Efek Proapoptosis yang Disempurnakan dari Kompleks Terdispersi Air dari Kemoterapi Berbasis 4-Thiazolidinone dengan Nanocarrier Polimer yang Mengandung PEG
Abstrak
Tujuan
Untuk mempelajari apakah formulasi air dari kompleks turunan 4-thiazolidinone dengan nanocarrier polimer yang mengandung PEG meningkatkan aksi pro-apoptosisnya terhadap sel glioma C6 tikus.
Metode
Mekanisme efek antineoplastik dari turunan 4-thiazolidinone diselidiki secara in vitro dengan sel glioma tikus C6. Kelahiran sel, pola siklus sel, dan ekspresi Annexin V dievaluasi dan kerusakan DNA diperkirakan dengan analisis komet DNA. Formulasi baru berbasis air dari turunan 4-thiazolidinone yang dikomplekskan dengan polimer nanocarrier digunakan untuk meningkatkan aksi pro-apoptosis terhadap sel C6.
Hasil
Turunan 4-thiazolidinone yang dipelajari menggunakan mekanisme apoptosis untuk membunuh sel glioma C6 tikus, sebagaimana dikonfirmasi oleh analisis FACS sel-sel ini pada tahap pra-G1, munculnya sel C6 positif Annexin V, dan peningkatan jumlah komet DNA dari kelas yang lebih tinggi. Kompleksasi senyawa yang dipelajari dengan nanocarrier polimer yang mengandung PEG secara signifikan meningkatkan efek pro-apoptosis pada sel glioma C6 tikus yang diukur dengan semua metode yang disebutkan di atas.
Kesimpulan
Kompleksasi turunan 4-thiazolidinone dengan nanocarrier polimer yang mengandung PEG memberi mereka kelarutan dalam air dan meningkatkan efek pro-apoptosis pada sel glioma C6 tikus.
Pengantar
Kemoterapi adalah modalitas pengobatan utama untuk banyak tumor, dan obat kemoterapi dipilih sebagai pilihan terakhir, terutama dalam kasus ketika kanker telah menyebar [1]. Namun, efek samping negatif yang parah mengurangi kemanjuran klinis dari banyak obat antikanker saat ini. Oleh karena itu, diperlukan pengembangan obat antikanker alternatif atau sinergis yang berkelanjutan dan sangat penting dengan efek samping yang minimal atau minimal [2].
Kelarutan obat antikanker dalam air yang rendah telah menjadi masalah umum dan serius yang menghambat pengembangan dan aplikasi klinisnya, dan banyak agen kemoterapi yang sangat aktif dan menjanjikan telah dikeluarkan karena kelarutannya dalam air yang rendah [3]. Surfaktan dan ko-pelarut digunakan dalam konsentrasi tinggi untuk melarutkan zat antikanker yang tidak larut dalam air; namun, zat ini juga dapat menghasilkan efek samping yang merugikan, sehingga membatasi penggunaan banyak obat antikanker [4].
Tantangan besar bagi pengembangan obat farmasi adalah untuk menghilangkan atau setidaknya mengurangi efek samping negatif dari obat yang sangat aktif, terutama agen antitumor yang menunjukkan toksisitas umum dalam tubuh yang secara signifikan membatasi penggunaannya [5,6,7,8,9 ]. Cara efektif untuk mengatasi masalah ini adalah dengan menggunakan nanocarrier multifungsi obat yang akan memungkinkan agen antitumor toksik untuk mengikat di tempat pengiriman mereka ke sel-sel yang ditargetkan di organ atau jaringan tertentu [8, 10, 11]. Ukurannya yang kecil, struktur spesifik yang terkontrol, luas permukaan yang besar, dan bentuk nanopartikel memberikan beberapa keunggulan dibandingkan material lain [5, 8, 9]. Saat menggunakan nanopartikel, dimungkinkan untuk mengoptimalkan efisiensi, meminimalkan efek samping negatif, dan meningkatkan terapi kanker [12, 13]. Dengan demikian, obat-obatan yang gagal sebelumnya karena toksisitas umum yang tinggi sekarang dapat memperoleh kesempatan kedua untuk penggunaan klinis, karena dimasukkan dalam sistem pengiriman yang telah meningkatkan bioavailabilitas dan pelepasan terkontrol. Kompleks pembawa obat semacam itu lebih mudah menembus penghalang alami seperti penghalang darah-otak atau membran sel individu. Area permukaan nanopartikel yang besar memungkinkan mereka untuk membentuk kompleks dengan biomolekul vektor spesifik yang membantu pengiriman obat ke organ target, menyebabkan pengurangan yang signifikan atau bahkan penghapusan efek samping negatif, memungkinkan peningkatan dosis efektif minimum. selama pemberian obat tunggal, meningkatkan efektivitas kerja obat, dan memberikan stimulus baru untuk pengembangan farmakoterapi yang dipersonalisasi. Selain itu, nanopartikel dapat mengenkapsulasi molekul yang meningkatkan kelarutan, stabilitas, dan penyerapan obat tertentu [11, 13,14,15]. Sistem penghantaran obat dapat memberikan sirkulasi obat yang berkepanjangan dalam darah, kemampuan obat untuk terakumulasi selama proses patofisiologis, dan kemampuan mentransfer molekul zat aktif secara efektif ke dalam sel dan organel sel. Nanopartikel harus stabil, mempertahankan struktur kimianya dalam jangka waktu tertentu, dan pada saat yang sama mampu melakukan biodegradasi [16, 17].
Untuk mengevaluasi obat antikanker baru, penting untuk mengukur aktivitas dan potensi sitotoksiknya menggunakan berbagai lini sel kanker manusia target, dan model tumor eksperimental in vivo. Kemoterapi sering gagal karena defisiensi dalam proses apoptosis yang memainkan peran penting dalam kematian sel yang diinduksi obat secara berurutan atau akibat dari perubahan tumorigenesis [18,19,20,21].
Karena banyak sel ganas dapat menghindari kematian apoptosis, pendekatan rasional harus digunakan dalam desain dan pengembangan obat antikanker baru. Tujuan utama untuk menciptakan obat antikanker baru adalah untuk (1) menemukan cara untuk mengatasi mutasi sel kanker individu yang berdampak pada mekanisme kerja obat yang independen; dan (2) merancang rejimen kemoterapi yang mampu menargetkan jalur independen secara bersamaan. Pemahaman yang lebih baik tentang hubungan antara genetika kanker dan sensitivitas pengobatan adalah masalah utama untuk mengembangkan obat antikanker baru yang efektif [22].
Dalam penelitian sebelumnya, kami menunjukkan bahwa turunan 4-tiazolidinon sintetis (Les-3288, Les-3833, dan Les-3882) mungkin menggunakan mekanisme aksi yang berbeda dari agen antikanker lainnya untuk membunuh sel glioma C6 tikus dan sel glioblastoma U251 manusia secara in vitro, sebaliknya menjadi doksorubisin (Dox). Les-3288 tidak secara signifikan mempengaruhi tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) dalam sel yang dirawat [23, 24]. Harus ditekankan bahwa agen antitumor yang poten ini menunjukkan toksisitas yang kurang umum dalam tubuh hewan percobaan, seperti yang ditunjukkan oleh parameter biokimia terukur dari aksi toksiknya dalam sel tumor dan hewan, dibandingkan dengan Dox [7, 8]. Dengan demikian, pengikatan obat antitumor dengan polimer nanocarrier (PNC) dan aplikasi obat dalam bentuk sistem pengiriman air yang stabil dapat mengurangi efek toksik pada organ hewan, dibandingkan dengan tindakan zat ini dalam bentuk bebas. 7, 8].
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mempelajari induksi apoptosis pada sel glioma tikus dari garis C6 in vitro dan in vivo dengan formulasi berbasis air dari kompleks turunan 4-thiazolidinone dengan PNC yang mengandung PEG, dan membandingkan induksi apoptosis menggunakan turunan ini. dalam bentuk bebas.
Bahan dan Metode
Obat Antikanker
Turunan heterosiklik 4-tiazolidinon (senyawa Les-3288 dan Les-3833, Gbr.1) disintesis di Departemen Kimia Farmasi, Organik dan Bioorganik Universitas Kedokteran Nasional Danylo Halytsky Lviv, Ukraina, seperti yang dijelaskan sebelumnya [25].
Struktur senyawa yang diselidiki—Les-3288 dan Les-3833
Sebelum digunakan dalam kultur sel, senyawa ini dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, Arterium, Lviv, Ukraina). Solusinya juga disimpan selama 5 menit dalam penangas air mendidih, dan diencerkan dalam air suling untuk mencapai konsentrasi kerja. Konsentrasi akhir DMSO dalam media kultur di bawah 0,1%. Dox dibeli di apotek lokal dari perwakilan Pfizer (Italia) di Ukraina.
Nanocarrier Polimer
PNC untuk pengiriman obat disintesis di Departemen Kimia Organik Universitas Nasional Politeknik Lviv, Ukraina, menggunakan metodologi yang dijelaskan sebelumnya [26, 27]. Sintesis poli(VEP-co -GMA)-graft-PEG dilakukan melalui tahapan sebagai berikut. Poli(VEP-bersama -GMA) disintesis dengan kopolimerisasi radikal 5-tert butylperoxy-5-methyl-l-hexene-3-yne (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (monomer peroksida disintesis dengan metode yang dijelaskan [28]) dan glisidil metakrilat (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich , USA) dalam etil asetat (7,9 mL) (Merck, Darmstadt, Jerman) menggunakan azoisobutyronitrile (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Jerman) sebagai inisiator radikal. Polimerisasi dilakukan pada 343K hingga konversi maksimal 65% tercapai. Poli(VEP-bersama -GMA) digunakan sebagai tulang punggung untuk perlekatan rantai PEG samping melalui reaksi adisi poli(etilena glikol) metil eter (mPEG) dengan gugus epoksida samping. Boron trifluorida eterat (0,027 mL, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ditambahkan ke dalam larutan kopolimer (1,0 g) dalam dioksan (20 mL; Merck, Darmstadt, Jerman) pada 313 K dan diaduk selama 3 jam. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) dilarutkan dalam dioksan (15 mL) dan larutan dicampur dengan larutan polimer tulang punggung dan diaduk selama 6 jam pada 313 K. mPEG yang tidak bereaksi dihilangkan menggunakan kantong dialisis dengan ukuran pori batas berat molekul (MWCO) 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, USA). Menghasilkan poli seperti sisir (VEP-co -GMA)-graft-PEG dikeringkan pada suhu kamar di bawah vakum sampai berat konstan. Struktur dan beberapa karakteristik PNC disajikan pada Gambar. 2 dan telah dijelaskan sebelumnya [29].
Struktur skema PNC — poly(VEP-co- GMA)-korupsi -PEG dengan rantai utama di dasar kopolimer peroksida tak jenuh 2-tert -butilperoksi-2-metil-5-hexen-3-in (VEP, dilambangkan dengan "k"), dengan rantai samping glisidil metakrilat (GMA, dilambangkan dengan "l") dan polietilen glikol (PEG, dilambangkan dengan "m" )
Untuk menyiapkan larutan PNC berbasis air, 0,09 g PNC dilarutkan dalam 0,9 mL DMSO. Larutan PNC ini ditambahkan ke dalam 8,0 mL larutan NaCl 0,9%. Kemudian, larutan diaduk selama 0,5 jam dan disonikasi selama 10 detik. Dispersi air dari kompleks diperoleh dengan menjatuhkan larutan DMSO 4-tiazolidinon dan PNC ke dalam air dengan urutan sebagai berikut:0,045 g PNC dilarutkan dalam 0,15 mL DMSO (Sigma-Aldrich, USA), dan 0,0015 g Les -3288 (atau Les-3833) dilarutkan dalam 0,10 mL DMSO. Larutan PNC dan 4-tiazolidinon dicampur dan ditambahkan ke 4,25 mL larutan NaCl 1% dan disonikasi selama 10 detik.
PNC aktif permukaan ini mengandung rantai PEG hidrofilik yang dicangkokkan ke tulang punggung hidrofobik (Gbr. 2a). Dalam larutan berair, PNC amfifilik membentuk struktur mirip misel yang dapat melarutkan senyawa yang tidak larut dalam air (misalnya, obat-obatan) atau senyawa ini dapat diadsorpsi ke permukaan nanopartikel, sehingga meningkatkan biokompatibilitasnya. Teknik yang dikembangkan untuk memperoleh dispersi air yang sangat stabil dari kemoterapi berbasis 4-tiazolidinon terdiri dari nukleasi partikel obat skala nano yang terjadi ketika larutan encer dalam DMSO dipindahkan ke dalam larutan garam pengendap yang mengandung surfaktan polimer PNC yang menyediakan lapisan polimer untuk permukaan nanopartikel. Akibatnya, karena agregasi dan sedimentasi, kompleks distabilkan dan dispersi dicegah. Selain itu, kompleks skala nano dari turunan 4-tiazolidinon dilindungi dari kemungkinan interaksi dengan lingkungan mikro biologis di sekitarnya. Perlindungan ini memungkinkan mereka bertahan lebih lama di dalam tubuh tanpa kehilangan stabilitas dan menumpuk di jaringan atau organ target tanpa menimbulkan efek samping negatif. Dengan demikian, modifikasi tersebut memberikan peningkatan stabilitas agregasi dan sedimentasi dispersi air dari nanopartikel senyawa antikanker.
Ukuran misel polimer PNC dan kompleks PNC dengan heterosiklik 4-tiazolidinon diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Jerman) dan DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) dan dengan spektrum korelasi foton menggunakan teknologi non-invasive back scatter (NIBS) pada 25°C. Sampel untuk pengukuran DLS disiapkan seperti dijelaskan di atas, dan jika perlu, diencerkan dengan air suling ganda, pH 6,5-7,0. Tiga-lima pengukuran dilakukan untuk setiap sampel (setiap pengukuran terdiri dari 5 siklus dan rentang antara pengukuran adalah 5 menit). Gambar 3 menunjukkan distribusi ukuran struktur misel PNC dan nanopartikel kompleks PNC dengan 4-tiazolidinon heterosiklik (Les-3833 dan Les-3288) yang dianalisis dengan DLS. Ukuran dan morfologi misel PNC serta nanopartikel 4-tiazolidinon berlapis PNC dipelajari menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-200А (JEOL, Jepang) pada tegangan percepatan 200 kV [30, 31]. Sampel disiapkan seperti dijelaskan di atas, dan jika perlu, diencerkan dengan air suling ganda. Sampel disiapkan dengan menyemprotkan larutan yang diuji ke substrat dengan menggunakan dispersan ultrasonik UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraina), yang memfasilitasi pelapisan seragam pada substrat. Sebuah film karbon amorf tipis disimpan pada grid tembaga digunakan sebagai substrat. Ukuran dan morfologi misel PNC dan kompleks dengan 4-tiazolidinon heterosiklik (Les-3288 dan Les-3833) yang dipelajari dengan metode DLS dan TEM disajikan pada Gambar 3.
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari PNC (kiri) dan kompleks PNC + Les-3833 (kanan)
Studi DLS dan mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan bahwa ukuran misel PNC adalah 50 ± 25 nm dan nanopartikel yang dibentuk oleh kompleks PNC dengan heterosiklik 4-thiazolidinones Les-3833 dan Les-3288 adalah 140 ± 25 nm dan 155 nm. ± 30 nm, masing-masing. Dispersi kompleks PNC dengan turunan 4-thiazolidinone sangat stabil dan terlindung dari agregasi dan sedimentasi oleh cangkang PNC yang teradsorpsi pada permukaan nanopartikel thiazolidinone. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, perubahan ukuran nanopartikel yang terdispersi dalam sistem air dapat diabaikan pada beberapa pengenceran dengan air, serta setelah 6 bulan penuaan sistem air kompleks PNC dengan 4-tiazolidinon.
Studi DLS diameter hidrodinamik PNC dan kompleks (a ) dan ketergantungan ukuran rata-rata kompleks obat PNC pada pengenceran dispersi (b ):dispersi air PNC (1), kompleks Les-3833+PNC (2), dan Les-3288+PNC (3), serta ukuran hidrodinamik Les-3833+PNC (1–3) dan Les- 3288+PNC (4–6) dispersi setelah penyimpanan selama 2 hari (1.4), 4 bulan (2.5), dan 6 bulan (3.6) (c )
Budaya Sel
Sel glioma tikus dari garis C6 diperoleh dari Koleksi Kultur Sel di Institut Biologi dan Genetika Molekuler, Akademi Sains Nasional Ukraina (Kyiv, Ukraina). Sel dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, Sigma, USA) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (Sigma, USA). Sel ditumbuhkan dalam CO2 -inkubator pada 37°C, 5% CO2 , dan kelembaban 95%. Penyemaian sel dilakukan dengan perbandingan 1:5 sekali dalam 2-3 hari.
Evaluasi Aksi Sitotoksik dari Zat yang Dipelajari
Sel-sel diunggulkan dalam pelat 24-sumur dengan konsentrasi 100.000 sel / mL dalam satu sumur. (Greiner Bio-One Amerika Utara, Inc., Monroe, NC, AS). Zat yang diteliti ditambahkan pada konsentrasi 0,1, 0,5, dan 1,0 pM setelah periode adaptasi 24 jam yang dimulai setelah penyemaian sel. Penghitungan sel dilakukan secara berkala di ruang hitung hemositometrik menggunakan pewarna Trypan Blue (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) pada konsentrasi akhir 0,01%, 2 menit setelah penambahannya ke suspensi sel . Sel-sel mati mengambil pewarna ini karena kerusakan pada membran plasmanya.
Flow Cytometry
Untuk mempelajari siklus sel dan apoptosis, sel C6 diperlakukan dengan Les-3288, Les-3833 dan kompleksnya dengan PNC, serta dengan PNC dalam bentuk bebas, dicuci dengan saline buffer fosfat (PBS, pH 7,4), dibuat pelet dengan sentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C dan disuspensikan kembali dalam PBS dingin (2 juta sel per 1 mL PBS). Kemudian, sel-sel difiksasi dengan menambahkan alikuot 4 mL etanol absolut yang didinginkan hingga -20 ° C dengan pencampuran lembut. Sampel tetap disimpan pada -20 ° C sampai digunakan (tidak lebih dari 1 minggu). Untuk analisis penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS), sampel sel disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ° C, supernatan dibuang dan pelet sel disuspensikan kembali dalam 1 mL PBS. Seratus mikroliter RNase bebas DNase (Sigma, USA) ditambahkan ke suspensi itu, dan sampel diinkubasi pada 37 ° C selama 30 menit. Kemudian, setiap sampel dilengkapi dengan 100 l propidium iodida (PI) (Sigma, USA, 1 mg/mL), dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Akhirnya, sampel dipindahkan ke tabung plastik Falcon, dan suspensi sel dipantau dengan sitometer aliran FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) dan perangkat lunak Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) untuk mengukur parameter siklus sel dan apoptosis.
Pengukuran sel Annexin V-positif (apoptosis) dilakukan dengan menggunakan analisis FACS. Sel glioma C6 tikus diobati dengan konsentrasi PNC, Les-3288, Les-3833, dan konjugat polimeriknya seperti ditunjukkan di bawah gambar. Di akhir percobaan, sel-sel dipisahkan dari dasar cawan dengan larutan Trypsin-EDTA, dicuci dua kali dengan PBS, dan diwarnai dengan Annexin V-FITC menggunakan Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) , sesuai dengan instruksi pabrik. Sel yang dicuci diinkubasi selama 15 menit dalam buffer pengikat Annexin V (BD Pharmingen), yang mengandung 1/50 volume larutan Annexin V terkonjugasi FITC. Kemudian, sampel diencerkan dua kali dengan volume buffer pengikat Annexin V yang sesuai dan segera diukur pada saluran FL1/FL2 (FITC-PI) dari flow cytometer (Becton Dickinson, USA). Sel-sel positif tunggal Annexin V diklasifikasikan sebagai apoptosis.
Pengujian Komet DNA
Uji komet DNA dilakukan dalam kondisi basa. Sepuluh ribu sel dicampur dalam 75 l agarosa titik leleh rendah (0,5%) per sampel. Setelah tercampur, sampel dipipet ke atas kaca objek yang telah ditutup dengan agarosa bertitik lebur normal 1,5% sebelumnya. Sampel diinkubasi pada suhu 4 °C selama 18 jam dalam larutan lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Untuk memungkinkan pelepasan DNA dan ekspresi kerusakan alkali-labil, slide diinkubasi dalam larutan alkali pada suhu kamar selama 20 menit (dilakukan dalam gelap). Untuk elektroforesis (~74 V/cm selama 30 menit), slide dipindahkan ke ruang horizontal dan buffer elektroforesis 1x (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH>-13) ditambahkan. Slide difiksasi dalam es dingin, metanol 100% dan dikeringkan. Slide diwarnai dengan 80 L 1x etidium bromida (EtBr) selama 5 menit dan kemudian dicelupkan ke dalam air suling dingin untuk menghilangkan noda berlebih. Komet DNA divisualisasikan menggunakan mikroskop (Carl Zeiss, Jerman), dan gambar dianalisis menggunakan perangkat lunak 'CASP' (perangkat lunak Casplab-1.2.3b2, CASPlab, Wroclaw, Polandia). Seratus komet per sampel dihitung. Kerusakan DNA dikategorikan menjadi lima tingkat genotoksisitas menurut ukuran ekor komet:0 (kerusakan 0–5%), 1 (kerusakan 5–25%), 2 (kerusakan 25–45%), 3 (kerusakan 45–70%). ), dan 4 (lebih dari 70% kerusakan) [32]. Indeks kerusakan (DI) dihitung, seperti yang dijelaskan sebelumnya [33].
Uji Interkalasi DNA Menggunakan Pewarna Metil Hijau
Senyawa Les-3288 dan Les-3833 diselidiki kemampuannya untuk berinterkalasi ke dalam molekul DNA dengan menggunakan methyl green assay [34]. DNA sperma ikan salmon (10 mg/mL) diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 °C dengan 15 L larutan methyl green (1 mg/mL dalam H2 HAI). Senyawa ditambahkan pada 1 g/mL dan diinkubasi pada suhu 37 °C dalam gelap selama 2 jam. Total volume akhir sampel adalah 1 mL. Penyerapan metil hijau diukur pada 630 nm, setelah inkubasi sampel selama 2 jam pada 37 °C, menggunakan mikrofotometer multi-saluran BioTek 76.883 (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr digunakan sebagai kontrol positif.
Analisis dan Statistik Data
Semua percobaan diulang tiga kali dengan tiga paralel di setiap varian. Analisis varians (ANOVA) digunakan untuk perbandingan kelompok. Data sebaran sel glioma tikus C6 pada fase siklus sel yang berbeda dianalisis dengan ANOVA satu arah, dilanjutkan dengan uji komparasi ganda post hoc Tukey. Semua data disajikan sebagai mean ± SD. p nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Efek Sitotoksik (Uji Pengecualian Trypan Blue) dari Derivatif 4-Thiazolidinon yang Digunakan dalam Bentuk Bebas dan Kompleks Dengan Nanocarrier Polimer
Hasil uji eksklusi biru Trypan menunjukkan bahwa bentuk kompleks Les-3288 dan Les-3833 berbasis air dengan PNC telah meningkatkan toksisitas terhadap sel glioma C6 (pengobatan 24 jam dan 48 jam) dibandingkan dengan sitotoksisitas yang diamati dari penggunaan bentuk bebas dari senyawa ini (Gbr. 5 dan 6). Efek sitotoksisitas tertinggi diamati pada dosis 0,1 dan 0,5 M senyawa Les-3288 dan Les-3833 dalam kompleksnya dengan PNC, sedangkan pada dosis tertinggi (1,0 M) senyawa ini, peningkatan kompleksasi dengan PNC terdeteksi hanya dalam kasus Les-3288 selama 24 jam (Gbr. 5 dan 6).
Jumlah sel glioma C6 tikus hidup diukur dengan uji eksklusi Trypan blue setelah perawatan selama 24 jam dan 48 jam dengan konsentrasi yang berbeda (0,1, 0,5, dan 1,0 M) dari Les-3288 saja dibandingkan dengan aksi kompleksnya dengan polimer nanocarrier ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 ( perbedaan dibandingkan dengan kontrol, 100%)
Jumlah sel glioma C6 tikus hidup diukur dengan uji eksklusi Trypan blue setelah perlakuan selama 24 jam dan 48 jam dengan konsentrasi yang berbeda (0,1, 0,5, dan 1,0 M) dari Les-3833 saja dibandingkan dengan aksi kompleksnya dengan polimer nanocarrier ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 (selisih dibandingkan dengan kontrol, 100%)
Kompleksasi Senyawa Les-3833 dan Les-3288 Dengan Polimer Nanocarrier Meningkatkan Aktivitas Pro-Apoptosis In Vitro Terhadap Sel Glioma C6 Tikus
Dua pendekatan alternatif digunakan untuk menilai efek modulasi PNC pada potensi sitotoksik dari turunan 4-tiazolidinon yang dipilih. Pertama, analisis siklus sel dilakukan untuk menyelidiki dampak kompleks obat-PNC pada siklus sel. Selain itu, pewarnaan ganda Annexin V/PI digunakan untuk membedakan jenis kematian sel yang tepat yang disebabkan oleh nanokomposit ini.
Senyawa Les-3288 dan Les-3833 pada dosis rendah (0,1 g/mL dan 0,5 g/mL) tidak menghasilkan efek yang terlihat pada perkembangan siklus sel atau induksi apoptosis, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7 dan Tabel 1. Namun, kompleksasi kedua senyawa dengan PNC secara signifikan meningkatkan jumlah sel di pra-G1 fase (4 kali lipat untuk Les-3288 dan 6 kali lipat untuk Les-3833), yang menunjukkan dorongan besar dari potensi pro-apoptosis mereka. Harus ditekankan bahwa PNC dalam bentuk bebas tidak berdampak pada siklus sel atau induksi apoptosis; dengan demikian, penampakan yang diamati dari populasi besar sel pra-G1 yang dirawat dengan kompleks thiazolidinone-nanocarrier tidak dapat dijelaskan dengan efek sinergis sederhana dari PNC dan obat-obatan eksperimental.
Dampak pada perkembangan siklus sel turunan 4-thiazolidinone Les-3288 dan Les-3833 dalam bentuk bebas dan dalam kompleks dengan polimer nanocarrier (PNC) dalam sel glioma tikus C6. Pewarnaan propidium iodida (PI), flow cytometry. R2, sebelum G1; R3, G1; R4, S; R5, fase G2. FL2-H, nilai emisi puncak saluran kedua (585/40 filter) flow cytometer
Untuk memastikan bahwa puncak sub-G1 yang diamati terdiri dari sel-sel apoptosis, hasil uji pewarnaan Annexin V/PI dianalisis. Kami tidak mengamati eksternalisasi fosfatidilserin yang signifikan (penanda utama apoptosis awal, dideteksi oleh Annexin V terkonjugasi FITC) selama pengobatan glioma C6 dengan Les-3288 dosis rendah (0,1 dan 0,5 g/mL) dan dosis tinggi (1,0 g/mL) , menunjukkan bahwa senyawa ini adalah penginduksi apoptosis yang lemah. Sebaliknya, kami menemukan peningkatan populasi sel nekrotik (dari 1,2% pada kontrol menjadi 11,25% untuk Les-3288, 1,0 g/mL), yang mungkin mengindikasikan bahwa Les-3288 setidaknya sebagian menyebabkan kematian sel nekrotik. Namun, kompleksasi Les-3288 dengan PNC sepenuhnya mengubah cara kerja obat ini. Terjadi peningkatan besar-besaran dalam jumlah sel apoptosis awal (Annexin V(+)/PI(−)) dan sel apoptosis akhir (Annexin V (+)/PI(+)), sementara jumlah keseluruhan sel nekrotik murni tetap pada tingkat sel kontrol (tidak diobati) (Gbr. 8a). Dengan demikian, mengikat Les-3288 dengan PNC tidak hanya secara kuat meningkatkan aktivitas pro-apoptosisnya terhadap sel glioma, tetapi juga menurunkan potensi mekanisme kematian sel pro-nekrotiknya. Temuan ini mungkin menjadi kunci penting untuk praktik klinis karena obat pro-nekrotik tidak direkomendasikan untuk digunakan karena induksi inflamasi masif yang tidak nyaman bagi pasien.
Perbandingan aktivitas pro-apoptosis Les-3288 (a ) dan Les-3833 (b ) dan kompleksnya dengan polymeric nanocarrier (PNC) menuju sel glioma C6 tikus. Pewarnaan ganda Annexin V/PI, flow cytometry. PI, propidium iodida
Anehnya, kami tidak mengamati efek yang sama untuk kompleks Les-3833+PNC. Faktanya, aktivitas pro-apoptosis dari kompleks Les-3833+PNC lebih rendah dibandingkan dengan Les-3288 dalam bentuk bebas pada semua konsentrasi yang diuji (Gbr. 8b). Perbedaan drastis antara kedua senyawa tersebut dapat dijelaskan oleh spesifisitas struktur kimianya, dan kami berspekulasi bahwa dalam kasus Les-3833, struktur polimer harus dioptimalkan untuk mencapai hasil yang lebih baik.
Uji Komet Kerusakan DNA pada Sel Glioma C6 Tikus Yang Disebabkan oleh Derivatif 4-Thiazolidinone Dalam Bentuk Bebas dan Dikomplekskan Dengan PNC
Uji komet alkali memungkinkan deteksi pemutusan DNA untai tunggal di situs DNA yang labil basa. Hasil yang diperoleh diestimasi menggunakan nilai mean momen Olive tail (OTM). Data kami menunjukkan bahwa pengobatan sel glioma tikus 6 dengan Les-3288, Les-3833, dan PNC (konsentrasi 0,5 g/mL) selama 3 jam (Gbr. 9 dan 10) tidak menyebabkan kerusakan DNA yang signifikan (OTM =0,7299 ± 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =0,5846 ± 0,1078, masing-masing), dibandingkan dengan sel yang tidak diobati dalam kontrol (OTM =0,4541 ± 0,07273). Namun, perawatan sel dengan kompleks Les-3833 + PNC (OTM =2.3880 ± 0.2212) menyebabkan kerusakan DNA yang lebih signifikan daripada perawatan sel dengan bentuk bebas Les-3833. Peningkatan kerusakan seperti itu tidak diamati untuk aksi kompleks Les-3288+PNC (Gbr. 9 dan 10).
Kerusakan DNA dievaluasi menggunakan momen Olive tail pada sel glioma C6 tikus yang dirawat selama 3 jam dengan senyawa antineoplastik eksperimental yang digunakan pada konsentrasi 0,5 g/mL. *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. PNC, pembawa nano polimer; Doks, doksorubisin (kontrol positif)
Adanya DNA pada ekor komet glioma tikus 6 sel setelah pengobatan selama 3 jam dengan (a ) kontrol (sel yang tidak diobati), Les-3288 (b ), Les-3288+PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ) and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration
An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.
DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)
Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration
The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.
DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)
DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)
We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.
During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).
DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833
Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.
Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control
Diskusi
There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.
In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.
The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].
Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.
In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.
A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.
Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.
The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].
Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.
The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.
Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].
We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].
It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].
The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.
Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.
Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.
We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).
Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.
Kesimpulan
The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.
