Fabrikasi Struktur Nano Hibrida Berdasarkan Nanocluster Fe3O4 sebagai Agen Theranostik untuk Pencitraan Resonansi Magnetik dan Pengiriman Obat
Abstrak
Menggabungkan obat antikanker dengan nanocrystals anorganik untuk membangun struktur nano hibrida multifungsi telah menjadi alat yang ampuh untuk pengobatan kanker dan penekanan tumor. Namun, tetap menjadi tantangan kritis untuk mensintesis struktur nano yang kompak dan multifungsi dengan fungsionalitas dan reproduktifitas yang ditingkatkan. Dalam penelitian ini, kami melaporkan pembuatan struktur nano hibrida magnetit menggunakan Fe3 O4 nanopartikel (NPs) untuk membentuk multifungsi magnetite nanoclusters (NCs) dengan menggabungkan perakitan mikroemulsi minyak dalam air dan metode lapis demi lapis (LBL). Fe3 O4 NCs pertama kali disiapkan melalui teknik perakitan mandiri mikroemulsi. Kemudian, lapisan polielektrolit yang terdiri dari poli(alillamin hidroklorida) (PAH) dan poli(natrium 4-stirenasulfonat) (PSS) dan doksorubisin hidroklorida (DOX) ditutup pada Fe3 O4 NCs untuk membangun Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX melalui metode LBL. Struktur nano hibrida yang disiapkan dengan DOX menunjukkan pelepasan obat yang responsif terhadap pH dan sitotoksisitas yang lebih tinggi terhadap sel kanker paru-paru manusia (A549) secara in vitro dan dapat berfungsi sebagai T2 -agen kontras pencitraan resonansi magnetik (MRI), yang secara signifikan dapat meningkatkan T2 relaksivitas dan menyebabkan efek kontras MRI seluler yang lebih baik. DOX yang dimuat memancarkan sinyal merah di bawah eksitasi dengan 490 nm cocok untuk aplikasi bioimaging. Karya ini memberikan strategi baru untuk membangun Fe3 O4 -berbasis nanoplatform theranostic multifungsi dengan T2 -weighted MRI, pencitraan fluoresensi, dan pemberian obat.
Pengantar
Dalam beberapa tahun terakhir, berbagai sistem penghantaran obat multifungsi telah dikembangkan untuk diagnosis dan terapi masa depan dalam aplikasi biomedis [1,2,3,4]. Struktur nano hibrida multifungsi yang terintegrasi dengan sifat menguntungkan akan memiliki aplikasi yang signifikan seperti pencitraan multimodal dan diagnosis dan terapi simultan [5,6,7,8,9,10,11]. Lebih lanjut, struktur nano ini adalah sistem pengiriman obat yang responsif terhadap rangsangan untuk meningkatkan akumulasi obat, meningkatkan kemanjuran terapi, dan/atau mengurangi efek samping. Terutama, sistem penghantaran obat yang responsif terhadap pH ini telah menarik minat penelitian yang luas. Ini karena sebagian besar tumor manusia memiliki nilai pH yang lebih asam, yang memberikan kemungkinan cara untuk merancang pelepasan terkontrol molekul obat [12,13,14,15,16].
Selama beberapa dekade terakhir, berbagai struktur nano hibrida dengan menggabungkan nanomaterial anorganik dengan polimer organik [17,18,19,20] telah dikembangkan, termasuk partikel magnetik [21,22,23], nanopartikel upconversion (NP) [17, 24] , dan partikel silika mesopori [25]. Di antara mereka, struktur nano hibrida magnetik berdasarkan oksida besi dengan magnetisasi yang relatif besar pada suhu kamar telah banyak digunakan di bidang biomedis [26,27,28,29]. Fungsionalisasi nanomaterial anorganik yang dilapisi dengan lapisan polielektrolit dapat mewujudkan enkapsulasi dan pelepasan molekul obat yang responsif terhadap pH [12, 17, 30]. Baru-baru ini, lapisan polielektrolit yang terdiri dari natrium poli (stirena sulfonat) (PSS) dan polikation poli(alillamin hidroklorida) (PAH) telah dipelajari secara luas [31,32,33,34,35,36]. Lapisan polielektrolit dikombinasikan dengan NP magnetik dan luminescent atau molekul obat untuk sistem penghantaran obat multifungsi juga baru-baru ini dilaporkan [37,38,39]. Oksida besi (Fe3 O4 ) NP semakin mendapat perhatian di bidang magnetic resonance imaging (MRI) dan pengiriman obat karena sifat superparamagnetiknya yang unik, biokompatibilitas, sitotoksisitas rendah, dan fleksibilitas [9, 11, 28, 29, 40,41,42] ]. Secara umum, ada dua metode untuk meningkatkan daya tanggap magnetik Fe3 O4 NP. Yang pertama adalah mensintesis partikel magnetit berukuran mikrometer. Karena ukurannya yang besar, bagaimanapun, mereka cenderung berkumpul dalam larutan berair, yang tidak bermanfaat untuk aplikasi biomedis. Pendekatan lainnya adalah merakit Fe3 O4 NP menjadi nanocluster (NCs). Biaya ini3 O4 NC sangat meningkatkan respons magnetik dibandingkan dengan Fe individu3 O4 NP [22, 43]. Oleh karena itu, jika Fe yang dirakit sendiri3 O4 NC diadopsi sebagai inti untuk membuat struktur nano hibrida multifungsi, kinerja MRI akan ditingkatkan dengan efek kolektif Fe3 O4 NP [43,44,45]. Sepengetahuan kami, Fe yang dirakit sendiri3 O4 NC yang difungsikan dengan multilayer PAH/PSS untuk pelepasan obat yang responsif terhadap pH jarang dilaporkan.
Dalam karya ini, nanoplatform theranostic serbaguna berdasarkan Fe3 O4 NP dibangun untuk MRI dan pengiriman obat. Dalam pendekatan kami, Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX diperoleh dengan menggabungkan metode mikroemulsi minyak dalam air dan metode adsorpsi elektrostatik lapis demi lapis (LBL). Diharapkan Fe3 . yang dikemas O4 Sistem NC dapat menyebabkan peningkatan T2 relaksivitas dan kontras pencitraan, dan luas permukaan spesifik yang besar dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS memungkinkan pemuatan obat antikanker yang tinggi. Selain itu, percobaan in vitro menunjukkan bahwa kontras MRI seluler sel kanker paru-paru manusia (A549) yang diinkubasi dengan Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX telah ditingkatkan secara signifikan.
Bahan dan Metode
Materi
FeCl3 ·6H2 O (99,99%), FeCl2 ·4H2 O (99,99%), asam oleat (OA, 90%), dan 1-oktadesen (ODE, 90%) dibeli dari Alfa Aeasar. Natrium oleat (NaOA), etanol, heksana, sikloheksana, isopropanol, natrium dodesil benzena sulfonat (SDBS), amonium fluorida (NH4 F), natrium hidroksida (NaOH), dimetil sulfoksida (DMSO), dan amonia dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Cina). Poli(alillamin hidroklorida) (PAH), poli(stirena sulfonat) (PSS), dan 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida dibeli dari Sigma-Aldrich. Obat antikanker doxorubicin hydrochloride (DOX,> 98%) dibeli dari Shanghai Sangon Biotech Company (Shanghai, China). Media pertumbuhan APMI 1640 dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Hyclone. Semua reagen digunakan seperti yang diterima tanpa pemurnian lebih lanjut.
Persiapan Ferric Oleate
Sintesis NP magnetik dimulai dari sintesis ferric oleate. FeCl3 ·6H2 O (2,59 g), NaOA (14,6 g), C2 H5 OH (32 mL), H2 O (24 mL), dan heksana (56 mL) dicampur bersama dalam labu leher tiga 150-mL dan dipanaskan hingga 70 °C untuk refluks selama 4 jam untuk membentuk larutan kompleks ferri oleat yang transparan. Setelah itu, cairan dipisahkan dengan corong pemisah dan lapisan minyak bagian atas diawetkan. Heksana dalam cairan diuapkan pada 70 °C dengan penguapan berputar dan dikeringkan selama 48 h di bawah vakum. Sampel yang telah disiapkan disimpan dalam kotak sarung tangan vakum untuk digunakan lebih lanjut.
Sintesis Fe3 O4 NP
Kami mensintesis Fe3 O4 NP mengikuti prosedur yang dilaporkan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [46]. Ferric oleate (7,2 g), OA (1,28 mL), dan ODE (50 mL) dicampur bersama dalam labu leher tiga 100-mL dan dipanaskan hingga 300 °C selama 40 menit di bawah perlindungan argon; setelah itu, campuran didinginkan sampai suhu kamar dan dioksidasi di udara selama lebih dari 12 h. Nanokristal yang dihasilkan diendapkan dengan penambahan isopropanol, disentrifugasi, dan dicuci dua kali dengan campuran etanol-air (1:1 v /v ). Fe yang tertutup asam oleat3 O4 NP akhirnya didispersikan dalam 200 mL sikloheksana, dan supernatannya disegel dan disimpan untuk eksperimen selanjutnya.
Persiapan Fe3 O4 NC
Biaya3 O4 NCs disiapkan dengan teknik perakitan mandiri mikroemulsi yang mudah dan langsung seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan modifikasi [47]. Secara singkat, 200-μL larutan Fe3 O4 nanocrystals dalam sikloheksana dituangkan ke dalam 4 mL larutan berair yang mengandung 14 mg SDBS. Campuran larutan tersebut menjalani perlakuan ultrasonik selama 5 menit sebanyak 4 kali. Emulsi padat-dalam-minyak-dalam-air (S/O/W) yang terbentuk diaduk pada suhu kamar selama 6 h untuk menguapkan pelarut organik diikuti dengan perakitan sendiri Fe3 O4 NP untuk membentuk NC 3D. Produk akhir dicuci dengan air deionisasi 3 kali untuk menghilangkan kelebihan SDBS, nanocrystals yang tidak tergabung, dan beberapa kemungkinan kontaminan yang lebih besar.
Persiapan Fe3 O4 Struktur Nano Hibrida NC/PAH/PSS/DOX
Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC / PAH / PSS / DOX disiapkan oleh interaksi menarik elektrostatik. Fe yang telah disiapkan3 O4 NCs bermuatan negatif karena enkapsulasi surfaktan anionik. Mereka pertama kali berubah menjadi bermuatan positif dengan adsorpsi lapisan polielektrolit bermuatan positif, poli(allylamina hidroklorida) (PAH, MW 15.000). Secara khusus, 300-μL Fe3 O4 Sampel NC pertama-tama diencerkan 10 kali menjadi 3 mL menggunakan air deionisasi. Fe3 O4 Campuran NC kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan PAH berair (1 mL, 10 g/L, 4 mM NaCl) dengan pengadukan kuat. Setelah larutan diaduk selama 24 jam, kelebihan PAH dihilangkan dengan sentrifugasi, dan dihasilkan Fe3 yang dilapisi PAH. O4 NC (Fe3 O4 NC/PAH) didispersikan kembali dalam air (3 mL).
Fe3 O4 NC/PAH kemudian diubah menjadi bermuatan negatif dengan adsorpsi lapisan polielektrolit bermuatan negatif, poli-(natrium 4-stirenasulfonat) (PSS, MW 70.000). Secara khusus, 3 mL Fe3 O4 Larutan sampel NC/PAH ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan PSS berair (1 mL, 10 g/L, 4 mM NaCl) dengan pengadukan kuat. Setelah larutan diaduk selama 24 jam, PSS yang berlebih dihilangkan dengan sentrifugasi, dan dihasilkan Fe3 tersalut PSS. O4 NC/PAH (Fe3 O4 NC/PAH/PSS) didispersikan kembali dalam air (3 mL).
Larutan stok berair DOX pertama kali disiapkan [17]. Konsentrasinya adalah 5.0 mg/mL. Solusi struktur nano hibrida diperoleh dengan mencampurkan Fe3 O4 Larutan NC/PAH/PSS (3 mL, 32 mg/mL) dan larutan stok DOX (60 μL) dalam tabung plastik kecil sambil diaduk selama 24 h di kamar gelap. Setelah sentrifugasi, Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX akhirnya diperoleh.
Pengukuran MRI
Pengukuran MRI dilakukan dalam sistem pencitraan mikro 2,5 mikro 11,7 T (Bruker, Jerman). Besarnya Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX didispersikan dalam larutan air agarosa 1,2 mL dan kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube untuk pengukuran MRI. Konsentrasi ion Fe akhir berturut-turut adalah 0 mM, 0,013 mM, 0,026 mM, 0,032 mM, 0,041 mM, 0,052 mM, dan 0,065 mM. Parameter pengukuran adalah sebagai berikut:waktu pengulangan (TR) =300 ms, waktu gema (TE) =4,5 ms, matriks pencitraan =128 × 128, ketebalan irisan =1,2 mm, bidang pandang (FOV) =2,0 × 2,0 cm, dan jumlah rata-rata (NA) =2.
Serapan Seluler dan Pencitraan MR
Untuk mendemonstrasikan penyerapan seluler yang efisien, sel-sel A549 diunggulkan pada kaca penutup dalam cawan confocal dan diinkubasi dalam 5% CO2 yang dilembabkan. atmosfer selama 4 jam pada 37 °C. Kemudian, Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX ditambahkan ke dalam media inkubasi pada konsentrasi yang berbeda dan diinkubasi selama 2 jam. Konsentrasi ion Fe akhir diperoleh masing-masing sebagai 0, 2.2, 4.5, 9.0, dan 13,5 μM. Setelah media dihilangkan, sel dicuci dua kali dengan PBS (pH =7,4, 20 mM) dan langsung digunakan untuk pencitraan MR.
Kurva Standar DOX
Jumlah DOX yang sesuai dilarutkan dalam air dengan cara osilasi. Kemudian, serangkaian konsentrasi yang berbeda dari larutan berair DOX disiapkan (0-0,03 mg/mL). Intensitas fluoresensi dari berbagai konsentrasi larutan DOX diukur (λmantan =490 nm). Akhirnya, kurva standar DOX ditentukan melalui penyesuaian kurva intensitas fluoresensi vs konsentrasi DOX.
Kurva standar area:Y =447.4423 + 69745.08457X.
Tingkat presisi kurva standar:R
2
=0,9992.
Memuat dan Melepas DOX
Untuk mengukur kapasitas pemuatan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX, larutan supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi struktur nano hibrida yang telah disiapkan. Spektrum fluoresensi molekul DOX dalam larutan supernatan diperiksa dan konsentrasi DOX dalam supernatan dihitung dengan membandingkan kurva standar DOX. Persentase DOX yang tersisa di Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX dihitung menurut persamaan berikut:
dimana A0 dan As mewakili massa DOX awal dan massa DOX dalam supernatan, masing-masing.
Untuk studi pelepasan DOX kumulatif dalam larutan buffer PBS (pH 5.0 dan 7,4) dengan konsentrasi NaCl yang sama yaitu 0,15 M, Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX didispersikan dalam 1,0 mL larutan buffer dan kemudian dipindahkan ke dalam kantong dialisis. Kemudian, disimpan dalam larutan buffer dan dikocok perlahan pada suhu 37 °C di kamar gelap. Pada interval waktu yang dipilih, 100 μL larutan ditarik dan dianalisis dengan spektrum fluoresensi, dan kemudian dikembalikan ke larutan aslinya.
Sitotoksisitas Fe secara In Vitro3 O4 Struktur Nano Hibrida NC/PAH/PSS/DOX
Sitotoksisitas in vitro dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX dinilai terhadap sel A549 berdasarkan uji standar methyl thiazolyltetrazolium (MTT). Sel A549 dikultur dalam media pertumbuhan APMI 1640 dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS), streptomisin pada 100 μg/mL, dan penisilin pada 100 μg/mL. Sel-sel dipertahankan pada suhu 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 di udara. Pengujian dilakukan dalam rangkap tiga dengan cara yang sama. Secara singkat, sel A549 diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 8 × 10
3
sel per sumur dalam 100 μL media. Setelah pertumbuhan semalam, sel-sel kemudian diinkubasi pada berbagai konsentrasi DOX bebas, Fe3 O4 NC/PAH/PSS, dan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 μM) selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 h, larutan 10 μL 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (5 mg/mL) kemudian ditambahkan setiap sumur dan sel diinkubasi lebih lanjut selama 4 jam. jam pada 37 °C. Setelah larutan 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide dihilangkan, 150 μL dimethyl sulfoxide (DMSO) ditambahkan ke masing-masing well dan plate dikocok perlahan selama 10 menit agar larut. kristal ungu yang diendapkan. Kerapatan optik (OD) diukur pada 490 nm menggunakan pembaca pelat mikro (Perkin Elmer, Victor X4). Viabilitas sel dievaluasi sebagai persentase dibandingkan dengan sel kontrol.
Karakterisasi
Ukuran dan morfologi Fe3 O4 NP dan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX diperiksa oleh mikroskop elektron transmisi (TEM) FEI Tecnai G2-F20 pada tegangan akselerasi 200 kV. Pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) dilakukan pada ukuran partikel dan penganalisis potensi zeta dari Malvern (Zetasizer Nano ZS90). Spektrum serapan UV-vis diperoleh dengan spektrometer UV-vis Perkin Elmer Lambda-25. Spektrum fluoresensi direkam menggunakan spektrofotometer fluoresensi Hitachi F-4600. Spektroskopi emisi atom plasma berpasangan induktif (ICP-AES) (Agilent 5100) digunakan untuk menganalisis konsentrasi unsur Fe dalam Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX.
Hasil dan Diskusi
Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX disiapkan dengan merakit sendiri oksida besi primer (Fe3 O4 ) NP yang dihasilkan menjadi agregat bulat padat melalui teknik perakitan mikroemulsi seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan modifikasi [17, 47], diikuti dengan metode adsorpsi elektrostatik LBL. Gambar 1 mengilustrasikan ilustrasi skema sintesis Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX. Magnetit berlapis asam oleat hidrofobik Fe3 O4 NP awalnya diproduksi oleh proses dekomposisi termal dalam pelarut organik [46]. Biaya3 O4 NP berbentuk bulat dan berukuran seragam dengan ukuran partikel rata-rata sekitar 15 nm (File tambahan 1:Gambar S1). Untuk perakitan NC magnetik, Fe3 . berlapis OA O4 NP didispersikan dalam sikloheksana dan kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan berair yang mengandung SDBS. Solusi kompleks diperlakukan secara ultrasonik untuk membentuk emulsi minyak dalam air yang stabil. Setelah penguapan pelarut organik dalam emulsi, Fe3 O4 NP dirakit sendiri untuk membentuk nanocluster sferis melalui interaksi hidrofobik. Selanjutnya, Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX disiapkan melalui metode LBL melalui interaksi tarik-menarik elektrostatik, yang secara skematis diilustrasikan pada Gambar 1.
Ilustrasi skema sintesis Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX sebagai agen theranostik untuk MRI dan pengiriman obat
Morfologi dan ukuran Fe3 O4 NC dan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC / PAH / PSS masing-masing diperiksa dengan TEM dan DLS. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2a dan b, Fe3 O4 NC mendemonstrasikan cluster kuasi-bola. Ukuran partikel rata-rata yang diukur dengan DLS adalah sekitar 57 nm (Gbr. 2e). Dalam laporan sebelumnya, PAH dengan muatan positif atau PSS dengan muatan negatif secara bergantian diendapkan pada permukaan template karena sifat elektrostatiknya yang sangat baik [48,49,50,51]. Untuk mempelajari pembentukan setiap lapisan polielektrolit yang diendapkan pada Fe3 O4 NCs, percobaan potensial zeta dilakukan. Variasi potensial zeta dengan lapisan polielektrolit untuk pelapis PSS/PAH dan DOX ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S2. Fe yang murni3 O4 NCs memiliki zeta-potensial negatif 19.7 mV karena adanya SDBS. Penyerapan lapisan tunggal PAH bermuatan positif pada Fe3 O4 NCs membalikkan potensial permukaan dari 19,7 ke + 32 mV. Selanjutnya, pengendapan lapisan PSS bermuatan negatif menyebabkan pembalikan potensial permukaan lain dari + 32 menjadi 34 mV. Ini menunjukkan pertumbuhan lapisan bertahap selama pembuatan struktur nano hibrida NC magnetik. Hasil ini menunjukkan bahwa lapisan PAH dan PSS berhasil dilapisi pada Fe3 O4 NC. Akhirnya DOX berhasil teradsorpsi pada permukaan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX, yang dikonfirmasi oleh potensi zeta positif (+ 1,91 mV) (File tambahan 1:Gambar S2). Gambar TEM dengan perbesaran Fe3 . yang berbeda O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS ditunjukkan pada Gambar 2c dan d. Tidak ada perbedaan struktural dan morfologi yang signifikan yang diamati setelah pelapisan polielektrolit. Dibandingkan dengan Gambar 2a dan b, kontras terang dapat diamati dan ukuran Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS sedikit meningkat karena pelapisan lapisan PAH dan PSS. Struktur nano hibrida magnetik yang disintesis menunjukkan bentuk kuasi-spherical yang hampir mono-terdispersi dengan ukuran rata-rata sekitar 84 nm menurut hasil pengukuran DLS (Gbr. 2f).
Gambar TEM Fe3 O4 NC (a , b ) dan Fe3 O4 NC/PAH/PSS (c , d ) pada perbesaran yang lebih rendah dan lebih tinggi, masing-masing. Distribusi ukuran Fe3 O4 NC (e ) dan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS (f )
Untuk mengevaluasi potensi penerapan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS dalam MRI, tingkat relaksasi transversal proton (1/T2 ) sebagai fungsi konsentrasi ion Fe ditentukan dengan menggunakan spektrometer Bruker AVANCE 500WB pada 11,7 T. Hubungan linier antara laju relaksasi dengan konsentrasi ion Fe diamati, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3b. Selanjutnya, tingkat relaksasi melintang (1/T2 ) meningkat dengan meningkatnya konsentrasi Fe3 O4 NC karena tingkat agregasi Fe3 . yang tinggi O4 inti NP magnetik, menunjukkan bahwa struktur nano hibrida magnetik dapat menjadi T . yang efektif 2 -agen kontras MRI tertimbang (Gbr. 3a). Berdasarkan kemiringan plot pada Gambar 3b, nilai relaksivitas transversal (r2 ) ditentukan menjadi 651,38 mM
−1
S
−1
, yang lebih tinggi dari pekerjaan yang dilaporkan [22]. Dibandingkan dengan iklan T2 media kontras, nanocluster dapat secara signifikan meningkatkan kemampuan kontras Fe setelah NP magnetik dirakit sendiri berdasarkan efek kolektif, sehingga sangat meningkatkan efek angiografi. Dalam karya sebelumnya, nanocrystals magnetit rakitan menunjukkan tingkat magnetisasi saturasi yang lebih tinggi daripada nanocrystals individu karena efek kolektif nanocrystals magnetik [43, 52].
aT2 -gambar MRI tertimbang dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC / PAH / PSS pada konsentrasi berbeda dalam air. b Plot tingkat relaksasi r2dibandingkan Konsentrasi Fe dalam Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS. Nilai relaksivitas r2 diperoleh dari kemiringan linear fitting data eksperimen
Untuk mengevaluasi kapasitas pemuatan obat Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX sebagai pembawa pengiriman obat, obat antikanker yang larut dalam air (DOX) dipilih sebagai obat model. Penyimpanan DOX dalam struktur nano hibrida dengan efisiensi tinggi pertama kali diungkapkan oleh perubahan warna larutan. Warna larutan Fe3 O4 NC/PAH/PSS dan larutan DOX murni masing-masing berwarna kekuningan dan merah (Gbr. 4a dan b). Setelah pembentukan Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hibrida struktur nano, warna larutan menjadi oranye (Gbr. 4c). Karena adanya Fe3 O4 NP, struktur nano DOX-loaded dalam suspensi dapat dipisahkan oleh magnet eksternal, menunjukkan bahwa potensi besar dari struktur nano hibrida yang diperoleh untuk pengiriman obat yang ditargetkan secara magnetis (Gbr. 4d). Spektroskopi serapan UV-vis digunakan untuk menentukan kapasitas penyimpanan DOX yang efektif. Gambar 4e menunjukkan spektrum serapan UV–vis larutan DOX sebelum dan sesudah interaksi dengan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS. Dibandingkan dengan DOX bebas, karakteristik puncak serapan yang serupa diamati pada Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX, yang merupakan puncak serapan rekombinasi Fe3 O4 NC dan DOX. Sampel tanpa DOX hanya menunjukkan puncak serapan Fe3 O4 NC. Data ini menunjukkan bahwa DOX sebagai obat dapat berhasil diserap ke permukaan struktur nano hibrida. Juga ditemukan bahwa ada batas atas konsentrasi adsorpsi DOX yang dimuat pada permukaan struktur nano hibrida. Gambar 4f menunjukkan spektrum PL dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX setelah sentrifugasi ketika konsentrasi DOX yang berbeda ditambahkan ke dalam Fe3 O4 Solusi NC/PAH/PSS. Intensitas pendaran DOX meningkat seiring dengan peningkatan DOX yang ditambahkan hingga mencapai plafon (8 mg/mL) dengan konsentrasi Fe3 O4 NC/PAH/PSS (1,30 × 10
−2
mg/mL) tidak berubah. Selanjutnya jumlah penjeratan berkurang karena kelebihan DOX yang tidak dapat teradsorpsi pada permukaan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX. Intensitas fluoresensi terkuat DOX sesuai dengan konsentrasi pada 8 mg/mL, dan sampel yang sesuai akan digunakan untuk studi lebih lanjut untuk melakukan eksperimen biomedis. Efisiensi pemuatan obat yang terjamin dari struktur nano hibrida sangat penting untuk aplikasi klinis. Efisiensi pembebanan dihitung dengan integral area intensitas fluoresensi DOX menggunakan metode kurva standar DOX [53, 54]. Efisiensi pemuatan dihitung hingga 24,39% untuk Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX. Oleh karena itu, platform theranostik telah dibangun berdasarkan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX karena penyerapan efektif obat antitumor DOX.
Foto (a –d ) dari berbagai tahap penyerapan DOX pada Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS. Spektrum serapan UV–vis (e ) dari DOX, Fe3 O4 NC/PAH/PSS, dan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX. Spektrum luminesensi (f ) dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX ketika konsentrasi DOX yang berbeda ditambahkan ke dalam Fe3 O4 Solusi struktur nano hibrida NC/PAH/PSS
Profil pelepasan obat in vitro dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX di bawah berbagai nilai pH lingkungan ditunjukkan pada Gambar. 5. Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX didialisis melalui membran dialisis dalam buffer fosfat pada 37 °C. DOX yang dilepaskan dari struktur nano hibrida dikumpulkan dan kemudian jumlah pelepasan DOX dihitung dengan intensitas fluoresensi supernatan. Pada pH fisiologis 7.4, pelepasan obat yang diamati adalah proses pelepasan yang lambat. Sekitar 20 wt% DOX dilepaskan pada 5 h awal, dan kemudian memasuki tahap stabil dari rilis lambat. Pada pH 5,0, sekitar 80 wt% DOX dilepaskan dari struktur nano hibrida pada awal 15 h sebelum dataran pelepasan tercapai. Persentase dataran tinggi pelepasan DOX yang diamati selama periode 30 h adalah 80 ± 3 wt% dan 20 ± 3 wt% pada pH 5.0 dan 7.4, masing-masing. Dapat dilihat bahwa Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX telah mengungkapkan profil pelepasan berkelanjutan dan laju pelepasan DOX yang lebih tinggi pada pH 5.0 daripada pada pH 7.4. pH lingkungan yang rendah mempercepat pelepasan DOX dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX. Itu karena protonasi –NH2 kelompok DOX dalam kondisi asam, yang mengurangi interaksi elektrostatik antara polimer DOX dan PSS pada nilai pH rendah [55]. Studi pelepasan obat menunjukkan stabilitas yang baik dari molekul obat yang terikat secara elektrostatik pada pH fisiologis dan pelepasan yang dipicu pada kondisi asam, mirip dengan penelitian yang dilaporkan [56,57,58]. Maka diperoleh Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX adalah sistem yang responsif terhadap pH untuk penghantaran obat DOX dan cocok untuk pengobatan spesifik tumor padat [59].
Plot rilis DOX dari Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX dalam buffer PBS masing-masing pada pH 7.4 dan 5.0
Serapan seluler dan sitotoksisitas merupakan faktor kunci untuk mengevaluasi potensi sistem penghantaran obat baru. Serapan seluler dan sitotoksisitas Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX pada garis sel A549 dipelajari. Serapan antar sel Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC / PAH / PSS / DOX diselidiki menggunakan mikroskop optik dan fluoresensi, yang terutama diwujudkan dengan memantau fluoresensi dari DOX. Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX telah terbukti efektif dalam menghantarkan DOX ke sel kanker. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, fluoresensi merah kuat dari DOX diamati pada sel kanker setelah inkubasi selama 24 jam. Struktur nano hibrida diinternalisasi terutama melalui endositosis [60]. Setelah penyerapan sel, struktur nano hibrida melepaskan DOX dalam lingkungan asam di sekitar endosom/lisosom, di mana pH cukup rendah (4,3) dapat memicu pelepasan DOX yang efektif (pH 5.0, Gbr. 5). Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX menunjukkan serapan bergantung waktu pada sel kanker A549, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Pada 0,5 h pasca inkubasi, fluoresensi merah terlihat di sekitar sel. Hasilnya menunjukkan bahwa struktur nano hibrida yang mengandung DOX sebagian besar berada di sekitar sel A549. Namun, ketika waktu inkubasi meningkat menjadi 24 jam, sinyal fluoresensi antar sel meningkat dari sel A549. Jelas, banyak struktur nano hibrida dapat memasuki sel kanker dari waktu ke waktu. Hasil ini mengkonfirmasi bahwa Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX dapat secara efisien mentransfer DOX ke dalam sel A549. DOX yang dilepaskan dari struktur nano hibrida di sitoplasma melewati membran nukleus dan akhirnya terakumulasi dalam nukleus, membunuh sel dengan menyebabkan perubahan konformasi DNA [61].
Gambar mikroskopis fluoresensi confocal dari sel A549 yang diinkubasi dengan Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX pada 37 °C untuk a 0,5 h dan b 24 jam Bilah skala, 20 μm
Untuk mengevaluasi aktivitas farmakologis Fe3 O4 Struktur nano hibrida NC/PAH/PSS/DOX, sitotoksisitas terhadap sel A549 in vitro ditentukan dengan metode MTT. Gambar 7 menunjukkan aktivitas sel DOX bebas, Fe3 O4 NC/PAH/PSS, dan Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe3 O4 NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe3 O4 NC/PAH/PSS concentration in the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe3 O4 NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe3 O4 NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.
Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe3 O4 NC/PAH/PSS, and Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples
These results indicate that both free DOX and Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe3 O4 NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.
As discussed above, the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe3 O4 konsentrasi. Figure 8 presents the T2 -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe3 O4 concentration in Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T2 -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T2 -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.
T2 -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively
Kesimpulan
The multifunctional Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe3 O4 NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe3 O4 NP. Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. Fe3 O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.
Ketersediaan Data dan Materi
Data sharing is not applicable to this article as no datasets were generated or analyzed during the current study. Please contact the author for data requests.
