Potensi Pemicu Antiproliferatif dan Apoptosis dari Nanopartikel Lipid Target Berbasis Paclitaxel dengan Peningkatan Internalisasi Seluler oleh Reseptor Transferrin—Studi pada Sel Leukemia
Abstrak
Leukemia adalah kanker darah khas yang ditandai dengan banyak duplikasi dan proliferasi sel darah putih. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan nanopartikel multifungsi bermuatan PTX dan menargetkan sel leukemia. Dalam penelitian ini, nanopartikel lipid bermuatan paclitaxel-loaded (TPLN) yang didekorasi dengan transferrin disiapkan dengan tujuan untuk meningkatkan kemanjuran kemoterapi dalam sel leukemia. Hasil dengan jelas menunjukkan potensi penargetan yang lebih unggul dari TPLN ke sel kanker HL-60 dibandingkan dengan nanopartikel bermuatan paclitaxel (PLN). Untuk lebih spesifik, TPLN menunjukkan efek sitotoksik yang secara signifikan lebih tinggi dalam sel kanker dibandingkan dengan PLN yang menunjukkan efisiensi penargetan yang unggul dari sistem nanopartikel yang didekorasi dengan Tf. Nilai IC50 TPLN adalah 0,45 μg/ml dibandingkan dengan 2,8 μg/ml untuk PLN. TPLN menginduksi apoptosis sel kanker yang paling luar biasa dan sebagian besar sel terdistorsi dengan kehadiran besar pembentukan tubuh apoptosis. Yang penting, TPLN menunjukkan pengurangan yang luar biasa dalam proporsi sel yang layak menjadi ~ 65% dengan sekitar ~ 30% sel apoptosis (apoptosis awal dan akhir). Secara keseluruhan, hasil dengan jelas menunjukkan potensi penargetan sistem nanopartikel lipid terkonjugasi ligan ke sel leukemia yang mungkin membuka jalan bagi keberhasilan pengobatan kanker.
Latar Belakang
Leukemia merupakan kanker darah khas yang ditandai dengan banyaknya duplikasi dan proliferasi sel darah putih [1]. Oleh karena itu leukemia sangat mempengaruhi sistem limfatik dan sumsum tulang dan mengakibatkan kematian yang tinggi pada beberapa pasien. Sel punca hematopoietik yang abnormal menyebabkan multiplikasi yang tidak terkontrol di sumsum tulang dan menghasilkan produksi sel darah putih yang belum matang [2, 3]. Kemoterapi adalah pilihan pengobatan yang paling disukai untuk penyakit ini; namun, sebagian besar obat kemoterapi tidak menghasilkan kemanjuran pengobatan dan menyebabkan toksisitas parah pada jaringan normal [4, 5]. Oleh karena itu, pengobatan leukemia segera sangat penting untuk kelangsungan hidup pasien kanker. Strategi penghantaran baru yang dapat meningkatkan efikasi obat sekaligus mengurangi efek toksiknya merupakan kebutuhan waktu [6].
Paclitaxel (PTX) dianggap sebagai salah satu obat ampuh dalam pengobatan berbagai jenis kanker termasuk leukemia [7]. Potensi efek klinis PTX sangat terhambat oleh efek samping sistemik seperti myelosupresi pada jaringan sehat. Selain itu, obat bebas dilaporkan dengan cepat dihilangkan dari sirkulasi sistemik tanpa menimbulkan efek terapeutiknya [8]. Oleh karena itu, penting untuk merancang sistem penghantaran yang sesuai untuk meningkatkan stabilitas dan efek terapeutik obat antikanker. Di antara beberapa sistem pembawa, nanopartikel lipid dilaporkan memiliki stabilitas sistemik yang sangat baik [9, 10]. Untuk lebih spesifik, nanopartikel lipid padat (SLN) adalah kelas unik dari sistem nanocarrier menarik yang mencegah degradasi kimia obat yang dienkapsulasi dan meningkatkan bioavailabilitas [11]. Fitur yang menonjol dari SLN termasuk stabilitas yang sangat baik, pelepasan obat yang terkontrol, stabil pada suhu kamar, penggunaan sistem lipid biokompatibel dan biodegradable, dan efisiensi jebakan yang tinggi dari obat lipofilik seperti paclitaxel. Enkapsulasi nanopartikel obat diharapkan terakumulasi dalam tumor dengan cara yang istimewa karena efek permeasi dan retensi (EPR) yang ditingkatkan [12,13,14]. Meskipun nanopartikel dapat meningkatkan kemanjuran obat yang dienkapsulasi; namun, spesifisitas target untuk tumor masih menjadi pertanyaan. Untuk mengatasi masalah ini, nanopartikel dapat didekorasi dengan ligan penargetan yang secara khusus dapat menargetkan reseptor yang diekspresikan secara berlebihan dalam sel kanker dan meningkatkan akumulasi dan kemanjuran obat [15, 16]. Dalam penelitian ini, kami telah menggunakan transferin yang akan berikatan secara spesifik dengan reseptor transferin yang diekspresikan secara berlebihan dalam sel leukemia. Leukemia diketahui mengekspresikan sejumlah besar reseptor transferin. Nanopartikel terkonjugasi transferin akan terakumulasi dalam sel kanker dengan cara yang diperantarai reseptor [17].
Dalam penelitian ini, kami telah mengembangkan nanopartikel multifungsi yang terdiri dari nanopartikel lipid padat berhias transferrin yang dienkapsulasi dengan paclitaxel. Untuk menggabungkan transferin ke SLN, kami telah mensintesis Tf -PEG-asam oleat terkonjugasi dengan konjugasi PEG dan asam oleat yang kemudian terkonjugasi dengan transferin. Kehadiran PEG akan meningkatkan stabilitas nanocarrier di lingkungan in vitro dan sistemik. Selain itu, keberadaan PEG pada permukaan luar pembawa akan meningkatkan potensi sirkulasi sistem pembawa dan dengan demikian kemanjuran terapeutik.
Secara keseluruhan, tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan nanopartikel multifungsi bermuatan PTX dan menargetkan sel leukemia. Aspek fisikokimia nanopartikel diselidiki. Efek sitotoksik dari obat bebas dan formulasi yang mengandung obat diuji dalam sel kanker leukemia. Eksperimen serapan seluler dilakukan untuk menggambarkan spesifisitas target ligan transferin. Efek antikanker superior dari nanopartikel yang ditargetkan dipelajari lebih lanjut dengan uji apoptosis Hoechst 33342 dan kemudian dipelajari secara kuantitatif menggunakan flow cytometer setelah pewarnaan dengan Annexin V dan PI.
Metode
Materi
Compritol 888 ATO (Gliserol behanat) disediakan oleh Gattefosse (Cina). Kolesterol, asam oleat, dan paclitaxel dibeli dari Sigma-Aldrich, Cina. Transferin manusia (Tf) dibeli dari Sigma-Aldrich, Cina. Semua bahan kimia lainnya memiliki tingkat reagen dan digunakan seperti itu.
Konjugat transferin-PEG-oleic acid (Tf-PEG-OA) disintesis berdasarkan interaksi ikatan amida [18]. Secara singkat, asam oleat, NHS, dan DCC pada rasio molar 1:2:2 dilarutkan dalam pelarut organik dan diaduk selama 16 jam. Reaksi dilakukan pada suhu kamar. Secara terpisah, NH2-PEG-COOH dilarutkan dalam DMSO dan trietilamina ditambahkan dan reaksi dibiarkan sampai 12 jam di bawah atmosfer inert. PEG-OA yang terbentuk dikumpulkan dengan proses dialisis dan pengeringan beku. Sekarang, PEG-OA, DCC, dan NHS pada rasio molar 1:2:2 dilarutkan dalam DMSO dan transferin (bersama dengan TEA) ditambahkan ke dalam campuran reaksi dan reaksi dilakukan dalam atmosfer inert selama 12 jam. Formulasi yang mengandung Tf-PEG-OA yang terbentuk didialisis selama 48 jam dan kemudian diliofilisasi dan disimpan dalam pemrosesan eksperimen lebih lanjut.
SLN dibuat dengan metode penguapan pelarut [19]. Secara singkat, PTX, Compritol 888 ATO, kolesterol, dan Tf-PEG-OA dilarutkan dalam campuran organik yang terdiri dari etanol/kloroform (1:5) dan diaduk selama 30 menit. Larutan organik yang dihasilkan ditambahkan perlahan-lahan dalam fase berair yang mengandung polivinilalkohol 1% dan segera dihomogenkan menggunakan homogenizer T25 (IKA, Bangalore, India) pada 12.000 rpm. Solusinya kemudian probe disonikasi selama 3 menit. Dispersi diaduk selama 12 jam sampai semua pelarut organik menguap. Obat bebas yang tidak terperangkap dipisahkan dari nanopartikel yang mengandung obat oleh air tiga kali menggunakan filter sentrifugal Amicon Ultra-4 (Millipore Corporation, Bedford, USA). Efisiensi penjeratan (EE) dan efisiensi pembebanan (LE) ditentukan dengan metode HPLC. Nanopartikel yang mengandung obat adalah metanol dan diaduk selama 30 menit dan diencerkan dengan volume air yang sama. Jumlah obat yang dimuat dihitung dengan menyuntikkan di kolom HPLC. Nanopartikel lipid yang mengandung obat disimpan pada suhu 4 °C hingga digunakan lebih lanjut.
Karakterisasi Fisik Nanopartikel
Ukuran partikel dan distribusi nanopartikel yang berbeda dievaluasi dengan metode hamburan cahaya dinamis (DLS) menggunakan Zetasizer ZS Nano Malvern Instruments, UK. Partikel diencerkan dengan air suling dan digunakan untuk analisis. Penelitian dilakukan pada suhu kamar dalam rangkap tiga.
Morfologi nanopartikel diamati menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) menggunakan JEM-2000EX (JEOL, Jepang). Nanopartikel diwarnai dengan asam fosfotungistik dan dibiarkan selama 15 menit. Partikel kemudian dikeringkan dari air dan dikeringkan dalam cahaya inframerah selama 5 menit. Partikel dicitrakan menggunakan TEM.
Studi Pelepasan Obat In Vitro
Karakteristik pelepasan obat in vitro dari dua nanopartikel dipelajari dengan menggunakan metode dialisis. Secara singkat, 1 ml dispersi nanopartikel dikemas dalam kantong membran dialisis (MWCO:3500) dengan kedua ujung membran disegel dengan benar. Eksperimen pelepasan dimulai dengan menempatkan kantong dialisis yang ujungnya tertutup rapat dalam 10 ml media pelepas dalam pengocok otomatis dengan kecepatan 100 rpm. Pada titik waktu tertentu, 1 ml sampel dikumpulkan dan dianalisis untuk pelepasan obat menggunakan HPLC. Sistem HPLC Perkin Elmer (Norwalk, USA) dilengkapi dengan pompa (seri 200), degasser vakum on-line (seri 200), auto sampler (seri 200), oven kolom (seri 200), detektor UV/VIS (seri 200 ) digunakan. Kolom C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) dilindungi dengan kartrid pelindung pra-kolom RP18 (30 × 4.6 mm, 10 μm; Norwalk, USA) digunakan. Gradien linier diterapkan; 0 mnt, asetonitril 10%; 30 mnt, 90% asetonitril dan dianalisis pada 214 nm.
Uji Sitotoksisitas
Sitotoksisitas obat bebas dan nanopartikel yang mengandung obat dievaluasi dengan uji 4,5-(dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-tetrazolium bromida (MTT). Sel-sel HL-60 dengan kepadatan penyemaian 8000 sel per sumur disemai di piring 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan obat bebas dan formulasi yang mengandung obat pada konsentrasi yang berbeda dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada 37°C dalam CO yang dilembabkan2 (5%) inkubator. Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan 10 l larutan MTT (5 mg/ml) selama 4 jam. Sel-sel tersebut kemudian diekspos ke DMSO dan diinkubasi selama 20 menit. Kristal formazan kemudian dipelajari absorbansinya menggunakan pembaca lempeng mikro (Multiskan GO, USA) pada 570 nm. Jumlah absorbansi formazan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup yang ada di setiap sumur.
Serapan Nanopartikel ke Seluler
Efisiensi penargetan nanopartikel terhadap sel leukemia dievaluasi oleh percobaan serapan seluler pada tingkat in vitro. Secara singkat, sel-sel HL-60 diunggulkan di piring 6-sumur dengan kepadatan penyemaian 3 × 10
5
sel per sumur. Sel-sel diinkubasi selama 24 jam sebelum perawatan. Untuk mengamati fluoresensi dan pelacakan nanopartikel, nanopartikel dimuat rhodamin B sebagai pewarna fluoresen. Nanopartikel yang mengandung pewarna diekspos ke sel kanker dan diinkubasi selama 3 jam. Sel-sel kemudian dicuci dan dipasang pada slide kaca. Sel-sel kemudian diamati menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM, Nikon, Jepang).
Pengujian Hoechst 33342
Uji apoptosis kualitatif dilakukan menggunakan pewarnaan Hoechst 33342. Secara singkat, sel-sel HL-60 diunggulkan di piring 6-sumur dengan kepadatan penyemaian 3 × 10
5
sel per sumur. Sel-sel diinkubasi selama 24 jam sebelum perawatan. Sel-sel diperlakukan dengan formulasi masing-masing dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kemudian dicuci dua kali dengan PBS dan difiksasi dengan larutan paraformaldehida 4% selama 10 menit. Apoptosis dalam sel kemudian diamati menggunakan mikroskop fluoresen.
Pengujian Apoptosis Berbasis Sitometer Aliran
Apoptosis kuantitatif dievaluasi dengan flow cytometer dengan pewarnaan Annexin V dan PI. Secara singkat, sel-sel HL-60 diunggulkan di piring 6-sumur dengan kepadatan penyemaian 3 × 10
5
sel per sumur. Sel-sel diinkubasi selama 24 jam sebelum perawatan. Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan obat bebas dan formulasi yang mengandung obat pada konsentrasi yang berbeda dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada 37°C dalam inkubator CO2 (5%) yang dilembabkan. Hari berikutnya, sel dicuci dengan benar dan sel diekstraksi dengan hati-hati. Sel-sel disentrifugasi dan pelet diperlakukan dengan 2,5 l Annexin V dan 2,5 l PI, masing-masing dan diinkubasi selama 15 menit. Volume kemudian dibuat hingga 1 ml dan penyortiran sel dilakukan menggunakan flow cytometer (BD FACS, Biosciences, USA).
Pengujian Pembentukan Koloni
1000 sel/sumur disemai di piring 6-sumur dengan volume media disesuaikan 2 ml. Sel dibiarkan membentuk koloni selama 2 hari. Sel-sel diperlakukan dengan formulasi yang berbeda dengan dosis PTX setara dengan 0,1 g/ml dan diinkubasi selama 10 hari. Pelat dicuci dengan PBS dan difiksasi dalam metanol dan diwarnai dengan hematoxylin dan dicuci dan dikeringkan di udara. Kepadatan koloni dihitung menggunakan lemari lampu MultimageTM (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) dengan bantuan perangkat lunak AlphaEaseFCTM.
Analisis Statistik
Signifikansi perbedaan dinilai menggunakan t . Siswa dua sisi tes atau ANOVA satu arah. Perbedaan dianggap signifikan pada tingkat p < 0,05.
Hasil dan Diskusi
Leukemia adalah kanker darah khas yang ditandai dengan banyak duplikasi dan proliferasi sel darah putih. Dalam penelitian ini, kami telah mengembangkan nanopartikel multifungsi yang terdiri dari nanopartikel lipid padat berhias transferrin yang dienkapsulasi dengan paclitaxel. Untuk menggabungkan transferin ke SLN, kami telah mensintesis konjugat asam oleat Tf-PEG dengan konjugasi PEG dan asam oleat yang kemudian dikonjugasikan dengan transferin (Gbr. 1). Asam PEG-oleat-Tf digunakan untuk berbagai tujuan dalam preparasi partikel. Kehadiran ligan Tf pada permukaan partikel akan meningkatkan spesifisitas target partikel terhadap sel kanker yang diekspresikan secara berlebihan. Kehadiran PEG di permukaan luar akan memberikan keseimbangan sterik yang sangat dibutuhkan yang akan memberikan stabilitas pada partikel individu. Kami telah menambahkan catatan ini ke manuskrip.
Presentasi skema dari preparasi nanopartikel lipid padat yang dihias transferrin bermuatan PTX
Karakterisasi Fisikokimia Nanopartikel
Nanopartikel drug-loaded dibuat dengan metode penguapan pelarut diikuti dengan homogenisasi. Ukuran partikel rata-rata dari PTX-loaded lipid nanoparticles (PLN) adalah ~ 140 nm sedangkan ukuran partikel akhir dari PTX-loaded lipid nanoparticle (TPLN) yang didekorasi dengan transferrin adalah ~ 160 nm (Gbr. 2a). Sedikit peningkatan ukuran partikel dikaitkan dengan konjugasi transferin ke permukaan nanopartikel. Telah dilaporkan bahwa karakteristik partikel termasuk ukuran dan muatan merupakan faktor penting untuk kinerja sistemiknya. Ukuran dan muatan memainkan peran penting dalam penyerapan seluler dan efek toksik ke sel. Ukuran partikel kurang dari 200 nm seperti yang diamati dalam penelitian ini dilaporkan paling menguntungkan untuk penargetan kanker karena akan memungkinkan akumulasi spesifik partikel dalam jaringan kanker karena efek peningkatan permeasi dan retensi (EPR) [ 9, 20, 21]. Demikian pula, muatan permukaan nanopartikel menentukan interaksi partikel stabilitas koloid dengan permukaan sel. Muatan permukaan rata-rata TPLN adalah 22,5 ± 1,56 mV yang menunjukkan potensinya untuk penargetan kanker. Morfologi partikel pada gilirannya dipelajari oleh TEM (Gbr. 2b). Partikel-partikel itu berbentuk bulat sempurna dan terdistribusi secara merata di grid TEM. Distribusi partikel yang seragam menunjukkan keberhasilan metodologi preparasi.
a Distribusi ukuran partikel TPLN diukur dengan analisis hamburan cahaya dinamis (DLS). b Pengukuran bentuk partikel dengan mikroskop elektron transmisi (TEM). Eksperimen DLS dilakukan dalam rangkap tiga (n = 3)
Pemuatan Obat dan Pelepasan Obat In Vitro
Efisiensi penjebakan PTX dalam nanopartikel diamati menjadi 92,5 ± 1,35% dengan efisiensi pemuatan aktif 8,6% w /dengan . Karakteristik pelepasan obat secara in vitro PLN dan TPLN dipelajari dengan metode dialisis. PLN dan TPLN menunjukkan pelepasan obat yang berkelanjutan dari sistem pembawa yang menunjukkan kesesuaiannya untuk aplikasi penargetan kanker. Misalnya, ~ 30% obat dilepaskan dari kedua nanopartikel pada akhir periode studi 24 jam (Gbr. 3). Demikian pula, pelepasan obat dipertahankan hingga akhir 75 jam dengan pelepasan rata-rata sekitar ~ 65% diamati. Perlu dicatat bahwa TPLN menunjukkan pelepasan obat yang jauh lebih berkelanjutan dibandingkan dengan PLN. Pelepasan obat yang sedikit lebih rendah terutama disebabkan oleh konjugasi ligan transferin ke permukaan nanopartikel. Berat molekul tinggi transferin mungkin menghambat pelepasan obat untuk sebagian besar. Secara keseluruhan, pelepasan obat yang berkelanjutan dan berkepanjangan dari nanopartikel menunjukkan bahwa obat terdispersi dengan baik dengan matriks lipid yang menghindari pelepasan burst awal atau pola pelepasan bifasik. Secara keseluruhan, pelepasan obat yang terkontrol dari sistem pembawa mungkin mempotensiasi pengobatan kanker.
Karakteristik pelepasan obat in vitro PTX dari PLN dan TPLN dari saline buffer fosfat (pH 7,4). Pelepasan obat dipelajari dengan metode dialisis dan obat diukur dengan metode HPLC. Pengukuran dilakukan n = 3
Serapan Seluler dari Nanopartikel
Potensi penargetan nanopartikel terhadap sel kanker leukemia diuji dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Nanopartikel terkena sel kanker dan diinkubasi selama 3 jam. Rhodamin B digunakan sebagai pewarna fluoresen untuk melacak distribusi nanopartikel dalam sel kanker. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, intensitas fluoresen merah di PLN relatif lebih sedikit dibandingkan di TPLN. Hasil dengan jelas menunjukkan fluoresensi yang jauh lebih tinggi dalam sitoplasma sel dibandingkan dengan PLN yang menunjukkan potensi penargetan TPLN yang unggul terhadap sel kanker. Intensitas fluoresen yang sangat tinggi terutama dikaitkan dengan konjugasi transferin ke permukaan partikel nano. Tf lebih disukai terikat pada reseptor Tf yang diekspresikan secara berlebihan dalam sel kanker dan menghasilkan akumulasi nanopartikel yang lebih tinggi dalam sel kanker [22].
Analisis serapan seluler TPLN dan PLN menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) pada suhu 37 °C. Rhodamin B digunakan sebagai pewarna fluoresen dan diinkubasi selama 3 jam. Analisis serapan seluler dilakukan setelah menginkubasi nanopartikel selama 3 jam di bawah 37°C dalam inkubator. Bilah skala adalah 20 μm
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Efek sitotoksik in vitro dari PTX bebas, PLN, dan TPLN dalam sel HL-60 dievaluasi dengan uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, semua formulasi menunjukkan efek sitotoksik tergantung dosis yang khas pada sel kanker leukemia. Dapat dilihat bahwa meskipun PTX menunjukkan efek tergantung dosis, namun, PLN menunjukkan efek sitotoksik yang relatif lebih tinggi yang mungkin disebabkan oleh serapan intraseluler yang lebih tinggi dan pelepasan obat yang berkelanjutan dari nanopartikel. Untuk lebih spesifik, TPLN menunjukkan efek sitotoksik yang secara signifikan lebih tinggi dalam sel kanker dibandingkan dengan PLN yang menunjukkan efisiensi penargetan yang unggul dari sistem nanopartikel yang didekorasi dengan Tf. Nilai IC50 TPLN adalah 0,45 μg/ml dibandingkan dengan 2,8 μg/ml untuk PLN. Penurunan enam kali lipat dalam nilai IC50 terutama dikaitkan dengan penyerapan TPLN intraseluler yang lebih tinggi dalam sel kanker yang diekspresikan reseptor Tf. Potensi pengiriman TPLN yang lebih tinggi dibandingkan dengan PLN dan pelepasan obat yang berkelanjutan ke target nuklir mungkin menjadi alasan utama untuk efek sitotoksik yang lebih tinggi pada sel kanker. Nanocarrier yang didekorasi dengan Tf telah dieksplorasi sebagai target untuk mengantarkan obat antikanker ke dalam sel kanker, sehingga mengurangi konsentrasi efektif obat yang diberikan dan mengatasi faktor terkait resistensi multiobat (MDR).
Analisis sitotoksisitas obat bebas dan nanopartikel bermuatan obat dengan uji MTT. Setelah merawat sel dengan konsentrasi obat yang berbeda dan diinkubasi selama 24 jam, sel dianalisis dengan uji MTT dan menggunakan pembaca pelat. Pengukuran dilakukan n = 6. *p < 0,05 adalah perbedaan statistik antara TPLN dan PTX
Pengujian Apoptosis Hoechst 33342
Potensi sitotoksik nanopartikel dievaluasi lebih lanjut dengan uji apoptosis Hoechst 33342. Sel-sel setelah pengobatan dengan formulasi masing-masing diwarnai dengan Hoechst 33342 dan diinkubasi selama 15 menit. Seperti yang terlihat dari Gambar. 6, sel kontrol yang tidak diberi perlakuan berbentuk bulat dengan ciri khas untuk sel sehat. Namun, sel-sel yang diobati dengan PTX menunjukkan ketidakteraturan dalam bentuk sel. Kerusakan sel dan apoptosis yang khas dapat dilihat pada kelompok yang diobati dengan PLN yang mungkin disebabkan oleh peningkatan serapan dalam sel kanker. TPLN menginduksi apoptosis sel kanker yang paling luar biasa dan sebagian besar sel terdistorsi dengan kehadiran besar pembentukan tubuh apoptosis. Pembelahan sel yang luar biasa dan induksi apoptosis konsisten dengan paten viabilitas sel seperti yang dijelaskan dalam paragraf sebelumnya.
Uji apoptosis berbasis Hoechst 33342. Sel-sel diwarnai dengan Hoechst 33342 dan apoptosis dianalisis dengan mikroskop floresens. Sel diinkubasi dengan formulasi masing-masing selama 24 jam. Bilah skala adalah 50 μm
Pengujian Apoptosis Berbasis Sitometer Aliran
Analisis kuantitatif uji apoptosis dilakukan dengan flow cytometer setelah pewarnaan dengan kit pewarnaan Annexin V dan PI. Sel-sel diperlakukan dengan formulasi masing-masing dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kemudian diwarnai dengan Annexin V dan PI. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, sel kontrol yang tidak diberi perlakuan dapat hidup dengan lebih dari 99% sel yang ada di ruang yang layak. Perlakuan PTX mengurangi proporsi sel yang layak menjadi 90% dengan sekitar ~ 9% dari apoptosis. PLN menunjukkan sekitar ~ 10% sel apoptosis dengan ~ 7% sel nekrotik. Yang penting, TPLN menunjukkan signifikan (p < 0,05) pengurangan proporsi sel yang layak menjadi ~ 65% dengan sekitar ~ 30% sel apoptosis (apoptosis awal dan akhir). Potensi apoptosis yang luar biasa dari TPLN dikaitkan dengan serapan seluler yang dimediasi reseptor dan akumulasi yang lebih tinggi dari obat antikanker dalam sel kanker yang mungkin meningkatkan efek antikanker pada sel tumor [24, 25].
Uji apoptosis berbasis sitometer aliran. Sel diperlakukan dengan formulasi masing-masing dan setelah 24 jam, sel diwarnai dengan Annexin V dan PI selama 15. Sel kemudian disortir menggunakan flow cytometer. Sel-sel diinkubasi dengan formulasi masing-masing selama 24 jam. Pengukuran dilakukan n = 3. *p < 0,05 adalah perbedaan statistik antara TPLN dan PTX
Uji Pembentukan Koloni
Kemampuan pembentukan koloni dengan adanya formulasi masing-masing diuji dengan uji pembentukan koloni Gambar 8. Seperti yang ditunjukkan, PTX dan PLN memiliki sedikit potensi untuk menghambat kemampuan pembentukan koloni sel kanker. Yang penting, TPLN menunjukkan kemampuan luar biasa untuk mengontrol kemampuan pembentukan koloni sel kanker. TPLN menunjukkan ~ 20% pembentukan koloni dibandingkan dengan ~ 70% pembentukan koloni untuk PTX yang menunjukkan efek antikanker yang unggul dari TPLN. Pemeliharaan leukemia myeloid akut tergantung pada populasi sel punca leukemia dan sel progenitor yang lebih kecil yang memiliki kemampuan untuk membentuk koloni; penting untuk menguji apakah TPLN mampu menargetkan kumpulan sel pembentuk koloni. Seperti yang ditunjukkan oleh hasil, itu dapat secara signifikan mengurangi risiko kanker leukemia, menunjukkan kemampuan untuk mencegah perkembangan kanker dan/atau menghilangkan sel-sel ganas tahap awal. Oleh karena itu, uji pembentukan koloni memberikan informasi penting tentang potensi kemanjuran antikanker dari formulasi.
Uji pembentukan koloni. Sel-sel menjadi sasaran protokol uji pembentukan koloni setelah perawatan masing-masing. Sel-sel diinkubasi dengan formulasi masing-masing selama 24 jam. **p < 0.001 adalah perbedaan statistik antara PTX dan PTLN
Kesimpulan
Secara keseluruhan, nanopartikel lipid bermuatan paclitaxel yang didekorasi dengan transferrin disiapkan dengan tujuan untuk meningkatkan kemanjuran kemoterapi dalam sel leukemia. Hasil dengan jelas menunjukkan potensi penargetan TPLN yang lebih unggul ke sel kanker dibandingkan dengan PLN. Untuk lebih spesifik, TPLN menunjukkan efek sitotoksik yang secara signifikan lebih tinggi dalam sel kanker dibandingkan dengan PLN yang menunjukkan efisiensi penargetan yang unggul dari sistem nanopartikel yang didekorasi dengan Tf. Yang penting, TPLN menunjukkan apoptosis sel kanker yang luar biasa dan menunjukkan kemampuan anti-tumor yang kuat pada kedua sel HL-60. Secara keseluruhan, hasil dengan jelas menunjukkan potensi penargetan sistem nanopartikel lipid terkonjugasi ligan ke sel leukemia yang mungkin membuka jalan bagi pengobatan kanker yang berhasil. Kemanjuran terapeutik formulasi dalam model hewan klinis dan biodistribusinya akan menjadi bagian dari pekerjaan kami selanjutnya.
