berkelanjutan bersama dengan pelepasan ATRA yang lambat dari sistem nanocarrier dapat berkontribusi pada efek terapeutik sinergis. Dalam penelitian ini, dacarbazine (DBZ) adalah obat kemoterapi utama dan ATRA digunakan sebagai komponen struktural nanopartikel lipid, oleh karena itu tidak membuat kelompok terpisah untuk R-LNF. Kami telah mempelajari efek antikanker dari ATRA dan DBZ dalam sel kanker. Selain itu, banyak laporan yang diterbitkan adalah bukti efek antikanker dari ATRA; oleh karena itu, kami telah menggunakan ATRA sebagai komponen struktural yang juga dapat meningkatkan kemanjuran antikanker dari terapi yang dienkapsulasi secara sinergis.
a Uji sitotoksisitas in vitro dari DBZ dan ATRA bebas dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. b Sitotoksisitas in vitro dari ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas pada konsentrasi tetap 25 g/ml dan 50 g/ml
Uji Pembentukan Koloni
Uji pembentukan koloni dilakukan untuk mengevaluasi potensi tumorigenesis sel melanoma. Seperti yang ditunjukkan, DBZ dan ATRA bebas memiliki peran terbatas dalam menghambat pembentukan koloni dan demikian pula, D-LNF tidak efektif dalam mengendalikan pembentukan koloni (Gbr. 6). Seperti yang diharapkan, kombinasi DBZ + ATRA menghasilkan potensiasi penghambatan pembentukan koloni yang signifikan dibandingkan dengan obat bebas individu atau nanopartikel bermuatan obat tunggal. Uji formulasi koloni selanjutnya menegaskan kembali kemanjuran antikanker yang unggul dari RD-LNF dibandingkan obat-obatan gratis.
Pengaruh ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas terhadap pembentukan koloni. Sel B16F10 diperlakukan dengan formulasi masing-masing dan pembentukan koloni difoto setelah pewarnaan kristal violet
Pengujian Apoptosis In Vitro dan Analisis Siklus Sel
Induksi apoptosis sel B16F10 setelah pengobatan dengan D-LNF dan RD-LNF dipelajari menggunakan flow cytometer setelah pewarnaan sel dengan campuran Annexin V-FITC/PI (Gbr. 7a). Seperti yang ditunjukkan, ATRA dan DBZ hanya menyebabkan 10-12% apoptosis sel kanker dan sebagian besar sel tetap utuh. Sedikit peningkatan sel apoptosis awal diamati setelah pengobatan D-LNF mungkin menunjukkan efek pembawa pengiriman. Yang penting, RD-LNF menginduksi proporsi sel apoptosis yang lebih besar dengan proporsi sel yang lebih besar pada apoptosis akhir dan apoptosis awal yang menunjukkan kemanjuran antikanker superior dari nanopartikel kombinasional. RD-LNF menunjukkan bahwa sel apoptosis akhir meningkat 21,5% sementara sel apoptosis awal meningkat hingga 18,3% dan proporsi sel yang layak menurun dari 95 menjadi 52%, masing-masing, menunjukkan bahwa kombinasi DBZ + ATRA berkontribusi pada apoptosis sel kanker dan dapat menghambat penghambatan proliferatif sel melanoma B16F10. Efek apoptosis dari formulasi selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis siklus sel. Seperti yang ditunjukkan, DBZ dan ATRA menunjukkan sedikit peningkatan pada populasi sub-G0 sementara D-LNF menunjukkan populasi sub-G0 yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan obat bebas individu (Gbr. 7b). Khususnya, peningkatan luar biasa dalam populasi sub-G0 diamati untuk sel melanoma yang diobati dengan RD-LNF yang menunjukkan apoptosis sel kanker yang ditandai. Diketahui bahwa DBZ dapat meningkatkan level ekspresi p21, caspase-3, dan cleaved PARP dan dengan demikian mendorong apoptosis sel melalui stabilisasi p53. Induksi p53 akan menghambat perkembangan siklus sel [24, 25]. Kombinasi DBZ + ATRA diharapkan dapat mempotensiasi mekanisme apoptosis dan menghentikan perkembangan siklus sel sel kanker dan menunjukkan khasiat antikanker.
a Ilustrasi apoptosis sel B16F10 setelah pengobatan dengan ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF gratis. Sel-sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol yang tepat. Apoptosis dianalisis menggunakan flow cytometer. b Ilustrasi analisis siklus sel yang dilakukan dalam sel B16F10 setelah perawatan dengan formulasi masing-masing
Pengaruh Nanopartikel Kombinasi pada Migrasi Sel
Migrasi sel dianalisis melalui membran transwell dan mengamati sel yang bermigrasi dengan pewarnaan kristal violet (Gbr. 8). Setelah 24 jam, sel kontrol hampir mencapai migrasi lengkap sel kanker. ATRA tampaknya menghambat migrasi sel yang relatif lebih baik daripada sel yang diobati dengan DBZ. D-LNF juga menunjukkan efek penghambatan penting pada migrasi sel; namun, efek migrasi sel yang paling luar biasa diamati pada sel melanoma B10F16 yang diobati dengan RD-LNF. Seperti yang terlihat, penurunan manifold dalam migrasi sel diamati dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati. Hasil ini dengan jelas menunjukkan bahwa RD-LNF berpotensi menurunkan proliferasi sel ganas yang menyimpang dan menekan migrasi sel secara efisien.
Mikrofotograf representatif dari uji migrasi sel sel B16F10 setelah perawatan dengan ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF gratis dan kuantifikasinya
