Toksisitas Nanopartikel Emas pada Tikus karena Interaksi Nanopartikel/Obat Menginduksi Kerusakan Ginjal Akut
Abstrak
Nanomaterials adalah bahan inovatif dengan banyak sifat yang berguna, tetapi ada kekhawatiran mengenai banyak efek yang tidak diketahui pada organisme hidup. Nanopartikel emas banyak digunakan sebagai bahan industri karena sifatnya yang sangat baik. Potensi bahaya biologis nanopartikel emas tidak diketahui, dan dengan demikian, di sini kami memeriksa efek in vivo dari nanopartikel emas berdiameter 10, 50, dan 100 nm (masing-masing GnP10, GnP50, dan GnP100) dan interaksinya dengan obat-obatan pada tikus untuk memperjelas keamanan mereka pada mamalia. Cisplatin, paraquat, dan asam 5-aminosalisilat menyebabkan efek samping kerusakan hati dan ginjal pada tikus. Tidak ada hepatotoksisitas atau nefrotoksisitas yang diamati ketika salah satu nanopartikel emas saja diberikan melalui vena ekor. Sebaliknya, pemberian bersama GnP-10 dengan asam cisplatin, paraquat, atau 5-aminosalisilat menyebabkan kerusakan efek samping pada ginjal. Hal ini menunjukkan bahwa nanopartikel emas dengan ukuran partikel 10 nm berpotensi nefrotoksik karena interaksinya dengan obat.
Pengantar
Nanoteknologi memainkan peran yang semakin penting di abad kedua puluh satu, dengan bahan nano yang mendasari kemajuan dalam teknologi nano. Perkembangan terbaru dalam pembuatan nanopartikel telah membantu penggunaan nanomaterial inovatif di seluruh dunia [1, 2]. Nanomaterial memiliki diameter 100 nm atau kurang, dan contohnya termasuk nanopartikel emas, perak, silika, platinum, dan titanium dioksida, serta fullerene dan nanotube karbon [3, 4]. Bahan-bahan ini mungkin menemukan aplikasi dalam teknologi penyimpanan elektronik, gen/obat regeneratif, dan perangkat elektronik, dan merupakan dasar dari industri baru di abad kedua puluh satu [5]. Namun, nanopartikel seperti PM2.5 menyebabkan pencemaran lingkungan yang serius, penyakit pernapasan seperti asma, dan penyakit jantung iskemik [6]. Selanjutnya, partikel diesel yang dipancarkan oleh mobil dapat memiliki efek biologis dengan memasuki otak dan organ reproduksi [7], partikel halus berserat seperti asbes menginduksi mesothelioma, dan bahan nano berserat industri seperti nanotube karbon dapat berdampak negatif terhadap kesehatan manusia [8, 9]. Oleh karena itu, masih banyak yang belum diketahui mengenai efek biologis nanopartikel.
Emas (Au) memiliki kecenderungan ionisasi rendah dan stabilitas tinggi dan telah digunakan sebagai logam mulia untuk keperluan dekoratif sejak jaman dahulu. Nanopartikel emas yang dikembangkan baru-baru ini banyak digunakan dalam aplikasi medis dan teknik karena sifat optiknya yang khas [10, 11], dan sifat optoelektroniknya yang sangat baik telah menghasilkan penggunaannya dalam sel surya organik, probe sensor, dan bahan konduktif [12, 13] . Nanopartikel emas digunakan dalam industri kimia sebagai katalis untuk sintesis resin akrilik. Mereka juga menunjukkan aktivitas katalitik suhu rendah yang unggul untuk mengoksidasi CO dibandingkan dengan nanopartikel platinum, sehingga penggunaannya sebagai katalis pemurnian gas buang. Aplikasi lebih lanjut dari nanopartikel emas diharapkan di masa depan, tetapi hanya ada sedikit penelitian tentang toksisitas nanopartikel emas dan potensi interaksinya dengan obat.
Bidang nanoteknologi berkembang sebagai peneliti mengeksplorasi keamanan, farmakologi, dan farmakokinetik nanopartikel. Nanopartikel silika telah terbukti menyebabkan sitotoksisitas, hepatotoksisitas, dan kerusakan plasenta [14, 15], dan nanotube karbon dapat menginduksi mesothelioma paru [16]. Namun, sedikit yang diketahui tentang efek farmakologis yang dihasilkan dari interaksi antara nanopartikel dan obat-obatan. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki toksisitas partikel emas berdiameter 10, 50, dan 100 nm (masing-masing GnP10, GnP50, dan GnP100) pada tikus untuk memperjelas keamanannya pada mamalia. Selain itu, kami memeriksa efek nanopartikel ini pada toksisitas paraquat (PQ, hepatotoksin dan nefrotoksin yang terkenal) [17], cisplatin (CDDP, agen antitumor yang banyak digunakan) [18, 19], dan 5-aminosalisilat. acid (5-ASA, anti-inflamasi yang umum) [20].
Hasil dan Diskusi
Kami pertama-tama mengukur ukuran partikel nanopartikel emas menggunakan Zetasizer, kemudian mengamati partikel menggunakan mikroskop elektron transmisi (Gbr. 1a, b, c). Diameter rata-rata nanopartikel GnP10, GnP50, dan GnP100 masing-masing adalah 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2, dan 97,0 ± 27,1 nm (Tambahan Gambar 1). Selanjutnya, nanopartikel emas beragregasi ketika diukur dengan mikroskop elektron tetapi tidak beragregasi saat diberikan pada tikus. Selain itu, kami mengukur konsentrasi ion emas dengan ICP-MS, tetapi tidak ada ion yang terdeteksi (data tidak ditampilkan). Permukaan nanopartikel emas dimodifikasi dengan asam sitrat untuk meningkatkan afinitas nanopartikel terhadap air, tetapi modifikasi ini tidak menunjukkan fungsi lain.
Ultrastruktur nanopartikel emas. Mikrograf elektron GnP10 (a ), GnP50 (b ), dan GnP100 (c ) nanopartikel
Kami memeriksa apakah GnP menunjukkan hepatotoksisitas dan nefrotoksisitas dengan memberikan dosis maksimum 4 mg/kg pada tikus melalui vena ekor. Tidak ada hepatotoksisitas atau nefrotoksisitas yang diamati ketika nanopartikel emas saja diberikan (Gbr. 2). Nilai ALT dan AST dari tikus yang diberikan GnP10, 50, dan 100 saja (Gbr. 2a, b) mirip dengan nilai kontrol, seperti nilai BUN dan Cr. Pemberian tunggal GnP pada tikus tidak menyebabkan kerusakan hati atau ginjal, atau kerusakan jantung, paru-paru, atau limpa (Gambar Tambahan 2), yang menunjukkan bahwa nanopartikel emas tidak beracun bila diberikan sendiri pada tikus.
Pengaruh nanopartikel emas pada toksisitas yang diinduksi cisplatin. Tikus disuntik secara intraperitoneal dengan cisplatin (CDDP) pada 0 (batang terbuka) atau 100 μmol/kg (batang padat), bersama dengan injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam pasca injeksi, kadar serum enzim hati alanine aminotransferase (ALT; panel a ) dan aspartat aminotransferase (AST; panel b ), dan kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; panel c ), dan kreatinin (Cr; panel d ) ditentukan menggunakan kit yang tersedia secara komersial (lihat bagian “Analisis biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error mean (SEM; n =4). Perbedaan yang signifikan (*P <0,05, **P <0,01) antara kelompok yang diobati dengan kendaraan dan CDDP
Kerusakan hati dan ginjal telah dilaporkan diinduksi oleh pemberian bersama nanopartikel silika, nanoclays, atau nanopartikel polistiren dengan obat-obatan atau bahan kimia [14, 21, 22]. Oleh karena itu kami memberikan nanopartikel emas bersama dengan PQ (toksin hati-ginjal) atau obat CDDP atau 5-ASA (yang menyebabkan efek nefrotoksik hati yang merugikan). Gambar 2 menunjukkan hasil interaksi antara nanopartikel emas dan CDDP. Pemberian bersama GnP10 atau GnP50 dan CDDP meningkatkan ALT dan menginduksi kerusakan hati (Gbr. 2a), dan pemberian bersama GnP10 dan CDDP meningkatkan BUN dan Cr, menginduksi kerusakan ginjal (Gbr. 2c, d). Kami kemudian menyelidiki interaksi antara GnP dan 5-ASA, obat antiinflamasi yang banyak digunakan yang menyebabkan kerusakan hati dan ginjal. Pemberian bersama GnP10 atau GnP50 dengan CDDP meningkatkan ALT dan menginduksi kerusakan hati (Gbr. 3a), sedangkan pemberian bersama dengan 5-ASA meningkatkan BUN dan Cr dan menginduksi kerusakan ginjal (Gbr. 3c, d). Selanjutnya, kami menyelidiki interaksi antara GnP dan PQ, bahan kimia pertanian yang banyak digunakan yang menyebabkan kerusakan hati dan ginjal. Pemberian bersama GnP10 dan PQ meningkatkan kadar BUN dan Cr dan menginduksi kerusakan ginjal (Gbr. 4c, d) tetapi tidak merusak hati (Gbr. 4a, b). Pemberian bersama partikel emas terkecil yang diuji, GnP10, dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ menghasilkan nilai ALT, BUN, dan Cr tertinggi yang diamati dalam penelitian ini. Partikel 10x lebih besar dari GnP100 tidak menyebabkan kerusakan hati atau ginjal ketika diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Hasil ini menunjukkan bahwa GnP beracun ketika partikel dengan diameter kurang dari 100 nm digunakan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ.
Pengaruh nanopartikel emas pada toksisitas yang diinduksi asam 5-aminosalisilat. Tikus disuntik secara intraperitoneal dengan asam 5-aminosalisilat (5-ASA) pada 0 (batang terbuka) atau 500 mg/kg (batang padat), bersama dengan injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam pasca injeksi, kadar serum enzim hati alanine aminotransferase (ALT; a ) dan aspartat aminotransferase (AST; B), dan kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; c ) dan kreatinin (Cr; d ) ditentukan menggunakan kit yang tersedia secara komersial (lihat bagian “Analisis biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error mean (SEM; n =4). Perbedaan yang signifikan (*P <0,05, **P <0,01) antara kelompok yang diberi perlakuan kendaraan dan 5-ASA
Pengaruh nanopartikel emas pada toksisitas yang diinduksi paraquat. Tikus disuntik secara intraperitoneal dengan paraquat (PQ) pada 0 (batang terbuka) atau 50 mg/kg (batang padat), bersama dengan injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam pasca injeksi, kadar serum enzim hati alanine aminotransferase (ALT; a ) dan aspartat aminotransferase (AST; b ), dan kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; c ) dan kreatinin (Cr; d ) ditentukan menggunakan kit yang tersedia secara komersial (lihat bagian “Analisis biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error mean (SEM; n =4). Perbedaan yang signifikan (*P <0,05, **P <0,01) antara kelompok yang diberi perlakuan kendaraan dan PQ
Pengamatan hematoxylin dan eosin ginjal setelah pemberian bersama GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ (Gbr. 5) menunjukkan kerusakan tubulus, menunjukkan induksi cedera ginjal akut. Selanjutnya, kami mengukur IL-6 dan TNF-α dalam serum untuk menyelidiki penyebab yang mendasari kerusakan ginjal akut yang diinduksi GnP10. Gambar 6 menunjukkan kadar IL-6 serum 3 jam setelah pemberian bersama GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. IL-6 tidak terdeteksi pada kelompok GnP10 saja, tetapi peningkatan IL-6 diamati ketika GnP10 diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. TNF-α tidak terdeteksi pada kelompok mana pun (data tidak ditampilkan). Hasil ini menunjukkan bahwa IL-6 terlibat dalam kerusakan ginjal akut yang disebabkan oleh GnP10 dan CDDP, 5-ASA, atau PQ.
Analisis histologis jaringan ginjal dari tikus yang diobati dengan nanopartikel emas. Pada pemberian 24 jam pasca IV hanya GnP10 (a ), GnP10 dengan CDDP (b ), GnP10 dengan 5-ASA (c ), dan GnP10 dengan PQ (d ), jaringan dikumpulkan, difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, dipotong, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Panah menunjukkan situs kerusakan ginjal
Kadar IL-6 dalam serum, yang diukur dengan ELISA. Tikus menerima suntikan IV GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Kadar sitokin diukur 3 jam setelah pemberian. Nilai adalah rata-rata ± kesalahan standar (SE; n =4)
Kami menyelidiki efek pemberian bersama nanopartikel emas dan obat-obatan pada efek samping (yaitu, kerusakan hati dan ginjal). Ukuran partikel terkecil, GnP10, menginduksi kerusakan ginjal dan hati pada pemberian bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Kami juga memberikan bersama GnP10 dengan asetaminofen, streptomisin, atau tetrasiklin ke tikus dan mengamati tidak ada kerusakan hati atau ginjal (data tidak ditampilkan). Kami sebelumnya melaporkan bahwa nanopartikel silika menginduksi kerusakan hati, tergantung pada ukuran partikel [23], dan nanopartikel polistirena dapat menyebabkan kerusakan hati pada pemberian bersama dengan obat, tergantung pada ukuran partikel [24]. Xia dkk. melaporkan bahwa nanopartikel emas yang lebih kecil lebih genotoksik in vitro [25]. Secara keseluruhan, nanopartikel emas menjadi sangat beracun karena interaksi dengan obat-obatan saat ukuran partikel berkurang.
Pemberian bersama Gnp10 dengan cisplatin, 5-ASA, atau PQ meningkatkan kadar IL-6 (Gbr. 6). IL-6 tidak meningkat hanya dengan pemberian GnP10 saja (Gbr. 6) atau dengan pemberian CDDP, PQ, atau 5-ASA saja (data tidak ditampilkan). IL-6 sebelumnya dilaporkan terlibat dalam induksi kerusakan hati [26] dan ginjal akut [27, 28]. Kami percaya bahwa Gnp10 menginduksi IL-6, yang pada gilirannya menginduksi kerusakan hati dan ginjal, tetapi mekanisme yang mendasarinya masih belum jelas. Bauza dkk. melaporkan bahwa IL-6 menginduksi kerusakan hati dengan menginduksi faktor transkripsi di hepatosit [29]. Memahami keterlibatan faktor transkripsi sel spesifik dalam kerusakan hati dan ginjal yang diinduksi IL-6 akan memerlukan eksperimen lebih lanjut tentang mekanisme di balik sitotoksisitas nanopartikel emas.
Baru-baru ini, nanopartikel emas telah menarik perhatian sebagai biomaterial fungsional yang digunakan dalam sistem penghantaran obat [30], dan penelitian tentang pengobatan kanker menggunakan nanopartikel emas sedang aktif dilakukan. Misalnya, Anselmo dkk. melaporkan bahwa nanopartikel silika-emas berlapis PEG meningkatkan suhu lokal setelah menyerap cahaya dan tumor padat yang larut secara termal [31], menunjukkan bahwa nanopartikel emas adalah bahan yang menjanjikan untuk pengobatan kanker. Namun, kami menemukan bahwa interaksi antara cisplatin obat antikanker dan nanopartikel emas menyebabkan kerusakan ginjal (Gbr. 2), menunjukkan bahwa penggunaan nanopartikel emas dalam pengobatan kanker memerlukan studi keamanannya ketika digunakan bersama dengan obat.
Kesimpulan
Singkatnya, Gnp10 menyebabkan kerusakan ginjal pada pemberian bersama dengan CDDP, PQ, atau 5-ASA. GnP50 menyebabkan kerusakan ginjal hanya ketika diberikan bersama dengan 5-ASA sedangkan GnP100 tidak. Kami menunjukkan bahwa nanopartikel emas dapat menyebabkan kerusakan ginjal dan efek ini dapat diperburuk secara sinergis sebagai akibat interaksi dengan bahan kimia atau obat-obatan. Studi lebih lanjut berdasarkan data ini akan diperlukan untuk sepenuhnya menjelaskan profil toksikologi nanopartikel yang diusulkan untuk penggunaan diagnostik atau terapeutik.
Bahan dan Metode
Materi
Suspensi partikel emas yang tertutup ligan sitrat berdiameter 10, 50, dan 100 nm diperoleh dari NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, USA). Distribusi ukuran partikel dianalisis menggunakan Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japan) dan mikroskop elektron transmisi TEM JEOL JEM-1011. Diameter rata-rata adalah 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2, dan 87,0 ± 27,1 nm (Gbr. 1, Gambar Tambahan 1). Suspensi berair (1 mg/mL) didispersikan secara menyeluruh dengan sonikasi sebelum digunakan dan diencerkan dengan air. Kehadiran emas terionisasi dalam suspensi nanopartikel emas diperiksa oleh ICP-MS, dan tidak ada emas terionisasi yang terdeteksi. Volume identik dari setiap suspensi disuntikkan ke tikus untuk setiap percobaan. Ukuran geometris partikel dikarakterisasi dengan TEM. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), cisplatin, dan asam 5-aminosalisilat (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepang) dilarutkan dalam garam dan disimpan pada suhu 20 °C sampai digunakan. Semua reagen adalah kelas penelitian.
Hewan
Tikus jantan BALB/c berumur delapan minggu dibeli dari Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Jepang). Hewan-hewan dipelihara dalam lingkungan yang terkendali (suhu 23 ± 1,5 °C; siklus terang/gelap 12 jam) dengan akses gratis ke makanan hewan pengerat standar dan air. Tikus diberi waktu 1 minggu untuk menyesuaikan diri sebelum memulai percobaan. Protokol eksperimental sesuai dengan pedoman etika Sekolah Pascasarjana Ilmu Farmasi Universitas Teikyo Heisei, yang disusun dari Pedoman Eksperimen Hewan dari Asosiasi Jepang untuk Laboratorium Ilmu Hewan.
Analisis Biokimia
Serum alanine aminotransferase (ALT), serum aspartate aminotransferase (AST), nitrogen urea darah (BUN), dan kreatinin (Cr) diukur menggunakan kit yang tersedia secara komersial (Wako Pure Chemical Industries) sesuai dengan protokol pabrikan. Secara singkat, serum yang dikumpulkan (10 mL) digabungkan dengan 1 mL reagen warna A (mengandung urease) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit. Setelah penambahan 1 mL reagen warna B, sampel diinkubasi pada suhu 37 °C selama 10 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 570 nm. Interleukin (IL)-6 dan TNF-α dianalisis menggunakan kit enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (BioSource International, CA, USA). Semua analisis dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik.
Analisis Histologi
Pada 24 jam setelah pemberian dosis, hewan dikorbankan, dan hati dikeluarkan dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Setelah diproses dan dipotong, potongan jaringan tipis diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk pengamatan histologis.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan formulir tambahan Statcel, Perangkat Lunak Excel ke-3 (publikasi EMS Co., Ltd., Saitama, Jepang). Semua data disajikan sebagai mean ± standard error of mean (SEM). Perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan eksperimen ditentukan dengan menggunakan uji Dunnett; sebuah P nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan.
