Efek Antitumor yang Ditingkatkan dari Pengiriman Bersama Dakarbazin dan Asit Retinoik Trans-Telus melalui Nanopartikel Lipid untuk Melanoma Malignan
Abstrak
Melanoma maligan adalah kanker kulit yang sangat agresif dan bertanggung jawab atas 80% kematian, dan kelangsungan hidup median keseluruhan pasien dengan melanoma metastatic hanya 6–9 bulan. Pengobatan kombinasi melalui pemberian ganda obat secara bersamaan dalam satu nanosir telah terbukti elegan dan efektif dalam mengatasi kanker. Di sini, kami menerapkan terapi kombinasi berdasarkan dakarbazin (DBZ), obat yang disetujui FDA untuk melanoma dan asit retinoik trans-telus (ATRA), agen antikanker yang menjanjikan yang dimuat pada formulasi nano lipid (RD-LNF) sebagai strategi pengobatan baru untuk melanoma maligan. Kami berhasil mengenkapsulasi kedua obat dalam formulasi nano lipid dan menunjukkan pelonggaran beban yang terkontrol seiring waktu. Kami mendemonstrasikan bahwa pengiriman bersamaan DBZ dan ATRA dapat secara efektif mengurangi proliferasi sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Nanopartikel kombinasi secara signifikan mengurangi kemampuan pembentukan koloni sel melanoma B16F10. Analisis sitometer aliran menunjukkan bahwa RD-LNF menginduksi proporsi sel apoptosis yang lebih besar dengan inhibisi signifikan pada progresi siklus sel dan migrasi sel. Hasil ini menunjukkan potensi yang menjanjikan RD-LNF dalam pengobatan melanoma maligan dengan efikasi tinggi.
Pendahuluan
Melanoma maligan adalah salah satu malignancy agresif yang terutama terjadi pada kulit manusia [1]. Melanoma hanya berupa 4% dari semua kanker dermatologis namun bertanggung jawab atas 80% kematian kanker kulit dan menjadi kekhawatiran yang meningkat di negara kurang berkembang dan berkembang [2, 3]. Melanoma memiliki kecenderungan tinggi untuk metastas ke berbagai bagian tubuh termasuk otak, jantung, dan paru-paru, menjadikannya salah satu bentuk malignancy yang agresif [4]. Jika didiagnosis pada tahap awal, eksisi bedah adalah salah satu opsi terapeutik potensial. Namun, intervensi bedah tidak menjamin pemulihan lengkap dari melanoma [5]. Selain itu, fase pertumbuhan radial dari malignancy ini menjadi resistant terhadap sebagian besar opsi pengobatan lain termasuk kemoterapi dan radioterapi [6]. Secara spesifik, reseptor peptide diekspresi berlebihan pada permukaan kanker melanoma menjadikannya prospek yang menarik. Reseptor somatostatin tipe-2 (SSTR2) telah ditunjukkan diekspresi tinggi pada sel melanoma [7].
Dakarbazin (DBZ) atau dimethyl-triazeno-imidazol karboksamida (DTIC), agen alquilasi DNA adalah pilihan obat kemoterapi satu-satunya dan garis pertama yang disetujui oleh Badan POM (FDA) [8]. DBZ adalah agen alquilasi yang kuat yang membunuh sel kanker dengan menambahkan grup alkil ke DNA atau materi nuklir sel kanker [9]. Meskipun tindakan yang kuat, DBZ menderita keberlanjutan air yang buruk dan umur paruh pendek (41 menit) dalam sirkulasi darah yang mengurangi efek terapeutiknya dalam pengobatan malignancy melanoma [10]. Selain itu, tingkat respons yang mengecewakan antara 10 dan 25% diamati dengan kurang dari 5% pemulihan kanker lengkap yang menunjukkan keterbatasan terapi agen tunggal [11, 12]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan strategi alternatif untuk meningkatkan efektivitas pengobatan DBZ.
Pengiriman bersama beberapa agen terapeutik dalam satu pemberian terbukti lebih efektif dibandingkan dengan agen terapeutik individu [13]. Pengiriman agen terapeutik dalam satu sistem pengiriman akan memberikan aktivitas sinergis, properti farmakokinetik yang sama, dan efikasi antikanker yang lebih tinggi [14]. Asit retinoik trans-telus (ATRA) adalah agen antikanker yang menjanjikan yang digunakan dalam pengobatan beberapa kanker [15]. ATRA menunjukkan efek terapeutiknya dengan terikat pada reseptor asit retinoik dalam nukleus sel kanker yang mengakibatkan inhibisi pertumbuhan, proliferasi, diferensiasi, dan pada akhirnya kematian sel [16]. Tidak seperti agen kemoterapi lainnya, ATRA tidak mengakibatkan efek samping apapun seperti kardiotoksisitas atau hipoplasia sumsum tulang. ATRA telah dilaporkan meningkatkan efikasi antikanker ketika digunakan dalam kombinasi dengan agen kemoterapi yang sesuai. Lagi, ATRA lipofilik menderita keberlanjutan air yang buruk dan penglihatan sistemik yang cepat yang menuntut kebutuhan akan sistem pengiriman yang stabil [17].
Sistem pengiriman partikulat telah ditunjukkan meningkatkan efektivitas terapeutik obat yang dienkapsulasi dengan melepaskannya pada jaringan tumor target dan menghindari efek off-target dalam sirkulasi sistemik dengan memanfaatkan efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR) [18, 19]. Nanopartikel lipid padat (SLN) dianggap sebagai alternatif bagi banyak pembawa yang ada termasuk liposom atau miksel karena fitur yang menonjol seperti stabilitas yang ditingkatkan, pelonggaran obat yang terkontrol, efisiensi muatan tinggi, dan kemudahan persiapan/pengskalaan [20]. Salah satu aspek penting SLN sebagai pembawa pengiriman obat adalah profil keamanan lipid yang memiliki status GRAS, baik ditoleransi, dan lipid fisiologis [21]. Penggabungan stabil obat pada inti lipid meningkatkan keberlanjutan air dan meningkatkan profil farmakokinetik serta memperpanjang stabilitas fisiologis dalam sirkulasi sistemik [22].
Dalam studi ini, kami mengatasi strategi yang menjanjikan pengiriman bersama DBZ dan ATRA menggunakan formulasi nano lipid untuk pengobatan kombinasi dalam malignancy melanoma. DBZ diharapkan dimuat pada inti lipid sementara ATRA diharapkan menjadi bagian dari struktur nanoparticle. Kami mempelajari properti fisikokimia, pengambilan seluler, dan toksisitas sel in vitro dari nanoparticle gabungan. Selain itu, efek antikanker lebih dievaluasi dengan assay apoptosis, analisis siklus sel, pembentukan koloni, dan analisis migrasi sel.
Kesimpulan
Kesimpulannya, kami berhasil merumuskan formulasi nano lipid yang dimuat dakarbazin dan asit retinoik trans-telus. Hasil kami secara jelas menunjukkan bahwa RD-LNF menghambat proliferasi sel melanoma, menginduksi apoptosis yang luar biasa, dan menghambat progresi siklus sel dan migrasi sel. Pekerjaan di masa depan akan berfokus pada studi efikasi antikanker dalam model hewan yang relevan klinis dan mengembangkan terapi terpadu terhadap malignancy melanoma. Ini adalah studi preliminer yang dilakukan pada sel melanoma dan studi luas yang lebih banyak dalam berbagai model hewan yang relevan klinis adalah bagian selanjutnya dari pekerjaan penelitian kami.
Materi dan Metode
Persiapan Formulasi Nano Lipid Dimuat DBZ/ATRA
Nanopartikel lipid dimuat obat disiapkan dengan metode sonikasi. Secara singkat, 10 mg DBZ dan 10 mg ATRA dilarutkan dalam 2 ml larutan kloroform yang mengandung 50 mg Egg l-α-fosfatidilkolin (PC) dan 2 mg DSPE–metil(polietilen glikol)-2000 (mPEG2000). Pelarut organik dikeringkan dengan paparan gas argon selama 20 menit. Campuran obat + lipid yang kering ditambahkan dengan 80 mg trimiristin (Tm) dan diinkubasi pada 65 °C selama 1 jam. Ke dalam campuran minyak ini, 5 ml larutan poloksamer 4% ditambahkan dan segera disonikasi probe pada 80 W selama 6 menit. Emulsi yang dihasilkan didinginkan di es selama 30 menit. Nanopartikel disubjekkan pada unit filter sentrifugal Amicon Ultra 0,5 (putus 3 kDa; Merck, Jerman) pada 12000×g selama 20 menit. Jumlah DBZ dan ATRA bebas dalam filtrat dievaluasi oleh metode HPLC dan efisiensi muatan serta kapasitas muatan dihitung. Sistem HPLC Waters yang terdiri dari pompa biner Waters 1525, detektor UV Waters 2487, detektor fluoresensi Waters 2475, pemanas kolum 1500, dan kolum Symmetry C18 digunakan untuk analisis obat. Untuk ATRA, fase seluler terdiri dari asetonitril dan asam trikloroasetat dalam rasio 90/10 v/v dengan laju alur 1 ml/min dan terdeteksi pada 348 nm. Untuk DBZ, asetonitril dan fosfat hidrogen natrium 0,05 M dalam rasio 30/70 v/v yang mengandung 0,5% TEA digunakan. pH fase seluler dipertahankan pada pH 3,7 dan laju alur 1 ml/min digunakan.
Analisis Ukuran dan Morfologi Partikel
Distribusi ukuran partikel nanoparticle gabungan dievaluasi oleh Malvern Zetasizer Nano ZS90 dengan laser He-Ne (633 nm). Semua sampel dicairkan dengan air tisu dan eksperimen dilakukan pada 24 °C tiga kali. Morfologi nanoparticle dievaluasi oleh mikroskop elektron transmisi (TEM; JEOL JEM200CX pada 120 kV). Partikel yang dicairkan diwarnai dengan asam fosfotungstik 2%, dikeringkan, dan diamati di bawah TEM.
Pelepasan Obat In Vitro dari Formulasi Nano Dimuat Obat
Pelepasan obat yang dienkapsulasi dievaluasi oleh metode dialisis. Dua mililiter nanoparticle dimuat obat yang mengandung setara 1 mg ATRA dan 1 mg DBZ ditutup dalam membran dialisis (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa). Tab dialisis ditempatkan dalam 25 ml buffer pelarasan dan dipertahankan pada rotasi 100 rpm pada 37 °C. Pada interval waktu yang ditentukan hingga 72 jam, 1 ml sampel diambil dan diganti dengan buffer segar dalam jumlah yang sama. Jumlah DBZ dan ATRA dievaluasi oleh metode HPLC seperti yang dijelaskan di atas.
Kultur Sel dan Analisis Pengambilan Seluler
Sel melanoma kulit tikus (B16F10) dibeli dari Infrastruktur Baris Sel China (Beijing, China). Sel dikultur dalam medium RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% campuran antibiotik. Medium diganti secara teratur setiap 2 hari dan dikultur setelah konfluensi 90%. Untuk analisis pengambilan seluler, sel B16F10 ditanam dalam lelangka 6 sumur selama 24 jam inkubasi. Nanopartikel dimuat dengan Coumarin-6 sebagai pelacak fluoresensi. Medium lama dihilangkan dan diganti dengan medium segar yang mengandung nanoparticle lipid Coumarin-6 dan diinkubasi selama 1–3 jam dalam urutan terbalik. Sel dicuci dan dicabut dengan penggaruk sel. Sel disenterifikasi pada 1200 rpm selama 5 menit dan pelet sel dicampur kembali dalam 1 ml PBS dingin. Sampel dievaluasi oleh sitometer aliran AccuriTM C6 (BD Co., AS).
Assay Toksisitas Sel In Vitro
Efek toksis bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF pada sel B16F10 dievaluasi oleh assay MTT. Sel (1 × 104) ditanam di setiap sumur lelangka 96 sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel pertama diobati dengan konsentrasi berbeda bebas ATRA dan DBZ dan diuji efek antikankernya pada sel melanoma. Selanjutnya, sel diobati dengan konsentrasi tetap bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF pada 25 μg/ml dan 50 μg/ml, masing-masing. Sel diinkubasi selama 24 jam dan kemudian media dihaluskan dan dicuci dua kali dengan PBS. Pada akhirnya, sel diobati dengan 100 μl larutan MTT 5 mg/ml dan diinkubasi selama 4 jam. Medium kultur dihaluskan dan 100 μl isopropanol ditambahkan dan diinkubasi selama 15 menit dalam kondisi goyangan. Kristal formazan yang terlarut diteliti pada 570 nm menggunakan pembaca lelangka. Sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol dan perhitungan dilakukan berdasarkan kelangsungan hidup kontrol.
Assay Apoptosis—Sitometer Aliran
Efek apoptosis bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF pada sel B16F10 dievaluasi setelah pewarnaan dengan kit apoptosis PE annexin V dan 7AAD. Sel ditanam dalam lelangka 12 sumur dengan densitas sel 2 × 105 sel/lelangka dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diobati dengan 25 μg/ml setara bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF formulasi dan sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Setelah 24 jam paparan obat, sel diwarnai sesuai protokol produsen. Sitometer aliran AccuriTM C6 digunakan untuk ekspresi PE dan 7AAD dan minimal 10.000 peristiwa diadkuisisi dalam sitometer aliran. Sel PE-positif dan 7AAD-negatif adalah apoptosis awal; sel PE-positif dan 7AAD-positif adalah apoptosis akhir.
Analisis Siklus Sel—Sitometer Aliran
Sel ditanam dalam lelangka 12 sumur dengan densitas sel 2 × 105 sel/lelangka dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diobati dengan 25 μg/ml setara bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF formulasi dan sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Setelah 24 jam, sel yang diobati dicuci dan dikumpulkan dengan tripsinisasi dan diperbaiki dengan etanol 70% selama 2 jam pada 4 °C. Sel kemudian diobati dengan ribonuklease untuk menghilangkan kontaminasi RNA. Sekarang, sel diwarnai dengan iodida propidium (PI) selama 30 menit pada 37 °C dalam inkubator. Fluoresensi sel yang diwarnai PI ditentukan oleh sitometer aliran AccuriTM C6. Fase siklus sel dibagi menjadi subG1, G1, S, dan G2/M fase.
Assay Pembentukan Koloni
Sel ditanam dalam lelangka 12 sumur dengan densitas sel 2 × 105 sel/lelangka dan diinkubasi selama 24 jam. Sel diobati dengan 25 μg/ml setara bebas ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF formulasi. Sel yang diobati dicabut dengan tripsin, dicuci, dan dihitung menggunakan penghitung sel. Sel kemudian ditanam kembali dalam lelangka 6 sumur dengan densitas 1500 sel/lelangka. Sel kemudian diinkubasi dalam kondisi sekitar 37 °C selama 12 hari hingga koloni terlihat. Sel dicuci dengan PBS dan diperbaiki dengan metanol ke asam asetat ke air (1:1:8) selama 10 menit, diikuti oleh pewarnaan dengan kristal violet 0,1% selama 45 menit. Sel yang diwarnai kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya.
Assay Migrasi Sel
Kamber transwell 12 sumur dengan ukuran pori 8 μm digunakan untuk assay ini. Untuk memulai studi, 5 × 104 sel/lelangka ditanam dalam kamber atas. Medium atas bebas FBS sementara medium kamber bawah terdiri dari 10% FBS. Setelah 24 jam, jumlah sel yang bermigrasi ke permukaan membran bawah diperbaiki dan diwarnai dengan pewarna kristal violet 0,5%. Jumlah sel dihitung dalam lima bidang yang dipilih secara acak di bawah mikroskop cahaya; rata-rata jumlah sel dicatat dan dianalisis.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± SD dan dilakukan tiga kali kecuali jika disebutkan secara terpisah. Dua kelompok dibandingkan menggunakan uji t tidak berpasangan, sementara perbandingan lebih dari dua kelompok dilakukan menggunakan one-way ANOVA dengan uji multi-perbandingan Turkey. Statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism dan perbedaan p < 0,05 dianggap signifikan.
Hasil dan Pembahasan
Persiapan dan Karakterisasi Formulasi Nano Lipid Dimuat DBZ/ATRA
Pengobatan melanoma masih merupakan tantangan besar dan opsi pengobatan standar termasuk kemoterapi atau radioterapi atau resesi bedah akan efektif hanya pada tumor padat massal yang disertai dengan prognosis buruk. FDA telah menyetujui obat seperti paklitaksel atau kombinasi, namun gagal meningkatkan dampak keseluruhan pada kelangsungan hidup pasien dan pemulihan kanker. Dakarbazin (DBZ) adalah pilihan obat kemoterapi garis pertama yang disetujui FDA; namun, DBZ menderita properti fisikokimia yang buruk dan menghasilkan tingkat respons yang mengecewakan antara 10 dan 25%. Untuk mengatasi tantangan ini, kami telah mengembangkan strategi terapeutik baru kombinasi dengan ATRA dan DBZ dalam formulasi nano lipid (Gambar 1). Kami berhipotesis bahwa kombinasi dua komponen terapeutik akan meningkatkan efikasi antitumor dalam malignancy melanoma. Perlu dicatat bahwa ATRA meskipun menunjukkan properti antikanker, tidak mengakibatkan efek samping apapun dalam lingkungan sistemik [23]. Karena DBZ bersifat hidrofobik secara alami, kami merancang formulasi nano lipid yang dapat secara stabil menyatukan obat hidrofobik pada inti lipid dan ATRA akan dimuat sebagai komponen struktural nanopartikel. Nanopartikel lipid yang membawa komponen terapeutik akan membantu mengirimi ke dalam tumor jauh dalam tubuh. Efisiensi muatan DBZ dan ATRA adalah 91,2 ± 1,25% dan 95,8 ± 1,14% masing-masing. Kapasitas muatan DBZ dan ATRA dalam RD-LNF adalah 7,07 ± 0,65% w/w dan 7,48 ± 1,05% w/w, masing-masing. Ukuran partikel D-LNF diamati sebesar 121,5 ± 1,65 nm dengan indeks dispersi polidispersi (PDI) 0,134 dan potensi zeta -23,5 ± 0,85 mV. Ukuran partikel RD-LNF adalah 138,2 ± 1,28 nm dengan PDI 0,159 dan potensi zeta −25,4 ± 0,58 mV. Peningkatan ukuran partikel secara keseluruhan terutama dikaitkan dengan pemuatan struktural ATRA; namun, ukuran akhir RD-LNF kurang dari 150 nm yang memungkinkan akumulasi preferensi pada tumor melanoma maligan berkat efek EPR. Selain itu, kehadiran PEG yang hidrofilik akan mencegah agregasi partikel dan mengurangi penyerapannya oleh sistem retikuloendotel (RES) dan oleh karena itu meningkatkan performa sistemiknya dalam tubuh. Muatan permukaan sekitar –25 mV akan memberikan stabilitas penyimpanan yang baik. Morfologi partikel diteliti oleh mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gambar 2). Seperti yang terlihat, baik D-LNF maupun RD-LNF sempurna berbentuk bola dalam ukuran dan didistribusikan secara merata pada grid tembaga. Perbedaan ukuran antara D-LNF dan RD-LNF konsisten dengan observasi DLS. Kurangnya sisa partikel, partikel kecil, dan agregasi menunjukkan keberhasilan proses formulasi.
Struktur dakarbazin (DBZ) dan asit retinoik trans-telus (ATRA). Ilustrasi skematis formulasi nano lipid dimuat DBZ/ATRA disajikan. Formulasi nano lipid disiapkan dengan metode ultrasonikasi. Keduanya DBZ dan ATRA adalah molekul hidrofobik dengan bobot molekuler kurang dari 300 g/mol. Molekul hidrofobik diharapkan terkonsentrasi pada inti nanopartikel yang stabilized oleh surfactant
Analisis morfologi D-LNF dan RD-LNF menggunakan mikroskop elektron transmisi. Citra representatif yang menggambarkan morfologi yang akurat disajikan
Analisis Stabilitas dan Pelepasan Obat In Vitro dari D-LNF dan RD-LNF
RD-LNF menunjukkan stabilitas yang luar biasa pada kondisi pH 7,4 (PBS) dan serum (10% FBS) (Gambar 3a). Ukuran partikel tidak menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam kedua kondisi sepanjang periode studi yang menunjukkan stabilitas nanopartikel. Kemampuan pelonggaran obat secara tepat waktu memutuskan efektivitas sistem nanopartikel dimuat obat. Kami telah melakukan kinetika pelonggaran DBZ dan ATRA dari D-LNF dan RD-LNF dalam buffer fosfat (PBS, pH 7,4). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3b, tidak ada pelonggaran mendadak atau bertahap dari obat yang diamati dari salah satu sistem nanopartikel ini yang menunjukkan pemuatan yang stabil pada inti nanopartikel dan tidak pada permukaan nanopartikel. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam pelonggaran DBZ dari D-LNF dan RD-LNF yang menunjukkan bahwa kehadiran ATRA tidak melambat atau mengubah pola pelonggaran obat. Penundaan ringan dalam pelonggaran obat DBZ dari RD-LNF mungkin dikaitkan dengan panjang jalur yang meningkat yang dikaitkan dengan ATRA dalam struktur lipid. Menarik untuk dicatat bahwa ATRA melepaskan secara signifikan lebih lambat dibandingkan DBZ dalam sistem pembawa RD-LNF. Perbedaan yang signifikan mulai muncul setelah 24 jam hingga 72 jam terutama dikaitkan dengan sifat hidrofobik yang ekstrim ATRA dan menjadi bagian komponen struktural. Secara keseluruhan, kurangnya pelonggaran mendadak dan pelonggaran terkontrol dari komponen terapeutik akan menguntungkan pengobatan kanker melanoma.
a Analisis stabilitas RD-LNF pada pH 7,4 dan serum (10% FBS). b Pelepasan obat in vitro DBZ dari D-LNF; dan pelepasan obat in vitro DBZ dan ATRA dari RD-LNF. Studi pelepasan dilakukan dalam buffer fosfat (pH 7,4) untuk periode studi 72 jam. Hasil disajikan sebagai mean ± deviasi standar (n = 4)
Pengambilan Sel In Vitro
Pengambilan sel yang lebih tinggi atau ditingkatkan dari nanopartikel menentukan efikasi terapeutik pada sel kanker. Kami telah melakukan pengambilan sel RD-LNF pada sel kanker B16F10 dan Coumarin-6 digunakan sebagai pelacak fluoresensi. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, internalisasi nanopartikel yang luar biasa diamati setelah 1 jam inkubasi nanopartikel dan pengambilan terus meningkat hingga 3 jam. Pengambilan yang luar biasa dari formulasi nano lipid konsisten dengan pengambilan sel yang lebih tinggi dari sistem pembawa berbasis lipid. Diduga bahwa mekanisme difusi pasif dan endositosis mungkin bertanggung jawab atas pengambilan sel yang lebih tinggi. Nanopartikel setelah endositosis akan mencapai lisosom di mana obat yang dienkapsulasi dilepaskan dan menunjukkan tindakan farmakologis masing-masing.
Analisis pengambilan sel in vitro sel melanoma B16F10. Sel kanker diobati dengan RD-LNF dan waktu inkubasi bervariasi dari 1 jam hingga 3 jam dan pengambilan sel dianalisis menggunakan sitometer aliran. Coumarin-6 digunakan sebagai pelacak fluoresensi
Assay Toksisitas Sel In Vitro
Assay MTT dilakukan pada sel B16F10 setelah diobati dengan formulasi masing-masing untuk mengevaluasi efek antikanker dari agen terapeutik individual (Gambar 5a). Pada awalnya, toksisitas bebas DBZ dan ATRA individual dievaluasi. DBZ menunjukkan efek toksis bergantung pada konsentrasi pada sel kanker melanoma sementara ATRA menunjukkan efek toksis yang jauh lebih tinggi pada sel B16F10. Pada 100 μg/ml, DBZ menunjukkan kelangsungan hidup sel sekitar 45% dibandingkan sekitar 22% kelangsungan hidup sel untuk ATRA yang menunjukkan efikasi terapeutik yang luar biasa ATRA. Untuk membuktikan bahwa pengiriman bersama DBZ dan ATRA dapat secara potensial menghambat progresi kanker, formulasi nano lipid dimuat DBZ+ATRA (RD-LNF) diobati pada sel melanoma. Formulasi nano lipid dimuat DBZ (D-LNF) yang mengandung obat tunggal digunakan sebagai grup referensi untuk menyorot efikasi sinergis ATRA (Gambar 5b). Seperti yang diharapkan, pada konsentrasi tetap 25 μg/ml, ATRA menunjukkan kelangsungan hidup sel yang sedikit lebih rendah dibandingkan DBZ sementara D-LNF berbasis nanopartikel tidak meningkatkan efek antikanker DBZ dan tetap jauh dari efektif. Seperti yang diharapkan, RD-LNF menunjukkan kelangsungan hidup sel yang jauh lebih rendah dan efek antikanker yang lebih tinggi dibandingkan D-LNF yang menunjukkan efek terapeutik sinergis yang jelas dari dua komponen terhadap kematian sel kanker melanoma. RD-LNF menunjukkan efek antikanker yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan grup pengobatan lain. Mungkin dapat diharapkan bahwa pelonggaran perlahan dan berkelanjutan DBZ bersama dengan pelonggaran perlahan ATRA dari sistem nanosir mungkin berkontribusi pada efek terapeutik sinergis. Dalam studi ini, dakarbazin (DBZ) adalah obat kimia utama dan ATRA digunakan sebagai komponen struktural nanoparticle lipid, oleh karena itu tidak dibuat grup terpisah untuk R-LNF. Kami telah mempelajari efek antikanker ATRA dan DBZ bebas pada sel kanker. Selain itu, banyak laporan yang diterbitkan adalah bukti untuk efek antikanker ATRA; oleh karena itu, kami telah menggunakan ATRA sebagai komponen struktural yang juga dapat meningkatkan efikasi antikanker obat yang dienkapsulasi secara sinergis.
a Assay toksisitas sel in vitro DBZ dan ATRA bebas dengan cara bergantung pada konsentrasi. b Assay toksisitas sel in vitro ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas pada konsentrasi tetap 25 μg/ml dan 50 μg/ml
Assay Pembentukan Koloni
Assay pembentukan koloni dilakukan untuk mengevaluasi potensi tumorigenesis sel melanoma. Seperti yang ditunjukkan, bebas DBZ dan ATRA memiliki peran terbatas dalam menghambat pembentukan koloni dan secara serupa, D-LNF tidak efektif dalam mengontrol pembentukan koloni (Gambar 6). Seperti yang diharapkan, kombinasi DBZ + ATRA menghasilkan peningkatan signifikan dari inhibisi pembentukan koloni dibandingkan obat bebas individual atau nanoparticle dimuat obat tunggal. Assay pembentukan koloni lebih lanjut menguatkan efikasi antikanker unggul RD-LNF dibandingkan obat bebas.
Efek ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas pada pembentukan koloni. Sel B16F10 diobati dengan formulasi masing-masing dan pembentukan koloni difoto setelah pewarnaan kristal violet
Assay Apoptosis In Vitro dan Analisis Siklus Sel
Induksi apoptosis sel B16F10 setelah diobati dengan D-LNF dan RD-LNF dikaji menggunakan sitometer aliran setelah sel diwarnai dengan campuran Annexin V-FITC/PI (Gambar 7a). Seperti yang ditunjukkan, ATRA dan DBZ hanya menyebabkan 10–12% apoptosis sel kanker dan banyak sel masih utuh. Peningkatan ringan dalam sel apoptosis awal diamati setelah pengobatan D-LNF mungkin menunjukkan efek pembawa pengiriman. Yang penting, RD-LNF menginduksi proporsi sel apoptosis yang lebih besar dengan proporsi sel apoptosis akhir dan awal yang lebih besar yang menunjukkan efikasi antikanker yang unggul dari nanoparticle kombinasi. RD-LNF menunjukkan sel apoptosis akhir meningkat 21,5% sementara sel apoptosis awal meningkat hingga 18,3% dan proporsi sel hidup berkurang dari 95 menjadi 52%, masing-masing, yang menunjukkan bahwa kombinasi DBZ + ATRA berkontribusi pada apoptosis sel kanker dan dapat menghambat inhibisi proliferasi sel melanoma B16F10. Efek apoptosis formulasi lebih dikonfirmasi oleh analisis siklus sel. Seperti yang ditunjukkan, DBZ dan ATRA menunjukkan peningkatan ringan pada populasi sub-G0 sementara D-LNF menunjukkan populasi sub-G0 yang relatif lebih tinggi dibandingkan obat bebas individual (Gambar 7b). Secara mencolok, peningkatan yang luar biasa pada populasi sub-G0 diamati untuk sel melanoma yang diobati RD-LNF yang menunjukkan apoptosis sel kanker yang jelas. Widely known bahwa DBZ dapat meningkatkan ekspresi p21, caspase-3, dan PARP terbelah dan oleh karena itu mempromosikan apoptosis sel melalui stabilisasi p53. Induksi p53 akan menghambat progresi siklus sel [24, 25]. Kombinasi DBZ + ATRA diharapkan mempersiapkan mekanisme apoptosis dan menghentikan progresi siklus sel kanker dan menunjukkan efikasi antikanker.
a Ilustrasi apoptosis sel B16F10 setelah pengobatan dengan ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas. Sel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol yang sesuai. Apoptosis dianalisis menggunakan sitometer aliran. b Ilustrasi analisis siklus sel yang dilakukan pada sel B16F10 setelah pengobatan dengan formulasi masing-masing
Efek Nanopartikel Kombinasi pada Migrasi Sel
Migrasi sel dianalisis melalui membran transwell dan sel yang bermigrasi diamati dengan pewarnaan kristal violet (Gambar 8). Setelah 24 jam, kontrol hampir telah mencapai migrasi lengkap sel kanker. ATRA tampaknya menghambat migrasi sel relatif lebih baik dibandingkan sel yang diobati DBZ. D-LNF juga menunjukkan efek hemmatan yang menonjol pada migrasi sel; namun, efek migrasi sel yang paling luar biasa diamati pada sel melanoma B10F16 yang diobati RD-LNF. Seperti yang terlihat, penurunan banyak kali dalam migrasi sel diamati dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati. Hasil ini secara jelas menunjukkan bahwa RD-LNF secara potensial mengurangi proliferasi sel ganas yang abnormal dan menekan migrasi sel secara efisien.
Citra mikro representatif assay migrasi sel sel B16F10 setelah pengobatan dengan ATRA, DBZ, D-LNF, dan RD-LNF bebas dan kuantifikasinya
