Nanodetection Kanker Kepala dan Leher pada Permukaan Penginderaan Titanium Oksida

Abstrak

Kanker kepala dan leher merupakan penyakit heterogen, berasal dari sel skuamosa yang melapisi laring (kotak suara), mulut, faring (tenggorokan), rongga hidung dan kelenjar ludah. Diagnosis kanker kepala dan leher pada stadium lanjut sangat mempengaruhi tingkat kelangsungan hidup pasien. Itu membuat situasi wajib untuk mengidentifikasi kanker ini pada tahap awal perkembangan dengan biomarker yang sesuai. Antigen karsinoma sel skuamosa (SCC-Ag) adalah biomarker tumor serum yang bersirkulasi, dan tingkat yang meningkat telah ditemukan pada pasien kanker kepala dan leher dan sangat berkorelasi dengan volume tumor. Penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi dan mengukur kadar SCC-Ag pada titanium oksida (TiO₂ )-dimodifikasi sensor elektroda interdigitated (IDE) oleh antibodi SCC-Ag. Deteksi SCC-Ag ditemukan pada level 100 fM, sementara ditingkatkan menjadi 10 fM saat antibodi dikonjugasikan dengan nanostar emas, yang menunjukkan peningkatan 10 kali lipat. Menariknya, peningkatan sensitivitas ini 1000 kali lipat lebih tinggi daripada substrat lainnya. Selain itu, analisis spesifisitas dilakukan menggunakan dua protein kontrol yang berbeda dan melihat bahwa antibodi hanya mengenali SCC-Ag, yang menunjukkan deteksi spesifik pada IDE-TiO₂ permukaan penginderaan.

Pengantar

Kanker kepala dan leher menunjukkan pertumbuhan sel abnormal di daerah kepala dan leher dan dilaporkan secara luas. Berasal dari tenggorokan, mulut, mukosa, epitel rongga mulut, kelenjar ludah dan rongga hidung [1]; adalah kanker keenam yang paling sering dilaporkan di seluruh dunia; dan mempengaruhi lebih dari 644.000 orang setiap tahun [2]. Sebagian besar pasien yang terkena didiagnosis pada stadium lanjut dan sangat mempengaruhi kelangsungan hidup mereka. Identifikasi stadium awal kanker kepala dan leher wajib dilakukan untuk meningkatkan kelangsungan hidup dan gaya hidup. Penanda tumor serologis telah digunakan untuk mendiagnosis dan mengelola pengobatan lanjutan kanker kepala dan leher. Sel skuamosa melepaskan antigen karsinoma sel skuamosa yang dominan (SCC-Ag), kehadirannya meningkat pada pasien kanker dan SCC-Ag telah terbukti menjadi penanda tumor yang menjanjikan dengan kanker terkait sel skuamosa seperti kanker ginekologi, paru-paru, esofagus dan dubur [3, 4]. Mengingat kanker kepala dan leher, tingkat SCC-Ag yang lebih tinggi telah dikaitkan dengan metastasis penyakit, kekambuhan dan kematian sebagaimana dibuktikan dalam penelitian yang berbeda dengan pasien kanker [5,6,7]. Para peneliti telah menemukan bahwa serum SCC-Ag berada pada tingkat risiko yang signifikan untuk kanker di hipofaring, rongga mulut dan laring [8, 9]. Selain itu, terdapat korelasi antara kadar SCC-Ag dengan volume tumor pada pasien kanker kepala dan leher [10]. Adalah bijaksana untuk mengukur tingkat SCC-Ag untuk mengidentifikasi kondisi kanker kepala dan leher, untuk memberikan pengobatan lebih dini. Penelitian saat ini difokuskan untuk mendeteksi SCC-Ag pada tingkat yang lebih rendah menggunakan nanopartikel pada sensor elektroda interdigitated (IDE) oleh antibodi SCC-Ag.

IDE adalah biosensor elektrokimia yang memiliki fitur menjanjikan seperti biaya rendah, portabel dan sensitif, membuat berbagai aplikasi, khususnya dengan pemantauan lingkungan dan diagnosis medis [11, 12]. Meningkatkan properti listrik pada permukaan penginderaan meningkatkan deteksi biomolekul. Aplikasi nanomaterial telah banyak digunakan dalam biosensor untuk meningkatkan deteksi biomolekuler pada permukaan penginderaan. Nanomaterial berukuran lebih kecil, memiliki luas permukaan yang lebih besar, memiliki konduktivitas termal dan listrik yang baik, kompatibel dengan biomolekul, dan menunjukkan kemampuan yang luar biasa untuk diterapkan di bidang biosensor [13, 14]. Nanomaterial telah diterapkan dalam dua cara yang berbeda untuk tujuan:satu adalah fungsionalisasi permukaan dan lainnya adalah konjugasi analit atau target untuk meningkatkan deteksi [15]. Emas adalah salah satu nanomaterials mapan dan diterapkan di berbagai sensor, yang meliputi resonansi plasmon permukaan, sensor mode pandu gelombang, sensor elektrokimia dan kolorimetri [16,17,18]. Selain itu, nanomaterial perak, graphene, tembaga dan titanium juga diaplikasikan dalam berbagai aplikasi biomedis. Sebagai semikonduktor ramah lingkungan dan biaya rendah, titanium oksida (TiO₂ ) memiliki celah pita lebar yang digunakan di sini untuk modifikasi permukaan pada IDE untuk mendeteksi SCC-Ag. Karena sifat listrik dan optik yang tinggi dari TiO₂ , itu banyak digunakan untuk tujuan kapasitas super, konversi fotokatalitik dan fotolistrik [19,20,21,22,23]. Selain itu, sifat hidrofilisitas dan luas permukaan yang lebih besar cocok untuk modifikasi permukaan dan membantu mendeteksi biomolekul pada tingkat yang lebih rendah. Dalam penelitian ini, TiO₂ dilapisi pada permukaan penginderaan IDE untuk meningkatkan aliran listrik ketika interaksi biomolekul terjadi. Untuk meningkatkan deteksi SCC-Ag, antibodi dikonjugasi dengan nanostar emas (antibodi GNS) dan diimobilisasi pada TiO₂ -permukaan dilapisi Karena telah terbukti bahwa biomolekul terkonjugasi nanomaterial emas menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi dan memberikan biomolekul amobil permukaan yang berorientasi dengan benar, ia memiliki kemampuan untuk meningkatkan batas deteksi [24, 25]. Selain itu, lebih banyak biomolekul dapat diimobilisasi pada satu partikel emas, yang mengarah untuk menarik tingkat molekul target yang lebih tinggi. Pada penelitian ini, dua nanomaterial yang berbeda yaitu TiO₂ (untuk modifikasi permukaan) dan GNS (untuk konjugasi antibodi), digunakan untuk meningkatkan deteksi SCC-Ag pada permukaan penginderaan IDE. Penerapan GNS diharapkan dapat meningkatkan kinerja dengan sensor arus dengan permukaan yang lebih besar untuk menangkap jumlah antibodi yang lebih tinggi.

Bahan dan Metode

Reagen dan Biomolekul

Antigen SCC (glikoprotein dengan isoform mulai dari 45 hingga 55 kDa) dibeli dari Randox Life Sciences (Malaysia). Antibodi anti-SCC diperoleh dari Next Gene (Malaysia). (3-Aminopropil)triethoxysilane (APTES), ethanolamine, albumin (protein darah utama pada 45 mg/mL; 50–70% protein darah dengan berat molekul 66,5 kDa), phosphate-buffered saline (PBS; pH 7,4) dan titanium IV isopropoksida berasal dari Sigma Aldrich (AS). Serpin (penghambatan protease serin yang didistribusikan secara umum dengan berat molekul 40 hingga 50 kDa) berasal dari Sino Biological (Cina). Nanostar emas disintesis seperti yang dijelaskan oleh Shan et al. [26]. Semua reagen dan bahan kimia yang diperoleh disimpan di tempat yang direkomendasikan oleh produsen.

Fabrikasi Elektroda Interdigitasi

Desain dasar dan fabrikasi IDE diikuti seperti yang dilaporkan sebelumnya [27]. Awalnya, wafer silikon dibersihkan dengan larutan pembersih standar, dan elektroda aluminium IDE diendapkan dengan metode etsa basah tradisional pada wafer silikon. Kemudian, photoresist positif diendapkan pada permukaan wafer silikon, dilanjutkan dengan oksidasi termal. Pengendapan aluminium dilakukan dengan teknik fotolitografi. Tiga langkah dilakukan, di mana langkah 1 dengan 1200 rpm selama 10 s kemudian langkah 2 dengan 3500 rpm selama 20s, diikuti oleh 500 rpm selama 10s. Dan kemudian, sinar ultraviolet (UV) disinari pada permukaan penginderaan untuk mentransfer pola IDE ke permukaan sampel. Setelah itu, pengembang RD-6 digunakan selama 15 detik untuk melakukan proses pengembangan. Penolakan foto dilakukan untuk menghilangkan daerah yang tidak terpapar. Sampel yang dikembangkan dipanggang pada suhu 100 °C untuk menghilangkan kelembapan yang tidak perlu dan meningkatkan daya rekat antara SiO₂ lapisan dan aluminium. Akhirnya, dengan menggunakan 23 s aluminium etsa, area yang tidak terpapar dihilangkan dan dibersihkan dengan aseton. Permukaan akhir dimodifikasi oleh TiO₂ untuk mendeteksi SCC-Ag. Permukaan IDE yang dibuat diamati di bawah mikroskop daya tinggi dan nanoprofiler 3D. Gambar diambil menggunakan sistem terkait pada perbesaran × 50.

Lapisan TiO₂ pada Permukaan Penginderaan IDE

Pada permukaan IDE fabrikasi, TiO₂ larutan dilapisi dan titanium IV isopropoksida digunakan sebagai prekursor untuk membuat larutan TiO₂ . Untuk itu, etanol dicampur dengan titanium IV isopropoksida dan diaduk kuat selama 5 menit. Kemudian bahan penstabil (100 μL asam asetat) diteteskan dalam kondisi diaduk kemudian dipanaskan di atas hot plate pada suhu 85 °C. Campuran rasio molar ditetapkan sebagai 9:1:0.1 (etanol ke TIP menjadi asam asetat). Setelah 3 jam pencampuran, larutan bening diperoleh. Setelah proses penuaan 24 jam, larutan diteteskan pada silikon dioksida (SiO₂ ) substrat dengan menggunakan spin coater pada kecepatan 2000 rpm. Setelah pelapisan, permukaan dikeringkan selama 15 menit pada suhu 175 °C dan dianil selama 1 jam pada suhu 450 °C. TiO₂ film tipis mendapatkan ketebalan yang cukup setelah melapisi tiga lapisan.

Persiapan Anti-SCC-Ag Terkonjugasi GNS

Antibodi SCC-Ag diimobilisasi pada GNS dengan menggunakan asam penghubung 16-mercaptoundecanoic (16-MDA). Awalnya, 5 mM 16-MDA encer dicampur dengan 100 μL GNS dan disimpan pada suhu kamar (RT) selama 30 menit. 16-MDA terikat dengan GNS dihilangkan dengan sentrifugasi pada 13.000×g , 5 menit. Pelet emas yang terkumpul kemudian diaktivasi dengan EDC (400 mM) dan NHS (50 mM) dengan perbandingan 1:1 dengan inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. EDC dan NHS yang tidak terikat dari campuran larutan dihilangkan dengan sentrifugasi pada 13.000×g , 5 menit. Pelet yang mengandung GNS teraktivasi dikumpulkan untuk mengkonjugasikan antibodi. Diikuti dengan 200 nM antibodi SCC-Ag dicampur dengan GNS yang diaktifkan EDC-NHS dan disimpan di RT selama 1 jam. Akhirnya, antibodi yang tidak terikat dihilangkan dengan sentrifugasi pada 13.000×g , 5 menit. Antibodi terkonjugasi dengan GNS disimpan pada suhu 4 °C untuk penggunaan lebih lanjut, dan konjugasi dikonfirmasi dengan pemindaian spektroskopi UV-Vis. Pemindaian dilakukan di wilayah antara 480 dan 560 nM, dan puncak maksimum ditemukan.

Imobilisasi pada Antibodi GNS pada TiO₂ -Permukaan IDE

TiO₂ Permukaan IDE yang dilapisi lebih lanjut dimodifikasi menjadi amina oleh APTES untuk melumpuhkan antibodi GNS. APTES dengan 3% (diencerkan dalam etanol 30%) diteteskan pada TiO₂ permukaan dan disimpan selama 3 h di RT. Permukaan dicuci dengan etanol 30% tiga kali untuk menghilangkan APTES yang tidak terikat. Untuk melumpuhkan antibodi, langkah aktivasi diikuti seperti yang disebutkan di atas. Antibodi atau antibodi GNS dijatuhkan pada permukaan dan menunggu selama 1 jam untuk menyelesaikan proses imobilisasi. Akhirnya, permukaan dicuci lima kali dengan buffer PBS untuk sepenuhnya menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Permukaan yang dimodifikasi antibodi atau antibodi GNS ini digunakan untuk mendeteksi SCC-Ag dan dibandingkan. TiO yang diimobilisasi oleh antibodi GNS₂ permukaan dianalisis dengan mikroskop gaya atom (AFM), mikroskop elektron transmisi medan-emisi (FETEM) dan penganalisis energi dispersif sinar-X (EDX) seperti yang dijelaskan sebelumnya [15]. Pengamatan AFM pada skala 5 μm, sedangkan SEM pada skala 100 nM yang dioperasikan dengan 15 kV. Kehadiran elemen ditemukan oleh EDX.

Deteksi Antigen SCC pada Permukaan Antibodi Antibodi Emas/Nanostar

Untuk mendeteksi SCC-Ag, TiO yang dimodifikasi antibodi atau emas nanostar antibodi₂ Permukaan -IDE diblokir oleh 1 M etanolamin untuk menutupi area permukaan bebas antibodi dan disimpan selama 30 menit di RT. Pada permukaan yang diblokir etanolamin, 1 nM SCC-Ag berinteraksi dan respons saat ini diperhatikan sebelum dan sesudah penambahan SCC-Ag. Untuk mengevaluasi batas deteksi, SCC-Ag dititrasi dari 10 fM hingga 1 nM dan dijatuhkan satu per satu pada permukaan yang dimodifikasi antibodi atau GNS dan respons dengan arus dicatat. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga dan menghitung statistik. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Batas deteksi (LOD) dianggap sebagai konsentrasi analit terendah (dari garis kalibrasi pada konsentrasi rendah) terhadap sinyal latar belakang (S /T = 3:1), dengan kata lain, LOD = standar deviasi dari garis dasar + 3σ .

Deteksi Selektif SCC-Ag

Untuk memeriksa interaksi selektif SCC-Ag dengan antibodinya, dilakukan eksperimen kontrol dengan dua protein berbeda, yaitu serpin dan albumin. Konsentrasi 1-nM dari protein kontrol ini dijatuhkan pada antibodi atau permukaan yang dimodifikasi antibodi GNS, dan perubahan arus terlihat sebelum dan sesudah interaksi. Level saat ini dibandingkan dengan deteksi spesifik SCC-Ag oleh antibodinya dan antibodi GNS. Pengaturan eksperimental kontrol lainnya termasuk interaksi SCC-Ag dengan GNS saja dan SCC-Ag dengan TiO₂ -Permukaan IDE dilapisi oleh GNS berlabel antibodi non-imun. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga dan menghitung statistik. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran.

Hasil dan Diskusi

Kanker kepala dan leher telah digambarkan sebagai tumor yang berbeda berkembang di dalam atau di sekitar hidung, mulut, laring dan sinus [28]. Diagnosis dini dan pengobatan dengan biomarker yang sesuai adalah wajib untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pasien. SCC-Ag ditemukan sebagai biomarker serum yang cocok untuk kanker kepala dan leher; disini percobaan dilakukan untuk mendeteksi dan mengukur kadar SCC-Ag pada TiO₂ -memodifikasi sensor elektroda interdigitasi (IDE) oleh antibodinya. TiO₂ digunakan di sini untuk meningkatkan respons saat ini selama interaksi biomolekul. Dibandingkan dengan bahan nano lainnya, TiO₂ dianggap menarik dalam sensor elektrokimia karena perilaku aktifnya di permukaan sepanjang elektroda dan peningkatan aktivitas elektrokatalitik. Selain itu, memberikan stabilitas lebih ke permukaan, yang menghasilkan pengulangan respon oleh elektroda dan peningkatan batas deteksi dengan meningkatkan arus puncak [29,30,31]. Untuk memanfaatkan sifat positif tersebut, pada penelitian ini dilakukan pelapisan TiO₂ pada permukaan IDE (IDE-TiO₂ ) meningkatkan aliran arus. GNS nanomaterial lain digunakan untuk melumpuhkan antibodi anti-SCC-Ag pada IDE-TiO₂ permukaan dan untuk meningkatkan batas penghapusan. Karena telah terbukti bahwa permukaan imobilisasi biomolekul terkonjugasi emas meningkatkan deteksi target [32, 33], di sini, SCC-Ag dideteksi dan dibandingkan dengan antibodi dan antibodi GNS yang dimodifikasi IDE-TiO₂ permukaan. Seperti yang digeneralisasi di tempat lain, dengan peningkatan luas permukaan nanopartikel, akan ada peningkatan perlekatan biomolekuler. Dalam konteks ini, GNS memiliki permukaan yang lebih besar dibandingkan dengan nanopartikel emas berbentuk bola. Untuk menerapkan ide ini, eksperimen saat ini telah dilakukan menggunakan GNS untuk meningkatkan sensitivitas.

Karakterisasi Permukaan dan Imobilisasi Antibodi GNS

Gambar 1 menunjukkan representasi skema pendeteksian SCC-Ag pada IDE-TiO₂ permukaan penginderaan. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 1a, awalnya, permukaan penginderaan IDE dilapisi dengan TiO₂ dan kemudian antibodi diimobilisasi dengan atau tanpa konjugasi GNS. Permukaan yang dimodifikasi antibodi ini digunakan untuk mendeteksi tingkat SCC-Ag. Sebelum melakukan deteksi, konjugasi GNS dengan antibodi dikonfirmasi dengan spektroskopi UV-Vis. Profil pemindaian GNS dengan rentang panjang gelombang yang diinginkan sebelum dan sesudah konjugasi dengan antibodi ditentukan. Terlihat jelas bahwa setelah imobilisasi, pergeseran dipindahkan dari 535 ke 545 nM (Gbr. 1b). Hasil ini mengkonfirmasi konjugasi antibodi pada permukaan GNS. Di sisi lain, permukaan penginderaan buatan diamati secara morfologis. Gambar 2a menampilkan gambar mikroskop berdaya tinggi, sedangkan Gambar 2b menjelaskan gambar yang diambil dari pencitraan nanoprofil 3D. Kedua profil pencitraan dengan jelas ditunjukkan dengan celah dan daerah elektroda, yang membentuk jari. Susunan celah dan jari tampak seragam dan utuh.

a Representasi skematis untuk deteksi SCC-Ag. IDE-TiO₂ permukaan dimodifikasi menjadi amina oleh APTES diikuti oleh imobilisasi antibodi atau antibodi GNS. Gugus amina dari APTES bereaksi dengan gugus karboksil pada antibodi. SCC-Ag dideteksi dengan interaksi pada daerah antigenik dan dibandingkan. b Pengukuran spektroskopi UV-Vis dengan GNS. Pemindaian berada di wilayah antara 480 dan 560 nM, dan puncak maksimum adalah ~ 530 nM. GNS dengan dan tanpa antibodi ditunjukkan oleh panah

a Gambar mikroskop daya tinggi pada permukaan IDE. Gambar diambil pada × 50. b Gambar nanoprofiler 3D pada permukaan IDE. Gambar diambil pada × 50. Wilayah elektroda dan celah ditampilkan. Kesenjangan ditunjukkan oleh bintang. Pengaturan yang seragam menunjukkan fabrikasi yang berhasil. c Gambar mikroskop kekuatan atom. AFM menampilkan diskriminasi yang jelas antara TiO₂ dan GNS oleh bintik-bintik gelap dan terang, masing-masing. d Gambar mikroskop elektron transmisi medan-emisi. e Analisis sinar-X dispersif energi. Menunjukkan elemen yang ditemukan di permukaan

Perbandingan Antibodi dan TiO Imobilisasi Antibodi GNS₂ -Permukaan Penginderaan IDE

SCC-Ag terdeteksi pada TiO₂ -Permukaan IDE oleh permukaan yang diimobilisasi antibodi atau GNS. Lampiran GNS pada TiO₂ permukaan dikonfirmasi oleh AFM, pengamatan SEM dan analisis EDX (Gbr. 2c). Di bawah pengamatan AFM, diskriminasi yang jelas terlihat antara TiO₂ dan GNS oleh bintik-bintik gelap dan terang, masing-masing. Ini didukung oleh analisis SEM dan EDX, di mana emas menonjol dan puncak titanium sedang diamati. Hasil ini membuktikan terjadinya GNS pada TiO₂ permukaan. Gambar 3 menunjukkan proses imobilisasi antibodi dan antibodi GNS pada IDE-TiO yang dimodifikasi amina₂ permukaan penginderaan. TiO₂ -permukaan penginderaan IDE yang dimodifikasi menunjukkan level saat ini sebagai 4.65E−12 (Gbr. 3a). Setelah menambahkan APTES, level saat ini ditingkatkan menjadi 5.37E−11; kenaikan arus ini menunjukkan bahwa permukaan dimodifikasi menjadi amina oleh APTES. Ketika antibodi diimobilisasi, level saat ini diubah dari 5.375E−11 menjadi 1.05E−9. Perbedaan arus terlihat sebagai 1,04E−9 (Gbr. 3a). Imobilisasi ini terjadi karena adanya interaksi kimia gugus amina dari gugus APTES dan COOH pada antibodi [18]. Perubahan arus mengkonfirmasi pengikatan antibodi pada permukaan yang dimodifikasi APTES. Setelah itu, permukaan yang tersisa ditutupi oleh etanolamin 1 M untuk mengurangi efek biofouling dari pengikatan biomolekul yang tidak spesifik pada permukaan penginderaan. Demikian pula, antibodi GNS diimobilisasi pada TiO₂ permukaan -IDE, dan ketika antibodi GNS diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi APTES, level saat ini meningkat dari 4.41E−12 menjadi 1.23E−9 (Gbr. 3b). Jelas ditemukan bahwa ketika antibodi diimobilisasi pada permukaan GNS, itu menunjukkan respons yang lebih tinggi pada permukaan yang dimodifikasi amina. Ini mungkin karena jumlah antibodi yang lebih besar yang terikat pada permukaan GNS tunggal dan ikatan yang kuat dari kompleks ini pada permukaan yang dimodifikasi amina. Pengikatan ini terjadi karena gugus terminal amino pada APTES menggantikan gugus sitrat pada GNS dan secara kimiawi terfiksasi pada permukaan IDE yang dimodifikasi APTES [34]. Telah diketahui dengan baik bahwa deteksi biomolekul pada permukaan penginderaan terutama tergantung pada dua faktor, yaitu, afinitas pengikatan molekul interaktif dan imobilisasi permukaan yang tepat dari molekul pada permukaan penginderaan. Imobilisasi biomolekuler yang lebih tinggi pada permukaan penginderaan secara drastis meningkatkan deteksi target pada tingkat yang lebih rendah. Dalam penelitian ini, GNS digunakan untuk melumpuhkan antibodi anti-SCC-Ag pada IDE-TiO₂ permukaan untuk meningkatkan kemungkinan pengikatan antibodi yang lebih tinggi, yang memimpin deteksi SCC-Ag yang efisien.

Proses imobilisasi pada IDE-TiO₂ permukaan. a Dengan antibodi. b Dengan antibodi GNS. Modifikasi permukaan dimulai dengan 3% APTES, diikuti oleh aktivasi EDC dan NHS untuk melumpuhkan antibodi; 1 M etanolamin digunakan untuk memblokir wilayah antibodi yang tidak terikat. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Perubahan arus yang tepat setelah setiap imobilisasi dikonfirmasi bahwa pengikatan antibodi dan antibodi GNS pada permukaan penginderaan

Deteksi Perbandingan SCC-Ag pada IDE-TiO₂ Permukaan oleh Antibodi atau Antibodi GNS

Karena antibodi GNS menunjukkan imobilisasi yang efisien pada IDE-TiO₂ permukaan, konsentrasi 1 nM SCC-Ag yang serupa terdeteksi pada permukaan antibodi dan antibodi GNS dan membandingkan perubahan pada level saat ini. Gambar 4a menunjukkan 1 nM deteksi SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi. Sebelum melakukan deteksi, permukaan yang dimodifikasi antibodi ditutupi oleh agen penghambat etanolamin untuk menghindari pengikatan biomolekul yang tidak spesifik. Ethanolamine menunjukkan perubahan saat ini sebagai 4.65E−12. Setelah menambahkan 1 nM SCC-Ag, level saat ini ditingkatkan menjadi 1,33E−09. Perubahan saat ini dengan jelas menunjukkan pengikatan SCC-Ag ke antibodinya. Dalam kasus permukaan antibodi GNS, ethanolamine menunjukkan level saat ini sebagai 1,33E−11; setelah menambahkan 1 nM SCC-Ag, itu meningkat menjadi 1,62E−09 (Gbr. 4b). Perubahan saat ini dengan antibodi GNS lebih tinggi dibandingkan dengan hanya permukaan yang dimodifikasi antibodi untuk konsentrasi SCC-Ag yang serupa. Ini mungkin karena jumlah antibodi yang lebih tinggi yang terikat pada IDE-TiO₂ permukaan melalui GNS.

Deteksi SCC-Ag dengan a antibodi dan b antibodi GNS. Diuji pada IDE-TiO₂ permukaan dengan langkah-langkah di atas sampai 1 M pemblokiran etanolamin. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Setelah berinteraksi 1 nM SCC-Ag, level saat ini meningkat dalam kedua kasus; pada saat yang sama, ini menunjukkan perubahan arus yang lebih tinggi dengan antibodi GNS

Batas Deteksi SCC-Ag pada IDE-TiO₂ Permukaan oleh Antibodi atau Antibodi GNS

Permukaan yang dimodifikasi antibodi-antibodi atau GNS menunjukkan deteksi SCC-Ag yang jelas, dan batas deteksi diperkirakan pada kedua permukaan untuk perbandingan (Gambar 5a, b). Untuk itu, konsentrasi dari 10 fM hingga 1 nM SCC-Ag diencerkan dan dijatuhkan pada permukaan ini satu per satu dan dicatat perubahan arusnya. Gambar 5a menunjukkan konsentrasi yang berbeda dari pengikatan SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi. Setelah etanolamin, 10 fM SCC-Ag berinteraksi, dan tidak ada perubahan yang terlihat. Saat konsentrasi dinaikkan menjadi 100 fM, ada sedikit perubahan pada arus dari 4.65E−12 menjadi 6.54E−11. Selanjutnya, konsentrasi ditingkatkan menjadi 1 pM, 10 pM, 100 pM dan 1 nM, dan level saat ini masing-masing ditingkatkan sebagai 4.69E−10, 7.91E−10, 8.78E−10 dan 1.33E-09. Hasil ini jelas menunjukkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi, pengikatan juga meningkat. Batas deteksi dihitung berdasarkan 3σ , dan pada 100 fM (Gbr. 6a).

Interaksi tergantung dosis dengan a antibodi dan b Antibodi GNS pada IDE-TiO₂ permukaan. Permukaan dengan langkah-langkah di atas sampai 1 M pemblokiran etanolamin. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Konsentrasi SCC-Ag dari 10 fM hingga 10 nM berinteraksi di kedua permukaan, dan perubahan saat ini terlihat. Pencucian dilakukan dengan lima volume reaksi pada setiap langkah menggunakan 10 mM PBS (pH 7,4). Dengan peningkatan konsentrasi SCC-Ag, level saat ini secara bertahap meningkat dalam kedua kasus. Antibodi GNS menunjukkan perubahan saat ini dari 10 fM, sedangkan perubahan dari 100 fM hanya terlihat dengan antibodi. Dalam kedua kasus (antibodi dan antibodi GNS), 1 nM SCC-Ag menunjukkan saturasi. Ketika konsentrasi ditingkatkan lebih lanjut, setiap perubahan signifikan pada arus tidak dapat diamati

Perbandingan perubahan saat ini dengan konsentrasi SCC-Ag yang berbeda pada permukaan yang dimodifikasi antibodi dan GNS. a Grafik regresi linier untuk batas deteksi SCC-Ag. Dengan antibodi (garis merah) dan dengan antibodi GNS (garis biru) ditampilkan. Batas deteksi ditemukan sebagai 10 fM dengan antibodi GNS dan 100 fM dengan antibodi saja. b Perubahan saat ini dengan SCC-Ag dan interaksi antibodi. Dengan semua konsentrasi, tingkat perubahan arus yang lebih tinggi ditemukan pada permukaan antibodi GNS. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Bilah kesalahan menunjukkan nilai rata-rata dari rangkap tiga (n = 3) dengan simpangan baku berada pada kisaran ± 0,1 hingga 0,15 × 10⁻⁹ A. Batas deteksi (LOD) dianggap sebagai konsentrasi analit terendah (dari garis kalibrasi pada konsentrasi rendah) terhadap sinyal latar belakang (S /T = 3:1), dengan kata lain, LOD = standar deviasi dari garis dasar + 3σ

Konsentrasi SCC-Ag yang sama berinteraksi secara independen pada permukaan yang dimodifikasi antibodi GNS. Ketika 10 fM SCC-Ag dijatuhkan ke permukaan, jelas mengubah arus dari 1,33E−11 menjadi 3,74E−11. Hasil ini menunjukkan bahwa bahkan 10 fM SCC-Ag dapat secara jelas berinteraksi dengan permukaan yang diimobilisasi antibodi GNS, yang tidak dapat dideteksi dalam kasus hanya dengan antibodi. Selain itu, ketika konsentrasi ditingkatkan menjadi 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM dan 1 nM, level saat ini meningkat lebih lanjut menjadi 4.69E−10, 9.23E−10, 1.41E−09, 1.48E−09 dan 1.62E−09, masing-masing (Gbr. 5b). Perhitungan statistik dengan standar deviasi berada dalam kisaran ± 0,1 hingga 0,15 × 10⁻⁹ A. Jika dibandingkan dengan penginderaan pada dua permukaan di atas, permukaan yang dimodifikasi antibodi GNS menunjukkan perubahan arus yang lebih tinggi dengan semua konsentrasi SCC-Ag yang diuji (Gbr. 6b). Berdasarkan 3σ , ia dapat menemukan batas deteksi sebagai 10 fM (Gbr. 6a), ini adalah deteksi 10 kali lebih baik (lebih rendah) dibandingkan dengan hanya permukaan yang dimodifikasi antibodi. Perhitungan statistik dengan simpangan baku berada pada kisaran ± 0,1 hingga 0,15 × 10⁻⁹ A. Sebelumnya, SCC-Ag telah dievaluasi pada nanomaterial yang berbeda, seperti nanopartikel strontium dan graphene; namun, permukaan ini menunjukkan sensitivitas ~ 1000 kali lipat lebih rendah dibandingkan dengan penelitian saat ini [35].

Deteksi Selektif SCC-Ag pada Permukaan yang Dimodifikasi Antibodi/GNS

Deteksi selektif SCC-Ag dibandingkan dengan dua protein kontrol yaitu serpin dan albumin yang banyak terdapat dalam aliran darah. Serpin adalah protease inhibitor yang melakukan fungsi fisiologis dan proses biologis manusia yang berbeda, sedangkan albumin menyumbang 45 mg mL⁻¹ dan berkontribusi 50-70% dalam serum darah. Seperti yang ditunjukkan pada gambar, konsentrasi 1 nM dari dua protein kontrol ini dan SCC-Ag dijatuhkan satu per satu pada antibodi permukaan atau antibodi GNS (Gbr. 7a); terlihat jelas bahwa perubahan saat ini hanya terlihat dengan SCC-Ag dalam kedua kasus, menunjukkan bahwa antibodi hanya mampu mengenali SCC-Ag. Tidak ada perubahan signifikan yang terlihat pada arus dengan interaksi protein kontrol. Eksperimen ini mengonfirmasi bahwa pengaturan eksperimental saat ini dapat secara khusus mendeteksi/mendiagnosis SCC-Ag. Dukungan lebih lanjut diberikan oleh eksperimen kontrol lain dengan interaksi SCC-Ag dengan GNS saja dan SCC-Ag dengan TiO₂ -Permukaan IDE dilapisi dengan GNS berlabel antibodi non-imun. Tidak ada perubahan signifikan pada arus yang diperhatikan dibandingkan dengan interaksi spesifik (Gbr. 7b).

a Deteksi selektif SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi dan GNS. Interaksi dengan C1-serpin dan C-2-albumin dilakukan. Permukaan dengan langkah-langkah di atas sampai 1 M pemblokiran etanolamin. Nilai dirata-ratakan dengan rangkap tiga. Dalam kedua kasus, antibodi hanya mengenali SCC-Ag, yang menunjukkan deteksi spesifik. b Pengukuran kontrol. Interaksi spesifisitas dibandingkan dengan interaksi non-spesifik. Ada diskriminasi yang jelas terlihat. Tegangan sapuan linier 0 hingga 2 V pada tegangan langkah 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Bilah kesalahan menunjukkan nilai rata-rata dari rangkap tiga (n = 3) dengan standar deviasi dalam kisaran ± 0,1 hingga 0,15 × 10⁻⁹ A

Conclusion

Head and neck cancer is a common cancer that affects the areas of the mouth, throat and salivary glands. Diagnosing head and neck cancer with a suitable biomarker is mandatory to give the necessary treatment to the patients and improve their lifestyle. SCC-Ag has been found to be one of the important biomarkers for cancers; herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO₂ ). Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO₂ surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO₂ surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO₂ sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.