Dampak Nanopartikel Emas pada Metabolisme Testosteron pada Mikrosom Hati Manusia
Abstrak
Kompleks korona nanopartikel emas (AuNP)-protein dapat mengubah metabolisme testosteron (TST) yang dimediasi sitokrom P450 (CYP) dengan mengubah sifat fisikokimianya. Kami menyelidiki dampak ukuran NP, kimia permukaan, dan korona protein dalam metabolisme TST dalam kumpulan mikrosom hati manusia (pHLM) yang menggunakan AuNP 40 dan 80 nm yang difungsikan dengan polietilen bercabang (BPEI), asam lipoat (LA), dan polietilen glikol (PEG ) serta korona protein plasma manusia (PC). Variasi individu dalam metabolisme TST yang dimediasi AuNP juga dicirikan di antara HLM donor tunggal yang mengandung tingkat aktivitas CYP yang berbeda. Efek penghambatan 40 nm AuNP dan pada tingkat yang lebih rendah dari 80 nm AuNP terjadi untuk produksi total lima metabolit hidroksilasi TST dalam pHLM tetapi PC menguranginya. Sementara itu, telanjang AuNP meningkatkan produksi androstenedion. Variasi antarindividu dalam metabolisme TST terjadi dalam HLM donor tunggal. Dalam kebanyakan kasus, 40 dan 80 nm telanjang dan PC AuNP pada dasarnya menekan metabolisme TST pada konsentrasi non-penghambatan tetapi PC PEG-AuNP meningkatkan androstenedion. Studi ini berkontribusi pada pemahaman yang lebih baik tentang peran AuNP sebagai pengganggu TST dengan mengubah metabolisme TST dan dapat digunakan untuk menyaring NP lain sebagai pengganggu endokrin potensial.
Pengantar
Nanopartikel emas (AuNP) telah banyak digunakan dalam pengiriman obat, diagnosis medis, dan terapi kanker serta produk konsumen, yaitu kosmetik, kemasan makanan, karena sifat optik dan fisiknya yang unik [1,2,3]. Setelah terpapar campuran protein, NP berasosiasi dengan protein dan membentuk protein korona, yang mengubah kimia permukaan, konformasi protein yang teradsorpsi, dan respons biologis berikutnya, yaitu, toksisitas NP, serapan NP seluler, aktivitas katalitik sitokrom P450 (CYP). ) enzim terhadap obat [4,5,6,7]. Studi in vitro dengan sel epitel primer dan garis sel kanker menunjukkan bahwa AuNP beracun bagi hepatosit manusia, garis sel hepatoma C3A, dan sel sperma [6,7,8]. Tetapi pembentukan korona protein di sekitar NP secara intensif melemahkan atau memperkuat toksisitas AuNP dengan cara yang bergantung pada kimia permukaan [6, 7]. Protein korona mengganggu pengambilan AuNP seluler di hepatosit manusia, sel tubulus proksimal ginjal, sel HepG2, garis sel C3A, terlepas dari ukuran dan muatan permukaannya [6, 7, 9,10,11,12].
Enzim CYP hati terutama terlibat dalam sintesis dan/atau metabolisme senyawa endogen dan eksogen tetapi berbagai agen, yaitu, obat-obatan, pestisida, atau NP, sebaliknya mempengaruhi sintesis hormon steroid, metabolisme, dan/atau detoksifikasi yang menghasilkan efek farmakologis. dan fungsi fisiologis [13,14,15,16,17]. Testosteron (TST) adalah androgen penting dan substrat spesifik CYP3A4 (konversi utama menjadi 6β-OH TST) dengan cara selektif regio dan stereo [18]. Selama metabolisme fase I, TST juga dihidroksilasi menjadi 2β-OH TST oleh CYP3A4 dan dealkilasi menjadi androstenedion (AD) oleh CYP2D6 [17, 19]. Studi in vitro dengan hepatosit manusia, garis sel C3A, mikrosom hati manusia (HLM), dan enzim CYP rekombinan menunjukkan bahwa AuNP telanjang dan protein berlapis korona memodulasi berbagai enzim CYP yang mencakup CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, dan 3A4 [6, 7, 20, 21]. NP logam lainnya, AgNP telanjang juga menekan produksi 6β-OH TST yang dimediasi CYP3A4 di HLM [22]. AuNP yang difungsikan dengan branched polyethylenimine (BPEI) dan lipoic acid (LA) menurunkan aktivitas CYP3A4 di lini sel C3A tetapi human plasma protein corona (PC) melemahkannya [7]. Sebaliknya, telanjang (tanpa PC) dan PC BPEI-AuNP menghambat CYP2C9 dan 3A4 pada hepatosit manusia, terlepas dari ukuran NP [6].
Studi in vivo melaporkan bahwa ukuran kecil AuNP (4 dan 13 nm) terakumulasi terutama di hati dan limpa pada tikus BALB/c jantan dan menginduksi ekspresi gen Cyp1a1 dan 2b hati [23]. NP logam lainnya, NP seng oksida menghambat aktivitas CYP1A2, 2C11, dan 3A2 hati pada tikus jantan Sprague Dawley dengan peningkatan perubahan patologis di hati [24].
Sampai saat ini, sedikit yang diketahui bagaimana AuNP mengaitkan metabolisme TST yang dimediasi CYP (hidroksilasi dan dealkilasi TST) dengan tidak adanya dan/atau adanya korona protein yang relevan secara biologis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki dampak PC pada sifat fisikokimia dari 40 dan 80 nm BPEI AuNP kationik, LA AuNP anionik, dan netral polietilen glikol (PEG) AuNP. Dampak AuNP pada metabolisme TST yang dimediasi CYP dengan dan tanpa PC akan dikarakterisasi menggunakan pHLM. Variasi individu dalam metabolisme TST juga akan dipelajari dalam HLM donor tunggal yang mengandung berbagai tingkat enzim CYP.
Metode/Eksperimental
Bahan kimia
2,3,4-
13
C3 testosteron (CAS#327048-83-9) dan 6β-hidroksitestosteron (6β-OH TST, CAS#62-99-7) diperoleh dari MilliporeSigma (St. Louis, MO). Testosteron (TST, CAS# 58-22-0), 2α-hidroksitestosteron (2α-OH TST, CAS#004075-14-3), 2β-hidroksitestosteron (2β-OH TST, CAS#10390-14-4), 6α -hidroksitestosteron (6α-OH TST, CAS#2944-87-8), 11β-hidroksitestosteron (11β-OH TST, CAS#1816-85-9), 15β-hidroksitestosteron (15β-OH TST, CAS#39605-73- 7), 16α-hidroksitestosteron (16α-OH TST CAS#63-01-4), 16β-hidroksitestosteron (16β-OH TST, CAS#17528-90-4), 11-ketotestosteron (CAS#564-35-2) , androstenedion (AD, CAS#63-05-8), 4-hidroksi androstenedion (CAS#566-48-3), dan 11β-hidroksi androstenedion (CAS#382-44-5) dibeli dari Steraloid (Newport, RI ). LC-MS grade-acetonitrile dan -formic acid diperoleh dari Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ), sedangkan air ultra murni diproduksi sendiri oleh sistem Synergy® UV-R dari Merck KGaA (Darmstadt, Jerman). Jika tidak ditentukan, semua reagen lainnya dibeli dari MilliporeSigma (St. Louis, MO).
Mikrosom Hati Manusia
Mikrosom hati manusia yang dikumpulkan (pHLM) (200 donor, 100 pria, dan 100 wanita) dan satu mikrosom hati donor diperoleh dari Corning Inc. (Charlotte, NC). PHLM dikumpulkan oleh pemasok tetapi bukan kumpulan HLM donor tunggal. Karakteristik dan aktivitas enzim sitokrom P450 (CYP) terpilih dari HLM donor tunggal yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dalam File tambahan 1:Tabel S1.
Sintesis Nanopartikel Emas
Biopure™ 40 dan 80 nm sferis AuNP yang difungsikan dengan polietilen bercabang kationik (BPEI), asam lipoat anionik (LA), dan polietilena glikol netral (PEG) dibeli dari nanoComposix (San Diego, CA). Bahan inti disintesis melalui reduksi hidrogen tetrakloroaurat (III) hidrat (HAuCl4 3H2 O) dalam larutan encer kalium karbonat dan mengalami proses aging dan tangential flow filtrasi (TFF). Permukaan AuNP difungsikan dengan LA atau PEG dengan menambahkan asam dihydrolipoic (0.2:1, w /dengan ) atau PEG yang diakhiri dengan tiol-metoksi (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /dengan ), masing-masing, dengan pencucian TFF dan filtrasi steril. Permukaan yang difungsikan BPEI disintesis melalui kimia EDC/NHS dengan menghubungkan asam karboksilat LA dengan amina BPEI. BPEI yang tidak terikat dihilangkan dengan pencucian TFF dan sentrifugasi berikutnya.
Persiapan Korona Protein Plasma Manusia
Plasma manusia yang terkumpul (HP, n =5) diperoleh dari Biological Specialty Corp. (Colmar, PA). AuNP 40 dan 80 nm diinkubasi dengan plasma manusia pada volume plasma fisiologis dalam volume darah total, 55% (v /v ) dalam inkubator goyang/rotasi orbital pada 37 °C pada 250 rpm selama 1 jam. Pada akhir inkubasi, human plasma protein corona (PC) di sekitar NP dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 20.000×g pada 20 °C selama 20 menit diikuti dengan tiga kali pencucian phosphate-buffered saline (PBS). Protein yang tidak terikat dan terikat longgar dibuang dengan sentrifugasi. PC AuNP yang dihasilkan didispersikan dalam PBS dan digunakan untuk karakterisasi sifat fisikokimia dan interaksinya dengan TST.
Karakterisasi Fisik AuNP
Ukuran partikel dan sifat permukaan diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) dan mikroskop elektron transmisi (TEM). Diameter hidrodinamik (DH ), dan zeta-potensial 40 dan 80 nm telanjang (tanpa PC) BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP dalam air deionisasi (DI) dan PC AuNP di PBS diukur dengan Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) pada 0 jam pada 25 °C. DH , indeks polidispersitas (PDI), dan zeta-potensial juga diperoleh untuk telanjang dan PC AuNP dalam buffer inkubasi mikrosomal (pH 7,4) pada 0 menit dan 45 menit pada 37°C. Sampel diukur lima kali dengan 11 sub-run masing-masing 10 detik. TEM mengkarakterisasi morfologi telanjang dan PC AuNP. Semua AuNP ditempatkan pada kisi tembaga berlapis formvar dan dilihat pada Tecnai G2 Spirit BioTWIN dengan detektor Oxford (FEI Company, Hillsboro, OR) pada tegangan akselerasi 120 kV. Rangkaian mikroskop GATAN (GATAN Inc., Pleasanton, CA) mengukur diameter AuNP. Spektrum serapan optik diukur dengan pembaca microplate multi-mode Spectra Max i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Metabolisme Testosteron In Vitro dengan Tidak Ada dan Adanya AuNP Telanjang dan PC
Studi pendahuluan dilakukan untuk menentukan waktu inkubasi dan konsentrasi protein mikrosomal untuk memberikan laju metabolisme linier untuk TST (konsentrasi akhir 10 M). Produksi metabolit TST linier dari 1,3 hingga 9,3 mg protein mikrosomal mL
−1
hingga 60 mnt. Tes metabolisme dilakukan seperti yang dijelaskan sepenuhnya [25]. Secara singkat, pHLM dalam buffer inkubasi mikrosomal diperlakukan dengan 10 μM TST dan selanjutnya, 40 dan 80 nm telanjang (tanpa PC) AuNP ditambahkan pada 0, 7, 32, 63, 143, 250, 400, dan 571 μg mL
−1
; untuk PC AuNP pHLM 0, 7, 32, 63, dan 143 μg mL
−1
. Buffer inkubasi mikrosomal mengandung 100 mM buffer fosfat, 3,3 mM MgCl2 , dan 1 mM EDTA (pH 7,4). Reaksi metabolisme dimulai dengan dan tanpa sistem regenerasi NADPH yang mengandung 0,25 mM NADP, 2,5 mM glukosa-6-fosfat, dan 2 U mL
−1
glukosa-6-fosfat dehidrogenase. Setelah inkubasi selama 45 menit pada suhu 37°C, reaksi dihentikan dengan menambahkan 4% (v /v ) larutan asam fosfat (1:1, v /v ). Setelah sentrifugasi pada 3500 rpm selama 20 menit, sampel supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 20 °C hingga digunakan lebih lanjut. Selain itu, HLM donor tunggal dalam buffer inkubasi mikrosomal diperlakukan dengan 10 μM TST diikuti dengan inkubasi dengan 63 μg mL
−1
dari semua telanjang dan PC AuNP selama 45 menit pada 37 °C. Pada akhir inkubasi, sampel diproses dan disimpan pada suhu 20 °C seperti di atas.
Standar dan Persiapan Sampel
Larutan stok standar primer TST, metabolitnya, dan
13
C3 -berlabel TST sebagai standar internal (ISTD) disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 1 mM dan disimpan pada 20 °C hingga digunakan lebih lanjut. Konsentrasi larutan standar kerja TST dan metabolitnya adalah 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100, dan 200 M dengan pengenceran serial larutan stok primer. Untuk kalibrator standar, 50 L alikuot dari setiap larutan standar kerja ditambahkan ke 450 L buffer reaksi, menghasilkan pengenceran 1:10, sedangkan 0,1 μM larutan ISTD juga dibuat menggunakan larutan air asam fosfat 4%. Sampel kontrol kualitas (QC) disiapkan pada konsentrasi 0,01, 0,05, dan 0,1 μM.
Setelah dicairkan, sampel menjalani sentrifugasi pada 3500 rpm selama 20 menit pada suhu kamar. Supernatan dibubuhi 50 L 0,1 μM ISTD dan menjalani pelat elusi 96-sumur Oasis PRIME HLB dan pelat pengumpul dalam prosesor Waters positive pressure-96 pada 80 psi selama 1-2 menit. (Waters Corp., Milford, MA). Setelah dicuci dengan 300 L air dengan metanol 5% dan elusi dengan 50 L campuran asetonitril/metanol (90/10, v /v ), eluen yang dihasilkan diencerkan dalam 50 L air (volume akhir 100 L) dan tunduk pada spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS/MS).
Kromatografi Cair-Spektrometri Massa
Semua sampel dipisahkan pada kolom Waters UPLC HSS T3 (2,1 × 50 mm, 1,8 μm) dengan sistem Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography dengan Triple Quadrupole Detector (UPLC TQD) (Waters Corp., Milford, MA). Fase gerak A dan B berturut-turut adalah 0,1% asam format dalam air dan 0,1% asam format dalam metanol. Metode LC gradien digunakan pada laju aliran 600 μL min
−1
selama 0–8,4 mnt. Gradiennya adalah 0–1 menit (30% B), 1-3 menit (hingga 50% B), 3–3,5 menit (50% B), 3,5–7 menit (hingga 80% B), 7–7,01 menit ( hingga 98% B), 7,01–7,5 mnt (98% B), dan 7,51–8,4 mnt (30% B). Kondisi MS dijelaskan secara singkat di bawah ini. Sumber ionisasi dioperasikan dalam elektrospray positif (ESI
+
) mode dengan tegangan kapiler 4000 V; untuk suhu sumber 150 °C; dan untuk suhu desolvasi 450 °C. Laju aliran gas desolvasi (N2 ), gas kerucut (N2 ), dan gas tumbukan (argon) adalah 900 L j
−1
, 100 L j
−1
, dan 0,1 mL mnt
−1
, masing-masing. Jenis pemindaiannya adalah pemantauan reaksi ganda (MRM) dan waktu pengoperasian MS adalah 8,4 mnt. Transisi MRM yang digunakan untuk analisis diringkas dalam File tambahan 1:Tabel S2 dan Gambar 2. Volume injeksi adalah 2 μL dan kolom dipertahankan pada 50 °C selama analisis. Semua metode kuantisasi didasarkan pada kurva kalibrasi tujuh titik pada rentang konsentrasi dari 0,001 hingga 20 μM. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) 0,001 μM dan 0,005 μM ditetapkan untuk TST dan metabolit yang ditargetkan.
Analisis Statistik
Efek dispersan pada DH dan PDI telanjang dan PC pada AuNP dinilai menggunakan t . Siswa uji dengan distribusi dua arah. Konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50 ) dan konsentrasi aktivasi setengah maksimal (EC50 ) dari AuNP terhadap produksi metabolit TST yang bergantung pada CYP di pHLM ditentukan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati menggunakan GraphPad Prism®. Analisis varians satu arah (ANOVA) dilakukan menggunakan GraphPad Prism® untuk menilai efek pengobatan AuNP pada metabolisme TST pada HLM donor tunggal. Ketika efeknya signifikan, perbandingan ganda dilakukan dengan uji beda nyata (HSD) Tukey pada tingkat signifikansi 5%. Koefisien korelasi Pearson (r ) antara aktivitas CYP dari HLM donor tunggal dan produksi metabolit TST yang bergantung pada CYP ditentukan menggunakan GraphPad Prism® versi 6.07 (La Jolla, CA).
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Fisikokimia Protein Plasma Telanjang dan Manusia Corona AuNP
Dampak korona protein plasma manusia (PC) dalam ukuran NP, muatan permukaan, dan morfologi serta sifat spektral telah dikarakterisasi menggunakan spektroskopi DLS, TEM, dan UV-Vis (Gbr. 1). Gambar TEM menunjukkan bahwa semua telanjang (tanpa PC) dan PC AuNP kecuali untuk PC BPEI-AuNP 40 dan 80 nm adalah monodispersi dengan distribusi ukuran yang stabil dan rentang spektrum UV-Vis yang unik (520–557 nm) (Gbr. 1a, b) . PC yang berbeda di sekitar AuNP di PBS juga ditemukan oleh TEM. Agregasi 40 dan 80 nm PC coated branched polyethylenimine (BPEI)-AuNP dalam PBS pada 0 menit pada 25 °C berkorelasi beberapa puncak dalam distribusi ukuran dan pergeseran merah spektrum penyerapan relatif terhadap BPEI-AuNP telanjang (Gbr. 1b). Diameter hidrodinamik (DH ) nilai 40 dan 80 nm PC BPEI-AuNP yang dilarutkan dalam PBS pada 0 menit pada 25 °C dan dalam buffer inkubasi mikrosomal pada 0 dan 45 menit pada 37°C tidak ditentukan oleh DLS, bersama dengan beberapa puncak dalam distribusi ukuran. DH nilai BPEI- dan LA-AuNP telanjang 40 nm dan PC PEG-AuNP dan BPEI-AuNP telanjang 80 nm dalam buffer inkubasi mikrosomal meningkat secara substansial hingga 45 menit pada 37 °C, sedangkan nilainya menurun untuk LA PC 80 nm -AuNP (Tabel 1). Indeks polidispersitas (PDI) dari 40 nm telanjang dan PC PEG-AuNP dan 80 nm PC PEG-AuNP meningkat pada 45 menit pada 37 °C. Selain itu, nilai potensial zeta (z) dari BPEI-AuNP telanjang 40 dan 80 nm dan PEG-AuNP telanjang 40 nm menurun secara substansial dari waktu ke waktu. Studi sebelumnya melaporkan bahwa AuNP (7 dan 70 nm) yang terkait dengan protein mikrosomal hati manusia mengubah karakteristik absorbansi maksimum dalam kisaran UV-visible [21]. Hasil ini didukung oleh penelitian terbaru di laboratorium kami bahwa PC dan serum albumin korona manusia mengubah ukuran NP, pergeseran merah dari absorbansi maksimum, dan morfologi terlepas dari media pelarutan dan waktu inkubasi [6, 7, 10, 26]. Berdasarkan perubahan sifat fisikokimia NP yang dimediasi PC dan fungsi enzimatik aktivitas CYP [6, 7], efek potensial dari AuNP 40 dan 80 nm pada metabolisme TST mikrosomal hati manusia yang dimediasi CYP diselidiki dengan adanya PC yang relevan.
Mikrograf elektron transmisi (a ) AuNP telanjang 40 dan 80 nm dalam air deionisasi dan b PC AuNP 40 dan 80 nm di PBS pada 0 jam pada 25 °C, spektrum penyerapan UV (inset atas), dan distribusi hamburan cahaya dinamis (inset bawah). Panah menunjukkan pembentukan PC. BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol, ND tidak ditentukan, PC korona protein plasma manusia, telanjang tanpa PC
Metabolisme Testosteron yang Dimediasi AuNP dalam Kumpulan Mikrosom Hati Manusia
Sebanyak 11 metabolit TST disaring dan enam metabolit ditemukan dalam kumpulan mikrosom hati manusia (pHLM) pada 10 M TST. Analisis LC-MS/MS yang ditargetkan dari TST dan enam metabolit yang dipilih ditunjukkan pada Gambar 2. Daftar metabolit yang dipilih termasuk lima metabolit TST terhidroksilasi (2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 16α -OH TST, 16β-OH TST) dan metabolit dealkilasi (androstenedion, AD). Ini berkorelasi dengan penelitian sebelumnya yang menggunakan hepatosit manusia dan HLM bahwa TST terutama dihidroksilasi menjadi 6β-OH TST dan pada tingkat yang lebih rendah 2β-OH TST, 15β-OH TST, 16α-OH TST, dan 16β-OH TST serta a metabolit dealkilasi, AD [17, 19, 27].
Kromatogram ion (XIC) yang diekstraksi untuk testosteron (TST),
13
TST berlabel C3, androstenedion, 2β-hidroksi testosteron (2β-OH TST), 16α-hidroksitestosteron (16α-OH TST), 16β-hidroksitestosteron (16β-OH TST), 6β-hidroksitestosteron (6β-OH TST), dan 15β -hidroksitestosteron (15β-OH TST) diproduksi dalam kumpulan HLM pada konsentrasi akhir 10 μM testosteron dengan adanya NADPH selama 45 menit pada 37 °C. HLM mikrosom hati manusia, NADPH nikotinamida adenin dinukleotida fosfat tereduksi
Hasil coincubation TST dengan AuNP telanjang 40 dan 80 nm di pHLM ditunjukkan pada Gambar. 3 dan 4. Semua 40 dan 80 nm telanjang AuNP mengubah produksi 2β-OH TST, 6β-OH TST, dan 15β-OH TST di pHLM dengan berbagai tingkat penghambatan (Gbr. 3a–f). Konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50 ) nilai 40 nm BPEI-AuNP untuk produksi 6β-OH TST adalah 416 μg mL
−1
; untuk 80 nm BPEI-AuNP 438 μg mL
−1
; dan untuk 80 nm PEG-AuNP 387 μg mL
−1
(Gbr. 3c, d). Untuk produksi TST 15β-OH, IC50 nilai 40 nm BPEI-AuNP adalah 1113 μg mL
−1
; untuk 80 nm BPEI-AuNP 415 μg mL
−1
; dan untuk 80 nm PEG-AuNP 480 μg mL
−1
(Gbr. 3e, f). Hasil ini didukung oleh penelitian in vitro dengan garis sel kanker manusia dan jaringan hati bahwa NP logam, AgNP, dan NP silikon berpori menghambat produksi 6β-OH TST dalam sel adenokarsinoma kolorektal epitel manusia Caco2, sel HepG2 karsinoma hepatoseluler, dan mikrosom hati manusia [22, 28]. AuNP telanjang 40 dan 80 nm tidak menghambat produksi 16α-OH TST dan 16β-OH TST kecuali untuk BPEI-AuNP 40 nm yang menekan produksi 16β-OH TST pada konsentrasi tertinggi (517 μg mL
− 1
) (Gbr. 4a–d). BPEI-AuNP 40 dan 80 nm meningkatkan produksi androstenedion (AD) pada konsentrasi tertinggi dengan tingkat metabolisme yang sesuai sebesar 4,3 dan 2,1 pmol mg protein
−1
min
−1
, masing-masing dibandingkan dengan kontrol (0,7 pmol mg protein
−1
min
−1
) (Gbr. 4e, f). Tapi 80 nm LA-AuNP menghambat produksi AD dengan IC50 nilai 233 μg mL
−1
. Hasil ini menunjukkan bahwa AuNP telanjang memediasi produksi metabolit TST yang dipilih dalam pelapisan permukaan, dan perilaku yang bergantung pada ukuran. Selain itu, semua 40 dan 80 nm PC AuNP tidak menghambat produksi enam metabolit terpilih dari TST di pHLM hingga 143 μg mL
−1
, terlepas dari pelapis permukaan (Gbr. 5 dan 6). Khususnya, PC mengurangi penghambatan 40 nm telanjang BPEI-AuNP yang dimediasi dari produksi 6β-OH TST dan 15β-OH TST pada konsentrasi yang lebih tinggi (32 μg mL
−1
hingga 143 μg mL
−1
) (Gbr. 3c, e dan 5c, e). Hasil ini menunjukkan bahwa BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP telanjang 40 dan 80 nm menurunkan hidroksilasi TST (2β-OH TST, 6β-OH TST, dan 15β-OH TST) dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 7 ). Selain itu, BPEI-AuNP telanjang 40 dan 80 nm meningkatkan produksi AD tetapi yang pertama menurunkan TST 16β-OH. Studi in vitro melaporkan bahwa produksi 6β-OH TST terutama dimediasi oleh CYP3A4 dihambat oleh nanotube karbon berdinding tunggal (SWCNT) dengan cara yang bergantung pada dosis tetapi serum albumin korona sapi meringankannya [17, 29]. Laboratorium kami baru-baru ini melaporkan bahwa 40 dan 80 nm telanjang dan PC BPEI-AuNP berfungsi sebagai inhibitor untuk CYP1A2, 2C9, dan 3A4 pada tingkat seluler dan transkripsi [6, 7]. Studi in vivo melaporkan bahwa PEG-AuNP (4 dan 13 nm) terutama terakumulasi terutama di hati pada tikus BALB/c jantan dan mengubah tingkat transkripsi gen Cyp1a1 dan 2b hati [23]. Tikus ICR jantan dengan i.v. injeksi PEG-NH2 -AuNP menunjukkan NP meningkatkan kadar TST plasma tanpa morfologi dan fertilitas sperma [30]. NP logam lainnya, titanium dioksida (TiO2 ) terakumulasi dalam testis mencit jantan CD1 dan menurunkan ekspresi cyp1b1 dan 2e1 [31]. Studi epidemiologi melaporkan bahwa pria dewasa di klinik infertilitas Massachusetts menunjukkan kadar TST plasma rendah yang digabungkan dengan kadar tinggi 3,5,6-trikloro-2-piridinol (TCP) yang berasal dari paparan tinggi klorpirifos (CFS), pengganggu endokrin yang diketahui dan inhibitor untuk metabolisme TST yang dimediasi CYP [32]. Studi sebelumnya melaporkan bahwa insektisida pengganggu endokrin yang diketahui, CFS, CFS oxon, fonofos, phorate, diethyltoluamide (DEET), dan permethrin secara substansial menghambat dan/atau mengaktifkan produksi metabolit TST terhidroksilasi dan/atau dealkilasi, yaitu, 2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, dan AD dan 4-hidroksi AD di hati manusia [17]. Dengan demikian, masuk akal untuk mendalilkan bahwa AuNP mungkin merupakan pengganggu endokrin potensial dengan memediasi potensi penghambatan dan/atau pengaktifan terhadap metabolisme TST yang dimediasi CYP.
Efek penghambatan AuNP telanjang (tanpa PC) pada produksi 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) dan TST 15β-OH (e , f ) dalam pHLM. Data mewakili mean ± S.D. (n =3). IC50 , konsentrasi penghambatan setengah maksimal; pHLM , kumpulan mikrosom hati manusia; ND , tidak ditentukan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati menggunakan GraphPad Prism®; PC , protein plasma manusia; BPEI , polietilenimina bercabang; LA , asam lipoat; PEG, polietilen glikol; Konsentrasi, konsentrasi; 2β-OH TST, 2β -hidroksitestosteron; 6β-OH TST, 6β -hidroksitestosteron; 15β-OH TST, 15β -hidroksitestosteron
Efek penghambatan dan stimulasi dari AuNP telanjang (tanpa PC) pada produksi 16β-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) dan AD (e , f ) dalam pHLM. Data mewakili mean ± S.D. (n =3). IC50 , konsentrasi penghambatan setengah maksimal; EC50 , konsentrasi aktivasi setengah maksimal; pHLM , kumpulan mikrosom hati manusia; ND , tidak ditentukan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati menggunakan GraphPad Prism®; PC , protein plasma manusia; BPEI , polietilenimina bercabang; LA , asam lipoat; PEG , polietilen glikol; Konsentrasi, konsentrasi; 16α-OH TST, 16α -hidroksitestosteron; 16β-OH TST, 16β -hidroksitestosteron; IKLAN , androstenedion.
Pengaruh PC AuNP pada produksi 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) dan TST 15β-OH (e , f ) dalam pHLM. Data mewakili mean ± S.D. (n =3). IC50 , konsentrasi penghambatan setengah maksimal; pHLM , kumpulan mikrosom hati manusia; ND , tidak ditentukan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati menggunakan GraphPad Prism®; PC , korona protein plasma manusia; BPEI , polietilenimina bercabang; LA , asam lipoat; PEG , polietilen glikol; Konsentrasi, konsentrasi; 2β-OH TST, 2β -hidroksitestosteron; 6β-OH TST, 6β -hidroksitestosteron; 15β-OH TST, 15β-hidroksitestosteron.
Pengaruh PC AuNP pada produksi 16α-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) dan AD (e , f ) dalam pHLM. Data mewakili mean ± S.D. (n =3). IC50 , konsentrasi penghambatan setengah maksimal; pHLM , kumpulan mikrosom hati manusia; ND , tidak ditentukan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati menggunakan GraphPad Prism®; PC , korona protein plasma manusia; BPEI , polietilenimina bercabang; LA , asam lipoat; PEG , polietilen glikol; Konsentrasi, konsentrasi; 16α-OH TST, 16α -hidroksitestosteron; 16β-OH TST, 16β -hidroksitestosteron; IKLAN , androstenedion.
Skema metabolisme testosteron yang diusulkan dalam kumpulan mikrosom hati manusia dan produksi metabolitnya yang dimediasi AuNP. AuNP nanopartikel emas, BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol, PC korona protein plasma manusia. Panah merah, efek penghambatan; panah biru, efek stimulasi
Metabolisme TST pada Mikrosom Hati Manusia Donor Tunggal dan Modulasinya oleh AuNP
Produksi enam metabolit terpilih dicirikan dengan HLM donor tunggal yang diisolasi dari donor dengan berbagai tingkat aktivitas CYP pada konsentrasi non-inhibitor berbasis pHLM dari 40 dan 80 nm telanjang dan PC AuNP (10 μg mL
−1
). Variasi individu dalam metabolisme TST diamati di antara tiga HLM donor tunggal yang berbeda (File tambahan 1:Gambar S1). Hubungan antara aktivitas katalitik masing-masing enzim CYP dan produksi metabolit turunan TST dicirikan dalam tiga HLM donor tunggal yang berbeda yang mengandung aktivitas katalitik CYP rendah, sedang, dan tinggi (File tambahan 1:Tabel S1). Produksi 6β-OH TST berkorelasi positif dengan aktivitas CYP2C19 (r =0,99 dan p =0,01) dan CYP3A4 (r =0,99 dan p =0,03) dalam individu (File tambahan 1:Gambar S2). Produksi AD berkorelasi negatif dengan CYP4A11 (r =0,98 dan p =0,04) (File tambahan 1:Gambar S3). Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa CYP3A4 dan CYP2D6 memainkan peran kunci dalam produksi metabolit TST utama, masing-masing 6β-OH TST dan AD [17]. Studi ini juga menyarankan bahwa variasi individu dalam metabolisme TST yang bergantung pada CYP tergantung pada genotipe enzim CYP dan aktivitas fenotipiknya. Sebuah studi sebelumnya melaporkan bahwa polimorfisme dan fenotipe CYP adalah fitur utama dalam fungsi CYP dan menghasilkan fenotipe farmakogenetik kategoris sebagai metabolisme yang buruk, menengah, ekstensif, dan ultrarapid yang berkontribusi pada kerentanan individu terhadap reaksi obat yang merugikan dan/atau kemanjuran obat dan dosis yang disarankan. bahwa pemetabolisme enzim CYP yang buruk, yaitu CYP3A4 mungkin rentan terhadap metabolisme TST dari paparan inhibitor CYP, AuNP [33].
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8 dan 9, coincubation TST dengan AuNP pada konsentrasi non-inhibitor menyebabkan peningkatan dan/atau penurunan metabolisme TST yang dimediasi CYP di antara HLM donor tunggal sebagai fungsi modifikasi ukuran dan perubahan permukaan. ANOVA menunjukkan bahwa perubahan signifikan berdasarkan ukuran AuNP (p <0,0001), pelapis permukaan (p <0,0001), dan formasi PC (p <0,0001) diamati untuk produksi enam metabolit TST terpilih dalam HLM donor tunggal (HDA1, HDB2, dan HDC3).
Effects of 40 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione
Effects of 80 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione
All 40 nm naked and PC AuNP decreased both 2β-OH TST and 6β-OH TST production in HDA1 and HDC3 except for PC PEG-AuNP in the former and naked LC-AuNP in the latter, whereas in HDB2, only PC AuNP potentiated inhibition of their productions, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–B3)). The 40 nm naked LA-AuNP was an inhibitor for 15β-OH TST production in HDA1; for HDB2 PC PEG-AuNP; and for HDC3 naked BPEI- and PEG-AuNP and PC LA- and PC PEG-AuNP (Fig. 8(C1–C3)). All 40 nm naked AuNP were an activator for 16α-OH TST production in HDA1 but PC attenuated it except for PC BPEI-AuNP which potentiated its inhibition (Fig. 8(D1)). All 40 nm naked and PC AuNP did not influence the production of 16β-OH production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). AD production was modulated by the 40 nm naked and PC AuNP with varying degrees of inhibition except for PC PEG-AuNP which served an activator in HDC3 (Fig. 8(F1–F3)).
The 80 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST production was observed within individuals except for 80 nm naked and PC PEG-AuNP which served as the activators in HDB2 and HDC3, respectively (Fig. 9(A1–A3)). These results were not consistent with all naked and PC 40 nm AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–A3)). For 6β-OH TST, the 80 nm naked AuNP were the activators except for LA-AuNP but PC potentiated its inhibition in HDB2 (Fig. 9(B2)), which was similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition and/or activation, respectively (Fig. 8(B2)). For 15β-OH TST, 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP and PC PEG-AuNP were the activators in HDB2 and in HDC3, respectively (Fig. 9(C2 and C3)). The 80 nm naked AuNP increased 16α-OH TST production in HDA1, irrespective of surface coatings but PC attenuated it except for PC LA-AuNP which was an inhibitor (Fig. 9(D1)). This is similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated activation and attenuation for 16α-OH TST production in HDA1 (Fig. 8(D1)). All 80 nm naked and PC were not inhibitory to 16β-OH TST production within all individuals, irrespective of surface coatings (Fig. 9(E1–E3)). These results were consistent with the 40 nm naked and PC-mediated its production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). For AD production, the 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP were the inhibitors but PC attenuated and vice versa with naked and PC LA-AuNP in HDA1 (Fig. 9(F1)). The 80 nm naked and PC AuNP decreased its production in HDC3 except for PC PEG-AuNP, which was an activator (Fig. 9(F3)). This study strongly suggests that AuNP interaction with CYP enzymes in HLM cause a decrease and/or increase in TST conversion to hydroxylated and dealkylated metabolites within individuals and the presence of PC played the inhibitive or protective role. In vivo study reported that the male CD-1 mice orally administrated with ketoconazole, a noncompetitive CYP3A4 inhibitor showed that a decrease in serum TST level, gonadal TST secretion, and hepatic TST hydroxylation activity that included 6β-OH TST, 15α-OH TST, 15β-OH TST, and 16β-OH TST [34]. In vitro studies with human hepatocyte, C3A cell line, HepG2 cell line, HLM, and recombinant CYP enzymes suggested that AuNP modulated the activity of various CYP enzymes that included CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 3A4 [6, 7, 20, 21]. PC and human serum albumin corona mitigated an inhibitory effect of BPEI- and LA-AuNP on CYP1A2, 2C9, and 3A4 enzyme activity in human hepatocytes and C3A cell line [6, 7]. That being said, it may be rational to propose that AuNP interference with CYP enzymes relates individual susceptibility to unexpected toxicological effects that may result in an altered circulating TST level tied to endocrine disrupting substance and/or drug-drug interaction sharing the same CYP enzymes [35].
Kesimpulan
These studies exhibit that AuNP interaction with PC definitely modulate CYP-dependent metabolism of TST in HLM derived from a large donor pool that better represents the average American population. The 40 nm naked (no PC) AuNP and to a lesser degree 80 nm naked AuNP inhibited TST hydroxylation but activated TST dealkylation at high concentration. Cationic BPEI-AuNP withheld the production of 6β-OH TST and 15β-OH TST in pooled HLM but the presence of a more biologically relevant PC alleviated their adverse effects as function of size and surface charge modification. In most cases, the 40 and 80 nm naked and PC AuNP are essentially inhibitory to TST metabolism in single donor HLM in a surface chemistry-dependent manner at the noninhibitory concentration. In addition, PC PEG-AuNP caused an activation of AD production in HDC3, irrespective of size. These results may indicate that individual variations in AuNP-mediated TST metabolism could be a factor for their toxicity and could be utilized to identify vulnerable subgroup to TST-disrupting NP.
Ketersediaan Data dan Materi
All data generated or analyzed during this study are included in this article and its supplementary information file.
