Agen Theranostik Berbasis Nanocluster Magnetit untuk MRI Berbobot T2 dan Pengiriman Doksorubicin Responsif pH

Abstrak

Nanostruktur multifungsi yang menggabungkan obat antikanker dengan kristal anorganik muncul sebagai platform kuat untuk diagnosis dan terapi tumor. Dalam studi ini, kami membuat nanocluster (NC) magnetit (Fe₃O₄) dengan menggabungkan mikroemulsi minyak-dalam-air dan pengelompokan lapis-demi-lapis (LBL). NC Fe₃O₄ pertama kali dirakit dari nanopartikel (NP) Fe₃O₄ yang dicap asam oleat. Adsorpsi berurutan dari poli(alilamin hidroklorida) (PAH), poli(sodium 4-stirensulfonat) (PSS), dan doksorubicin hidroklorida (DOX) menghasilkan struktur hibrid Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX. Pengangkut ini menunjukkan peluasan DOX responsif pH, sitotoksisitas yang ditingkatkan terhadap sel karsinoma paru A549, dan kontras MRI T2 yang unggul (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). Emisi fluoresen DOX (λ_ex = 490 nm) memfasilitasi pencitraan seluler. Kami menetapkan platform theranostik berbasis Fe₃O₄ yang kuat yang mengintegrasikan MRI, pencitraan fluoresen, dan pengiriman obat yang terkontrol.

Pendahuluan

Perkembangan terbaru dalam sistem pengiriman obat multifungsi telah memungkinkan imaging dan terapi secara bersamaan, terutama melalui desain responsif stimulan yang mengeksploitasi petunjuk mikroenvironment tumor seperti keasaman (pH ≈ 6,5–6,8). Nanopartikel magnetit (Fe₃O₄) sangat menarik untuk aplikasi biomedis karena superparamagnetisme, biokompatibilitas, dan sitotoksisitas rendah. Namun, NP Fe₃O₄ tunggal sering menderiti responsivitas magnet yang rendah dan muatan obat yang terbatas. Pengumpulan NP Fe₃O₄ menjadi nanocluster (NC) memperkuat efek magnet kolektif, meningkatkan relaksivitas T2 dan memungkinkan muatan obat yang lebih tinggi saat digabungkan dengan multilapis polielektrolit. Meskipun keuntungan ini, sedikit studi yang melaporkan NC Fe₃O₄ yang difungsionalkan dengan PAH/PSS untuk peluasan obat yang dipicu pH.

Di sini, kami melaporkan rute pembuatan yang terukur untuk struktur hibrid Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, menggabungkan mikroemulsi self-assembly dan adsorpsi elektrostatis LBL. Pengangkut yang dihasilkan memberikan DOX dengan peluasan yang terkontrol dan bergantung pada pH, menunjukkan kontras MRI T2 yang kuat, dan secara efisien membunuh sel A549 in vitro.

Bahan dan Metode

Bahan

FeCl₃·6H₂O (99,99 %), FeCl₂·4H₂O (99,99 %), asam oleat (OA, 90 %), 1-oktadesena (ODE, 90 %), sodium oleat (NaOA), etanol, heksana, sikloheksana, isopropanol, sodium dodeksil benzen sulfonat (SDBS), fluorida amonium (NH₄F), NaOH, DMSO, dan ammonia dibeli dari Alfa Aesar dan Sinopharm. PAH (MW 15 kDa), PSS (MW 70 kDa), dan doksorubicin hidroklorida (DOX, > 98 %) diperoleh dari Sigma-Aldrich dan Shanghai Sangon Biotech. Medium APMI 1640 dan serum sapi fetal (FBS) diperoleh dari Hyclone. Semua reagen digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

Persiapan Oleat Besi (III)

FeCl₃·6H₂O (2,59 g), NaOA (14,6 g), etanol (32 mL), H₂O (24 mL), dan heksana (56 mL) dicampur dalam kolong 150 mL dan direfluks pada 70 °C selama 4 jam untuk membentuk larutan oleat besi (III) transparan. Lapisan minyak dipisahkan, heksana dihilangkan dengan evaporasi rotary pada 70 °C, dan sisa disimpan di bawah vakum.

Sintesis NP Fe₃O₄

Oleat besi (III) (7,2 g), OA (1,28 mL), dan ODE (50 mL) dipanaskan ke 300 °C selama 40 min di bawah Ar; larutan kemudian didinginkan dan dioksidasi di udara selama >12 jam. Nanokristal terendam dengan isopropanol, dicuci dua kali dengan etanol–air (1:1 v/v), dan disperdi dalam 200 mL sikloheksana.

Persiapan NC Fe₃O₄

200 µL NP Fe₃O₄ dalam sikloheksana ditambahkan ke 4 mL SDBS air (14 mg). Perlakuan ultrasonik (5 min × 4) membentuk emulsi padat-dalam-minyak-dalam-air. Pengadukan pada suhu ruang selama 6 jam menguapkan sikloheksana, memungkinkan self-assembly menjadi NC quasi-sferis. Produk dicuci tiga kali dengan air deionisasi.

Persiapan Struktur Hibrid NC Fe₃O₄/PAH/PSS/DOX

NC Fe₃O₄ (3 mL) pertama kali dilapisi PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) dengan penambahan tetesan dan pengadukan selama 24 jam; PAH berlebih dihilangkan dengan sentrifugasi. NC yang dilapisi PAH kemudian dilapisi PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) dalam kondisi yang sama, diikuti dengan sentrifugasi. DOX (5 mg/mL) ditambahkan (60 µL) ke larutan NC Fe₃O₄/PAH/PSS (3 mL) dan diaduk selama 24 jam dalam kegelapan. Struktur hibrid NC Fe₃O₄/PAH/PSS/DOX akhir diisolasi dengan sentrifugasi.

Pengukuran MRI

Struktur hibrid disperdi dalam 1,2 mL agarose (1% w/v) dengan konsentrasi Fe dari 0 hingga 0,065 mM. Pencitraan dilakukan pada sistem micro-MRI Bruker 11,7 T (TR = 300 ms, TE = 4,5 ms, matriks 128 × 128, iris 1,2 mm, FOV 2,0 × 2,0 cm, 2 rata-rata).

Pengambilan Sel dan Pencitraan MR

Sel A549 diinkubasi dengan struktur hibrid (Fe = 0–13,5 µM) selama 2 jam, dicuci, dan dicitrakan dengan MRI T2-berbobot.

Kurva Standar DOX

Fluoresensi DOX (λ_ex = 490 nm) diukur untuk konsentrasi 0–0,03 mg/mL. Regresi linier menghasilkan Y = 447,44 + 69.745 X (R² = 0,9992).

Pemuatan dan Peluasan DOX

Efisiensi pemuatan dihitung dari perbedaan antara massa DOX awal (W₀) dan massa dalam natrium (W_s) setelah sentrifugasi. Peluasan kumulatif dimonitor dalam PBS (pH 5,0 atau 7,4) pada 37 °C menggunakan kantong dialisis, pengambilan 100 µL setiap 1–3 jam.

Sitotoksisitas In Vitro

Sel A549 ditanam dalam plate 96-lubang (8 × 10³ sel/lubang) dan diobati dengan DOX bebas, NC Fe₃O₄/PAH/PSS, atau NC Fe₃O₄/PAH/PSS/DOX (0,1–2,0 µM ekivalen DOX). Setelah 24 jam, MTT (5 mg/mL) ditambahkan, diinkubasi 4 jam, dan serapan diukur pada 490 nm.

Karakterisasi

Mikroskopi elektron transmisi (TEM, 200 kV) menilai morfologi; pencaharan cahaya dinamis (DLS) mengukur ukuran hidrodinamis dan potensial zeta; spektroskopi UV–vis menentukan pemuatan DOX; spektroskopi fluoresensi memantau peluasan DOX; ICP-AES mengukur kandungan Fe.

Hasil dan Pembahasan

Morfologi dan Ukuran Nanostruktur

Citra TEM mengungkapkan bahwa NC Fe₃O₄ adalah agregat quasi-sferis (~57 nm, DLS) yang dibentuk oleh self-assembly dari NP Fe₃O₄ primer 15 nm. Penyetoran lapisan (PAH, PSS, DOX) dikonfirmasi oleh pergeseran potensial zeta: −19,7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), −34 mV (NC/PAH/PSS), +1,9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). Struktur hibrid akhir menunjukkan ukuran monodisperse ~84 nm (DLS).

Kontras MRI T2 yang Ditingkatkan

Relaksivitas lintas (r₂) adalah 651,38 mM⁻¹s⁻¹, melebihi banyak agen komersial. Linear 1/T₂ versus konsentrasi Fe mengonfirmasi kontras T2 yang efisien.

Pemuatan dan Peluasan DOX Responsif pH

Spektra UV–vis dan fluoresensi mengonfirmasi adsorpsi DOX. Efisiensi pemuatan mencapai 24,4%. Dalam PBS (pH 7,4) hanya ~20 wt% DOX yang terlepas selama 30 jam, sedangkan pada pH 5,0 ~80 wt% terlepas dalam 15 jam, yang menunjukkan responsivitas pH yang kuat yang dipicu oleh protonasi DOX dan pengurangan ikatan elektrostatis.

Pengambilan Sel dan Sitotoksisitas

Mikroskopi konfokal menunjukkan internalisasi yang bergantung pada waktu dari hibrid termuat DOX, dengan fluoresensi merah kuat setelah 24 jam. Uji MTT mengungkapkan sitotoksisitas yang tidak signifikan dari NC Fe₃O₄/PAH/PSS sendirian (viabilitas sel > 85% pada 2 µM). DOX bebas dan hibrid termuat DOX menunjukkan pembunuhan A549 sel yang bergantung pada dosis (IC₅₀ ≈ 1–2 µM). Sitotoksisitas yang ditingkatkan dari hibrid disebabkan oleh peluasan DOX yang berkelanjutan dan dipicu pH endosom.

Pencitraan MRI Selular

Hibrid NC Fe₃O₄/PAH/PSS/DOX yang diinternalisasi ke dalam sel A549 menghasilkan penurunan sinyal T2 yang signifikan, mengonfirmasi kegunaannya sebagai agen kontras MRI selular.

Kesimpulan

Kami telah merakit struktur hibrid NC Fe₃O₄/PAH/PSS/DOX yang menggabungkan kontras MRI T2 yang tinggi, peluasan DOX responsif pH, dan aktivitas antitumor yang kuat in vitro. Desain modularnya memungkinkan fungsionalisasi lebih lanjut (misalnya, ligan targeting) untuk aplikasi in vivo, yang memosisikannya sebagai platform theranostik serbaguna untuk pencitraan dan terapi kanker.