nanoliposom berdekorasi antibodi monoklonal PD-L1 sarat dengan Paclitaxel dan penghambat transportasi P-gp untuk kemoterapi sinergis melawan kanker lambung yang resistan terhadap berbagai obat
Abstrak
Resistensi multidrug (MDR) berdasarkan transporter penghabisan yang bergantung pada ATP (p-glikoprotein (p-gp)) tetap menjadi kendala utama dalam pengobatan kemoterapi yang berhasil. Di sini, kami telah menyelidiki potensi nanoliposom terkonjugasi PD-L1 mAb untuk berfungsi sebagai platform pengiriman yang ditargetkan untuk pengiriman bersama paclitaxel (PTX) dan penghambat transportasi khusus p-gp (TQD, tariquidar) pada kanker lambung yang resistan terhadap obat. . Dua obat, PTX dan TQD, dimuat bersama dalam satu kendaraan dalam rasio yang tepat untuk meningkatkan prospek efek kemoterapi kombinasi. Studi serapan seluler menunjukkan bahwa PD-PTLP memiliki efisiensi internalisasi yang lebih tinggi pada reseptor PD-L1 yang mengekspresikan sel SGC7901/ADR secara berlebihan daripada PTLP yang tidak ditargetkan. Sinergi tertinggi diamati pada fraksi berat 1/0,5 (PTX/TQD) dan kombinasi PTX dan TQD menghasilkan efek sinergis yang jelas dibandingkan dengan obat individu saja. Hasil in vitro kami menunjukkan bahwa TQD efektif dalam membalikkan resistensi multidrug dalam sel SGC7901/ADR. Nilai IC50 dari PD-PTLP adalah 0,76 g/ml dibandingkan dengan 6,58 g/ml dan 7,64 g/ml untuk PTX dan TQD, masing-masing. PD-TPLP memicu tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) dan apoptosis sel yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan PTX atau TQD bebas. Lebih lanjut, studi antitumor in vivo menunjukkan bahwa kemoterapi kombinasi PD-PTLP menunjukkan penghambatan signifikan beban tumor dari tumor xenograft yang resistan terhadap obat dengan sel positif terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) yang secara signifikan lebih tinggi. Selanjutnya, PTX bebas menghasilkan peningkatan kadar AST dan ALT yang signifikan sedangkan PD-PTLP tidak berbeda nyata dengan kontrol yang menunjukkan indeks keamanan. Secara keseluruhan, kami percaya bahwa kombinasi obat antikanker dengan inhibitor p-gp dapat memberikan arahan potensial menuju pengobatan tumor lambung yang resistan terhadap obat.
Pengantar
Perawatan kemoterapi saat ini berdasarkan rejimen obat tunggal jauh dari sempurna dan menderita efek samping yang parah pada dosis yang lebih tinggi dan secara bersamaan mengarah pada pengembangan resistensi obat [1]. Dekade terakhir telah menyaksikan kemanjuran terapi yang tinggi dari rejimen obat kombinasi dalam pengobatan kanker [2]. Kombinasi dua atau lebih obat telah ditunjukkan untuk menghasilkan kemanjuran antikanker sinergis karena tindakan farmakologis yang berbeda dari obat kombo [3, 4]. Namun, memilih kombinasi obat yang tepat tergantung pada beberapa faktor termasuk jenis sel kanker, obat hidrofilik/hidrofobik, aktivitas biokimia, dan pola farmakokinetik obat. Di antara semuanya, kombinasi obat bersifat selektif untuk jenis kanker tertentu [5].
Kanker lambung adalah beban kesehatan global dan penyebab paling umum kedua kematian terkait kanker di seluruh dunia. Prevalensi kanker lambung tinggi di Asia Timur seperti Jepang, Korea, dan Cina dengan laporan terakhir tingkat kematian tertinggi di dunia [6]. Rata-rata, 400.000 kasus baru terdaftar setiap tahun di Cina dan sebagian besar kasus didiagnosis pada stadium lanjut/lebih lanjut [7, 8]. Kemajuan luar biasa telah dibuat dalam strategi pengobatan; Namun, itu tidak meningkatkan tingkat kelangsungan hidup dan mengakibatkan kegagalan dalam terapi. Kegagalan pengobatan terutama dikaitkan dengan perkembangan kemoresistensi dan toksisitas parah dari dosis kemoterapi dan terulangnya episode kanker lambung [9]. Oleh karena itu, ada tugas mendesak untuk meningkatkan kemanjuran terapi dan mengatasi metastasis dan kekambuhan kanker lambung.
Paclitaxel (PTX) merupakan salah satu obat penting yang diindikasikan dalam pengobatan kanker lambung [10]. PTX menghambat replikasi sel dengan mengganggu degradasi mikrotubulus sehingga menyebabkan penghentian siklus sel. Namun, akuisisi resistensi multidrug (MDR) adalah kerumitan utama antara keberhasilan kemoterapi [11, 12]. Penghabisan yang bergantung pada ATP yang dimediasi oleh transporter transmembran dari keluarga kaset pengikat ATP (ABC) di mana p-glikoprotein (p-gp) dianggap sebagai faktor kemakmuran diekspresikan secara berlebihan pada kanker lambung [13]. Sebaliknya, PTX berfungsi sebagai substrat untuk reseptor p-gp di mana penghabisan obat akan mengurangi konsentrasi obat intraseluler yang menyebabkan kemanjuran rendah dan resistensi tinggi [14]. Dalam hal ini, Tariquidar (TQD) adalah penghambat p-gp generasi ketiga yang poten dan telah dilaporkan membalikkan ekspresi berlebih dari reseptor p-gp di beberapa sel kanker [15, 16]. Namun, laporan menyarankan bahwa pemberian TQD harus dihentikan lebih awal karena menghambat fungsi p-gp dari sistem fisiologis normal. Ekspresi P-gp diperlukan untuk mempertahankan sawar darah otak (BBB) dan membuang racun dari jaringan normal [17]. Karena p-gp hadir dalam jaringan normal dan bertindak sebagai penghalang terhadap racun seluler, penghambatan non-spesifik PTX atau TQD berpotensi mengganggu fungsi fisiologis normal dan menyebabkan toksisitas yang merugikan. Selain itu, PTX dan TQD adalah obat yang sangat lipofilik dengan kelarutan terbatas dalam larutan air dan darah sistemik, sehingga memerlukan sistem penghantaran obat yang stabil yang ditargetkan pada kanker lambung di dalam tubuh [18].
Sistem penghantaran obat (DDS) secara signifikan meningkatkan konsentrasi obat yang dienkapsulasi dalam jaringan kanker dan menawarkan pelepasan obat yang berkelanjutan untuk jangka waktu yang lama [19]. Dalam hal ini, liposom adalah salah satu pembawa obat yang banyak digunakan untuk meningkatkan kemanjuran terapi pada kanker. Liposom semakin penting karena biokompatibilitasnya, modifikasi permukaan struktural, pemuatan obat hidrofilik/lipofilik, dan kapasitas pemuatan obat yang tinggi [20]. Obat-obatan dapat secara stabil tergabung dalam lipid bilayer liposom dan mudah diberkahi kemampuan sirkulasi panjang (PEGylation) dengan efek permeasi dan retensi (EPR) yang ditingkatkan [21]. Baru-baru ini, liposom telah dilaporkan memiliki kemampuan untuk mempertahankan beberapa rasio obat setelah pemberian intravena [22]. Ide ini ditunjukkan pada tahun 2017 setelah persetujuan dari FDA, Vyxeos® (formulasi liposomal) yang mengandung rasio sitarabin:daunorubisin dalam pengobatan leukemia [23]. Dibandingkan dengan formulasi non-target, formulasi ligan-target sangat menarik dan prospektif. Dalam hal ini, PD-1 adalah reseptor permukaan sel yang dikenal untuk menurunkan regulasi sistem kekebalan dan menekan aktivitas inflamasi sel T. Ekspresi PD-L1 telah dilaporkan pada 50% pasien kanker lambung yang menjadikan PD-L1 sebagai reseptor penargetan untuk internalisasi nanopartikel [24, 25]. Antibodi monoklonal PD-L1 (mAb) secara khusus dapat mengikat domain ekstraseluler protein PD-L1 dan dapat menjadi strategi terapi yang sangat baik untuk meningkatkan kemanjuran antikanker [26].
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan pengiriman obat kombinasi, PTX dan TQD untuk meningkatkan kemanjuran antikanker terhadap kanker lambung. Untuk tujuan ini, PTX dan PD-L1/nanoliposome yang mengandung TQD diformulasikan dan dievaluasi untuk kemanjuran antikanker pada kondisi in vitro dan in vivo. Kemanjuran in vivo dievaluasi dalam model xenograft berbasis sel kanker lambung dan imunohistokimia (IHC) dilakukan.
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, pekerjaan kami mewujudkan terapi kombinasi melawan tumor MDR dengan strategi pengiriman terprogram. Kami telah menunjukkan potensi kombinasi PTX dan p-gp inhibitor (TQD) dalam menghambat beban tumor tumor xenograft SGC7901/ADR yang resisten terhadap berbagai obat. Pengiriman bersama PTX dan TQD dalam nanocarrier multifungsi memungkinkan kontrol rasiometrik obat antikanker yang dimuat bersama, menghambat pompa penghabisan p-gp, dan menunjukkan kemanjuran antikanker sinergis. Kami percaya bahwa kombinasi obat antikanker dengan penghambat p-gp dapat memberikan arahan potensial menuju pengobatan tumor yang resistan terhadap obat.
Telur fosfatidilkolin (EPC), 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamina-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] ( DSPE-PEG), dan DSPE-PEG2000-maleimide (DSPE-PEG2000-Mal) dicampur dalam larutan kloroform dengan perbandingan mol 3/2/0.5/0.25 beserta PTX dan TQD kemudian pelarut organik diuapkan menggunakan rotary evaporator dilanjutkan dengan pengeringan beku selama 3 jam. Lapisan lipid dihidrasi dengan larutan amonium sulfat 250 mM yang dipertahankan pada pH 7,0. Liposom multilamellar besar disonikasi selama 30 menit dalam sonikator tipe mandi (Branson ultrasonicbath, USA) yang dipertahankan pada 65 ° C. Liposom didialisis terhadap volume besar air suling selama 1 jam untuk menukar obat bebas dan komponen awal. Liposom didispersikan kembali dalam saline buffer fosfat (PBS, pH 7,4). PD-L1 mAb dikonjugasi ke liposom dengan mencampurkan rasio 8:1 (liposom:mAb) dan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 4 jam. PD-L1 mAb akan terkonjugasi ke DSPE-PEG2000-Mal dengan berinteraksi antara residu sulfhidril pada antibodi terhadap kelompok maleimida C-terminal liposom. Liposom terkonjugasi PD-L1 disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit dan supernatan dihilangkan dan didispersikan kembali dalam buffer PBS dan disimpan dalam suhu 4 ° C sampai analisis lebih lanjut. Jumlah PTX dan TQD yang terenkapsulasi dalam liposom dievaluasi dengan metode HPLC. Model sistem HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity yang dilengkapi dengan sampler otomatis Agilent Technologies dan detektor susunan dioda G1315D digunakan dalam penelitian ini. Fase gerak terdiri dari campuran asetonitril/air (70:30 v/v) dipertahankan pada laju alir 1 ml/menit. Kolom C18 (5 m, 150 × 60 mm, ODS-3) digunakan untuk mengelusi sampel dan dideteksi pada 227 nm. Sebelumnya, liposom bermuatan PTX/TQD dilarutkan dalam asetonitril dan divorteks selama 15 menit, disaring melalui filter 0,45 m, dan 10 l alikuot disuntikkan ke dalam kolom HPLC.
Distribusi ukuran dan analisis morfologi partikel
Distribusi ukuran dan potensi zeta dari formulasi drug-loaded ditentukan oleh Malvern zetasizer (UK) pada 25 °C. Sebelum percobaan yang sebenarnya, dispersi nanopartikel diencerkan 10x dengan air suling dan percobaan dilakukan pada sudut deteksi 90° dalam rangkap tiga. Morfologi nanopartikel dievaluasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM). Dispersi nanopartikel diencerkan 10x dengan air suling dan ditempatkan dalam kisi tembaga berlapis karbon dan dikeringkan menggunakan lampu IR dan kemudian sampel dievaluasi dengan TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Belanda)) setelah pewarnaan dengan uranil asetat (1% b/v).
Analisis profil rilis
Profil pelepasan PTX dan TQD dari nanoliposom dievaluasi dengan metode dialisis. Untuk tujuan ini, 15 mg bubuk terliofilisasi PTX terkonjugasi PD-L1 mAb dan nanoliposom bermuatan TQD (PD-PTLP) dilarutkan dalam 1 ml air suling dan disegel dalam membran dialisis (MWCO 3,5 kDa) dan direndam dalam a 30 ml buffer rilis masing-masing dipertahankan pada 37 ° C. Pada waktu yang telah ditentukan, alikuot sampel ditarik dan diganti dengan jumlah buffer rilis yang sama. Penelitian dilanjutkan selama 72 jam. Sampel disaring melalui filter spuit 0,22 m dan disuntikkan ke dalam kolom HPLC dan dievaluasi dengan metode yang disebutkan di atas.
Studi serapan seluler
Sel SGC7901/ADR dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 100 IU/ml penisilin dan 100 g/ml streptomisin dalam kondisi 5% CO2 atmosfer pada 37°C. Mikroskop pemindaian laser confocal (BX61WI; Olympus, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengevaluasi distribusi seluler dan serapan seluler PTLP dan PD-PTLP dalam sel SGC7901/ADR. Untuk mencapai tujuan ini, 1 × 10
5
sel-sel diunggulkan di setiap sumur dari pelat 12-sumur dan diinkubasi selama 18 jam. Sel-sel tersebut kemudian diekspos dengan PTLP dan PD-PTLP dan diinkubasi selama 3 jam. Sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin dan difiksasi dengan paraformaldehyde (PFA) 4% selama 10 menit. Sel-sel dicuci lagi dengan PBS dan diwarnai dengan 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) selama 10 menit. Akhirnya, sel-sel dicuci dengan hati-hati dan diamati di bawah CLSM. Eksperimen kompetitif pada penyerapan PD-PTLP dilakukan dengan perlakuan awal sel-sel bebas PD-L1 mAb selama 30 menit dan dicuci. Sel-sel dibagi menjadi dua kelompok, satu kelompok yang diberi PD-L1 mAb bebas dan kelompok lain yang tidak diberi mAb PD-L1 bebas. Sel-sel diinkubasi dengan PD-PTLP dan diinkubasi selama 3 jam dan metode yang sama diikuti untuk evaluasi analisis serapan seluler.
Ekspresi protein dengan uji Western blot
Sel SGC7901/ADR diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan penyemaian 3 × 10
5
sel/sumur dan diinkubasi selama 18 jam. Sel-sel diperlakukan dengan formulasi yang berbeda (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel dicuci dan diekstraksi dengan stripping buffer dan dilisiskan menggunakan buffer lisis standar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Sel-sel disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit dan supernatan dikumpulkan dan kuantifikasi protein dilakukan menggunakan uji protein BCA (Beyotime). Jumlah protein yang sama dimuat dalam gel SDS-PAGE 8% dan kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Membran diblokir dengan susu skim 5% selama 1 jam untuk menghambat situs pengikatan non-spesifik. Membran diinkubasi dengan antibodi primer (p-gp dan GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA) pada suhu 4 °C semalaman. Membran dicuci dengan TBST dan diinkubasi lagi dengan antibodi sekunder dari antibodi anti-kelinci atau -tikus berlabel lobak peroksidase (kelinci atau tikus, 1:10,000, Abcam, MA, USA) pada suhu kamar. Membran dicuci kembali dengan TBST. Bercak divisualisasikan di bawah metode chemiluminescence yang disempurnakan (EMD Millipore).
Analisis sitotoksisitas in vitro
Efek sitotoksik obat individu dan formulasi dievaluasi dengan uji MTT. Secara singkat, sel kanker berlapis dengan kepadatan 1 × 10
4
sel / sumur di piring 96-sumur dan diinkubasi selama 18 jam. Sel-sel tersebut kemudian diobati dengan PTX, TQD, PTLP, dan PD-PTLP gratis, masing-masing selama 24 jam. Selanjutnya, sel-sel dicuci dengan hati-hati dan ditambahkan 15 l larutan MTT 5 mg/ml dan diinkubasi selama 3 jam dan kemudian 100 l DMSO ditambahkan untuk mengekstrak kristal formazan. Absorbansi yang dihasilkan diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat mikro otomatis. Viabilitas sel dihitung dengan OD kelompok uji/OD kontrol × 100%. Indeks kombinasi dievaluasi oleh Calcusyn
TM
perangkat lunak. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Apoptosis in vitro dan analisis spesies oksigen reaktif
Untuk uji apoptosis, sel kanker berlapis dengan kepadatan 2 × 10
5
sel / sumur di piring 12-sumur dan diinkubasi selama 18 jam. Sel-sel tersebut kemudian diobati dengan PTX, TQD, PTLP, dan PD-PTLP gratis, masing-masing selama 24 jam. Sel-sel diekstraksi dengan stripping dan disentrifugasi dan pelet didispersikan kembali dalam 100 l buffer pengikat. Sel-sel diwarnai bersama dengan kombinasi 5 l Annexin-V/FITC dan 2,5 l larutan kerja PI dan diinkubasi selama 15 menit. Sel-sel yang diwarnai dianalisis dengan flow cytometer menggunakan BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA). Annexin-V dan PI masing-masing mewakili indikator apoptosis awal dan indikator apoptosis akhir berdasarkan komponen struktural sel hidup dan sel mati.
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) digunakan sebagai penyelidikan untuk analisis spesies oksigen reaktif (ROS). Untuk analisis kuantitatif, 1 × 10
4
sel / sumur diunggulkan dalam pelat dasar hitam 96 sumur dan diinkubasi selama 18 jam. Sel-sel tersebut kemudian diobati dengan PTX, TQD, PTLP, dan PD-PTLP gratis, masing-masing selama 24 jam. Sel-sel dicuci dengan buffer PBS dan kemudian diinkubasi dengan 1 ml larutan DCFH-DA sesuai pedoman pabrik selama 30 menit. Diikuti oleh sel yang dilisis dan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke pelat 96-sumur baru dan fluoresensi diukur pada 485 nm menggunakan pembaca pelat mikro otomatis. Secara bersamaan, kumpulan sel terpisah diproses dengan cara yang sama dan gambar diamati menggunakan mikroskop fluoresensi (Nikon A1, Jepang).
Efikasi antitumor PD-PTLP dalam model xenograft
Studi kemanjuran antitumor dilakukan pada tikus telanjang BALB/c dan diperoleh dari Pusat Hewan Laboratorium, Rumah Sakit Afiliasi Keempat Universitas Kedokteran Harbin, Harbin. Semua hewan percobaan dilakukan sesuai dengan standar nasional kualitas hewan laboratorium. Eksperimen dilakukan secara ketat sesuai dengan pedoman Komite Peraturan untuk Hewan Eksperimental dari Rumah Sakit Afiliasi Keempat Universitas Kedokteran Harbin, Harbin. Hewan-hewan disuntik secara subkutan dengan 1 × 10
6
Sel SGC7901/ADR dalam 150 l media kultur di sayap kanan tikus. Tumor dibiarkan tumbuh hingga 100 mm
3
sebelum percobaan yang sebenarnya. Tikus-tikus tersebut dibagi rata menjadi lima kelompok dengan masing-masing kelompok berjumlah delapan ekor. Dosis individu PTX dan TQD ditetapkan pada 5 mg/kg, sedangkan kombinasi menggunakan dosis total 5 mg/kg. Penyuntikan vena ekor dilakukan setiap hari ketiga, total dilakukan tiga kali penyuntikan. Pada hari-hari yang telah ditentukan, volume tumor dan berat badan diukur. Volume tumor dihitung dengan mengukur diameter terpanjang dan diameter terpendek tumor menggunakan jangka sorong digital. Volume tumor (V ) =× panjang × lebar (mm)
2
. Tikus dikorbankan pada akhir penelitian dan tumor diekstraksi dan ditimbang. Tumor menjadi sasaran analisis imunohistokimia (IHC). Tumor diekstraksi, diiris tipis, dan difiksasi dalam larutan formalin 10%. Tumor tertanam dalam lilin parafin dan kemudian melakukan uji TUNEL sesuai dengan pedoman pabrik.
Analisis biokimia serum
Tikus diberikan dengan formulasi masing-masing; 24 jam kemudian, tikus dikorbankan dan sampel darah dikumpulkan dari kontrol serta kelompok hewan yang diberi perlakuan uji. Serum dipisahkan dari darah utuh dan disimpan dalam suhu -80 °C sampai analisis lebih lanjut. Analisis biokimia serum dilakukan untuk menilai kinerja hati. Aspartat transaminase (AST) dan alanine transaminase (ALT) diukur untuk mengevaluasi fungsi hati. Semua pengukuran dilakukan sesuai dengan prosedur uji kit biokimia.
Hasil dan diskusi
Persiapan dan karakterisasi nanoliposom terkonjugasi PD-L1 yang dimuat PTX/TQD
PTX telah banyak digunakan di klinik dan terutama diindikasikan dalam pengobatan kanker lambung. Namun, sebagian besar pasien tampaknya menderita respon terapeutik yang buruk karena resistensi multidrug (MDR) dari kanker lambung. Peningkatan dosis PTX mengakibatkan peningkatan toksisitas sistemik sehingga MDR menjadi kendala utama dalam keberhasilan pengobatan terapi kanker. Di antara kebanyakan mekanisme MDR, penghabisan obat yang dimediasi p-gp dianggap bertanggung jawab atas resistensi obat dalam sel kanker [27]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menggunakan obat kedua (TQD) sebagai penghambat p-gp untuk mengatasi fenomena MDR pada sel kanker dan meningkatkan efikasi antikanker PTX. Kami telah mempelajari fraksi berat dua obat dengan hati-hati di mana mereka menunjukkan efek sinergis. Untuk memaksimalkan efek antikanker, penting untuk memberikan beberapa obat dalam sistem nanopartikel tunggal. Pengiriman dua obat (PTX dan p-gp inhibitor) secara bersamaan akan memungkinkan penekanan mekanisme penghabisan obat yang efisien dan meningkatkan prospek peningkatan konsentrasi intraseluler dalam sel kanker [28]. Untuk tujuan ini, dalam penelitian ini, kami telah memuat dua obat dalam lapisan ganda lipid nanoliposom yang dianggap sangat stabil dalam sirkulasi sistemik (Gbr. 1). Untuk mencapai penargetan spesifik tumor yang ditingkatkan, nanoliposom dikonjugasi permukaan dengan PD-L1 mAb. Gugus maleimida yang ada pada nanoliposom akan berikatan dengan gugus tiol dari PD-L1 mAb dan membentuk ikatan kovalen yang stabil. Tetapi batasan yang mungkin dari konjugasi maleimida adalah bahwa reaksinya reversibel:produk mungkin mengalami reaksi adisi retro-Michael dengan tiol biologis dalam plasma yang dapat menyebabkan pelepasan maleimida. Namun, kami telah mengatasi reaksi tersebut dengan konjugasi permukaan maksimum antibodi pada liposom maleimida. Telah dilaporkan bahwa ligan penargetan tumor akan secara khusus mengirimkan beban terapeutik dalam jaringan tumor dan menghindari efek samping yang tidak perlu pada jaringan normal. Sebelumnya, Patel et al. melaporkan bahwa penggabungan p-gp inhibitor dengan PTX dapat mengatasi MDR pada sel kanker ovarium pada kondisi in vitro [11]. Demikian pula, Zou et al. dan Zhang dkk. melaporkan bahwa sitotoksisitas PTX terhadap sel-sel multidrug-resistant SKOV-3TR dan A2780-Adr meningkat secara signifikan dengan adanya Tariquidar. Namun, dalam studi ini, baik kombinasi fisik PTX + TQD digunakan atau pembawa non-target dikembangkan [29, 30]. Yang penting, semua penelitian ini hanya dilakukan pada kondisi in vitro. Penelitian ini berfokus pada perancangan nanocarrier yang ditargetkan menggunakan kelas agen penargetan yang relatif baru, antibodi PDL1. Selain itu, penelitian ini menunjukkan kemanjuran PTX + TQD dalam model tumor xenograft dan juga menilai parameter darah yang berhubungan dengan toksisitas sistemik.
Ilustrasi skema pemuatan paclitaxel dan tariquidar dalam nanoliposom terkonjugasi permukaan antibodi monoklonal (mAb) PD-L1. Liposom dibuat dengan hidrasi film lipid tipis dan disonikasi untuk membentuk nanoliposom yang mengandung obat.
Ukuran partikel rata-rata PTLP adalah 135,6 ± 1,26 nm dan meningkat menjadi 168,59 ± 1,34 nm setelah konjugasi dengan PD-L1 mAb (PD-PTLP). Ukuran partikel meningkat karena berat molekul besar PD-L1 mAb; namun demikian, ukuran keseluruhan kurang dari 200 nm dan bentuk sferis adalah poin yang perlu diperhatikan (Gbr. 2a). Ukuran nanopartikel kurang dari 200 nm akan memungkinkan akumulasi yang lebih tinggi dalam jaringan tumor karena efek permeasi dan retensi (EPR) yang ditingkatkan. Selain itu, keberadaan PEG akan memungkinkan waktu sirkulasi darah yang lebih lama dalam sirkulasi sistemik. Potensi zeta PD-PTLP adalah 22,1 ± 1,21 mV yang tidak akan memungkinkan pengikatan non-spesifik ke komponen darah. PD-PTLP menunjukkan efisiensi jebakan yang tinggi ~ 95% untuk kedua obat (PTX dan TQD). PD-PTLP juga menunjukkan pemuatan obat yang tinggi masing-masing 12-14% b/b untuk PTX dan TQD (Gbr. 2b).
Karakterisasi fisikokimia nanoliposom terkonjugasi PD-L1 yang dimuat PTX / TQD. a Analisis morfologi PD-PTLP menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). b Kapasitas pemuatan obat PD-PTLP. c Pelepasan in vitro PTX dan TQD dari PD-PTLP pada buffer pH 7,4 dan kondisi buffer pH 5,0 pada 37 °C. **p <0,01 adalah perbedaan statistik dalam pelepasan obat antara pH 7,4 dan pH 5,0 buffer
Pelepasan obat in vitro
Perilaku pelepasan PTX dan TQD dari PD-PTLP dipelajari pada kondisi pH 7,4 dan pH 5,0 pada suhu 37 °C. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, pelepasan obat yang terkontrol (PTX dan TQD) diamati dari PD-PTLP selama periode penelitian (72 jam). Pelepasan obat dari lapisan ganda nanoliposome yang tebal dapat menyebabkan pelepasan dua obat yang lambat dan berkelanjutan dari PD-PTLP. Harus dicatat bahwa tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada pola pelepasan PTX dan TQD pada pH 7,4 dan pH 5,0. Pada titik waktu yang lebih lama, perbedaan yang signifikan adalah pelepasan diamati pada kondisi pH yang berbeda. Perlu dicatat bahwa tidak ada elemen yang responsif terhadap pH yang ditambahkan dalam nanoliposom dan pelepasan obat yang lebih tinggi dalam kondisi asam dapat dikaitkan dengan difusi yang lebih tinggi pada pH yang lebih rendah. Misalnya, ~ 85% PTX dilepaskan dalam kondisi pH 5,0 dibandingkan dengan ~ 55% pelepasan obat pada lingkungan pH fisiologis. Pola serupa dari pelepasan molekul kecil yang cepat pada kondisi asam dan pelepasan yang lebih lambat dalam kondisi pH basa telah ditunjukkan oleh peneliti lain. Namun demikian, pelepasan obat yang relatif rendah dalam kondisi pH 7,4 dapat mengurangi efek samping sistemik yang tidak perlu dan memperpanjang sirkulasi sistemik sementara pelepasan obat yang lebih tinggi pada pH 5,0 mungkin bermanfaat bagi kemanjuran terapi yang lebih tinggi dalam jaringan tumor.
Analisis serapan seluler in vitro
Efisiensi pengiriman nanoliposom yang ditargetkan (PD-PTLP) dan non-target (PTLP) diuji dalam SGC7901/ADR. Serapan seluler dievaluasi menggunakan rhodamin-B sebagai pelacak fluoresensi. Rhodamin-B adalah fluorofor yang umum digunakan tanpa interaksi biologis sel. Nukleus diwarnai dengan DAPI berwarna biru dan warna merah berasal dari nanopartikel. Data CLSM dengan jelas mengungkapkan bahwa PD-PTLP menunjukkan fluoresensi merah yang kuat dalam sel kanker dibandingkan dengan PTLP yang tidak ditargetkan. Fluoresensi merah yang lebih tinggi pada sel kanker yang diobati dengan PD-PTLP dikaitkan dengan internalisasi nanopartikel yang lebih tinggi (Gbr. 3a). Hasil data CLSM menunjukkan bahwa reseptor PD-L1 yang diekspresikan pada membran sel dikenali oleh PD-L1 mAb yang terkonjugasi pada permukaan nanoliposom. Mekanisme penyerapan non-spesifik atau pasif terbukti dalam sel kanker yang diobati dengan PTLP. Spesifisitas target PD-L1 dikonfirmasi lebih lanjut oleh eksperimen pra-perawatan PD-L1 mAb. Sel-sel SGC7901/ADR diberi perlakuan awal dengan PD-L1 mAb dan diinkubasi selama 30 menit. Sel-sel tersebut kemudian diekspos dengan PD-PTLP dan PTLP dan diinkubasi selama 3 jam. Seperti yang ditunjukkan (Gbr. 3b), sel yang diberi pra-perawatan dengan PD-L1 mAb menunjukkan fluoresensi merah yang jauh lebih sedikit dibandingkan dengan sel yang tidak diobati yang menunjukkan bahwa PD-L1 mAb dikonsumsi oleh reseptor yang diekspresikan permukaan dan tidak ada reseptor tambahan yang tersedia untuk mengikat dan internalisasi menghasilkan lebih sedikit penyerapan nanopartikel dan lebih sedikit internalisasi. CLSM ini dengan jelas mengungkapkan spesifisitas penargetan PD-PTLP dalam sel kanker SGC7901/ADR.
a Gambar mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dari sel SGC7901/ADR setelah inkubasi dengan PTLP dan PD-PTLP selama 3 jam; Gambar CLSM dari sel SGC7901/ADR yang diberi perlakuan sebelumnya dengan/tanpa PD-L1 mAb setelah inkubasi dengan PD-PTLP selama 3 jam. Rhodamin B digunakan sebagai pelacak fluoresen dan DAPI digunakan untuk mewarnai inti sel kanker
Nanoliposom bermuatan obat ganda meningkatkan efek antiproliferatif
Untuk terapi kombinasi, rasio yang berbeda dari dua obat (PTX dan TQD) digunakan untuk menentukan sejauh mana efek sinergis atau aditif pada sel kanker lambung yang resisten. Untuk menghitung isobologram dan indeks kombinasi (CI), digunakan perangkat lunak CalcuSyn (Biosoft, Versi 2.1). Plot isobologram dapat dijelaskan berdasarkan persamaan Chou-Talalay. Nilai CI dicirikan oleh sinergis (CI < 0.9), aditif (CI =1), dan antagonis (CI> 1). Seperti yang ditunjukkan, semua rasio kombinasi PTX dan TQD menunjukkan nilai CI <-1 menandakan mekanisme aksi sinergis (Gbr. 4a). Secara spesifik, sinergi tertinggi diamati pada fraksi berat 1/0,5 (P/T) sedangkan tingkat sinergi menurun dengan peningkatan fraksi berat TQD yang menunjukkan pentingnya keberadaan dua obat dalam fraksi berat spesifik. Konsentrasi TQD yang terlalu rendah dan terlalu tinggi dalam rejimen kombinasi tidak menghasilkan efek sinergis terbaik. Untuk semua percobaan in vitro, kami telah menggunakan rasio P/T =1/0,5 dalam penelitian ini.
a Indeks kombinasi (CI) dari berbagai fraksi berat PTX dan TQD dalam sel SGC7901/ADR. Indeks kombinasi dievaluasi oleh Calcusyn
TM
perangkat lunak. b Viabilitas sel in vitro sel SGC7901/ADR setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi PTX bebas, TQD, PTLP, dan PD-PTLP selama masa inkubasi 24 jam. c Analisis western blot dari ekspresi p-gp dalam sel SGC7901/ADR setelah perawatan dengan formulasi masing-masing. **p <0,01 dan ***p <0,001 adalah perbedaan statistik antara PTX bebas dan kelompok yang diobati dengan PD-PTLP
Efek sitotoksik in vitro dari obat individu maupun obat kombinasi ditentukan oleh protokol MTT setelah inkubasi 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, NP kosong tidak memiliki efek apa pun pada viabilitas sel yang mengesampingkan kemungkinan gangguan apa pun pada hasil akhir. Monoterapi dengan PTX dan TQD menunjukkan efek sitotoksik tergantung konsentrasi pada sel kanker lambung yang resisten; itu tidak cukup efektif dalam pengobatan. Efek anti-proliferatif dari agen tunggal sangat meningkat ketika dikombinasikan dengan obat kedua yang dienkapsulasi dalam nanoliposom. Kombinasi PTX dan TQD menghasilkan efek sinergis yang jelas dibandingkan dengan obat individu saja. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.
In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.
Apoptosis analysis by flow cytometer
Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.
a Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. b Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. ***p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group
Intracellular ROS level determination
We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.
Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors
Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm
3
, ~ 1650 mm
3
, 1625 mm
3
, ~ 1000 mm
3
, and ~ 650 mm
3
, masing-masing. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].
In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; a tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. *p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.
Systemic toxicity analysis
The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.
Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; a mice body weight analysis; b , c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. *p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group
Ketersediaan data dan materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan file informasi tambahannya.
Singkatan
EPR:
Peningkatan permeasi dan efek retensi
PD-PTLP:
PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes
