Interaksi Nanopartikel Emas dan Obat Penyebab Kerusakan Ginjal Akut pada Tikus: Studi Toksisitas Bergantung pada Ukuran
Abstrak
Nanomaterial merupakan material inovatif dengan banyak properti berguna, namun masih terdapat kekhawatiran mengenai efek-efek yang belum diketahui pada organisme hidup. Nanopartikel emas banyak digunakan sebagai material industri karena properti unggulnya. Bahaya biologi potensial nanopartikel emas masih tidak diketahui, sehingga penelitian ini menguji efek in vivo nanopartikel emas dengan diameter 10, 50, dan 100 nm (GnP10, GnP50, dan GnP100) serta interaksinya dengan obat pada tikus untuk menilai keamanannya pada mamalia. Sisplatin, paraquat, dan asam 5-aminosalisilat menyebabkan kerusakan sampingan pada hati dan ginjal tikus. Tidak ada hepatotoksisitas atau nefrotoksisitas yang teramati ketika nanopartikel emas saja diberikan melalui vena ekor. Sebaliknya, pemberian bersama GnP-10 dengan sisplatin, paraquat, atau asam 5-aminosalisilat menyebabkan kerusakan ginjal sampingan. Ini menunjukkan bahwa nanopartikel emas dengan ukuran partikel 10 nm potensial nefrotoksik karena interaksinya dengan obat.
Pendahuluan
Nanoteknologi memainkan peran yang semakin penting pada abad ke-21, dengan nanomaterial sebagai dasar kemajuan nanoteknologi. Perkembangan terkini dalam pembuatan nanopartikel telah membantu penggunaan nanomaterial inovatif di seluruh dunia [1, 2]. Nanomaterial memiliki diameter 100 nm atau kurang, dan contohnya meliputi nanopartikel emas, perak, silika, platinum, dan dioksida titanium, serta fuleren dan nanocarbon [3, 4]. Material ini dapat digunakan dalam teknologi penyimpanan elektronik, obat genetik/regeneratif, dan perangkat elektronik, serta menjadi dasar industri baru pada abad ke-21 [5]. Namun, nanopartikel seperti PM2.5 menyebabkan pencemaran lingkungan yang serius, penyakit pernapasan seperti asma, dan penyakit jantung isemik [6]. Selain itu, partikel diesel yang diproduksi kendaraan bermotor dapat memiliki efek biologi dengan memasuki otak dan organ reproduksi [7], partikel halus fibrous seperti asbes menginduksi mesotelioma, dan nanomaterial fibrous industri seperti nanocarbon dapat berdampak negatif pada kesehatan manusia [8, 9]. Oleh karena itu, banyak hal yang masih tidak diketahui mengenai efek biologi nanopartikel.
Emas (Au) memiliki tendensi ionisasi rendah dan stabilitas tinggi, dan telah digunakan sebagai logam berharga untuk tujuan dekoratif sejak zaman kuno. Nanopartikel emas yang dikembangkan kini banyak digunakan dalam aplikasi medis dan teknik karena properti optik khasnya [10, 11], dan properti optoelektronik unggulnya telah menghasilkan penggunaan dalam sel surya organik, probe sensor, dan material konduktif [12, 13]. Nanopartikel emas digunakan dalam industri kimia sebagai katalis untuk sintesis harsa akril. Mereka juga menunjukkan aktivitas katalitik suhu rendah yang unggul untuk mengoksidasi CO dibandingkan nanopartikel platinum, sehingga digunakan sebagai katalis pembuangan gas buang. Aplikasi lebih lanjut nanopartikel emas diharapkan di masa depan, namun sedikit penelitian mengenai toksisitas nanopartikel emas dan interaksi potensial mereka dengan obat.
Bidang nanoteknologi sedang berkembang seiring penjelajahan peneliti terhadap keamanan, farmakologi, dan farmakokinetika nanopartikel. Terdapat indikasi bahwa nanopartikel silika dapat menyebabkan toksisitas sel, hepatotoksisitas, dan kerusakan plasenta [14, 15], dan nanocarbon dapat menginduksi mesotelioma paru [16]. Namun, sedikit yang diketahui mengenai efek farmakologis yang timbul dari interaksi antara nanopartikel dan obat. Dalam studi ini, kami menyelidiki toksisitas partikel emas dengan diameter 10, 50, dan 100 nm (GnP10, GnP50, dan GnP100) pada tikus untuk menjelaskan keamanan mereka pada mamalia. Selain itu, kami memeriksa efek nanopartikel ini terhadap toksisitas paraquat (PQ, heptotoksin dan nefrotoksin yang terkenal) [17], sisplatin (CDDP, agen antitumor yang banyak digunakan) [18, 19], dan asam 5-aminosalisilat (5-ASA, antiinflamasi umum) [20].
Hasil dan Pembahasan
Pertama, kami mengukur ukuran partikel nanopartikel emas menggunakan Zetasizer, lalu mengamati partikel menggunakan mikroskop transmisi elektron (Gambar 1a, b, c). Diameter rata-rata nanopartikel GnP10, GnP50, dan GnP100 berturut-turut 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2, dan 97,0 ± 27,1 nm (Gambar Pelengkap 1). Selain itu, nanopartikel emas mengagregasi ketika diukur dengan mikroskop elektron tetapi tidak mengagregasi ketika diberikan pada tikus. Selain itu, kami mengukur konsentrasi ion emas dengan ICP-MS, namun tidak ada ion yang terdeteksi (data tidak ditampilkan). Permukaan nanopartikel emas dimodifikasi dengan asam sitrat untuk meningkatkan afinitas nanopartikel terhadap air, namun modifikasi ini tidak menunjukkan fungsionalitas lain.
Ultrastuktur nanopartikel emas. Mikrograf elektron nanopartikel GnP10 (a), GnP50 (b), dan GnP100 (c)
Kami memeriksa apakah GnP menunjukkan hepatotoksisitas dan nefrotoksisitas dengan memberikan dosis maksimum 4 mg/kg pada tikus melalui vena ekor. Tidak ada hepatotoksisitas atau nefrotoksisitas yang teramati ketika nanopartikel emas saja diberikan (Gambar 2). Nilai ALT dan AST tikus yang diberikan GnP10, 50, dan 100 saja (Gambar 2a, b) serupa dengan nilai kontrol, begitu juga nilai BUN dan Cr. Pemberian tunggal GnP pada tikus tidak menginduksi kerusakan hati atau ginjal, serta jantung, paru, atau limpa (Gambar Pelengkap 2), menunjukkan bahwa nanopartikel emas non-toksik ketika diberikan saja pada tikus.
Efek nanopartikel emas terhadap toksisitas yang diinduksi sisplatin. Tikus diinjeksi intraperitoneal dengan sisplatin (CDDP) pada 0 (bar terbuka) atau 100 μmol/kg (bar padat), bersama injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam setelah injeksi, kadar enzim hati serum alanin aminotransferase (ALT; panel a) dan aspartat aminotransferase (AST; panel b), serta kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; panel c) dan kreatinin (Cr; panel d) diukur menggunakan kit komersial (lihat bagian “Analisis Biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error rata-rata (SEM; n = 4). Perbedaan signifikan (*P < 0,05, **P < 0,01) antara grup kendaraan dan grup yang dirawat CDDP
Kerusakan hati dan ginjal telah dilaporkan diinduksi oleh pemberian bersama nanopartikel silika, nanoklay, atau nanopartikel polistiren dengan obat atau kimia [14, 21, 22]. Oleh karena itu, kami memberikan bersama nanopartikel emas dengan PQ (toksin hati-ginjal) atau obat CDDP atau 5-ASA (yang menyebabkan efek samping nefrotoksik hati). Gambar 2 menunjukkan hasil interaksi antara nanopartikel emas dan CDDP. Pemberian bersama GnP10 atau GnP50 dan CDDP meningkatkan ALT dan menginduksi kerusakan hati (Gambar 2a), dan pemberian bersama GnP10 dan CDDP meningkatkan BUN dan Cr, menginduksi kerusakan ginjal (Gambar 2c, d). Kami kemudian menyelidiki interaksi antara GnP dan 5-ASA, obat antiinflamasi yang banyak digunakan yang menyebabkan kerusakan hati dan ginjal. Pemberian bersama GnP10 atau GnP50 dengan CDDP meningkatkan ALT dan menginduksi kerusakan hati (Gambar 3a), sedangkan pemberian bersama dengan 5-ASA meningkatkan BUN dan Cr dan menginduksi kerusakan ginjal (Gambar 3c, d). Selanjutnya, kami menyelidiki interaksi antara GnP dan PQ, agrobahan yang banyak digunakan yang menyebabkan kerusakan hati dan ginjal. Pemberian bersama GnP10 dan PQ meningkatkan kadar BUN dan Cr serta menginduksi kerusakan ginjal (Gambar 4c, d) tetapi tidak kerusakan hati (Gambar 4a, b). Pemberian bersama partikel emas terkecil yang diuji, GnP10, dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ menghasilkan nilai ALT, BUN, dan Cr tertinggi yang diamati dalam studi ini. Partikel 10× lebih besar GnP100 tidak menyebabkan kerusakan hati atau ginjal ketika diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Hasil ini menunjukkan bahwa GnP toksik ketika partikel dengan diameter kurang dari 100 nm diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ.
Efek nanopartikel emas terhadap toksisitas yang diinduksi asam 5-aminosalisilat. Tikus diinjeksi intraperitoneal dengan asam 5-aminosalisilat (5-ASA) pada 0 (bar terbuka) atau 500 mg/kg (bar padat), bersama injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam setelah injeksi, kadar enzim hati serum alanin aminotransferase (ALT; a) dan aspartat aminotransferase (AST; B), serta kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; c) dan kreatinin (Cr; d) diukur menggunakan kit komersial (lihat bagian “Analisis Biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error rata-rata (SEM; n = 4). Perbedaan signifikan (*P < 0,05, **P < 0,01) antara grup kendaraan dan grup yang dirawat 5-ASA
Efek nanopartikel emas terhadap toksisitas yang diinduksi paraquat. Tikus diinjeksi intraperitoneal dengan paraquat (PQ) pada 0 (bar terbuka) atau 50 mg/kg (bar padat), bersama injeksi IV kendaraan atau nanopartikel emas (4 mg/kg). Pada 24 jam setelah injeksi, kadar enzim hati serum alanin aminotransferase (ALT; a) dan aspartat aminotransferase (AST; b), serta kadar plasma nitrogen urea darah (BUN; c) dan kreatinin (Cr; d) diukur menggunakan kit komersial (lihat bagian “Analisis Biokimia”). Data disajikan sebagai mean ± standar error rata-rata (SEM; n = 4). Perbedaan signifikan (*P < 0,05, **P < 0,01) antara grup kendaraan dan grup yang dirawat PQ
Pemantulan hematoxylin dan eosin ginjal setelah pemberian bersama GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ (Gambar 5) menunjukkan kerusakan tubulus, yang mengindikasikan cedera ginjal akut. Selanjutnya, kami mengukur IL-6 dan TNF-α dalam serum untuk menyelidiki penyebab di balik kerusakan ginjal akut yang diinduksi GnP10. Gambar 6 menunjukkan kadar IL-6 serum 3 jam setelah pemberian bersama GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. IL-6 tidak terdeteksi dalam grup GnP10 saja, tetapi peningkatan IL-6 diamati ketika GnP10 diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. TNF-α tidak terdeteksi dalam grup apa pun (data tidak ditampilkan). Hasil ini menunjukkan bahwa IL-6 terlibat dalam cedera ginjal akut yang diinduksi GnP10 dan CDDP, 5-ASA, atau PQ.
Analisis histologis jaringan ginjal tikus yang treated dengan nanopartikel emas. Pada 24 jam setelah pemberian IV hanya GnP10 (a), GnP10 dengan CDDP (b), GnP10 dengan 5-ASA (c), dan GnP10 dengan PQ (d), jaringan dikumpulkan, di-fiksasi dengan paraformaldehyd 4%, dipotong, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Panah menandai situs kerusakan ginjal
Kadar IL-6 dalam serum, diukur dengan ELISA. Tikus menerima injeksi IV GnP10 dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Kadar sitokin diukur 3 jam setelah pemberian. Nilai adalah rata-rata ± standar error (SE; n = 4)
Kami menyelidiki efek pemberian bersama nanopartikel emas dan obat pada efek samping (yaitu, kerusakan hati dan ginjal). Ukuran partikel terkecil, GnP10, menginduksi kerusakan ginjal dan hati saat diberikan bersama dengan CDDP, 5-ASA, atau PQ. Kami juga memberikan bersama GnP10 dengan asetaminofen, streptomisin, atau tetrasiklin pada tikus dan tidak mengamati kerusakan hati atau ginjal (data tidak ditampilkan). Kami sebelumnya melaporkan bahwa nanopartikel silika menginduksi kerusakan hali, bergantung pada ukuran partikel [23], dan nanopartikel polistiren dapat menginduksi kerusakan hati saat diberikan bersama dengan obat, bergantung pada ukuran partikel [24]. Xia et al. melaporkan bahwa nanopartikel emas yang lebih kecil lebih genotoksik in vitro [25]. Secara keseluruhan, nanopartikel emas menjadi sangat toksik karena interaksi dengan obat seiring berkurangnya ukuran partikel.
Pemberian bersama Gnp10 dengan sisplatin, 5-ASA, atau PQ meningkatkan kadar IL-6 (Gambar 6). IL-6 tidak meningkat dengan pemberian GnP10 saja (Gambar 6) atau dengan pemberian CDDP, PQ, atau 5-ASA saja (data tidak ditampilkan). IL-6 sebelumnya dilaporkan terlibat dalam induksi kerusakan hati [26] dan ginjal akut [27, 28]. Kami yakin bahwa Gnp10 menginduksi IL-6, yang selanjutnya menginduksi kerusakan hati dan ginjal, namun mekanisme di baliknya masih tidak jelas. Bauza et al. melaporkan bahwa IL-6 menginduksi kerusakan hati dengan menginduksi faktor transkripsi dalam hepatosit [29]. Memahami terlibatnya faktor transkripsi spesifik sel dalam kerusakan hati dan ginjal yang diinduksi IL-6 akan memerlukan eksperimen lebih lanjut mengenai mekanisme di balik toksisitas sel nanopartikel emas.
Terakhir, nanopartikel emas telah menarik perhatian sebagai material biomaterial fungsional yang digunakan dalam sistem pengiriman obat [30], dan penelitian mengenai pengobatan kanker menggunakan nanopartikel emas sedang dilakukan secara aktif. Misalnya, Anselmo et al. melaporkan bahwa nanopartikel silika-emas terlaPEGkan meningkatkan suhu lokal saat menyerap cahaya dan secara termal melarutkan tumor padat [31], menunjukkan bahwa nanopartikel emas adalah material yang menjanjikan untuk pengobatan kanker. Namun, kami menemukan bahwa interaksi antara obat antikanker sisplatin dan nanopartikel emas menginduksi kerusakan ginjal (Gambar 2), yang menunjukkan bahwa penggunaan nanopartikel emas dalam pengobatan kanker memerlukan studi keamanan saat diberikan bersama dengan obat.
Kesimpulan
Secara ringkas, Gnp10 menyebabkan kerusakan ginjal saat diberikan bersama dengan CDDP, PQ, atau 5-ASA. GnP50 menyebabkan kerusakan ginjal hanya saat diberikan bersama dengan 5-ASA sedangkan GnP100 tidak. Kami telah menunjukkan bahwa nanopartikel emas dapat menyebabkan kerusakan ginjal dan bahwa efek ini dapat diperburuk secara sinergis sebagai hasil interaksi dengan kimia atau obat. Studi lebih lanjut berdasarkan data ini akan diperlukan untuk sepenuhnya menguraikan profil toksikologis nanopartikel yang diusulkan untuk penggunaan diagnostik atau terapeutik.
Bahan dan Metode
Bahan
Suspensi partikel emas dengan diameter 10, 50, dan 100 nm yang dilapisi ligan sitrat diperoleh dari NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, Amerika Serikat). Distribusi ukuran partikel dianalisis menggunakan Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Jepang) dan mikroskop transmisi elektron TEM JEOL JEM-1011. Diameter rata-rata adalah 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2, dan 87,0 ± 27,1 nm (Gambar 1, Gambar Pelengkap 1). Suspensi air (1 mg/mL) diedisperse secara menyeluruh dengan sonikasi sebelum penggunaan dan diencerkan dengan air. Kehadiran ion emas yang terionisasi dalam suspensi nanopartikel emas diperiksa dengan ICP-MS, dan tidak ada ion emas yang terdeteksi. Volume yang sama dari setiap suspensi diinjeksi ke tikus untuk setiap eksperimen. Ukuran geometris partikel dikarakterisasi dengan TEM. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Serikat), sisplatin, dan asam 5-aminosalisilat (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepang) dilarutkan dalam larutan garam dan disimpan pada −20 °C hingga digunakan. Semua reagen adalah grade riset.
Hewan
Tikus BALB/c jantan berusia delapan minggu dibeli dari Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Jepang). Hewan dipelihara dalam lingkungan terkontrol (suhu 23 ± 1,5 °C; siklus cahaya/gelap 12 jam) dengan akses bebas ke makanan tikus standar dan air. Tikus diberikan satu minggu untuk menyesuaikan sebelum memulai eksperimen. Protokol eksperimen sesuai dengan pedoman etika Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Universitas Teikyo Heisei, yang dikompilasi dari Pedoman Eksperimen Hewan Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium Jepang.
Analisis Biokimia
Alanin aminotransferase serum (ALT), aspartat aminotransferase serum (AST), nitrogen urea darah (BUN), dan kreatinin (Cr) diukur menggunakan kit komersial (Wako Pure Chemical Industries) sesuai dengan protokol pabrikan. Singkatnya, serum yang dikumpulkan (10 mL) dicampur dengan 1 mL reagen warna A (yang mengandung urease) dan diinkubasi pada 37 °C selama 15 menit. Setelah penambahan 1 mL reagen warna B, sampel diinkubasi pada 37 °C selama 10 menit. Absorban diukur pada panjang gelombang 570 nm. Interleukin (IL)-6 dan TNF-α dianalisis menggunakan kit imunoabsorpsi enzim (ELISA) (BioSource International, CA, Amerika Serikat). Semua analisis dilakukan secara ketat sesuai dengan petunjuk pabrikan.
Analisis Histologis
Pada 24 jam setelah pemberian dosis, hewan dihadapkan, dan hati diambil dan difiksasi dengan paraformaldehyd 4%. Setelah pengolahan dan pemotongan, irisan jaringan tipis diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk pengamatan histologis.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan bentuk tambahan Statcel, Excel Software ke-3 (EMS publication Co., Ltd., Saitama, Jepang). Semua data disajikan sebagai rata-rata ± standar error rata-rata (SEM). Perbedaan signifikan antara grup kontrol dan grup eksperimental ditentukan menggunakan uji Dunnett; nilai P kurang dari 0,05 dianggap signifikan.
