Kompleks Polimer PEG yang Dispersi dalam Air dari Obat Kimiawati 4-Tiazolidinon Meningkatkan Aktivitas Pro-Apoptotik terhadap Sel Glioma C6 Tikus

Abstrak

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah formulasi air dari kompleks derivat 4-tiazolidinon dengan nanokarrier polimer yang mengandung PEG dapat meningkatkan tindakan pro-apoptotik terhadap sel glioma C6 tikus. Mekanisme efek antineoplasia derivat 4-tiazolidinon diselidiki in vitro dengan sel glioma C6 tikus. Natalitas sel, pola siklus sel, dan ekspresi Annexin V dievaluasi dan kerusakan DNA diestimasi melalui analisis komet DNA. Formulasi berbasis air baru dari derivat 4-tiazolidinon yang kompleks dengan nanokarrier polimer digunakan untuk meningkatkan tindakan pro-apoptotik terhadap sel C6. Derivat 4-tiazolidinon yang diteliti menggunakan mekanisme apoptosis untuk membunuh sel glioma C6 tikus, seperti yang dikonfirmasi oleh analisis FACS sel dalam tahap pre-G1, kemunculan sel C6 positif Annexin V, dan peningkatan jumlah komet DNA kelas yang lebih tinggi. Kompleksasi senyawa yang diteliti dengan nanokarrier polimer yang mengandung PEG secara signifikan meningkatkan efek pro-apoptotik pada sel glioma C6 tikus yang diukur oleh semua metode yang disebutkan di atas. Kompleksasi derivat 4-tiazolidinon dengan nanokarrier polimer yang mengandung PEG memberikan kepada mereka kelarutan air dan meningkatkan efek pro-apoptotik pada sel glioma C6 tikus.

Pendahuluan

Kimia terapi adalah modalitas pengobatan utama bagi banyak tumor, dan obat kimiawati dipilih sebagai opsi terakhir, terutama dalam kasus ketika kanker telah menyebar [1]. Namun, efek samping negatif yang parah mengurangi efektivitas klinis banyak obat anti-kanker saat ini. Oleh karena itu, ada kebutuhan yang terus-menerus dan krusial untuk mengembangkan obat anti-kanker alternatif atau sinergis dengan efek samping yang dikurangi atau minimal [2].

Kelarutan air yang rendah dari obat anti-kanker telah menjadi masalah yang meluas dan serius yang menghambat pengembangan dan aplikasi klinisnya, dan banyak agen kimiawati yang sangat aktif dan menjanjikan telah dikecualikan karena kelarutan air yang rendah [3]. Surfaktan dan pelarut pendamping digunakan dalam konsentrasi tinggi untuk melarutkan agen anti-kanker yang tidak larut air; namun, substansi ini juga dapat menghasilkan efek samping berbahaya, sehingga membatasi penggunaan banyak obat anti-kanker [4].

Tantangan besar dalam pengembangan obat farmasutika adalah untuk menghilangkan atau setidaknya mengurangi efek samping negatif dari obat yang sangat aktif, terutama agen anti-tumor yang menunjukkan toksisitas umum dalam tubuh yang secara signifikan membatasi penggunaannya [5,6,7,8,9]. Cara efektif untuk mengatasi masalah ini adalah dengan menggunakan nanokarrier multifungsi dari obat yang akan memungkinkan agen anti-tumor toksis untuk terikat di lokasi pengiriman ke sel target dalam organ atau jaringan tertentu [8, 10, 11]. Ukuran kecil, struktur yang terkontrol secara spesifik, luas permukaan besar, dan bentuk nanopartikel memberikan beberapa keuntungan dibandingkan dengan material lain [5, 8, 9]. Saat menggunakan nanopartikel, mungkin untuk mengoptimalkan efisiensi, meminimalkan efek samping negatif, dan meningkatkan terapi kanker [12, 13]. Dengan demikian, obat yang gagal sebelumnya karena toksisitas umum yang tinggi sekarang dapat mendapat kesempatan kedua untuk penggunaan klinis, karena termasuk dalam sistem pengiriman yang memiliki bioavailability yang ditingkatkan dan peluasan yang terkontrol. Kompleks obat-karrier ini lebih mudah menembus rintangan alami seperti blood–brain barrier atau membran sel individu. Luas permukaan besar nanopartikel memungkinkan mereka untuk membentuk kompleks dengan biomolekul vektor spesifik yang membantu pengiriman obat ke organ target, mengarah pada penurunan yang signifikan atau bahkan eliminasi lengkap efek samping negatif, memungkinkan peningkatan dosis minimum efektif selama satu pemberian obat, meningkatkan efektivitas tindakan obat, dan memberikan stimulus baru untuk pengembangan farmakoterapi personal. Selain itu, nanopartikel dapat mengenkapsulasi molekul yang meningkatkan kelarutan, stabilitas, dan penyerapan obat tertentu [11, 13,14,15]. Sistem pengiriman obat dapat memberikan sirkusi yang panjang dari obat dalam darah, kemampuan obat untuk menyelimuti selama proses patofisiologis, dan kemampuan untuk mentransfer molekul zat aktif secara efektif ke sel dan organel sel. Nanopartikel harus stabil, mempertahankan struktur kimia mereka untuk periode waktu tertentu, dan pada saat yang sama, mampu terbiodegradasi [16, 17].

Untuk mengevaluasi obat anti-kanker baru, penting untuk mengukur aktivitas sitotoksik dan potensinya menggunakan berbagai baris sel kanker manusia target, dan model tumor in vivo. Kimia terapi sering gagal karena kekurangan dalam proses apoptosis yang memainkan peran penting dalam kematian sel yang diinduksi obat berturut-turut atau yang dihasilkan dari perubahan in tumorigenesis [18,19,20,21].

Karena banyak sel ganas dapat menghindari kematian apoptosis, pendekatan rasional harus digunakan dalam desain dan pengembangan obat anti-kanker baru. Tujuan utama dalam menciptakan obat anti-kanker baru adalah untuk (1) menemukan cara untuk mengatasi mutasi sel kanker individual yang mempengaruhi mekanisme tindakan obat yang independen; dan (2) merancang regimen kimia terapi yang mampu menargetkan jalur independen secara bersamaan. Pemahaman yang lebih baik tentang hubungan antara genetika kanker dan sensitivitas perawatan adalah isu kunci untuk mengembangkan obat anti-kanker yang efektif [22].

Dalam studi sebelumnya, kami telah menunjukkan bahwa derivat 4-tiazolidinon sintesis (Les-3288, Les-3833, dan Les-3882) mungkin menggunakan mekanisme tindakan yang berbeda dari agen anti-kanker lainnya untuk membunuh sel glioma C6 tikus dan sel glioblastoma U251 manusia in vitro, berbeda dengan doksorubisin (Dox). Les-3288 tidak secara signifikan mempengaruhi tingkat spesies reaktif oksigen (ROS) pada sel yang diobati [23, 24]. Harus ditekankan bahwa agen anti-tumor yang potente ini menunjukkan toksisitas umum yang lebih rendah dalam tubuh hewan percobaan, seperti yang ditunjukkan oleh parameter biokimia dari tindakan toksik mereka pada sel tumor dan hewan, dibandingkan dengan yang ada pada Dox [7, 8]. Dengan demikian, ikatan obat anti-tumor dengan nanokarrier polimer (PNC) dan aplikasi obat dalam bentuk sistem pengiriman air yang stabil dapat mengurangi efek toksis pada organ hewan, dibandingkan dengan tindakan zat ini dalam bentuk bebas [7, 8].

Tujuan karya ini adalah untuk mempelajari induksi apoptosis pada sel glioma tikus baris C6 in vitro dan in vivo dengan formulasi berbasis air dari kompleks derivat 4-tiazolidinon dengan PNC yang mengandung PEG, dan membandingkan induksi apoptosis menggunakan derivat ini dalam bentuk bebas.

Bahan dan Metode

Obat Anti-Kanker

Derivat heterocyclic 4-tiazolidinon (senyawa Les-3288 dan Les-3833, Gambar 1) disintesis di Departemen Kimia Farmasutika, Organik, dan Bioorganik Universitas Kedokteran Nasional Danylo Halytsky Lviv, Ukraina, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [25].

Kompleks Polimer PEG yang Dispersi dalam Air dari Obat Kimiawati 4-Tiazolidinon Meningkatkan Aktivitas Pro-Apoptotik terhadap Sel Glioma C6 Tikus

Sebelum digunakan dalam kultur sel, senyawa ini dicairkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, Arterium, Lviv, Ukraina). Larutan tersebut ditambahkan selama 5 min dalam mandi air mendidih, dan dicairkan dengan air distilasi untuk mencapai konsentrasi kerja. Konsentrasi akhir DMSO dalam medium kultur di bawah 0,1%. Dox dibeli di apotek lokal dari perwakilan Pfizer (Italia) di Ukraina.

Nanokarrier Polimer

PNC untuk pengiriman obat disintesis di Departemen Kimia Organik Institut Teknologi Nasional Lviv Polytechnic, Ukraina, menggunakan metodologi yang dijelaskan sebelumnya [26, 27]. Sintesis poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG dilakukan melalui tahap-tahap berikut. Poly(VEP-co-GMA) disintesis melalui kopolimerisasi radikal dari 5-tert butylperoxy-5-methyl-l-hexene-3-yne (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (monomer peroksida yang disintesis dengan metode yang dijelaskan [28]) dan metakrilat glisidil (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich, AS) dalam etil asetat (7,9 mL) (Merck, Darmstadt, Jerman) menggunakan azoisobutyronitril (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Jerman) sebagai inisiator radikal. Polimerisasi dilakukan pada 343K hingga konversi maksimal 65% tercapai. Poly(VEP-co-GMA) digunakan sebagai tulang belakang untuk pemasangan rantai sisi PEG melalui reaksi penambahan eter metil polietilena glikol (mPEG) dengan grup epoksida sisi. Eterat boron trifluorida (0,027 mL, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS) ditambahkan ke dalam larutan kopolimer (1,0 g) dalam dioksan (20 mL; Merck, Darmstadt, Jerman) pada 313 K dan diaduk selama 3 h. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, AS) dicairkan dalam dioksan (15 mL) dan larutan dicampur dengan larutan polimer tulang belakang dan diaduk selama 6 h pada 313 K. mPEG yang tidak bereaksi dihilangkan menggunakan kantong dialisis dengan pore size molecular weight cut-off (MWCO) 6–8 kDa (Sigma-Aldrich, AS). Komb poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG yang dihasilkan dikeringkan pada suhu kamar di bawah vakum hingga bobot konstan. Struktur dan beberapa karakteristik PNC disajikan dalam Gambar 2 dan telah dijelaskan sebelumnya [29].

Untuk menyiapkan larutan PNC berbasis air, 0,09 g PNC dicairkan dalam 0,9 mL DMSO. Larutan PNC ini ditambahkan ke 8,0 mL larutan NaCl 0,9%. Kemudian, larutan diaduk selama 0,5 h dan diultrasonik selama 10 s. Dispersi air dari kompleks diperoleh dengan meneteskan larutan DMSO dari 4-tiazolidinon dan PNC ke dalam air dalam urutan berikut: 0,045 g PNC dicairkan dalam 0,15 mL DMSO (Sigma-Aldrich, AS), dan 0,0015 g Les-3288 (atau Les-3833) dicairkan dalam 0,10 mL DMSO. Larutan PNC dan 4-tiazolidinon dicampur dan ditambahkan ke 4,25 mL larutan NaCl akuatik 1% dan diultrasonik selama 10 s.

PNC yang aktif permukaan ini mengandung rantai PEG yang hidrofilik yang di-graft pada tulang belakang hidrofobik (Gambar 2a). Dalam larutan air, PNC amfifilik membentuk struktur seperti micelle yang dapat melarutkan senyawa yang tidak larut air (misalnya obat) atau senyawa ini dapat terikatan pada permukaan nanopartikel, sehingga meningkatkan kompatibilitas biologis. Teknik yang dikembangkan untuk mendapatkan dispersi air yang sangat stabil dari terapi kimiawati berbasis 4-tiazolidinon terdiri dari inti partikel obat skala nano yang terjadi ketika larutan yang dicairkan dalam DMSO dipindahkan ke dalam larutan penyenap saline yang berisi surfaktan polimer PNC yang menyediakan lapisan polimer untuk permukaan nanopartikel. Akibatnya, karena agregasi dan sedimentasi, kompleksnya terstabilisasi dan dispersi dicegah. Selain itu, kompleks skala nano dari derivat 4-tiazolidinon terlindungi dari interaksi yang mungkin dengan mikroenvironment biologis sekitar. Perlindungan ini memungkinkan mereka untuk bertahan lebih lama dalam tubuh tanpa kehilangan stabilitas dan menyelimuti jaringan atau organ target tanpa menyebabkan efek samping negatif. Dengan demikian, modifikasi ini memberikan stabilitas agregasi dan sedimentasi yang ditingkatkan dari dispersi air nanopartikel senyawa anti-kanker.

Ukuran micelle polimer PNC dan kompleks PNC dengan heterocyclic 4-tiazolidinon diukur oleh pencaran cahaya dinamis (DLS) menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Jerman) dan DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, AS) dan spektrum korelasi foton menggunakan teknologi back scatter non-invasif (NIBS) pada 25°C. Sampel untuk pengukuran DLS disiapkan seperti yang dijelaskan di atas, dan jika perlu, dicairkan dengan air bi-distilasi, pH 6,5–7,0. Tiga-lima pengukuran dilakukan untuk setiap sampel (setiap pengukuran terdiri dari 5 siklus dan rentang antara pengukuran adalah 5 min). Gambar 3 menunjukkan distribusi ukuran struktur micellar PNC dan nanopartikel kompleks PNC dengan heterocyclic 4-tiazolidinon (Les-3833 dan Les-3288) yang dianalisis oleh DLS. Ukuran dan morfologi micelle PNC serta nanopartikel 4-tiazolidinon yang dilapisi PNC diteliti menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-200А (JEOL, Jepang) pada tegangan percepatan 200 kV [30, 31]. Sampel disiapkan seperti yang dijelaskan di atas, dan jika perlu, dicairkan dengan air bi-distilasi. Sampel disiapkan dengan menyemprotkan larutan yang diuji ke substrat menggunakan dispersan ultrasonik UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraina), yang memfasilitasi lapisan seragam pada substrat. Ltipis karbon amorf yang ditetapkan pada grid tembaga digunakan sebagai substrat. Ukuran dan morfologi micelle PNC dan kompleks dengan heterocyclic 4-tiazolidinon (Les-3288 dan Les-3833) yang diteliti oleh metode DLS dan TEM disajikan dalam Gambar 3.

Studi DLS dan mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan bahwa ukuran micelle PNC adalah 50 ± 25 nm dan nanopartikel yang dibentuk oleh kompleks PNC dengan heterocyclic 4-tiazolidinon Les-3833 dan Les-3288 adalah 140 ± 25 nm dan 155 ± 30 nm, masing-masing. Dispersi kompleks PNC dengan derivat 4-tiazolidinon sangat stabil dan terlindungi dari agregasi dan sedimentasi oleh cakaran PNC yang terikatan pada permukaan nanopartikel tiazolidinon. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, perubahan ukuran nanopartikel yang disperdi dalam sistem air dapat diabaikan pada multiple pengenceran dengan air, serta setelah 6 bulan penuaan sistem air kompleks PNC dengan 4-tiazolidinon.

Kultur Sel

Sel glioma tikus baris C6 diperoleh dari Koleksi Kultur Sel di Institut Biologi Molekular dan Genetika, Akademi Ilmu Pengetahuan Ukraina (Kyiv, Ukraina). Sel dibudidayakan dalam medium Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM, Sigma, AS) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi fetus (Sigma, AS). Sel dibudidayakan dalam inkubator CO₂ pada 37°C, 5% CO₂, dan 95% kelembaban. Penanaman ulang sel dilakukan dengan rasio 1:5 sekali setiap 2–3 hari.

Evaluasi Tindakan Sitotoksik Senyawa yang Ditinjau

Sel ditanam dalam plate 24-lubang pada konsentrasi 100.000 sel/mL dalam satu lubang. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, AS). Senyawa yang ditinjau ditambahkan pada konsentrasi 0,1, 0,5, dan 1,0 μM setelah periode adaptasi 24 h yang dimulai setelah penanaman sel. Perhitungan sel dilakukan pada interval teratur dalam ruang penghitung hemositometer menggunakan cat biru Trypan (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, AS) pada konsentrasi akhir 0,01%, 2 menit setelah penambahannya pada suspensi sel. Sel mati menyerap cat ini karena kerusakan pada membran plasma mereka.

Sitometri Aliran

Untuk mempelajari siklus sel dan apoptosis, sel C6 diobati dengan Les-3288, Les-3833 dan kompleksnya dengan PNC, serta dengan PNC dalam bentuk bebas, dicuci dengan larutan puas fosfat (PBS, pH 7,4), dipelletkan oleh sentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 min pada 4°C dan dire-suspend dalam PBS dingin (2 juta sel per 1 mL PBS). Kemudian, sel di-fiks dengan menambahkan alikot etanol murni 4 mL yang didinginkan ke −20°C dengan diaduk lembut. Sampel yang di-fiks disimpan pada −20°C hingga digunakan (tidak lebih dari 1 minggu). Untuk analisis sortasi sel fluorescens (FACS), sampel sel difosentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 min pada 4°C, sobrenatan dibuang dan pellet sel dire-suspend dalam 1 mL PBS. Seratus mikroliter RNase bebas DNase (Sigma, AS) ditambahkan ke dalam suspensi itu, dan sampel diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit. Kemudian, setiap sampel ditambahkan dengan 100 μl iodida propidium (PI) (Sigma, AS, 1 mg/mL), dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Akhirnya, sampel dipindahkan ke tabung plastik Falcon, dan suspensi sel dipantau dengan sitometr aliran FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, AS) dan perangkat lunak Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, AS) untuk mengukur parameter siklus sel dan apoptosis.

Pengukuran sel positif Annexin V (apoptotik) dilakukan menggunakan analisis FACS. Sel glioma C6 tikus diobati dengan konsentrasi 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, dan 1 mg/mL dari PNC, Les-3288, Les-3833, dan konjugat polimeriknya seperti yang ditunjukkan di bawah gambar. Pada akhir eksperimen, sel dilepas dari dasar petri dengan larutan Trypsin-EDTA, dicuci dua kali dengan PBS, dan diwarnai dengan Annexin V-FITC menggunakan Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, AS), sesuai dengan petunjuk produsen. Sel yang dicuci diinkubasi selama 15 min dalam buffer binding Annexin V (BD Pharmingen), yang mengandung volume 1/50 larutan Annexin V terkonjugasi FITC. Kemudian, sampel dicairkan dua kali dengan volume yang sesuai dari buffer binding Annexin V dan segera diukur pada saluran FL1/FL2 (FITC-PI) dari sitometr aliran (Becton Dickinson, AS). Sel positif tunggal Annexin V diklasifikasikan sebagai apoptotik.

Analisis Komet DNA

Analisis komet DNA dilakukan dalam kondisi alkali. Sepuluh ribu sel dicampur dalam 75 μl agarose titik leleh rendah (0,5%) per sampel. Setelah dicampur, sampel dipipetkan pada slide yang telah ditutupi dengan agarose titik leleh normal 1,5% sebelumnya. Sampel diinkubasi pada 4 °C selama 18 jam dalam larutan lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Untuk membuka DNA dan mengekspresikan kerusakan yang rapuh alkali, slide diinkubasi dalam larutan alkali pada suhu kamar selama 20 min (dilakukan dalam gelap). Untuk elektroforesis (~74 V/cm selama 30 min), slide dipindahkan ke kamar horizontal dan buffer elektroforesis 1x (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) ditambahkan. Slide di-fiks dalam metanol dingin 100% dan dikeringkan. Slide diwarnai dengan 80 μL etidium bromida (EtBr) 1× selama 5 menit dan kemudian dicelupkan dalam air distil dingin untuk menghilangkan cat berlebih. Komet DNA divisualisasikan menggunakan mikroskop (Carl Zeiss, Jerman), dan citra dianalisis menggunakan perangkat lunak ‘CASP’ (Casplab-1.2.3b2 software, CASPlab, Wroclaw, Polandia). Seratus komet per sampel dihitung. Kerusakan DNA dikategorikan ke dalam lima tingkat genotoksisitas berdasarkan ukuran ekor komet: 0 (0–5% kerusakan), 1 (5–25% kerusakan), 2 (25–45% kerusakan), 3 (45–70% kerusakan), dan 4 (lebih dari 70% kerusakan) [32]. Indeks kerusakan (DI) dihitung, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [33].

Analisis Interkalasi DNA Menggunakan Cat Methyl Green

Senyawa Les-3288 dan Les-3833 diselidiki untuk kemampuan interkalasi ke dalam molekul DNA menggunakan analisis methyl green [34]. DNA sperma salmon (10 mg/mL) diinkubasi selama 1 h pada 37 °C dengan 15 μL larutan methyl green (1 mg/mL dalam H₂O). Senyawa ditambahkan pada 1 μg/mL dan diinkubasi pada 37 °C dalam gelap selama 2 h. Volume akhir total sampel adalah 1 mL. Absorpsi methyl green diukur pada 630 nm, setelah sampel diinkubasi selama 2 h pada 37 °C, menggunakan mikropektometer multichannel BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, AS). EtBr digunakan sebagai kontrol positif.

Analisis Data dan Statistik

Semua eksperimen diulang tiga kali dengan tiga paralel dalam setiap varian. Analisis variansi (ANOVA) digunakan untuk perbandingan grup. Data distribusi sel glioma C6 tikus dalam berbagai fase siklus sel dianalisis dengan one-way ANOVA, diikuti oleh uji komparasi multiple post hoc Tukey. Semua data disajikan sebagai mean ± SD. Nilai p < 0,05 dianggap sebagai secara signifikan statistik.

Hasil

Efek Sitotoksik (Uji Pengecualian Cat Biru Trypan) dari Derivat 4-Tiazolidinon yang Digunakan dalam Bentuk Bebas dan dalam Kompleks dengan Nanokarrier Polimer

Hasil uji pengecualian cat biru Trypan menunjukkan bahwa bentuk air dari kompleks Les-3288 dan Les-3833 dengan PNC memiliki toksisitas yang ditingkatkan terhadap sel glioma C6 (pengobatan 24 h dan 48 h) dibandingkan dengan sitotoksisitas yang diamati dari penggunaan bentuk bebas senyawa ini (Gambar 5 dan 6). Efek sitotoksik tertinggi diamati pada dosis 0,1 dan 0,5 μM senyawa Les-3288 dan Les-3833 dalam kompleks mereka dengan PNC, sedangkan pada dosis tertinggi (1,0 μM) senyawa ini, peningkatan kompleksasi dengan PNC terdeteksi hanya dalam kasus Les-3288 untuk 24 h (Gambar 5 dan 6).

Kompleksasi Les-3833 dan Les-3288 dengan Nanokarrier Polimer Meningkatkan Aktivitas Pro-Apoptotik Mereka In Vitro terhadap Sel Glioma C6 Tikus

Dua pendekatan alternatif digunakan untuk menilai efek modulat dari PNC pada potensi sitotoksik derivat 4-tiazolidinon yang dipilih. Pertama, analisis siklus sel dilakukan untuk menyelidiki dampak kompleks obat-PNC pada siklus sel. Selain itu, pewarnaan ganda Annexin V/PI digunakan untuk membedakan jenis kematian sel yang tepat yang diinduksi oleh nanokomposit ini.

Senyawa Les-3288 dan Les-3833 pada dosis rendah (0,1 μg/mL dan 0,5 μg/mL) tidak menghasilkan efek yang terlihat pada perkembangan siklus sel atau induksi apoptosis, seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 7 dan Tabel 1. Namun, kompleksasi keduanya dengan PNC secara signifikan meningkatkan jumlah sel dalam tahap pre-G₁ (4 kali lipat untuk Les-3288 dan 6 kali lipat untuk Les-3833), yang menunjukkan peningkatan besar dari potensi pro-apoptotik mereka. Harus ditekankan bahwa PNC dalam bentuk bebas tidak memiliki dampak pada siklus sel atau induksi apoptosis; sehingga, kemunculan populasi sel pre-G1 yang besar pada pengobatan dengan kompleks tiazolidinon-nanokarrier tidak dapat dijelaskan oleh efek sinergis sederhana dari PNC dan obat eksperimental.

Untuk mengonfirmasi bahwa puncak sub-G1 yang diamati terdiri dari sel apoptotik, hasil uji pewarnaan Annexin V/PI dianalisis. Kami tidak mengamati eksternalitas fosfatidilserine yang signifikan (markernya utama apoptosis awal, terdeteksi oleh Annexin V terkonjugasi FITC) selama pengobatan glioma C6 dengan dosis rendah (0,1 dan 0,5 μg/mL) dan dosis tinggi Les-3288 (1,0 μg/mL), yang menunjukkan bahwa senyawa ini adalah indutor apoptosis yang lemah. Sebaliknya, kami menemukan peningkatan populasi sel nekrotik (dari 1,2% pada kontrol hingga 11,25% untuk Les-3288, 1,0 μg/mL), yang mungkin menunjukkan bahwa Les-3288 setidaknya sebagian menyebabkan kematian sel nekrotik. Namun, kompleksasi Les-3288 dengan PNC sepenuhnya mengubah mode tindakan obat ini. Ada peningkatan massal dalam jumlah sel apoptotik awal (Annexin V(+)/PI(−)) dan sel apoptotik akhir (Annexin V (+)/PI(+)), sementara jumlah keseluruhan sel nekrotik murni tetap pada tingkat sel kontrol (tidak diobati) (Gambar 8a). Dengan demikian, ikatan Les-3288 dengan PNC tidak hanya secara kuat meningkatkan aktivitas pro-apoptotiknya terhadap sel glioma, tetapi juga mengurangi potensi mekanisme kematian sel pro-nekrotik. Temuan ini mungkin sangat penting untuk praktik klinis karena obat pro-nekrotik tidak direkomendasikan untuk digunakan karena induksi inflasi yang massial yang tidak nyaman bagi pasien.

Menganga, kami tidak mengamati efek yang sama untuk kompleks Les-3833+PNC. Faktanya, aktivitas pro-apoptotik kompleks Les-3833+PNC lebih rendah dibandingkan Les-3288 dalam bentuk bebas pada semua konsentersi yang diuji (Gambar 8b). Perbedaan yang drastis antara kedua senyawa ini mungkin dijelaskan oleh spesifisitas struktur kimia mereka, dan kami spekulasi bahwa dalam kasus Les-3833, struktur polimer harus dioptimalkan untuk mencapai hasil yang lebih baik.

Analisis Komet DNA dari Kerusakan DNA pada Sel Glioma C6 Tikus yang Disebabkan oleh Derivat 4-Tiazolidinon dalam Bentuk Bebas dan Kompleks dengan PNC

Analisis komet alkali memungkinkan deteksi pita tunggal DNA yang patah pada situs DNA yang rapuh alkali. Hasil yang diperkirakan menggunakan nilai mean dari Olive tail moment (OTM). Data kami menunjukkan bahwa pengobatan sel glioma C6 tikus dengan Les-3288, Les-3833, dan PNC (konsentrasi 0,5 μg/mL) selama 3 h (Gambar 9 dan 10) tidak menyebabkan kerusakan DNA yang signifikan (OTM = 0,7299 ± 0,1276, OTM = 1,466 ± 0,3086, OTM = 0,5846 ± 0,1078, masing-masing), dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati (OTM = 0,4541 ± 0,07273). Namun, pengobatan sel dengan kompleks Les-3833 + PNC (OTM = 2,3880 ± 0,2212) menyebabkan kerusakan DNA yang lebih signifikan dibandingkan pengobatan sel dengan bentuk bebas Les-3833. Peningkatan kerusakan ini tidak diamati untuk tindakan kompleks Les-3288+PNC (Gambar 9 dan 10).

Peningkatan waktu inkubasi sel hingga 6 h (Gambar 11 dan 12) menyebabkan kerusakan DNA yang lebih besar dalam semua grup eksperimental: Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, dan Dox (kontrol positif). Namun, efek kompleks Les-3288+PNC dan Les-3833+PNC tampaknya lebih rendah dibandingkan efek bentuk bebas Les-3288 dan Les-3833. Harus dicatat bahwa efek kerusakan DNA dari kompleks kedua derivat dengan PNC lebih rendah dari efek tersebut dari derivat ini yang digunakan dalam bentuk bebas.

Hasil dievaluasi menggunakan nilai mean TailDNA%. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa inkubasi sel glioblastoma С6 tikus dengan senyawa Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, dan PNC (semua pada konsentrasi 0,5 μg/mL) selama 3 h (Gambar 13) tidak mengakibatkan kerusakan DNA yang signifikan (TailDNA% 4,157 ± 0,682; TailDNA% 3,530 ± 1,012, 8,807 ± 0,878; 3,298 ± 0,514, masing-masing) dibandingkan dengan kontrol (TailDNA% = 3,638 ± 0,406), namun pengobatan sel dengan kompleks Les-3833+PNC (TailDNA% = 19,53 ± 1,48) menyebabkan kerusakan DNA yang lebih signifikan dibandingkan bentuk bebas Les-3833. Peningkatan waktu inkubasi hingga 6 h (Gambar 14) dalam semua kasus mengakibatkan kerusakan DNA yang lebih besar. Lagi, tingkat TailDNA% yang terdeteksi dari tindakan kompleks kedua derivat dengan PNC lebih rendah dari tingkat indikator tersebut untuk tindakan derivat ini yang digunakan dalam bentuk bebas.

Kami juga menggunakan sistem klasifikasi alternatif lima kategori untuk mengklasifikasikan migrasi DNA dan menghitung DI. Tabel 2 merangkum persentase sel glioma C6 tikus untuk setiap tingkat genotoksisitas selama 3 h pengobatan. Dalam kontrol (sel tidak diobati), persentase sel yang lebih tinggi dalam tingkat 0 (81,3%) dan 1 (18,6%) terdeteksi dibandingkan dengan tingkat ini pada sel yang diobati Les-3288 dan PNC. Kompleksasi Les-3288 dengan PNC tidak mengakibatkan perubahan besar dalam pola distribusi komet DNA. Sebaliknya, sel yang diobati Les-3833 menunjukkan persentase sel yang lebih rendah dalam tingkat 0 (38,6%) dan persentase sel yang lebih tinggi dalam tingkat 1 (60,0%), sedangkan sel yang diobati Les-3833 + PNC menunjukkan persentase sel yang secara signifikan lebih rendah dalam tingkat 0 (8,0%) dan persentase sel yang jauh lebih tinggi dengan tingkat 1 (76,0%), 2 (13,3%), dan 3 (2,6%). Indikator integratif dari kerusakan DNA (DI) dalam kasus aplikasi Les-3288 dan kompleksnya dengan PNC tidak berbeda secara signifikan dari kontrol atau menggunakan PNC bebas, sementara DI dari penggunaan Les-3833 dan kompleksnya dengan PNC bahkan lebih tinggi dari DI dari penggunaan Dox.

Selama interval waktu ini, sel yang diobati Les-3833 + PNC menunjukkan persentase sel dengan kerusakan DNA tingkat 4 (5,3%) yang lebih tinggi dibandingkan sel yang diobati Les-3288 dan senyawa eksperimental lainnya, namun persentase sel dalam tingkat 2 dan 3 lebih rendah (16,0% dan 12,0%, masing-masing) dibandingkan dari pengobatan dengan senyawa lain (Tabel 2). Tabel 3 merangkum persentase sel glioma C6 tikus dengan kerusakan DNA setelah 6 h pengobatan. Secara umum, kecenderungan untuk munculnya komet DNA kelas yang lebih tinggi terdeteksi saat kompleks Les-3833 dan Les-3288 digunakan, dibandingkan dengan spektrum kelas komet DNA yang diinduksi oleh bentuk bebas agen ini (Tabel 3). Namun, indikator integratif dari kerusakan DNA (DI) yang dihitung untuk tindakan kompleks Les-3833 dan Les-3288 ditemukan lebih rendah dari indikator tersebut untuk tindakan bentuk bebas agen ini. Penjelasan yang mungkin adalah tingkat DI yang sangat tinggi pada tindakan 6 h agen yang diteliti yang bahkan lebih tinggi dari indikator yang ditemukan untuk tindakan Dox (Tabel 3). Dengan demikian, kami mengamati ketergantungan waktu dari kerusakan DNA yang disebabkan oleh kompleks Les-3833 dan Les-3288: pada 3 h pengobatan, ada peningkatan DI dalam kasus tindakan kompleks Les-3833, dibandingkan dengan tindakan bentuk bebas Les-3833; namun, pada 6 h pengobatan, ada penurunan dalam kerusakan DNA untuk tindakan kompleks kedua Les-3833 dan Les-3288, dibandingkan dengan kerusakan tersebut yang diamati untuk tindakan bentuk bebas agen ini. Tidak ada ketergantungan waktu yang signifikan untuk tindakan PNC, sementara peningkatan yang signifikan bergantung pada waktu (dari 3 hingga 6 h) dalam DI diamati untuk tindakan Dox (dari 41,2 + 0,40 hingga 185,2 + 0,23).

Interkalasi DNA oleh Derivat 4-Tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833

Senyawa Les-3288 dan Les-3833 menunjukkan kemampuan tertentu untuk interkalasi molekul DNA dengan penggantian cat methyl green sekitar 15% dan 10%, masing-masing. EtBr, agen interkalasi DNA yang terkenal, digunakan sebagai kontrol positif, dan ditunjukkan menggantikan cat methyl green secara lebih efisien (70%) (Gambar 15). Dengan demikian, Les-3288 dan Les-3833 tidak mampu secara efektif interkalasi di antara pasangan basis komplementer dalam DNA ganda rantai.

Pembahasan

Ada dua masalah utama yang menghambat peningkatan efisiensi perawatan bagi pasien kanker: (1) tindakan yang tidak diatasi dari banyak obat anti-kanker yang mengarah pada toksisitas umum dan efek samping negatif yang parah karena kerusakan jaringan dan organ normal; (2) perkembangan resistensi sel tumor terhadap obat anti-kanker yang diterapkan dengan cepat (6–12 bulan) yang mengarah pada kehilangan efektivitas tindakan obat. Selain itu, ada masalah teknis ketiga, yaitu kelarutan air yang buruk dari banyak obat anti-kanker. Namun, ikatan obat ini dengan karrier spesifik berukuran skala nano dapat membantu menyelesaikan masalah kelarutan.

Dalam studi ini, kami mengatasi masalah pertama dan ketiga yang disebutkan di atas dengan (a) memilih substansi sintesis baru (derivat 4-tiazolidinon: Les-3288 dan Les-3833) yang memiliki aktivitas anti-kanker tinggi dan toksisitas umum yang lebih rendah pada hewan yang membawa tumor [7, 8, 23] dan (b) menerapkan platform pengiriman obat baru yang menyediakan bentuk berbasis air yang stabil dari kompleks derivat 4-tiazolidinon yang tidak larut air dengan polimer PEGilasi.

Derivat 4-tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833—adalah senyawa heterocyclic dengan massa molekular 400–600 Da. Senyawa ini dan derivat terkait lainnya disintesis di Universitas Kedokteran Nasional Lviv (Ukraina), dan sebagian besar telah diuji di bawah Program Therapeutik Pengembangan di Institut Kanker Nasional di Bethesda, MA, (AS) [35,36,37,38]. Berdasarkan evaluasi aktivitas antineoplasia mereka, substansi paling menjanjikan dipilih untuk studi lebih lanjut tentang mekanisme tindakan sitotoksik mereka dan efek anti-kanker [25]. Les-3833 menunjukkan toksisitas tinggi terhadap sel melanoma B16F10, WM793, dan SK-Mel-28, dan terhadap sel kanker paru A549, payudara MCF-7, usus HCT116, dan ovarium SKOV3 manusia serta sel leukemia (baris L1210, Jurkat, HL-60) [23, 25, 39]. Les-3288 dan Les-3833 menunjukkan toksisitas tinggi terhadap sel glioma mamalia (baris C6, U251, U373) [23, 24].

Sebelumnya, kami menemukan bahwa Les-3288 dan Les-3833 adalah yang paling toksis di antara derivat 4-tiazolidinon lainnya terhadap sel glioma C6 tikus dan sel glioblastoma U251 manusia [23, 24], meskipun aplikasi mereka untuk pengobatan sel sangat rumit karena ketidaklarutan air yang mutlak. Hanya menggunakan DMSO dengan pemanasan tambahan yang efektif untuk menyiapkan bentuk yang larut dari derivat ini (lihat bagian “Bahan dan Metode”). Dengan demikian, wajar untuk mencari cara untuk meningkatkan pengiriman derivat ini ke sel target, dan kami menggunakan PNC sintesis untuk menyelesaikan tugas ini. Kompleksasi derivat 4-tiazolidinon yang diteliti dengan PNC yang diterapkan juga meningkatkan efektivitas tindakan antineoplasia mereka. Mekanisme tindakan pro-apoptotik senyawa ini telah divisualisasikan menggunakan analisis western blot dan FACS [23, 24]. Harus dicatat bahwa pada hewan percobahan sehat, Les-3288 dan Les-3833 menghasilkan efek samping negatif yang jauh lebih sedikit seperti kardiotoksisitas [40], hepatotoksisitas [8], dan nefrotoksisitas [7] dibandingkan dengan agen kimiawati anti-kanker yang banyak digunakan Dox.

Dalam studi sebelumnya, kami menunjukkan bahwa Les-3288 tidak menginduksi produksi ROS selama tindakan pro-apoptotiknya in vitro dan efek pada hewan percobaan laboratorium [23], sementara tindakan Les-3833 mengarah pada produksi tersebut; namun, ini lebih rendah daripada Dox. ROS dianggap sebagai efektor utama efek samping negatif obat anti-kanker, terutama Dox [41, 42]. Dengan demikian, senyawa Les-3288 dan Les-3833 dapat menjadi obat anti-kanker yang menjanjikan karena mereka memiliki aktivitas anti-tumor, tetapi tidak menunjukkan toksisitas umum pada tingkat yang khas untuk obat anti-kanker efektif seperti Dox.

Hambatan besar dalam mempromosikan Les-3288 dan Les-3833 sebagai obat anti-kanker adalah kelarutan air yang buruk. Masalah ini juga ada pada obat anti-kanker lain, seperti taxol [2, 4]. Untuk paklitaksel, masalah ini diatasi dengan menggunakan minyak khusus untuk menyusun formulasi obat [2, 4, 43]. Namun, platform pengiriman spesifik dianggap lebih menjanjikan untuk menciptakan obat “cerdas” yang memiliki tindakan efektif dalam organisme [3, 13]. Surfaktan polimer fungsional spesifik dengan arsitektur blok, kombinasi, dan blok/cabang, termasuk yang mengandung PEG, serta bentuk air yang dihasilkan telah dikembangkan dan diusulkan untuk digunakan sebagai karrier untuk pengiriman Dox [26, 27] dan agen kimiawati logam KP-1019 [10] di Departemen Kimia Organik Universitas Teknologi Nasional Lviv Polytechnic.

Karena derivat 4-tiazolidinon adalah senyawa yang tidak larut air, DMSO digunakan untuk menyiapkan bentuk yang larut air mereka. Untuk menghindari konsekuensi negatif dari penggunaan pelarut beracun seperti DMSO, kami komplekskan derivat ini dengan PNC di atas. Dispersi air nano yang sangat terperinci dan stabil dari senyawa ini diperoleh dan diterapkan untuk pengobatan sel glioma C6 tikus.

Penggunaan kompleks derivat 4-tiazolidinon dengan PNC mengarah pada pengurangan toksisitas umum senyawa ini pada hewan percobaan. Sebelumnya, kami menemukan bahwa ketika agen anti-tumor eksperimental (Les-3288, Les-3833, Les-3882) diterapkan dalam kompleks dengan karrier polimer sintesis, tindakannya diiringi oleh perubahan yang jauh lebih kecil dalam parameter biokimia dalam serum darah yang khas untuk kardiotoksisitas [40], hepatotoksisitas [8], dan nefrotoksisitas [7], dibandingkan dengan yang ada pada Dox. Dengan demikian, kompleksasi agen anti-tumor ini dengan PNC dan aplikasi mereka dalam bentuk sistem pengiriman air yang stabil mengurangi efek toksis mereka pada hewan percobaan, dibandingkan dengan tindakan zat ini dalam bentuk bebas [44]. Beberapa sistem pengiriman paklitaksel telah diusulkan termasuk nanopartikel polimer, formulasi berbasis lipid, konjugat polimer, nanopartikel anorganik, nanokarbon, kristal nano, dan nanopartikel siklodestrin [43].

Jadi, kompleksasi Les-3288 dengan PNC secara signifikan meningkatkan aktivitas pro-apoptotik obat eksperimental ini, yang memungkinkan kami melangkahnya ke studi pre-klinis pada model tumor hewan. Kompleksasi Les-3833 dengan nanokarrier jenis yang sama kurang efisien, dan sehingga jenis polimer lain harus digunakan.

Bentuk berbasis air yang dikembangkan dari kompleks, serta derivat bebas, diterapkan untuk pengobatan sel glioma C6 tikus. Ditemukan bahwa bentuk berbasis air dari kompleks PNC dengan derivat 4-tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833—meningkatkan tindakan pro-apoptotik senyawa ini. Dalam studi lain, kami menunjukkan bahwa induksi apoptosis oleh Les-3288 tidak diiringi oleh induksi ROS, yang berlawanan dengan tindakan Dox dan Les-3833 [23]. Dengan demikian, aktivitas anti-tumor yang tinggi dari Les-3288 bersama dengan toksisitas umum yang rendah saat menargetkan ganas pada tikus yang membawa limfoma NK/Ly menunjukkan potensi besar untuk senyawa anti-kanker eksperimental ini. Data yang disajikan juga memprediksi kegunaan potensi senyawa Les-3288 dan Les-3833 yang kompleks dengan PNC untuk pengobatan glioma.

Pembelahan sel, differensiasi, dan kematian adalah proses fisiologis utama yang mengatur homeostasis jaringan dalam organisme multiseluler. Gangguan integritas genom dan regulasi kematian sel yang terpencil mungkin keduanya mengarah pada pertumbuhan sel yang tidak terkontrol. Proses kematian sel yang terpencil juga dapat mempromosikan ketidakstabilan genom. Semakin jelas bahwa deregulasi siklus sel dan proses kematian sel memainkan peran penting dalam perkembangan gangguan utama seperti kanker, penyakit kardiovaskular, infeksi, inflamasi, dan penyakit neurodegenerasi [45].

Kami telah menemukan bahwa beberapa derivat 4-tiazolidinon, yaitu Les-3288 dan Les-3833, bahkan lebih efektif daripada Dox dalam induksi apoptosis pada sel glioma C6 tikus dan sel glioblastoma U251 manusia in vitro [23, 24]. Harus dicatat bahwa tumor otak termasuk maligansi yang paling resistan terhadap terapi kimia yang diterapkan, dan tingkat kelangsungan hidup pasien dengan tumor ini sangat rendah [44].

Telah ditunjukkan bahwa kompleksasi dengan PNC ini meningkatkan tindakan pro-apoptotik derivat 4-tiazolidinon (Les-3288 dan Les-3833) [44]. Dalam studi lain [23], kami menunjukkan bahwa induksi apoptosis oleh Les-3288 tidak diiringi oleh induksi ROS, yang berlawanan dengan tindakan Dox dan sebagian berlawanan dengan tindakan Les-3833. Data ini dapat menjelaskan toksisitas umum yang lebih rendah dari Les-3288 dibandingkan dengan Dox [23, 24].

Hasil analisis FACS sepakat dengan saran bahwa peningkatan tindakan pro-apoptotik derivat 4-tiazolidinon yang diteliti adalah karena kompleksasi mereka dengan PNC baru. Kompleksasi Les-3288 dan Les-3833 ini meningkatkan rasio sel pre-G1 dalam populasi sel glioma C6 tikus yang diobati, mengurangi rasio sel G1, dan meningkatkan tindakan sel G2/M. Data ini menunjukkan peningkatan baik tindakan sitotoksik (apoptosis) dan tindakan sitostatis (blok dalam fase G2/M siklus sel) dari derivat yang diteliti yang kompleks dengan PNC. Secara umum, mekanisme apoptosis pembelihan sel glioma oleh kompleks Les-3288 + PNC dan kompleks Les-3833 + PNC telah ditunjukkan oleh hasil analisis FACS dari kemunculan sel glioma C6 tikus positif tunggal Annexin V.

Terlibatnya mekanisme apoptosis dalam tindakan derivat 4-tiazolidinon yang diteliti juga dikonfirmasi oleh hasil analisis komet DNA. Ditemukan bahwa kompleksasi Les-3833 dengan PNC mengakibatkan penurunan (dibandingkan Les-3833 bebas) dalam rasio sel glioma C6 tikus dalam komet DNA “0” dan peningkatan simultan dalam rasio komet “1,” “2,” dan “3” (pengobatan sel selama 3 h). Pada 6 h pengobatan dengan kompleks Les-3833+PNC, ada peningkatan besar (dibandingkan Les-3833 bebas) dalam rasio komet “1”, peningkatan dalam rasio sel dengan kerusakan DNA yang paling mencolok (“4” komet), dan penurunan dalam rasio komet “2” dan “3”. Harus dicatat bahwa efek kerusakan DNA Les-3288 dan Les-3833 yang diukur pada 6 h lebih tinggi dari efek tersebut dari kompleks derivat ini dengan PNC (lihat Tabel 3). Penjelasan yang mungkin di sini adalah tingkat DI yang sangat tinggi pada tindakan 6 h agen yang diteliti yang bahkan lebih tinggi dari tingkat indikator yang ditemukan untuk tindakan Dox (Tabel 3). Tidak ada ketergantungan waktu dalam tindakan PNC, sementara peningkatan yang signifikan bergantung pada waktu (dari 3 hingga 6 h) (dari 41,2 + 0,40 hingga 185,2 + 0,23) dalam DI terdeteksi untuk tindakan Dox.

Dengan demikian, kompleksasi derivat 4-tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833—dengan PNC meningkatkan efek sitotoksik senyawa ini terhadap sel glioma C6 tikus, dan efek tersebut dicapai melalui mekanisme apoptosis termasuk kerusakan DNA yang diamati sebagai komet DNA dalam sel yang di-elektroforesis.

Kami menggunakan uji interkalasi DNA untuk menyelidiki penargetan DNA langsung oleh derivat 4-tiazolidinon dan mengungkapkan penggantian cat methyl green yang lemah (15% dan 10% penggantian untuk Les-3288 dan Les-3833, masing-masing) yang terikrasi ke dalam DNA sperma salmon, dibandingkan dengan penggantian oleh EtBr, yang digunakan sebagai kontrol positif (70%).

Dengan demikian, melakukan eksperimen sitotoksis in vitro dengan derivat 4-tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833—lebih nyaman karena menggunakan bentuk berbasis air dari derivat 4-tiazolidinon—Les-3288 dan Les-3833—yang kompleks dengan PNC baru. Selain itu, kami telah menunjukkan bahwa derivat 4-tiazolidinon sintesis baru (Les-3833 dan Les-3288) memiliki efek pengobatan in vivo terhadap limfoma NK/Ly yang ditanam pada tikus BALB/C, dan efek tersebut dapat dibandingkan dengan efek Dox. Pada saat yang sama, tindakan derivat ini mengakibatkan jauh lebih sedikit efek samping negatif yang diukur sebagai perubahan dalam jumlah eritrosit, neutrofil, dan limfosit dalam darah hewan dan aktivitas aspartat dan alanin aminotransferase dalam serum darah mereka, dibandingkan dengan tindakan Dox.

Kesimpulan

Kompleksasi Les-3288 dan Les-3833 dengan PNC yang mengandung PEG meningkatkan tindakan sitotoksik mereka terhadap sel glioma C6 tikus. Tindakan sitotoksik direalisikan melalui mekanisme apoptosis dan dikonfirmasi oleh analisis FACS sebagai kehadiran fraksi pre-G1 dalam sel glioma C6 tikus dan sel positif tunggal Annexin V. Analisis komet DNA mengungkapkan pita tunggal DNA nuklir yang patah dalam sel glioma C6 yang diobati yang mungkin tidak disebabkan oleh interkalasi senyawa yang diteliti ke dalam molekul DNA. Les-3288 dan Les-3833 yang distabilkan oleh PNC PEG amfifilik menghasilkan bentuk berbasis air dan memberikan peningkatan efek anti-tumor mereka in vitro dibandingkan dengan bentuk bebas obat.

Singkatan

DMSO:: Dimetsil sulfoksida
Dox:: Doksorubisin
EtBr:: Etidium bromida
FACS:: Sortasi sel fluorescens
ROS:: Spesies reaktif oksigen
PBS:: Larutan puas fosfat
PEG:: Polietilena glikol
PI:: Iodida propidium
PNC:: Nanokarrier polimer
SEM:: Mikroskopi elektron pemindai
TEM:: Mikroskopi elektron transmisi
VEP:: 2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in

Penyesuaian Morfologi Grafena melalui Exfoliasi Plasma Katodik Ditingkatkan Ion untuk Superkapasitor Tingkat Tinggi Peningkatan Performa Sel Surya PERC: Al₂O₃ Deposit ALD dengan Pengerahan Dua Tahap yang Dioptimalkan untuk Passivasi Si yang Unggul

bahan nano