Pengiriman siRNA berbasis misel kationik untuk terapi gen kanker usus besar yang efisien
Abstrak
Terapi gen berbasis RNA kecil (siRNA) telah memberikan strategi alternatif untuk terapi kanker. Salah satu komponen kunci dalam proses terapi gen adalah sistem pengiriman. Sebagai vektor gen non-virus baru, DMP, yang dibuat dengan memodifikasi misel mPEG-PCL dengan lipid DOTAP kationik, telah disiapkan dan berhasil diterapkan dalam studi terapi gen kanker usus besar berbasis DNA plasmid. Namun, potensinya dalam pengiriman siRNA tidak diketahui. Dalam penelitian ini, proses preparasi DMP dioptimalkan dan efikasi antikanker dari kompleks DMP/siMcl1 dan DMP/siBcl-xl dipelajari pada model kanker usus besar tikus. Hasil kami menunjukkan bahwa siRNA yang dikirimkan misel kationik DMP dapat secara efektif menghambat pertumbuhan sel kanker usus besar C26 secara in vitro. Sementara itu, pemberian kompleks DMP/siMcl1 dan DMP/siBcl-xl secara intratumoral jelas menekan model tumor subkutan in vivo. Hasil ini menunjukkan bahwa kompleks DMP/siRNA menjadi kandidat potensial untuk terapi gen kanker.
Pengantar
Kanker merupakan masalah kesehatan masyarakat global yang utama. Kanker usus besar adalah tumor ganas yang umum, menyerang lebih dari satu juta orang di seluruh dunia setiap tahun [1]. Terapi gen telah diterapkan sebagai metode untuk mengobati tumor padat dan tumor darah [2, 3]. Kunci terapi gen kanker tergantung pada sistem pengiriman gen yang aman dan efektif [4, 5]. Vektor non-virus, termasuk lipid kationik, nanoemulsi lipid, nanopartikel lipid padat, dan vektor berbasis polimer telah mendapatkan lebih banyak perhatian daripada vektor virus karena keuntungan potensialnya dalam pengiriman gen:mudah disiapkan, menyebabkan respons imun yang lebih sedikit, memiliki toksisitas yang lebih rendah, dan biokompatibilitas yang lebih baik [6, 7]. Nanoteknologi menyediakan sarana baru untuk studi vektor non-virus dengan keuntungan termasuk biokompatibilitas, biodegradabilitas, keamanan dan kemampuan penargetan, dan sebagainya [2, 8]. Di dalamnya, sejumlah besar pembawa nanopartikel yang memiliki muatan positif tinggi dapat bergabung dengan obat asam nukleat anionik melalui efek muatan listrik, menunjukkan prospek aplikasi yang luas dan cerah dalam terapi gen [9, 10].
Sebagai jenis kopolimer polimer, memiliki biodegradabilitas dan biokompatibilitas, kopolimer PEG/PCL menunjukkan aplikasi yang menjanjikan dalam sistem penghantaran obat [11,12,13]. Berdasarkan misel MPEG-PCL, kami menggunakan DOTAP amfifilik untuk memodifikasi kopolimer MPEG-PCL dalam satu langkah, menciptakan DOTAP rakitan kationik dan misel hibrida MPEG-PCL (DMP) [14,15,16,17]. Misel ini menunjukkan prospek yang menjanjikan dalam pengiriman obat kimia dan obat gen dengan stabilitas dan keamanan yang sangat baik. Misalnya, DMP telah digunakan untuk memberikan gen bunuh diri survivinT34A dan kurkumin untuk terapi kanker usus besar [14, 18]. Namun, penelitian sebelumnya terbatas pada transmisi DNA plasmid, dan tidak ada laporan mengenai pengiriman misel DMP untuk bentuk lain dari terapi gen, yang membatasi penerapan misel DMP dalam terapi gen.
Interferensi genetik berdasarkan siRNA juga merupakan bagian penting dari terapi gen selain gen terapeutik DNA plasmid. Sebagai anggota penting obat gen, siRNA adalah molekul kecil RNA untai ganda. obat anti kanker siRNA menggunakan mekanisme RNAi endogen untuk membungkam ekspresi onkogen Karena keuntungan yang signifikan seperti peningkatan stabilitas dan kemanjuran pembungkaman, siRNA memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi aplikasi terapi kanker [19]. Dibandingkan dengan berat molekul besar DNA plasmid, siRNA memiliki efisiensi transfeksi yang lebih tinggi, yang sangat cocok untuk titik penargetan gen spesifik dalam terapi gen. Jadi, ini mungkin pilihan yang baik untuk terapi gen. Saat ini, beberapa obat pengobatan siRNA berbasis vektor non-virus telah diuji dalam uji klinis, seperti CALAA-01 berbasis nanopartikel polipolimer kation siklodekstrin dan ALN-TTR02 berbasis lipid [2]. Namun, terapi gen berdasarkan siRNA masih diperlukan untuk mengembangkan titik penargetan siRNA baru dan mencari pembawa pengiriman siRNA yang aman, efektif, dan spesifik tinggi.
Dalam penelitian ini, kami mencoba menggunakan misel DMP untuk mengirimkan siRNA untuk mempelajari efisiensi dan keamanan misel DMP untuk mengirimkan siRNA. Kami menggunakan Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA sebagai target terapeutik, mencari efek antitumornya untuk mengobati kanker usus besar secara in vitro dan in vivo. Gen Bcl-xl dan gen Mcl1 adalah anggota keluarga Bcl-2 dari gen anti-apoptosis, dan mereka memainkan peran penting dalam menghambat apoptosis [20, 21]. Kami menduga bahwa misel DMP sintetis dapat secara efektif dan aman mengirimkan Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA. Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA dapat menghambat ekspresi gen Bcl-xl dan gen Mcl1, menginduksi apoptosis sel C26 dan kemudian mencapai efek terapeutik dengan menghambat pertumbuhan sel C26.
Bahan dan metode
Materi
N-[1-(2,3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl sulfate (DOTAP) dibeli dari Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Kopolimer diblok MPEG-PCL dengan berat molekul yang dirancang 4000 telah disintesis menurut laporan kami sebelumnya [22]. Mn kopolimer MPEG-PCL adalah 4050. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) dan 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) diperoleh dari Sigma-Aldrich (USA ) dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Diklorometana dan pelarut organik lainnya dibeli dari ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, P. R. China). Sel C26 (murine colon adenocarcinoma) dan sel 293 T (HEK 293 T/17) dibeli dari American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Sel dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% serum janin betis, diinkubasi pada 37 °C dengan 5% CO2 -atmosfer udara yang lembab.
Persiapan misel DMP
Untuk memilih proses preparasi DMP yang lebih baik, misel DMP disiapkan dalam tiga pelarut organik, masing-masing pelarut dengan tiga dosis DOTP yang berbeda. Mengenai pelarut, diklorometana, kloroform, dan etil asetat dipilih untuk dipelajari, dan dosis DOTP termasuk 5 mg, 10 mg, dan 20mg. DOTAP dan MPEG-PCL dilarutkan bersama dalam pelarut organik dan kemudian diuapkan dengan pompa vakum untuk membentuk film kering. Film kering kemudian direhidrasi dalam air suling. Akhirnya, misel DMP yang telah disiapkan disimpan pada suhu 4 °C.
Karakterisasi misel DMP
Ukuran partikel dan potensi zeta misel DMP ditentukan oleh Zeta sizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) dan disimpan pada suhu 25 °C selama proses pengukuran. Semua hasil adalah rata-rata dari tiga putaran. Stabilitas misel DMP dievaluasi secara kualitatif. Agregat misel DMP diperiksa dengan mata telanjang. Kehadiran presipitasi menunjukkan ketidakstabilan misel DMP, sementara solusi transparan yang seragam menunjukkan stabilitas.
Perlambatan gel
DMP-delivered Scramble siRNA (DMP/Scramble siRNA) dicampur dengan buffer pemuatan 2 μL, dimasukkan ke dalam gel agarosa 1%, dan dipisahkan dengan elektroforesis pada 140 V selama 10 min. 0,2 μg Scramble siRNA digabungkan dengan 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 μg misel DMP. Gel diwarnai dengan penampil emas, dan pita yang sesuai dengan Scramble siRNA divisualisasikan di bawah sinar UV.
Sitotoksisitas misel DMP
Sitotoksisitas misel DMP pada sel 293 T dan sel C26 dievaluasi dengan metode MTT. Secara singkat, sel 293T dan sel C26 dilapisi dengan kepadatan 1,2 × 10
3
sel per sumur dalam 100 μL media DMEM yang mengandung 10% FBS (serum janin sapi) di piring 96-sumur dan ditumbuhkan selama 24 h. Sel kemudian terkena serangkaian misel DMP atau PEI25K pada konsentrasi yang berbeda selama 72 jam. Kelangsungan hidup sel diukur dengan menggunakan uji MTT. Hasil adalah rata-rata dari enam uji coba.
Transfeksi in vitro
Dua puluh empat jam sebelum transfeksi, sel C26 diunggulkan ke dalam pelat 24-sumur dengan kepadatan 5 × 10
4
sel per sumur dalam media DMEM 0,5 mL yang mengandung 10% FBS (serum sapi janin). Pada saat transfeksi, media di setiap sumur diganti dengan media 0,5 mL yang mengandung 0%, 10%, 20%, dan 30% FBS, dan DMP-delivered FAM (Carboxyfluorescein) siRNA (DMP/FAM siRNA) dan PEI- mengirim FAM siRNA (PEI/FAM siRNA) yang mengandung 1 μg siRNA dalam medium bebas serum dipipet ke setiap sumur, dan rasio massa siRNA DMP/FAM dan PEI25K/FAM siRNA adalah 30:1 dan 2:1. Dua puluh empat jam kemudian, sel yang ditransfer diamati di bawah mikroskop dan aktivitas luciferase diukur dengan flow cytometry (Epics Elite ESP, USA)
In vivo pembungkaman gen
mouse penargetan siRNA Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble siRNA, dan siRNA kontrol negatif berlabel FAM dibeli dari GenePharma Co., Ltd (Shanghai, P. R. China) dalam bentuk tanpa perlindungan, tanpa garam, dan dalam bentuk anil.
Untuk menentukan tingkat Bcl-xl mRNA, RNA total diekstraksi dari sel C26 menggunakan TRIzol™ Reagent (Thermo Fisher Scientific, USA), dan cDNA individu disintesis dengan uji transkriptase balik SuperScript II (Invitrogen). PCR kuantitatif real-time dilakukan dengan SYBR GreenER kuantitatif PCR SuperMix Universal kit (Invitrogen). Primer PCR disintesis oleh TSINGKE Biological Technology (Chengdu, P. R. China).
Studi anti-proliferasi
Kemampuan anti-proliferasi sel DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 hingga C26 dievaluasi dengan metode MTT. Secara singkat, sel C26 dilapisi dengan kepadatan 1,2 × 10
3
sel per sumur dalam 100 μL DMEM yang mengandung 10% FBS dalam pelat 96-sumur dan ditumbuhkan selama 24 jam. Sel kemudian terkena serangkaian DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 pada konsentrasi yang berbeda selama 72 h. Viabilitas sel diukur dengan menggunakan metode MTT. Hasil adalah rata-rata dari enam uji coba.
Studi pembentukan klon
Sel C26 diunggulkan ke dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 10
3
sel per sumur dalam media DMEM 2 mL yang mengandung 10% FBS. Dua puluh empat jam kemudian, sel-sel kemudian diekspos ke serangkaian misel DMP atau DMP/Scramble siRNA dan DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 pada konsentrasi yang berbeda. Ketika sel tumbuh menjadi tiruan yang terlihat dengan mata telanjang, kultur dihentikan dan diikuti dengan pembilasan, fiksasi, dan pewarnaan. Jumlah klon dihitung secara langsung, dan tingkat penghambatan dihitung.
In vitro studi apoptosis
Apoptosis seluler diamati melalui Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) dan pewarnaan propidium iodida. Secara singkat, sel C26 diunggulkan ke dalam pelat enam sumur dan diekspos ke serangkaian misel DMP, DMP/Scramble siRNA, DMP/siBcl-xl, dan DMP/siMcl1 selama 72 jam. Sel kemudian menjadi sasaran pewarnaan Annexin V-FITC dan propidium iodida.
Studi Xenograft Tumor di Vivo
Tikus BALB/c berumur 6–8 minggu diinokulasi dengan 5 × 10
6
Sel C26 di sisi kanan. Kompleks DMP/siRNA yang setara dengan 10 μg siRNA disuntikkan secara intratumor setiap hari selama 5 perawatan karena volume tumor mencapai 100 mm
3
. Tikus yang menerima salin normal atau DMP dalam jumlah yang setara dianggap sebagai kelompok kontrol. Ukuran tumor diukur dan berat hewan dipantau setiap 2 hari sampai semua hewan dikorbankan. Volume tumor dihitung sebagai (1/2 × panjang × lebar [2]).
Analisis histologis
Jaringan yang dipotong difiksasi dalam larutan formalin buffer netral 4% selama lebih dari 24 jam dan tertanam dalam parafin. Bagian jaringan (3–5 μm) diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Analisis ini dilakukan mengikuti protokol pabrikan, dan sampel diperiksa dengan mikroskop fluoresensi (× 400).
Kit TUNEL yang tersedia secara komersial (Promega, Madison, WI) digunakan untuk menganalisis efek apoptosis pada jaringan tumor xenograft melanoma tikus C26. Analisis ini dilakukan dengan mengikuti protokol pabrikan.
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD. Analisis statistik dilakukan dengan one-way analysis of variance (ANOVA) menggunakan software SPSS. Untuk semua hasil, P 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Studi proses persiapan
Untuk mendapatkan efisiensi transfeksi yang efektif dan sitotoksisitas yang rendah untuk pengiriman siRNA, kami mempelajari proses persiapan yang berbeda untuk misel DMP seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Dalam penelitian kami, mengenai pelarut, misel DMP yang dibuat oleh Etil asetat sangat tidak stabil, dan waktu stabil misel DMP tidak lebih dari 10 min. Dan misel DMP yang dibuat oleh diklorometana dan kloroform keduanya memiliki stabilitas yang sangat baik, dan mereka dapat tetap stabil selama 96 jam, kecuali DMP yang dibuat oleh kloroform dengan dosis DOTAP 20 mg. Lebih penting lagi, mereka juga memiliki ukuran, potensi zeta, dan PDI yang tepat. Namun, dengan membandingkan efisiensi transfeksi awal, efisiensi transfeksi misel DMP yang dibuat dengan diklorometana lebih tinggi daripada misel DMP yang dibuat dengan kloroform. Jadi kami memilih diklorometana untuk menyiapkan misel DMP.
Misel DMP yang dibuat dengan tiga dosis DOTAP tidak memiliki perbedaan nyata dalam ukuran, potensi zeta, dan PDI, tetapi misel DMP yang dibuat dengan dosis DOTAP 20 mg memiliki efisiensi transfeksi tertinggi dalam tiga dosis DOTAP. Melalui perbandingan di atas, kami memilih proses preparasi berdasarkan DOTAP dan MPEG-PCL (Gbr. 1a) untuk menyiapkan misel DMP dengan stabilitas yang sangat baik dan efisiensi transfeksi yang tinggi. Skema persiapan misel DMP disajikan pada Gambar. 1b.
a Struktur molekul DOTAP dan MPEG-PCL. b Skema persiapan misel DMP. c Spektrum distribusi ukuran misel DMP. d zeta spektrum potensial misel DMP. e uji perlambatan siRNA. f Sitotoksisitas misel DMP pada sel 293T. g sitotoksisitas misel DMP pada sel C26
Karakterisasi misel DMP
Seperti yang disajikan pada Gambar. 1c, spektrum distribusi ukuran partikel menunjukkan bahwa misel DMP berukuran nano (PDI =0,315) dengan ukuran partikel rata-rata 144,8 nm, menunjukkan bahwa ia memiliki distribusi ukuran partikel yang sangat sempit. Spektrum potensi zeta DMP disajikan pada Gambar. 1d dengan potensi zeta 46,4 mV. Stabilitas misel DMP dievaluasi secara kualitatif.
Untuk mengevaluasi kemampuan pengikatan DMP dengan siRNA, uji retardasi gel dilakukan, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 1e. Ketika rasio massa DMP ke siRNA adalah 30, keterbelakangan lengkap dari Scramble siRNA tercapai. SiRNA Perebutan anionik diserap pada permukaan DMP karena interaksi elektrostatik, membentuk kompleks DMP/siRNA.
Sitotoksisitas misel DMP pada sel C26 dan sel 293T dievaluasi dengan metode MTT. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1f dan g, PEI25K menunjukkan toksisitas tinggi pada sel 293T, dengan IC50 0,83 μg/mL. Namun, misel DMP jauh lebih tidak beracun, dan IC50 DMP adalah 3,7 μg/mL. IC50 misel DMP adalah 0,497 mg/mL pada sel C26. Namun, PEI25K menunjukkan toksisitas yang luar biasa, dengan IC50 <0,1 μg. Dengan demikian, misel DMP memiliki sitotoksisitas yang lebih rendah daripada PEI25K dan dapat digunakan untuk mengirimkan siRNA ke sel C26 dengan aman.
In vitro transfeksi
Selanjutnya untuk karakterisasi biofisik, kami membandingkan efisiensi transfeksi misel DMP dengan PEI25K (agen transfeksi (“standar emas”) in vitro . Seperti terlihat pada Gambar 2, pada medium yang mengandung transfeksi FBS 0%, 10%, 20%, dan 30%, misel DMP memiliki efisiensi transfeksi sebesar 85,47 ± 1,01%, 81,57 ± 2,04%, 75,29 ± 1,20 %, dan 71,64 ± 1,59%, dan PEI memiliki efikasi transfeksi sebesar 86,38 ± 2,92%. Ada sedikit perbedaan dalam efisiensi transfeksi antara kelompok serum dan kelompok non-serum. Dan efisiensi transfeksi kelompok serum dan kelompok non-serum serupa dengan efisiensi transfeksi PEI. Selain itu, gambar pada Gambar 2a menyajikan pengamatan langsung dari kemampuan transfeksi misel DMP dengan gen reporter berbasis FAM. Dari gambar, morfologi ruang bawah tanah kelompok PEI telah berubah dibandingkan dengan kelompok DMP, yang membuktikan PEI memiliki sitotoksisitas tinggi sedangkan misel DMP memiliki sitotoksisitas rendah.
Efisiensi transfeksi misel DMP. a Gambar sel C26 yang ditransfusikan (b , c ) efisiensi transfeksi misel DMP dalam medium yang mengandung 0%, 10%, 20%, dan 30% FBS dan PEI25K, dihitung dengan flow cytometry
Aktivitas antikanker in vitro
Dalam proses terapi gen, siRNA memainkan peran penting. Oleh karena itu, kami merancang siRNA penargetan Bcl-xl dan siRNA penargetan Mcl1 untuk mempelajari aktivitas antikankernya. Untuk mengevaluasi kemampuan interferensi Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA, kami mengkonfirmasi kemampuan interferensi Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA dengan qPCR. Menurut hasil kami (Gbr. 3), tingkat mRNA kelompok DMP/siMcl1 lebih rendah daripada kelompok kontrol, (Gbr. 3a). Dan tingkat mRNA kelompok DMP/siBcl-xl lebih rendah daripada kelompok kontrol, (Gbr. 3b). Telah dibuktikan dengan baik bahwa DMP/siBcl-xl dan DMP/siMCL1 secara efisien mengurangi tingkat mRNA yang relevan.
a tingkat mRNA Bcl-xl jelas berkurang oleh DMP/siMcl1. b tingkat mRNA Mcl1 jelas dikurangi oleh DMP/siBcl-xl. c Gambar pembentukan klon setelah perlakuan dengan DMP/siBcl-xl atau DMP/siMcl1 pada konsentrasi yang berbeda. d Jumlah klon setelah perlakuan dengan DMP/siBcl-xl konsentrasi siRNA berbeda. e Kemampuan antikanker DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 dengan konsentrasi siRNA 50-nM dan 100-nM pada sel C26 secara in vitro. f Laju penghambatan pembentukan klon setelah perlakuan dengan DMP/siMcl1 konsentrasi siMcl1 yang berbeda. g laju penghambatan pembentukan klon setelah perlakuan dengan DMP/siBcl-xl konsentrasi siBcl-xl yang berbeda
Selain itu, misel DMP digunakan untuk mengirimkan siRNA ke dalam sel C26 untuk mempelajari bahwa DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 dapat menghambat pertumbuhan sel C26. Viabilitas sel C26 ditentukan dengan metode MTT. Hasil penelitian menunjukkan tingkat kelangsungan hidup sel DMP/siBcl-xl (50 nM dan 100 nM) adalah 69,6%±3,3% dan 56,3%±1,9%, dan tingkat kelangsungan hidup sel DMP/siMcl1 (50 nM dan 100 nM) adalah 82,8 %±3,1% dan 56,3%±3,2% (Gbr. 3e).
Untuk mempelajari lebih lanjut aktivitas antikanker DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1, dilakukan uji pembentukan klon. Jelas ditunjukkan bahwa pada Gambar. 3c dan d, dibandingkan dengan kelompok kontrol, jumlah klon dalam DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 (50 nM dan 100 nM) lebih sedikit. Hasil ini menunjukkan bahwa DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 memiliki efek anti-proliferasi yang jelas pada sel C26. Dengan demikian, menggabungkan hasil uji MTT, hasilnya menunjukkan bahwa DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 dapat menghambat proliferasi sel C26 dan memiliki aktivitas antikanker yang menonjol pada sel C26.
Untuk menentukan apakah hilangnya kapasitas proliferasi dan viabilitas sel misel DMP yang diinduksi DMP/siBcl-xl- dan DMP/siMcl1 terkait dengan induksi apoptosis, jumlah sel apoptosis dinilai dengan flow cytometry. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3f, tingkat apoptosis kelompok DMP/siMcl1 adalah 37,9% ± 4,7%, yang lebih tinggi dari kelompok kontrol dan kelompok DMP dan kelompok siRNA DMP/Scramble. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3g, tingkat apoptosis kelompok DMP/siBcl-xl adalah 33,0% ± 3,8%, yang juga lebih tinggi daripada kelompok kontrol lainnya. Data apoptosis ini menunjukkan bahwa DMP/ siMcl1 dan DMP/ siBcl-xl memiliki kemampuan menginduksi apoptosis yang kuat. Hasil uji apoptosis konsisten dengan hasil MTT, dan hasil pembentukan klon dijelaskan sebelumnya, menunjukkan bahwa menginduksi apoptosis adalah mekanisme yang mungkin untuk menghambat proliferasi dan viabilitas sel C26.
Kompleks DMP/siRNA menghambat pertumbuhan tumor C26 in vivo
Model hewan xenograft C26 juga digunakan untuk menguji kemanjuran antitumor kompleks DMP/siRNA in vivo. Kurva pertumbuhan tumor dan gambar tumor xenograft C26 dari masing-masing kelompok disajikan pada Gambar. 4a dan b. Menurut hasil kami, injeksi intratumoral DMP/siMcl1 dan DMP/siBcl-xl menghasilkan penghambatan signifikan pertumbuhan tumor xenograft dibandingkan dengan kelompok kontrol. Bobot tumor pada masing-masing kelompok disajikan pada Gambar 4b. Dibandingkan dengan kelompok perlakuan NS (0,85 ± 0,09 g) dan kelompok DMP (0,76 ± 0,11 g), kompleks DMP/siMcl1 menyebabkan penurunan berat tumor yang signifikan secara statistik (0,34 ± 0,06 g, P <0,01), dan sementara itu, kompleks DMP/siBcl-xl menyebabkan penurunan berat tumor yang signifikan secara statistik (0,42 ± 0,08 g, P <0,01). Hasil ini menunjukkan bahwa injeksi intratumoral kompleks DMP/siRNA dapat secara efisien menghambat pertumbuhan xenograft subkutan model kanker usus besar C26. Efek samping in vivo kompleks DMP/siRNA pada organ lain diperiksa melalui analisis HE. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 4, tidak ada perubahan patologis yang signifikan pada jantung, hati, limpa, paru-paru, atau ginjal yang diamati.
Efek antikanker dan keamanan DMP/siRNA pada model xenograft tikus C26. a Kurva perkembangan tumor, dihitung berdasarkan volume tumor. b Rata-rata berat tumor pada setiap kelompok. Dibandingkan dengan kelompok perlakuan lain, kelompok DMP/siMcl1 dan kelompok DMP/siBcl-xl mencapai penurunan berat tumor yang signifikan secara statistik (***P , 0,001). c Gambar representatif tumor karsinoma usus besar C26. d Apoptosis dalam jaringan tumor terdeteksi oleh uji TUNEL. e Analisis HE organ utama dari masing-masing kelompok perlakuan pada kedua model. Tidak ada perubahan patologis signifikan yang diamati pada jantung, hati, limpa, paru-paru, atau ginjal
Diskusi
Dalam penelitian ini, misel hibrida DOTAP dan MPEG-PCL rakitan kationik disiapkan untuk memberikan Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA untuk mengobati kanker usus besar C26. Misel DMP ini memiliki stabilitas yang sangat baik dan mampu secara efektif menggabungkan dan mengirimkan Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA ke sel C26. Lebih penting lagi, misel DMP memberikan siRNA (Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA) yang belum pernah terjadi sebelumnya dan dapat secara efektif menginduksi apoptosis sel C26, menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel C26 baik in vitro maupun in vivo dengan keamanan tinggi. Secara kolektif, penelitian kami menunjukkan bahwa DMP adalah pembawa pengiriman gen potensial untuk siRNA.
Ada laporan bahwa DOTP lipid kationik telah diterapkan secara luas untuk pengiriman siRNA, tetapi menghasilkan muatan positif yang kuat yang memicu hemolisis dan memiliki sitotoksisitas yang tinggi. Berdasarkan liposom kationik DOTAP dengan efisiensi transfeksi tinggi, tetapi muatan positifnya akan menghasilkan toksisitas, alasannya mungkin karena kepala garam amonium kuaterner DMP dengan muatan positif terpapar pada permukaan lapisan ganda fosfolipid liposom. Namun, misel DMP berbasis lipid DOTP memiliki transfeksi tinggi dan sitotoksisitas rendah. Kami berspekulasi bahwa dalam proses rakitan sendiri misel, DOTAP tertanam di dalam nanopartikel polimer, di mana kepala garam amonium kuaterner tidak sepenuhnya terpapar di permukaan. Jadi, muatan positif parsial tertutup; sementara itu, hasil kami juga menunjukkan bahwa efisiensi transfeksi misel DMP tidak rendah dibandingkan dengan efisiensi transfeksi PEI25K. Dinyatakan bahwa muatan positif DOTAP setelah ditutup sebagian masih terekspos, menunjukkan potensi yang tepat, dan tingkat potensi ini terbukti cukup untuk menggabungkan dan mentransmisikan siRNA. Lebih lanjut, hasil kami menunjukkan bahwa misel DMP berdasarkan MPEG-PCL adalah pembawa pengiriman gen yang efektif dan aman, yang telah dioptimalkan untuk sitotoksisitas DOTAP dan mempertahankan kapasitas transmisi gen DOTAP. Dan penelitian serupa telah melaporkan bahwa sitotoksisitas DOTAP berkurang setelah dikombinasikan dengan bahan lain [23]. Baru-baru ini sebuah vektor baru yang terdiri dari DOTAP dan SWNT memiliki sitotoksisitas yang lebih rendah dalam pengiriman siRNA dibandingkan dengan lipofectamine [8]. LPN yang dibuat misel DOTAP-PLGA dengan menggunakan metode evaporasi pelarut emulsi ganda (DESE) menghasilkan pembawa berukuran nano [24,25,26]. Studi-studi ini sangat sesuai dengan yang dijelaskan dalam penelitian kami dan membuat dugaan kami lebih meyakinkan sampai batas tertentu.
Efisiensi pengiriman vektor transfer gen sangat dipengaruhi oleh serum. Protein serum dalam serum dapat menetralkan muatan positif pada permukaan kompleks nanocarrier/siRNA, yang dipengaruhi oleh efek elektrostatik pada permukaan sel dengan muatan negatif [27,28,29].
Dalam penelitian kami, ketika kami mempelajari efisiensi transfeksi misel DMP, kami menyiapkan serangkaian media DMEM yang mengandung 0%, 10%, 20%, dan 30% FBS untuk transfeksi, menyelidiki efek serum pada efisiensi transfeksi dari beban nanopartikel FAM siRNA. Hasil kami menunjukkan kehadiran FBS berdampak kecil pada efisiensi transfeksi. Dalam artikel ini, kami menggunakan MPEG-PCL untuk menutupi DOTAP, dan DOTAP tertanam di dalam MP dengan beberapa bagian yang tersisa di permukaan dalam proporsi yang tepat. Berdasarkan struktur ini, kami berspekulasi bahwa muatan positif DOTAP sebagian tersembunyi karena penutup MPEG-PCL, yang menurunkan tingkat paparan protein serum, sehingga efek serum pada transfeksi dihindari. Ini menyiratkan bahwa selain berkurangnya muatan permukaan pembawa kationik setelah modifikasi, adanya transfeksi serum memiliki sedikit efek pada efisiensi pembawa polimer kationik. Karena kapasitas transfeksi yang sangat baik dalam lingkungan serum yang ditunjukkan oleh misel DMP in vitro, ini menunjukkan bahwa serum memiliki sedikit pengaruh untuk pengiriman siRNA yang dimediasi DMP dalam percobaan sel in vitro.
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, misel DMP yang disiapkan memiliki kapasitas untuk mengirimkan siRNA. Dan misel DMP digunakan untuk mengirimkan Bcl-xl siRNA dan Mcl1 siRNA ke dalam sel C26 untuk studi aktivitas anti-kanker secara in vitro. Kami menyelidiki proses preparasi untuk misel DMP dan memilih proses preparasi yang sangat baik untuk menyiapkan misel DMP dengan ukuran yang sempit, potensi zeta yang baik, dan stabilitas yang sangat baik. Selain itu, misel DMP yang disiapkan tidak terpengaruh oleh adanya percobaan transfeksi serum in vitro. Lebih penting lagi, DMP/siBcl-xl dan DMP/siMcl1 dapat menghambat ekspresi gen Bcl-xl dan gen Mcl1, menginduksi apoptosis sel C26 dan kemudian mencapai efek terapeutik dalam menghambat pertumbuhan sel C26. Injeksi intratumoral kompleks DMP/siRNA secara efisien dapat menghambat pertumbuhan xenograft subkutan model kanker usus besar C26. Tidak ada perubahan patologis yang signifikan pada jantung, hati, limpa, paru-paru, atau ginjal yang diamati. Diyakini bahwa misel DMP dapat dianggap sebagai pembawa yang efektif untuk mengantarkan siRNA untuk mengobati kanker usus besar.
Singkatan
DOTAP:
N-[1-(2, 3-dioleoyloxy) propil]-N, N, N-trimethylammonium methyl sulfate
