Sensor Oksida Titanium Memungkinkan Deteksi Nano Awal Kanker Kepala dan Leher
Abstrak
Kanker kepala dan leher adalah penyakit heterogen yang berasal dari sel squamosa yang menapisi laring (kotak suara), mulut, faring (tenggorong), rongga hidung, dan kelenjar ludah. Diagnosis kanker kepala dan leher pada stadium akhir sangat mempengaruhi tingkat kelangsungan hidup pasien. Hal ini membuat situasi yang mendesak untuk mengidentifikasi kanker ini pada tahap awal perkembangan dengan biomarker yang sesuai. Antigen karsinoma sel squamosa (SCC-Ag) adalah biomarker tumor serum yang beredar, dan tingginya telah ditemukan pada pasien kanker kepala dan leher serta sangat berkorelasi dengan volume tumor. Penelitian saat ini dilakukan untuk mendeteksi dan mengukur tingkat SCC-Ag pada elektroda interdigitat (IDE) yang dimodifikasi oksida titanium (TiO2) dengan antibodi SCC-Ag. Deteksi SCC-Ag ditemukan pada tingkat 100 fM, sementara meningkat menjadi 10 fM ketika antibodi dikonjugasi dengan bintang emas, mewakili peningkatan 10 kali lipat. Menariknya, peningkatan sensitivitas ini 1000 kali lipat lebih tinggi dari substrat lain. Selain itu, analisis spesifisitas dilakukan menggunakan dua protein kontrol yang berbeda dan diperhatikan bahwa antibodi hanya mengenali SCC-Ag, yang menunjukkan deteksi spesifik pada permukaan sensor IDE-TiO2.
Pendahuluan
Kanker kepala dan leher menunjukkan pertumbuhan sel abnormal di area kepala dan leher dan banyak dilaporkan. Ini berasal dari tenggorong, mulut, mucosa, epitel rongga mulut, kelenjar ludah, dan rongga hidung [1]; merupakan kanker yang paling sering dilaporkan ke-6 di seluruh dunia; dan mempengaruhi lebih dari 644.000 orang setiap tahun [2]. Sebagian besar pasien yang terpengaruh diagnosis pada stadium lanjut dan sangat mempengaruhi kelangsungan hidup mereka. Identifikasi tahap awal kanker kepala dan leher adalah wajib untuk meningkatkan kelangsungan hidup dan gaya hidup. Marker tumor serologis telah digunakan untuk diagnosis dan pengelolaan perawatan lanjutan kanker kepala dan leher. Sel squamosa melepaskan antigen karsinoma sel squamosa (SCC-Ag) yang predominan, kehadirannya meningkat pada pasien kanker dan SCC-Ag telah menunjukkan sebagai biomarker tumor yang promising untuk kanker terkait sel squamosa seperti ginekologik, paru-paru, kerangka, dan kanker anus [3, 4]. Mempertimbangkan kanker kepala dan leher, tingkat SCC-Ag yang lebih tinggi telah dikaitkan dengan metastasis penyakit, kemunculan kembali, dan mortalitas sebagaimana dikuatkan dalam berbagai studi dengan pasien kanker [5,6,7]. Peneliti telah menemukan bahwa serum SCC-Ag berada pada tingkat risiko yang signifikan untuk kanker di hipofaring, rongga mulut, dan laring [8, 9]. Selain itu, terdapat korelasi antara tingkat SCC-Ag dan volume tumor pada pasien kanker kepala dan leher [10]. Bijak untuk mengukur tingkat SCC-Ag untuk mengidentifikasi kondisi kanker kepala dan leher, guna memberikan perawatan lebih awal. Penelitian saat ini difokuskan pada deteksi SCC-Ag pada tingkat yang lebih rendah menggunakan nanopartikel pada elektroda interdigitat (IDE) sensor dengan antibodi SCC-Ag.
IDE adalah biosensor elektrokimia yang memiliki fitur menjanjikan seperti biaya rendah, portabel, dan sensitif, membuat berbagai aplikasi, khususnya dengan pemantauan lingkungan dan diagnosis medis [11, 12]. Peningkatan properti listrik pada permukaan sensor meningkatkan deteksi biomolekul. Aplikasi nanomaterial telah digunakan secara luas dalam biosensor untuk meningkatkan deteksi biomolekul pada permukaan sensor. Nanomaterial berukuran lebih kecil, memiliki luas permukaan yang lebih besar, memiliki konduktivitas termal dan listrik yang baik, kompatibel dengan biomolekul, dan menunjukkan kemampuan besar untuk diterapkan dalam bidang biosensor [13, 14]. Nanomaterial telah diterapkan dalam dua cara yang berbeda untuk tujuan: satu adalah fungsionalisasi permukaan dan yang lain adalah mengonjugasi analit atau target untuk meningkatkan deteksi [15]. Emas adalah salah satu nanomaterial yang telah terbukti dan diterapkan dalam berbagai sensor, yang mencakup resonansi plasmon permukaan, sensor mode gelombang, sensor elektrokimia, dan colorimetry [16,17,18]. Selain itu, perak, grafen, tembaga, dan nanomaterial titanium juga telah diterapkan dalam berbagai aplikasi biomedis. Sebagai semikonductor ramah lingkungan dan biaya rendah, oksida titanium (TiO2) memiliki bandgap yang luas yang digunakan di sini untuk modifikasi permukaan pada IDE untuk mendeteksi SCC-Ag. Karena properti listrik dan optik yang tinggi dari TiO2, ini banyak digunakan untuk tujuan super-kapasitas, fotokatalisis, dan konversi fotoelektrik [19,20,21,22,23]. Selain itu, sifat hidrofilik dan luas permukaan yang besar cocok untuk modifikasi permukaan dan membantu mendeteksi biomolekul pada tingkat yang lebih rendah. Dalam penelitian ini, TiO2 dilapisi pada permukaan sensor IDE untuk meningkatkan aliran listrik ketika interaksi biomolekul sedang terjadi. Untuk meningkatkan deteksi SCC-Ag, antibodi dikonjugasi dengan bintang emas (GNS antibodi) dan diimobilkan pada permukaan yang dilapisi TiO2. Karena telah terbukti bahwa biomolekul yang dikonjugasi dengan nanomaterial emas menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi dan menyediakan biomolekul yang diimobilkan permukaan dengan orientasi yang tepat, ini memiliki kemampuan untuk meningkatkan batas deteksi [24, 25]. Selain itu, lebih banyak biomolekul dapat diimobilkan pada satu partikel emas, yang menyebabkan menarik tingkat yang lebih tinggi dari molekul target. Dalam karya ini, dua nanomaterial berbeda, yaitu TiO2 (untuk modifikasi permukaan) dan GNS (untuk konjugasi antibodi), digunakan untuk meningkatkan deteksi SCC-Ag pada permukaan sensor IDE. Penerapan GNS diharapkan dapat meningkatkan kinerja sensor saat ini dengan luas permukaan yang lebih besar untuk menangkap lebih banyak antibodi.
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
Antigen SCC (glikoprotein dengan isoform yang berkisar dari 45 hingga 55 kDa) dibeli dari Randox Life Sciences (Malaysia). Anti-SCC antibodi diperoleh dari Next Gene (Malaysia). (3-Aminopropil)trietosilksana (APTES), etanolamina, albumin (protein darah utama pada 45 mg/mL; 50–70% protein darah dengan bobot molekuler 66,5 kDa), larutan penyangkap fosfat (PBS; pH 7,4) dan titanium IV isopropoxide berasal dari Sigma Aldrich (USA). Serpin (penghambat protease serin yang banyak tersebar dengan bobot molekuler 40 hingga 50 kDa) berasal dari Sino Biological (China). Bintang emas disintesis sebagaimana dijelaskan oleh Shan et al. [26]. Semua reagen dan kimia yang diperoleh disimpan sesuai rekomendasi pabrikan.
Pembuatan Elektroda Interdigitat
Desain dan pembuatan dasar IDE diikuti sebagaimana dilaporkan sebelumnya [27]. Awalnya, wafer silicon dibersihkan dengan larutan pembersih standar, dan elektroda IDE aluminium ditambatkan dengan metode pengikisan basah tradisional pada wafer silicon. Kemudian, fotoresist positif ditetapkan pada permukaan wafer silicon, diikuti oleh oksidasi termal dilakukan. Penambatan aluminium dilakukan dengan teknik fotolitografi. Tiga langkah terlibat, di mana langkah 1 dengan 1200 rpm selama 10 s kemudian langkah 2 dengan 3500 rpm selama 20 s, diikuti oleh 500 rpm selama 10 s. Dan kemudian, cahaya ultraviolet (UV) diekspos pada permukaan sensor untuk mentransfer pola IDE ke permukaan sampel. Setelah itu, pengembang RD-6 digunakan selama 15 s untuk melakukan proses pengembangan. Pengresistan foto dilakukan untuk menghilangkan wilayah yang tidak diekspos. Sampel yang telah dikembangkan dipanaskan pada 100°°C untuk menghilangkan kelembaban yang tidak diperlukan dan meningkatkan penangkalan antara lapisan SiO2 dan aluminium. Akhirnya, dengan menggunakan 23 s pengikis aluminium, wilayah yang tidak diekspos dihilangkan dan dibersihkan dengan aseton. Permukaan akhir dimodifikasi oleh TiO2 untuk mendeteksi SCC-Ag. Permukaan IDE yang diproduksi diamati di bawah mikroskop daya tinggi dan nanoprofiler 3D. Gambar ditangkap menggunakan sistem terkait pada perbesar × 50.
Lapisan TiO2 pada Permukaan Sensor IDE
Pada permukaan IDE yang diproduksi, larutan TiO2 dilapisi dan titanium IV isopropoxide digunakan sebagai precursor untuk menyiapkan larutan TiO2. Untuk itu, etanol dicampur dengan titanium IV isopropoxide dan diaduk dengan keras selama 5 menit. Dan kemudian, stabilizer (100 μL asam asetat) diteteskan dalam kondisi pengadukan dan kemudian dipanaskan pada hot plate pada suhu 85 °C. Ras molar campuran ditetapkan sebagai 9:1:0.1 (etanol ke TIP ke asam asetat). Setelah 3 jam pencampuran, larutan jernih diperoleh. Setelah proses penuaan selama 24 jam, larutan ditetes pada substrat biosilikon dioksida (SiO2) dengan menggunakan spin coater pada kecepatan 2000 rpm. Setelah pelapisan, permukaan dikeringkan selama 15 menit pada suhu 175 °C dan dianil selama 1 jam pada 450 °C. Tipis film TiO2 mendapatkan tebal yang cukup setelah pelapisan tiga lapis.
Persiapan Anti-SCC-Ag yang Dikonjugasi GNS
Antibodi SCC-Ag diimobilkan pada GNS dengan menggunakan linker 16-merkaptoundekanoat asam (16-MDA). Awalnya, 5 mM 16-MDA yang diencerkan dicampur dengan 100 μL GNS dan disimpan pada suhu kamar (RT) selama 30 menit. 16-MDA yang terikat dengan GNS dihilangkan melalui sentrifugasi pada 13.000×g, 5 menit. Kemudian, pelet emas yang dikumpulkan diaktifkan oleh EDC (400 mM) dan NHS (50 mM) dengan ras 1:1 dengan inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. EDC dan NHS yang tidak terikat dari larutan campuran dihilangkan melalui sentrifugasi pada 13.000×g, 5 menit. Pelet yang berisi GNS yang diaktifkan dikumpulkan untuk mengonjugasi antibodi. Diikuti oleh 200 nM antibodi SCC-Ag dicampur dengan GNS yang diaktifkan EDC-NHS dan disimpan pada RT selama 1 jam. Akhirnya, antibodi yang tidak terikat dihilangkan melalui sentrifugasi pada 13.000×g, 5 menit. Antibodi yang dikonjugasi dengan GNS disimpan pada 4 °C untuk penggunaan lebih lanjut, dan konjugasi dikonfirmasi dengan pemindaian spektroskopi UV-Vis. Pemindaian dilakukan di wilayah antara 480 dan 560 nM, dan puncak maksimum ditemukan.
Imobilisasi Antibodi GNS pada Permukaan TiO2-IDE
Permukaan IDE yang dilapisi TiO2 lebih dimodifikasi menjadi amina oleh APTES untuk mengimobilkan antibodi GNS. APTES dengan 3% (diencerkan dalam 30% etanol) ditetes pada permukaan TiO2 dan disimpan selama 3 jam pada RT. Permukaan dicuci dengan 30% etanol tiga kali untuk menghilangkan APTES yang tidak terikat. Untuk mengimobilkan antibodi, langkah aktivasi diikuti seperti disebutkan di atas. Antibodi atau antibodi GNS ditetes pada permukaan dan ditunggu selama 1 jam untuk menyelesaikan proses imobilisasi. Akhirnya, permukaan dicuci lima kali dengan larutan PBS untuk sepenuhnya menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Permukaan yang dimodifikasi antibodi atau antibodi GNS ini digunakan untuk mendeteksi SCC-Ag dan dibandingkan. Permukaan TiO2 yang diimobilkan antibodi GNS dianalisis dengan mikroskop gaya atom (AFM), mikroskop transmisi sinar emis (FETEM) dan analis sinar X dispersif energi (EDX) sebagaimana dijelaskan sebelumnya [15]. Observasi AFM pada skala 5 μm, sedangkan SEM pada skala 100 nM dioperasikan dengan 15 kV. Keberadaan elemen ditemukan oleh EDX.
Deteksi Antigen SCC pada Permukaan Antibodi/Bintang Emas Antibodi
Untuk mendeteksi SCC-Ag, permukaan IDE-TiO2 yang dimodifikasi antibodi atau bintang emas antibodi diblokir oleh 1 M etanolamina untuk menutupi area permukaan bebas antibodi dan disimpan selama 30 menit pada RT. Pada permukaan yang diblokir etanolamina, 1 nM SCC-Ag bereaksi dan respons arus diperhatikan sebelum dan setelah penambahan SCC-Ag. Untuk mengevaluasi batas deteksi, SCC-Ag dititrasi dari 10 fM hingga 1 nM dan ditetes secara individu pada permukaan yang dimodifikasi antibodi atau antibodi GNS dan respons dengan arus dicatat. Eksperimen dilakukan secara triplikata dan statistik dihitung. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V dengan langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Batas deteksi (LOD) dianggap konsentrasi terendah analit (dari garis kalibrasi pada konsentrasi rendah) terhadap sinyal latar belakang (S/N = 3:1), dengan kata lain, LOD = simpangan baku baseline + 3σ.
Deteksi Selektif SCC-Ag
Untuk memeriksa interaksi selektif SCC-Ag dengan antibodi-nya, eksperimen kontrol dilakukan dengan dua protein berbeda, yaitu serpin dan albumin. Konsentrasi 1 nM dari protein kontrol ini ditetes pada permukaan yang dimodifikasi antibodi atau antibodi GNS, dan perubahan arus diperhatikan sebelum dan setelah interaksi. Tingkat arus ini dibandingkan dengan deteksi spesifik SCC-Ag oleh antibodi-nya dan antibodi GNS. Pengaturan eksperimen kontrol lainnya mencakup interaksi SCC-Ag dengan GNS saja dan SCC-Ag dengan permukaan IDE-TiO2 yang dilapisi GNS yang dilabeli antibodi non-imun. Eksperimen dilakukan secara triplikata dan statistik dihitung. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V dengan langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran.
Hasil dan Diskusi
Kanker kepala dan leher telah digambarkan sebagai berbagai tumor yang berkembang di atau di sekitar hidung, mulut, laring, dan sinus [28]. Diagnosis dan perawatan awal dengan biomarker yang sesuai adalah wajib untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pasien. SCC-Ag ditemukan sebagai biomarker serum yang sesuai untuk kanker kepala dan leher; di sini, eksperimen dilakukan untuk mendeteksi dan mengukur tingkat SCC-Ag pada sensor elektroda interdigitat (IDE) yang dimodifikasi TiO2 oleh antibodi-nya. TiO2 digunakan di sini untuk meningkatkan respons arus selama interaksi biomolekul. Dibandingkan dengan nanomaterial lain, TiO2 dianggap menarik dalam sensor elektrokimia karena perilaku aktifnya pada permukaan sepanjang elektroda dan peningkatan aktivitas elektrokatalitik. Selain itu, ini memberikan lebih banyak stabilitas pada permukaan, yang menghasilkan keulangan respons oleh elektroda dan peningkatan batas deteksi dengan meningkatkan puncak arus [29,30,31]. Untuk memanfaatkan fitur positif ini, dalam penelitian ini, TiO2 yang dilapisi pada permukaan IDE (IDE-TiO2) meningkatkan aliran arus. Nanomaterial lain GNS digunakan untuk mengimobilkan anti-SCC-Ag antibodi pada permukaan IDE-TiO2 dan untuk meningkatkan batas deteksi. Karena telah terbukti bahwa permukaan yang diimobilkan biomolekul yang dikonjugasi emas meningkatkan deteksi target [32, 33], di sini, SCC-Ag terdeteksi dan dibandingkan dengan permukaan IDE-TiO2 yang dimodifikasi antibodi dan antibodi GNS. Seperti digeneralisasi di tempat lain, dengan peningkatan luas permukaan nanopartikel, akan terjadi peningkatan pada pelampasan biomolekul. Dalam konteks ini, GNS memiliki luas permukaan yang lebih besar dibandingkan nanopartikel emas bola. Untuk menerapkan ide ini, eksperimen saat ini dilakukan menggunakan GNS untuk meningkatkan sensitivitas.
Karakterisasi Permukaan dan Imobilisasi Antibodi GNS
Gambar 1 menunjukkan representasi skematis deteksi SCC-Ag pada permukaan sensor IDE-TiO2. Seperti ditampilkan pada Gambar 1a, awalnya, permukaan sensor IDE dilapisi TiO2 dan kemudian antibodi diimobilkan dengan atau tanpa konjugasi GNS. Permukaan yang dimodifikasi antibodi ini digunakan untuk mendeteksi tingkat SCC-Ag. Sebelum melakukan deteksi, konjugasi GNS dengan antibodi dikonfirmasi oleh spektroskopi UV-Vis. Profil pemindaian GNS dengan rentang panjang gelombang yang diinginkan sebelum dan setelah konjugasi dengan antibodi ditentukan. Terlihat jelas bahwa setelah imobilisasi, pergeseran bergerak dari 535 hingga 545 nM (Gambar 1b). Hasil ini mengonfirmasi konjugasi antibodi pada permukaan GNS. Di sisi lain, permukaan sensor yang diproduksi diamati secara morfologis. Gambar 2a menampilkan gambar mikroskop daya tinggi, sedangkan Gambar 2b menggambarkan gambar yang ditangkap dari gambaran nanoprofiler 3D. Kedua profil gambaran jelas ditampilkan dengan wilayah celah dan elektroda, yang membentuk jari-jari. Susunan celah dan jari tampak seragam dan utuh.
a Representasi skematis untuk deteksi SCC-Ag. Permukaan IDE-TiO2 dimodifikasi menjadi amina oleh APTES diikuti oleh imobilisasi antibodi atau antibodi GNS. Grup amina dari APTES bereaksi dengan grup karboksil pada antibodi. SCC-Ag terdeteksi oleh interaksi di wilayah antigen dan dibandingkan. b Pengukuran spektroskopi UV-Vis dengan GNS. Pemindaian dilakukan di wilayah antara 480 dan 560 nM, dan puncak maksimum ~ 530 nM. GNS dengan dan tanpa antibodi ditunjukkan oleh panah
a Gambar mikroskop daya tinggi pada permukaan IDE. Gambar ditangkap pada × 50. b Gambar nanoprofiler 3D pada permukaan IDE. Gambar ditangkap pada × 50. Wilayah elektroda dan celah ditampilkan. Celah ditunjukkan oleh bintang. Susunan seragam menunjukkan pembuatan yang berhasil. c Gambar mikroskop gaya atom. AFM menunjukkan diskriminasi jelas antara TiO2 dan GNS dengan titik gelap dan terang, masing-masing. d Gambar mikroskop transmisi sinar emis. e Analisis sinar X dispersif energi. Menunjukkan elemen yang ditemukan pada permukaan
Perbandingan Imobilisasi Antibodi dan Antibodi GNS pada Permukaan Sensor IDE-TiO2
SCC-Ag terdeteksi pada permukaan IDE-TiO2 oleh permukaan yang diimobilkan antibodi atau antibodi GNS. Penambahan GNS pada permukaan TiO2 dikonfirmasi oleh AFM, observasi SEM, dan analisis EDX (Gambar 2c). Di bawah observasi AFM, diskriminasi jelas telah diperhatikan antara TiO2 dan GNS dengan titik gelap dan terang, masing-masing. Ini didukung oleh analisis SEM dan EDX, di mana puncak emas yang mencolok dan titanium yang sedang diamati. Hasil ini memberikan bukti terjadinya GNS pada permukaan TiO2. Gambar 3 menunjukkan proses imobilisasi antibodi dan antibodi GNS pada permukaan sensor IDE-TiO2 yang dimodifikasi amina. Permukaan sensor IDE yang dimodifikasi TiO2 menunjukkan tingkat arus sebesar 4,65E−12 (Gambar 3a). Setelah penambahan APTES, tingkat arus meningkat menjadi 5,37E−11; peningkatan arus ini menunjukkan bahwa permukaan dimodifikasi menjadi amina oleh APTES. Ketika antibodi diimobilkan, tingkat arus berubah dari 5,375E−11 menjadi 1,05E−9. Perbedaan arus diperhatikan sebesar 1,04E−9 (Gambar 3a). Imobilisasi ini terjadi karena interaksi kimia antara grup amina dari APTES dan grup COOH pada antibodi [18]. Perubahan arus mengonfirmasi ikatan antibodi pada permukaan yang dimodifikasi APTES. Setelah itu, sisa permukaan ditutupi oleh 1 M etanolamina untuk mengurangi efek biofouling dari ikatan non-spesifik biomolekul pada permukaan sensor. Demikian pula, antibodi GNS diimobilkan pada permukaan IDE-TiO2, dan ketika antibodi GNS diimobilkan pada permukaan yang dimodifikasi APTES, tingkat arus meningkat dari 4,41E−12 menjadi 1,23E−9 (Gambar 3b). Terjumpa jelas bahwa ketika antibodi diimobilkan pada permukaan GNS, ini menunjukkan respons yang lebih tinggi pada permukaan yang dimodifikasi amina. Ini mungkin karena lebih banyak antibodi terikat pada permukaan satu GNS dan ikatan yang kuat dari kompleks ini pada permukaan yang dimodifikasi amina. Ikatan ini terjadi karena grup terminal amino dalam APTES menggantikan grup sitrat pada GNS dan secara kimiawi diatasi pada permukaan IDE yang dimodifikasi APTES [34]. Hal yang diketahui adalah bahwa deteksi biomolekul pada permukaan sensor terutama bergantung pada dua faktor, yaitu affinensi ikatan molekul interaktif dan imobilisasi yang tepat molekul pada permukaan sensor. Imobilisasi biomolekul yang lebih tinggi pada permukaan sensor secara drastis meningkatkan deteksi target pada tingkat yang lebih rendah. Dalam penelitian ini, GNS digunakan untuk mengimobilkan anti-SCC-Ag antibodi pada permukaan IDE-TiO2 guna meningkatkan kesempatan ikatan antibodi yang lebih tinggi, yang mengarah pada deteksi SCC-Ag yang efisien.
Proses imobilisasi pada permukaan IDE-TiO2. a Dengan antibodi. b Dengan antibodi GNS. Modifikasi permukaan dimulai oleh 3% APTES, diikuti oleh aktivasi EDC dan NHS untuk mengimobilkan antibodi; 1 M etanolamina digunakan untuk menutupi wilayah antibodi yang tidak terlekat. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V pada langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Perubahan arus yang tepat setelah setiap imobilisasi mengonfirmasi ikatan antibodi dan antibodi GNS pada permukaan sensor
Deteksi Komparatif SCC-Ag pada Permukaan IDE-TiO2 oleh Antibodi atau Antibodi GNS
Karena antibodi GNS menunjukkan imobilisasi yang efisien pada permukaan IDE-TiO2, konsentrasi SCC-Ag 1 nM yang sama terdeteksi pada permukaan antibodi dan antibodi GNS dan perubahan tingkat arus dibandingkan. Gambar 4a menunjukkan deteksi SCC-Ag 1 nM pada permukaan yang dimodifikasi antibodi. Sebelum melakukan deteksi, permukaan yang dimodifikasi antibodi ditutupi oleh agen pemblokir etanolamina untuk menghindari ikatan non-spesifik biomolekul. Ethanolamina menunjukkan perubahan arus sebesar 4,65E−12. Setelah menambahkan 1 nM SCC-Ag, tingkat arus meningkat menjadi 1,33E−09. Perubahan arus ini secara jelas menunjukkan ikatan SCC-Ag ke antibodi-nya. Dalam kasus permukaan antibodi GNS, etanolamina menunjukkan tingkat arus sebesar 1,33E−11; setelah menambahkan 1 nM SCC-Ag, ini meningkat menjadi 1,62E−09 (Gambar 4b). Perubahan arus dengan antibodi GNS lebih tinggi dibandingkan hanya permukaan yang dimodifikasi antibodi untuk konsentrasi SCC-Ag yang sama. Ini mungkin karena jumlah lebih banyak antibodi yang terikat pada permukaan IDE-TiO2 melalui GNS.
Deteksi SCC-Ag dengan a antibodi dan b antibodi GNS. Diuji pada permukaan IDE-TiO2 dengan langkah-langkah di atas hingga 1 M pemblokiran etanolamina. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V pada langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Setelah interaksi 1 nM SCC-Ag, tingkat arus meningkat dalam kedua kasus; pada saat yang sama, ini menunjukkan perubahan arus yang lebih tinggi dengan antibodi GNS
Batas Deteksi SCC-Ag pada Permukaan IDE-TiO2 oleh Antibodi atau Antibodi GNS
Permukaan yang dimodifikasi antibodi atau antibodi GNS menunjukkan deteksi yang jelas dari SCC-Ag, dan batas deteksi diperkirakan pada kedua permukaan untuk perbandingan (Gambar 5a, b). Untuk itu, konsentrasi dari 10 fM hingga 1 nM SCC-Ag diencerkan dan ditetes pada permukaan ini secara individu dan dicatat perubahan arus. Gambar 5a menunjukkan konsentrasi yang berbeda dari ikatan SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi. Setelah etanolamina, 10 fM SCC-Ag bereaksi, dan tidak ada perubahan arus yang diperhatikan. Ketika meningkat konsentrasi menjadi 100 fM, terdapat perubahan kecil dalam arus dari 4,65E−12 menjadi 6,54E−11. Selanjutnya, konsentrasi ditingkatkan menjadi 1 pM, 10 pM, 100 pM, dan 1 nM, dan tingkat arus meningkat menjadi 4,69E−10, 7,91E−10, 8,78E−10, dan 1,33E-09, masing-masing. Hasil ini secara jelas menunjukkan bahwa dengan meningkatnya konsentrasi, ikatan juga meningkat. Batas deteksi dihitung berdasarkan 3σ, dan berada pada 100 fM (Gambar 6a).
Interaksi bergantung pada dosis dengan a antibodi dan b antibodi GNS pada permukaan IDE-TiO2. Permukaan berada dengan langkah-langkah di atas hingga 1 M pemblokiran etanolamina. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V pada langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Konsentrasi SCC-Ag dari 10 fM hingga 10 nM bereaksi pada kedua permukaan, dan perubahan arus diperhatikan. Pencucian dilakukan dengan lima volume reaksi pada setiap langkah menggunakan 10 mM PBS (pH 7,4). Dengan meningkatnya konsentrasi SCC-Ag, tingkat arus secara bertahap meningkat dalam kedua kasus. Antibodi GNS menunjukkan perubahan arus dari 10 fM, sementara perubahan dari 100 fM diperhatikan dengan hanya antibodi. Dalam kedua kasus (antibodi dan antibodi GNS), 1 nM SCC-Ag menampilkan saturasi. Ketika konsentrasi ditingkatkan lebih lanjut, tidak ada perubahan signifikan dalam arus yang dapat diamati
Perbandingan perubahan arus dengan konsentasi yang berbeda dari SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi dan antibodi GNS. a Grafik regresi linier untuk batas deteksi SCC-Ag. Dengan antibodi (garis merah) dan dengan antibodi GNS (garis biru) ditampilkan. Batas deteksi ditemukan sebesar 10 fM dengan antibodi GNS dan 100 fM dengan hanya antibodi. b Perubahan arus dengan interaksi SCC-Ag dan antibodi. Dengan semua konsentrasi, tingkat perubahan arus yang lebih tinggi ditemukan pada permukaan antibodi GNS. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V pada langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Bar error menunjukkan nilai rata-rata dari triplikata (n = 3) dengan simpangan baku dalam rentang ± 0,1 hingga 0,15 × 10−9 A. Batas deteksi (LOD) dianggap konsentrasi terendah analit (dari garis kalibrasi pada konsentrasi rendah) terhadap sinyal latar belakang (S/N = 3:1), dengan kata lain, LOD = simpangan baku baseline + 3σ
Konsentrasi yang sama dari SCC-Ag bereaksi secara independen pada permukaan yang dimodifikasi antibodi GNS. Ketika 10 fM SCC-Ag ditetes pada permukaan, ini secara jelas mengubah arus dari 1,33E−11 menjadi 3,74E−11. Hasil ini menunjukkan bahwa bahkan 10 fM SCC-Ag dapat secara jelas bereaksi dengan permukaan yang diimobilkan antibodi GNS, yang tidak dapat terdeteksi dalam kasus dengan hanya antibodi. Selain itu, ketika konsentrasi ditingkatkan menjadi 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, dan 1 nM, tingkat arus meningkat lebih lanjut menjadi 4,69E−10, 9,23E−10, 1,41E−09, 1,48E−09, dan 1,62E−09, masing-masing (Gambar 5b). Perhitungan statistik dengan simpangan baku berada dalam rentang ± 0,1 hingga 0,15 × 10−9 A. Ketika dibandingkan dengan sensori pada dua permukaan di atas, permukaan yang dimodifikasi antibodi GNS menunjukkan perubahan arus yang lebih tinggi dengan semua konsentrasi SCC-Ag yang diuji (Gambar 6b). Berdasarkan 3σ, dapat ditemukan batas deteksi sebesar 10 fM (Gambar 6a), ini 10 kali lebih baik (lebih rendah) deteksi dibandingkan dengan hanya permukaan yang dimodifikasi antibodi. Perhitungan statistik dengan simpangan baku berada dalam rentang ± 0,1 hingga 0,15 × 10−9 A. Sebelumnya, SCC-Ag telah dievaluasi pada berbagai nanomaterial, seperti nanopartikel strontium dan grafen; namun, permukaan ini menunjukkan sensitivitas ~ 1000 kali lipat lebih rendah dibandingkan dengan studi saat ini [35].
Deteksi Selektif SCC-Ag pada Permukaan yang Dimodifikasi Antibodi/Antibodi GNS
Deteksi selektif SCC-Ag dibandingkan dengan dua protein kontrol, yaitu serpin dan albumin yang melimpah dalam aliran darah. Serpin adalah penghambat protease yang melakukan berbagai fungsi fisiologis manusia dan proses biologis, sedangkan albumin mencatat 45 mg mL−1 dan menyumbang 50–70% dalam serum darah. Seperti ditunjukkan pada gambar, konsentrasi 1 nM dari dua protein kontrol ini dan SCC-Ag ditetes secara individu pada permukaan antibodi atau antibodi GNS (Gambar 7a); terlihat jelas bahwa perubahan arus hanya diperhatikan dengan SCC-Ag dalam kedua kasus, menunjukkan bahwa antibodi hanya mampu mengenali SCC-Ag. Tidak ada perubahan signifikan yang diperhatikan dalam arus dengan interaksi protein kontrol. Eksperimen ini mengonfirmasi bahwa pengaturan eksperimen saat ini dapat secara spesifik mendeteksi/mendiagnosis SCC-Ag. Dukungan lebih lanjut diberikan oleh eksperimen kontrol lainnya dengan interaksi SCC-Ag dengan GNS saja dan SCC-Ag dengan permukaan IDE-TiO2 yang dilapisi GNS yang dilabeli antibodi non-imun. Tidak ada perubahan signifikan dalam arus yang diperhatikan dibandingkan dengan interaksi spesifik (Gambar 7b).
a Deteksi selektif SCC-Ag pada permukaan yang dimodifikasi antibodi dan antibodi GNS. Interaksi dengan C1-serpin dan C-2-albumin dilakukan. Permukaan berada dengan langkah-langkah di atas hingga 1 M pemblokiran etanolamina. Nilai dirata-ratakan oleh triplikata. Dalam kedua kasus, antibodi hanya mengenali SCC-Ag, menunjukkan deteksi spesifik. b Pengukuran kontrol. Interaksi spesifisitas dibandingkan dengan interaksi non-spesifik. Terdapat diskriminasi yang jelas yang diperhatikan. Sweep tegangan linier 0 hingga 2 V pada langkah tegangan 0,01 V diikuti untuk pengukuran. Bar error menunjukkan nilai rata-rata dari triplikata (n = 3) dengan simpangan baku dalam rentang ± 0,1 hingga 0,15 × 10−9 A
Kesimpulan
Kanker kepala dan leher adalah kanker umum yang mempengaruhi area mulut, tenggorong, dan kelenjar ludah. Diagnosis kanker kepala dan leher dengan biomarker yang sesuai adalah wajib untuk memberikan perawatan yang diperlukan kepada pasien dan meningkatkan gaya hidup mereka. SCC-Ag telah ditemukan sebagai salah satu biomarker penting untuk kanker; di sini, SCC-Ag terdeteksi pada permukaan sensor elektroda interdigitat yang dilapisi oksida titanium (IDE-TiO2). Antibodi untuk SCC-Ag diimobilkan pada permukaan IDE-TiO2 dan mendeteksi SCC-Ag. Batas deteksi ditemukan sebesar 100 fM, dan peningkatan lebih lanjut dalam batas deteksi dicapai dengan mengonjugasi antibodi dengan bintang emas (antibodi GNS). Batas deteksi meningkat 10 kali lipat (ke 10 fM), ini mungkin karena jumlah lebih banyak antibodi yang terikat pada permukaan TiO2 yang dimodifikasi amina melalui GNS. Selain itu, eksperimen kontrol dilakukan dengan dua protein berbeda dan tidak dapat dikenali oleh anti-SCC-Ag, menunjukkan deteksi selektif SCC-Ag. Permukaan sensor IDE-TiO2 yang ditunjukkan membantu mendiagnosis kanker kepala dan leher, sebuah strategi yang dapat diikuti untuk deteksi lebih awal.
