microRNA-18a dari M2 Makrofag Menghambat TGFBR3 untuk Mempromosikan Perkembangan Karsinoma Nasofaring dan Pertumbuhan Tumor melalui Jalur Sinyal TGF-β
Abstrak
Tujuan
Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan salah satu jenis penyakit nasofaring dengan sifat metastasis dan invasi yang tinggi. Makrofag aktif (M2) alternatif terkait tumor terbukti terhubung dengan NPC. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi mekanisme dan partisipasi microRNA-18a (miR-18a) dari makrofag M2 di NPC.
Metode
Sel mononuklear darah tepi dibedakan menjadi makrofag dan makrofag dipolarisasi menjadi tipe M2 oleh interleukin-4. Sel SUNE-1 dan CNE2 ditransfeksi dengan miR-18a yang dipulihkan atau habis atau mengubah reseptor faktor-beta III pertumbuhan (TGFBR3) untuk mengeksplorasi peran mereka dalam perkembangan NPC dengan keterlibatan jalur pensinyalan TGF-β. Selanjutnya, sel SUNE-1 dan CNE2 dikultur bersama dengan makrofag M2 yang telah diobati dengan miR-18a atau TGFBR3 yang dipulihkan atau habis untuk memahami peran gabungan mereka dalam NPC dengan keterlibatan jalur pensinyalan TGF-β.
Hasil
MiR-18a sangat diekspresikan dan TGFBR3 diekspresikan dengan rendah dalam sel NPC. Restorasi MiR-18a, knockdown TGFBR3 atau kultur bersama dengan miR-18a meniru, atau makrofag M2 yang ditransfeksi si-TGFBR3 mempromosikan perkembangan sel SUNE-1, pertumbuhan tumor pada tikus, penurunan p-Smad1/t-Smad1, dan peningkatan p- Smad3/t-Smad3. downregulasi miR-18a, ekspresi berlebih TGFBR3, atau kultur bersama dengan inhibitor miR-18a atau makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3 menekan perkembangan sel CNE2, pertumbuhan tumor pada tikus, peningkatan p-Smad1/t-Smad1, dan penurunan p-Smad3/ t-Smad3.
Kesimpulan
Studi kami menjelaskan bahwa miR-18a dari makrofag M2 menghasilkan progresi sel NPC yang dipromosikan dan pertumbuhan tumor pada tikus telanjang melalui represi TGFBR3, bersama dengan inaktivasi Smad1 dan aktivasi Smad3.
Pengantar
Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan tumor ganas epitelial yang cenderung infiltrasi lokal dan metastasis awal jauh [1]. Pasien NPC sering mengeluhkan kelumpuhan saraf keenam dan sindrom Horner [2]. Saat ini, pengobatan yang diterapkan sebagian besar terdiri dari radioterapi, serta radioterapi dan kemoterapi terintegrasi [3]. Sayangnya, radioterapi dan kemoterapi secara tak terduga disertai dengan komplikasi, dan resistensi yang didapat terhadap radioterapi menghambat hasil NPC [3]. Mengingat bahwa tugas untuk menggali potensi terapi bertarget merupakan prioritas.
Disregulasi microRNAs (miRNAs) didokumentasikan untuk terlibat dalam tumorigenesis NPC, metastasis, invasi, dan resistensi terhadap radioterapi dan kemoterapi [1]. Sebagai subfamili miRNA, miR-18a ditemukan memfasilitasi perkembangan NPC melalui supresor morfogenesis pada inhibisi genitalia 1 dan aktivasi jalur mTOR [4]. Selain itu, miR-18a selanjutnya diverifikasi untuk mengaktifkan proliferasi dan metastasis sel NPC melalui regulasi DICER1 [5]. Selain itu, perkembangan sel NPC terbukti didorong oleh miR-18a melalui gangguan biogenesis miRNA [6]. Selain itu, miR-18a telah didokumentasikan berfungsi secara kritis dalam metastasis NPC [7]. Makrofag teraktivasi alternatif (M2) merupakan komponen penting dari keganasan padat dan hematologi dan terkait dengan perkembangan, metastasis, dan resistensi terapi [8]. Makrofag terkait tumor terpolarisasi M2 dikaitkan dengan prognosis buruk NPC [9]. Menarik dicatat perbedaan makrofag M2 di Epstein-Barr virus-negatif dan Epstein-Barr virus-positif NPC [10]. Ada penelitian yang menguraikan bahwa miR-18a menghambat metastasis hati sel kanker usus besar dengan menginduksi makrofag M1 [11]. Transforming growth factor-beta III receptor (TGFBR3) adalah ko-reseptor TGF-β yang menyediakan ligan reseptor TGF-β tipe II untuk merangsang pensinyalan dan keseimbangan permukaan sel, dan TGFBR3 terlarut adalah regulator selama perkembangan kanker [12]. TGFBR3 yang diekspresikan dengan rendah dilaporkan menginduksi lingkungan mikro tumor yang imunotoleran [13]. Sebaliknya, overekspresi transien TGFBR3 menginduksi apoptosis pada sel NPC manusia [14]. Sepengetahuan kami, polarisasi makrofag M2 yang diinduksi oleh miR-181a memajukan metastasis sel tumor yang dimediasi makrofag M2 melalui faktor 6 Kruppel-like dan CCAAT/enhancer binding protein axis [15].
Secara kolektif, meskipun banyak penelitian telah menemukan peran independen makrofag miR-18a, TGFBR3 dan M2 di NPC, interaksi gabungan di antara ketiga faktor ini masih sulit dipahami. Menimbang bahwa penelitian ini diluncurkan untuk menguraikan mekanisme dan partisipasi faktor-faktor ini dalam NPC.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Percobaan telah disetujui oleh komite etik Rumah Sakit Xiangya Ketiga, Universitas Selatan Tengah dan memenuhi standar etika medis. Penelitian ini dilakukan dengan persetujuan tertulis dari semua donor. Eksperimen hewan telah memenuhi persyaratan peraturan Pengelolaan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Nasional.
Koleksi Sel Mononuklear Darah Perifer
Monosit diperoleh dari darah tepi donor sehat dengan metode patuh. Spesimen darah tepi diperoleh dari donor sehat dari Departemen Hematologi Rumah Sakit Xiangya Ketiga, Universitas Selatan Tengah. Makrofag yang diturunkan dari monosit diperoleh melalui kepatuhan plastik sel mononuklear darah perifer (PBMC) yang sebelumnya diisolasi dengan sentrifugasi gradien kepadatan (Ficoll-Paque, GE Healthcare) dari persiapan buffy coat darah dari donor sehat. Kemudian, 2,0 × 10
6
PBMC dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) yang dilengkapi dengan 10% serum manusia (Millipore, Bedford, MA, USA) dan penisilin/streptomisin pada pelat 12-sumur (NalgeNunc, NY, USA). Ketika PBMC direkatkan ke dinding selama 2-3 jam, supernatan dan PBMC tersuspensi dikeluarkan berulang kali untuk mendapatkan monosit yang melekat.
Polarisasi Makrofag
Monosit diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi makrofag oleh human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) dan dipolarisasi menjadi makrofag M2 oleh interleukin (IL)-4.
Induksi Makrofag
Monosit dikultur dalam 20% serum janin sapi (FBS)-DMEM dan ditambahkan dengan M-CSF (100 g, Peprotech, NJ, USA) hingga konsentrasi akhir 100 ng/mL. Media diperbarui setengahnya setiap 3 hari dan kemudian ditambah dengan 100 ng/mL M-CSF. Dibudidayakan pada hari ke 7-8, sebagian sel dipanen, dan penanda permukaan makrofag CD68 [16], CD163 [17], dan CD206 [18] diuji dengan uji imunofluoresensi [19] untuk mengidentifikasi makrofag.
Polarisasi Makrofag
Makrofag dipolarisasi menjadi makrofag M2 dengan menambahkan 20 ng/mL IL-4 (Peprotech) ke media diferensiasi selama 24 jam. Sebagian dari sampel makrofag M2 digunakan untuk deteksi aliran sitometri. Sampel dibagi menjadi 3 tabung:tabung 1 adalah kumpulan makrofag yang sama tanpa stimulasi IL-4; tabung 2 dan 3 adalah makrofag patuh yang dirangsang oleh IL-4. Sampel diencerkan menjadi sekitar 10.000 sel saat memuat dan ditambahkan dengan imunoglobulin G non-spesifik untuk memblokir reseptor Fc. Kemudian sampel ditambahkan dengan antibodi isotipe non-spesifik, antibodi CD68 berlabel PE, dan antibodi CD163 berlabel PE (keduanya dari Biolegend, CA, USA). Diinkubasi selama 30 menit dan dibilas dengan 0,5% bovine serum albumin dalam phosphate-buffered saline (PBS), sampel disentrifugasi dan dibuat menjadi suspensi sel dengan 500 L PBS untuk dideteksi.
Reaksi berantai polimerase kuantitatif transkripsi terbalik (RT-qPCR) digunakan untuk mendeteksi miR-18a, CCL22, reseptor yang diaktifkan proliferator peroksisom (PPAR-γ), dan ekspresi mRNA TGFBR3 dalam sel yang dikumpulkan.
Total RNA diekstraksi dari sel oleh Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dan secara terbalik ditranskripsi menjadi RNA komplementer oleh Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA) untuk miR-18a dan PrimeScriptTM RT Master Mix Kit (Takara, Dalian, China) untuk CCL22, PPAR-γ, dan TGFBR3. U6 dan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) memuat kontrol untuk miR-18a, CCL22, PPAR-γ, dan TGFBR3. SYBR
@
Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) (Takara) dalam sistem LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Indiana, USA) digunakan dalam PCR. Penghitungan data dievaluasi dengan 2
-△△CT
metode. Primer PCR disajikan pada Tabel 1.
Pengujian Western Blot
Uji western blot diterapkan untuk mendeteksi protein TGFBR3, total (t)-Smad1, terfosforilasi (p)-Smad1, t-Smad3, dan p-Smad3 dalam sel yang dikumpulkan.
Protein total sel diekstraksi dan konsentrasi protein ditentukan berdasarkan kit asam bicinchoninic. Sampel protein dimasukkan ke dalam sumur dalam elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Membran PVDF diblokir dengan susu skim dan diinkubasi dengan antibodi primer TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology) , t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000), dan GAPDH (1:1000, semuanya dari Abcam, Cambridge, MA, UK) yang diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder berlabel peroksidase lobak (horseradish peroxidase-labeled secondary antibody ( 1:500, Laboratorium Penelitian Imuno Jackson, PA, AS). Dicuci 3 kali dengan tris-buffered saline dengan Tween 20, membran dikembangkan dengan peningkatan chemiluminescence. Kuantifikasi sinyal diselesaikan oleh National Institutes of Health ImageJ Imaging. Perangkat Lunak Analisis Pemrosesan dengan intensitas pensinyalan yang dinormalisasi ke GAPDH.
Kultur dan Penyaringan Sel
Garis sel NPC manusia CNE2, TW03, C666-1, dan SUNE-1 dan garis sel nasofaring manusia normal NP96 (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) dikultur di Roswell Park Memorial Institute (RPMI)- 1640 medium (Gibco, CA, USA) yang mengandung FBS (Gibco), 100 g/mL penisilin dan 100 g/mL streptomisin dan dilewatkan pada pertemuan 80%. RT-qPCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi miR-18a. Di antara garis sel NPC tersebut, sel CNE2 dan SUNE-1 menunjukkan perbedaan terbesar dan terkecil dalam ekspresi miR-18a dari sel NP96, sehingga mereka dipilih untuk pengujian regulasi turun atau regulasi miR-18a.
Pengelompokan dan Perawatan Sel
Di antara semua garis sel NPC, sel SUNE-1 dengan perbedaan terkecil dari sel NP96 dalam ekspresi miR-18a dipilih. Dipandu oleh spesifikasi Lipofectamine 2000 (Invitrogen), sel SUNE-1 ditransfeksi dengan miR-18a meniru, miR-18a meniru kontrol negatif (NC), si-TGFBR3, atau si-TGFBR3 NC.
Di antara semua garis sel NPC, sel CNE2 dengan perbedaan terbesar dari sel NP96 dalam ekspresi miR-18a dipilih dan ditransfeksi dengan inhibitor miR-18a, inhibitor miR-18a NC, overexpression (OE) -TGFBR3 atau OE-TGFBR3 NC oleh Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Dipandu oleh spesifikasi Lipofectamine 2000 (Invitrogen), makrofag M2 ditransfeksi dengan miR-18a meniru, miR-18a meniru NC, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, penghambat miR-18a, penghambat miR-18a NC, OE-TGFBR3, atau OE-TGFBR3 NC.
Kokultur Makrofag M2 dan Sel NPC
Kultur sel di ruang Transwell diadopsi untuk mengeksplorasi efek miRNA dari makrofag M2 pada sel NPC. Ruang atas diisi dengan makrofag M2 dengan ukuran pori 0,4 m, yang hanya menghentikan sel-sel ruang atas untuk melewatinya tetapi tidak molekul kecil yang disekresikan oleh sel seperti vesikel, faktor pertumbuhan, nutrisi, dll. Ruang bawah disebarkan dengan sel NPC.
SUNE-1 dan CNE2 diinkubasi dalam FBS (Gibco) normal. Sel-sel dalam fase pertumbuhan logaritmik diadopsi untuk eksperimen.
Sel SUNE-1 dan CNE2 dikultur bersama dengan makrofag M2 dalam media 10% FBS-RPMI-1640 (keduanya dari Gibco) dalam cawan kultur sel sisipan Transwell (Coring, Corning, NY, USA) dengan ukuran pori 0,4 m .
Sel SUNE-1 tidak dikultur bersama dengan makrofag M2, atau dikultur bersama dengan makrofag M2, miR-18a meniru makrofag M2 yang ditransfeksi, miR-18a meniru makrofag M2 yang ditransfeksi NC, makrofag M2 yang ditransfeksi si-TGFBR3, atau si -TGFBR3 NC-transfected M2 macrophages.
Sel CNE2 tidak dikultur bersama dengan makrofag M2, atau dikultur bersama dengan makrofag M2, makrofag M2 yang ditransfeksi inhibitor miR-18a, inhibitor miR-18a Makrofag M2 yang ditransfeksi NC, makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3, atau OE-TGFBR3 Makrofag M2 yang ditransfusikan NC.
Viabilitas sel diuji dengan uji 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium Bromide (MTT), yang merupakan uji kolorimetri yang diterapkan untuk menentukan aktivitas dehidrogenase mitokondria, yang mereduksi MTT menjadi formazan.
Ditripsinisasi dan diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur pada 4 × 10
4
sel/sumur, sel-sel dihilangkan media kultur masing-masing pada jam ke 0, 12, 24, 36, dan 48 dan dilengkapi dengan larutan MTT (500 L, 0,5 g/L). Diinkubasi selama 4 jam, supernatan dibuang dan sel diinkubasi dengan 200 L larutan dimetil sulfoksida. Nilai kepadatan optik (OD, 490 nm) diukur pada pembaca pelat mikro (ELX808IU, BioTek, VT, USA). Setiap kelompok dibentuk dengan 6 sumur paralel.
Uji Pembentukan Koloni
Kemampuan pembentukan koloni sel NPC diuji dengan uji pembentukan koloni, yang mencerminkan ketergantungan populasi sel dan proliferasi klon sel.
Dikultur selama 24 jam dan dipisahkan dengan tripsin 0,25%, 300 sel diunggulkan dalam cawan 35 mm dengan 3 sumur paralel di setiap kelompok. Dengan media kultur diperbarui setiap 3 hari, sel-sel dikultur selama seminggu dan difiksasi dengan 5 mL paraformaldehida 4%. Setelah itu, sel diwarnai dengan larutan pewarna kristal violet dan dikeringkan di udara. Cawan terbalik di mana film transparan dari kisi-kisi ditumpangkan, dan jumlah koloni (lebih dari 50 sel) dihitung di bawah mikroskop (Olympus, Tokyo, Jepang).
Uji Gores
Migrasi sel diuji dengan uji awal. Sel-sel ditripsinisasi, diunggulkan ke dalam pelat 6-sumur dengan 3 sumur paralel untuk setiap kelompok, dan dikultur hingga pertemuan 90%. Kemudian, sel-sel diinkubasi dalam medium dengan FBS 2% dan goresan vertikal digambar dengan ujung 100 L. Sel-sel difoto pada jam ke-0 dan ke-24 di bawah mikroskop terbalik untuk mengukur jarak migrasi sel.
Pengujian Transwell
Invasi dan migrasi sel diuji dengan uji Transwell. Bilik atas bilik Transwell direndam terlebih dahulu dan ditambahkan 100 L Matrigel (Coring) yang telah diencerkan dengan media RPMI 1640 bebas serum pada 1:100. Ruang atas dan bawah ditambahkan 200 L dan 600 L media RPMI 1640 bebas serum secara terpisah. Selanjutnya, ruang bawah ditambahkan media 600 L RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS sedangkan ruang atas dengan suspensi sel 200 L (12,5 × 10
4
sel/mL). Diinkubasi selama 40 jam, sel diwarnai dengan larutan pewarna kristal violet dan dilap dengan kapas untuk menghitung sel yang melewati Matrigel di bawah mikroskop.
Flow Cytometry
Apoptosis sel dan distribusi siklus sel ditentukan oleh flow cytometry.
Distribusi siklus sel dievaluasi dengan pewarnaan propidium iodida (PI). Sel diunggulkan ke dalam pelat 6-sumur pada 4 × 10
5
sel / sumur, dan dikultur hingga pertemuan 70-80%. Difiksasi dalam etanol 70% yang telah didinginkan semalaman, sel disentrifugasi (supernatan dibuang), ditambahkan dengan RNAase (1 g/L, 200 L) dan Triton X-100 (2 L), dan diwarnai dengan larutan pewarnaan PI untuk 30 menit. Setelah itu, distribusi siklus sel dideteksi oleh flow cytometer (BD Bioscience, NJ, USA) pada 488 nm sesuai dengan intensitas fluoresensi sel yang berbeda pada setiap frasa (frasa G0/G1, frasa S, dan frasa G2/M).
Apoptosis sel diukur dengan Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) dan pewarnaan ganda PI. Sel disuspensikan kembali dalam 500 L Binding buffer dan diwarnai dengan 5 L larutan pewarnaan Annexin V-FITC dan 10 L larutan PI. Apoptosis sel juga diuji dengan flow cytometer (BD Bioscience) dalam waktu 30 menit tanpa paparan cahaya. Pada scatter plot, sel hidup di kuadran kiri bawah (Q4) adalah FITC
−
/PI
−
, sel-sel apoptosis pada tahap awal di kuadran kanan bawah (Q3) adalah FITC
+
/PI
−
, dan sel nekrotik dan apoptosis pada stadium lanjut di kuadran kanan atas (Q2) adalah FITC
+
/PI
+
. Tingkat apoptosis =persentase apoptosis awal (Q3) + persentase apoptosis akhir (Q2).
Xenograft Tumor pada Tikus Telanjang
Pertumbuhan tumor diamati dengan membuat model NPC pada tikus telanjang. Dilepas oleh tripsin 0,25%, sel SUNE-1 dan CNE2 pada fase logaritmik dikonfigurasikan menjadi suspensi sel tunggal pada 5 × 10
7
sel/mL. Suspensi sel (0,2 mL) disuntikkan ke ketiak kanan tikus dengan mikroinjektor untuk membentuk model tikus. Tikus model dibesarkan di lingkungan bebas patogen tertentu. Mulai hari ke-4, pertumbuhan tumor diamati dan mencit ditimbang setiap 4 hari. Tikus telanjang di-eutanasia pada hari ke-20 setelah injeksi dan tumor direseksi, ditimbang dengan timbangan elektronik dan difoto.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Sistem gen reporter luciferase ganda diadopsi untuk mengkonfirmasi situs pengikatan miR-18a dan 3′wilayah yang tidak diterjemahkan (UTR) dari TGFBR3 mRNA. Situs web prediksi biologis (http://www.microrna.org/microrna/home.do) digunakan untuk menganalisis gen target miR-18a, dan menemukan keberadaan situs pengikatan komplementer miR-18a pada 3′ UTR dari TGFBR3. Uji gen reporter luciferase ganda digunakan untuk memverifikasi lebih lanjut apakah TGFBR3 ditargetkan secara langsung oleh miR-18a. Sebuah pmirGLO-TGFBR3-wild type (WT) dan pmirG-LO-TGFBR3-mutant type (MUT) dari TGFBR3 3′UTR binding site dibangun. TGFBR3-WT atau TGFBR3-MUT dan miR-18a meniru atau meniru NC ditransfusikan bersama ke dalam sel SUNE-1 dan CNE2 oleh Lipofectamine 2000 (Invitrogen) dan diinkubasi selama 48 jam. Kit uji luciferase (Promega, Madison, WI, USA) digunakan untuk menganalisis sel.
Analisis Statistik
Perangkat lunak statistik SPSS21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) digunakan untuk analisis. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbedaan antara dua kelompok dianalisis dengan t uji sementara perbedaan antara beberapa kelompok dengan analisis varians satu arah (ANOVA), diikuti dengan uji post hoc Tukey. Perbedaan signifikan dipertimbangkan pada P <0,05.
Hasil
Identifikasi Makrofag M2
Monosit yang diperkaya dengan metode patuh dan monosit yang diinduksi oleh M-CSF dikumpulkan dari darah tepi donor yang sehat. Deteksi imunofluoresensi CD68, CD206, dan CD163 mengkonfirmasi bahwa PBMC yang diinduksi oleh M-CSF in vitro berubah menjadi makrofag dengan karakteristik molekuler yang khas, yang memenuhi persyaratan kami (Gbr. 1a).
Identifikasi makrofag M2. a . CD68, CD206, dan CD163 diekspresikan pada permukaan makrofag yang diperoleh setelah induksi monosit in vitro. b Makrofag terpolarisasi oleh IL-4 adalah makrofag M2. c CD163 diekspresikan tinggi dan CD68 diekspresikan rendah dalam makrofag M2 yang dipolarisasi oleh IL-4. d CCL22 sangat diekspresikan dalam makrofag M2. e PPAR-γ sangat diekspresikan dalam makrofag M2. f miR-18a sangat diekspresikan dalam makrofag M2; *P <0,05; **P <0,01. Data pengukuran dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, N =3. Perbandingan antara dua kelompok dianalisis dengan t tes
Makrofag yang diperoleh dipolarisasi oleh IL-4 dan diamati di bawah mikroskop untuk morfologi. Dimanifestasikan bahwa makrofag (M0) tanpa stimulasi IL-4 beragam dan tidak teratur, menunjukkan bentuk bulat, lonjong, atau gelendong. Dirangsang oleh IL-4, makrofag M2 menjadi lebih besar dan sebagian besar berubah menjadi bentuk bulat, yang sesuai dengan karakteristik morfologi makrofag M2 seperti yang dijelaskan sebelumnya [20] (Gbr. 1b).
Flow cytometry menguji antigen permukaan sel patuh yang distimulasi oleh 20 ng/mL IL-4 selama 24 jam dan menemukan bahwa CD68 diekspresikan pada 21,16% sedangkan CD163 berada pada 98,69% dari jumlah total sel (Gbr. 1c), mengkonfirmasikan sel-sel yang melekat menjadi makrofag M2. RT-qPCR mengungkapkan bahwa dengan sel M0 sebaliknya, CCL22 dan PPAR-γ (molekul polarisasi tipikal) meningkat pada makrofag M2 (Gbr. 1d, e), menunjukkan keberhasilan induksi makrofag M2.
RT-qPCR juga menunjukkan bahwa ekspresi miR-18a meningkat pada makrofag M2 berbeda dengan makrofag M0 (P 0,05) (Gbr. 1f).
MiR-18a Sangat Diekspresikan dan TGFBR3 Diekspresikan dengan Buruk di Sel NPC
Situs web bioinformatika (miRanda) memprediksi target potensial miR-18a dan TGFBR3 dianggap sebagai salah satu target miR-18a (Gbr. 2a). Uji gen reporter luciferase ganda diterapkan untuk memverifikasi bahwa miR-18a menargetkan 3′UTR dari TGFBR3. TGFBR3-WT atau TGFBR3-MUT diklon ke vektor pmirGLO dan ditransfeksi bersama dengan miR-18a meniru atau NC ke dalam sel SUNE-1 dan CNE2. miR-18a meniru tidak memiliki pengaruh pada aktivitas luciferase dari TGFBR3 3′UTR-MUT tetapi mengganggu aktivitas TGFBR3 3′UTR-WT dalam sel SUNE-1 dan CNE2, menunjukkan bahwa TGFBR3 adalah gen target yang diatur oleh miR-18a (Gbr. . 2b).
MiR-18a sangat diekspresikan dan TGFBR3 diekspresikan dengan buruk dalam sel NPC. a miRanda memperkirakan miR-18a menargetkan TGFBR3. b Uji gen reporter luciferase ganda memverifikasi miR-18a yang menargetkan TGFBR3. c ekspresi miR-18a meningkat dan ekspresi TGFBR3 menurun pada makrofag M2 yang ditransfeksi miR-18a. d ekspresi miR-18a menurun dan ekspresi TGFBR3 meningkat pada makrofag M2 yang ditransfeksi inhibitor miR-18a. e ekspresi miR-18a meningkat dan ekspresi TGFBR3 menurun pada garis sel NPC dibandingkan dengan sel NP96. f ekspresi miR-18a meningkat dan ekspresi TGFBR3 menurun pada sel SUNE-1 yang ditransfeksi miR-18a. g ekspresi miR-18a menurun dan ekspresi TGFBR3 meningkat pada sel CNE2 yang ditransfeksi oleh inhibitor miR-18a. h ekspresi miR-18a meningkat dan ekspresi TGFBR3 menurun dalam sel SUNE-1 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi miR-18a. saya ekspresi miR-18a menurun dan ekspresi TGFBR3 meningkat dalam sel CNE2 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi inhibitor miR-18a; *P <0,05; **P <0,01. Data pengukuran dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, N =3. Perbandingan antara dua kelompok dianalisis dengan t tes. Perbandingan antara beberapa kelompok dianalisis dengan ANOVA satu arah, diikuti dengan uji post hoc Tukey
Efisiensi transfeksi miR-18a mimik atau inhibitor miR-18a dalam makrofag M2 dimanifestasikan oleh penentuan ekspresi miR-18a dan TGFBR3 dalam makrofag M2 dengan RT-qPCR dan uji Western blot. Jelas bahwa (Gbr. 2c, d) ekspresi berlebih miR-18a meningkatkan ekspresi miR-18a dan mengurangi ekspresi TGFBR3 dalam makrofag M2. Sebaliknya, penghambatan miR-18a mengurangi ekspresi miR-18a dan meningkatkan ekspresi TGFBR dalam makrofag M2. Tidak ada perbedaan yang terlihat dalam ekspresi miR-18a sementara ekspresi TGFBR3 berkurang ketika makrofag M2 ditransfeksi dengan si-TGFBR3. Tidak ada perbedaan yang terlihat pada ekspresi miR-18a sementara ekspresi TGFBR3 tumbuh pada transfeksi OE-TGFBR3 ke makrofag M2.
Ekspresi miR-18a dan TGFBR3 dalam garis sel CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1, dan NP96 diuji dengan RT-qPCR dan uji Western blot. Dalam sel NPC, dibandingkan dengan sel NP96, ekspresi miR-18a meningkat dan ekspresi TGFBR3 menurun (Gbr. 2e). Karena sel CNE2 dan sel SUNE-1 dimanifestasikan dengan perbedaan terbesar dan terkecil dalam ekspresi miR-18a dari sel NP96, mereka masing-masing dipilih untuk pengujian downregulasi dan upregulasi miRNA.
Untuk mengidentifikasi efek miR-18a dan TGFBR3 pada sel NPC, sel SUNE-1 ditransfeksi dengan miR-18a meniru atau si-TGFBR3 sementara sel CNE2 dengan inhibitor miR-18a atau OE-TGFBR3. RT-qPCR dan uji Western blot menunjukkan bahwa miR-18a meniru peningkatan ekspresi miR-18a dan mengurangi ekspresi TGFBR3 dalam sel SUNE-1. Transfeksi si-TGFBR3 tidak berpengaruh pada ekspresi miR-18a sementara ekspresi TGFBR3 berkurang dalam sel SUNE-1. inhibitor miR-18a menurunkan ekspresi miR-18a dan meningkatkan ekspresi TGFBR3 dalam sel CNE2. Transfeksi OE-TGFBR3 dalam sel CNE2 tidak mempengaruhi ekspresi miR-18a tetapi meningkatkan ekspresi TGFBR3 (Gbr. 2f, g).
Untuk mengeksplorasi efek miR-18a dari makrofag M2 pada sel NPC, makrofag M2 yang ditransfusikan miR-18a atau si-TGFBR3 atau inhibitor miR-18a- atau makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3 dikultur bersama dengan SUNE-1 atau sel CNE2 di ruang Transwell, masing-masing. RT-qPCR dan Western blot assay menguji ekspresi miR-18a dan TGFBR3 dalam sel SUNE-1 atau CNE2. Sel SUNE-1 dikultur bersama dengan makrofag M2 yang tidak ditransfeksi atau miR-18a yang ditransfeksi yang ditunjukkan dengan ekspresi miR-18a yang meningkat dan ekspresi TGFBR3 yang terdegradasi. Tidak ada perbedaan yang terlihat dalam ekspresi miR-18a dan ekspresi TGFBR3 berkurang dalam sel SUNE-1 yang telah dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi si-TGFBR3 (Gbr. 2h). Setelah kultur bersama dengan makrofag M2 yang tidak ditransfeksi, sel CNE2 ditampilkan oleh peningkatan ekspresi miR-18a dan penurunan ekspresi TGFBR3. Namun, pengurangan ekspresi miR-18a dan peningkatan ekspresi TGFBR3 yang disajikan dalam sel CNE2 yang sebelumnya dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi inhibitor miR-18a. Tidak ada perbedaan yang dikenali pada ekspresi miR-18a, dan ekspresi TGFBR3 meningkat pada sel CNE2 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3 (Gbr. 2i).
miR-18a dari M2 Makrofag Meningkatkan Viabilitas Sel NPC dan Kemampuan Membentuk Koloni
Uji MTT dan uji pembentukan koloni diterapkan untuk mengidentifikasi dampak miR-18a dan TGFBR3 pada viabilitas dan kemampuan pembentukan koloni sel SUNE-1 dan sel CNE2. miR-18a meniru, inhibitor miR-18a, si-TGFBR3, atau OE-TGFBR3 ditransfusikan ke dalam sel SUNE-1 atau sel CNE2. Diindikasikan bahwa dalam sel SUNE-1, upregulation miR-18a atau downregulation TGFBR3 meningkatkan viabilitas sel dan meningkatkan jumlah koloni (Gbr. 3a, e). Dalam sel CNE2, viabilitas sel terganggu dan jumlah koloni berkurang oleh inhibisi miR-18a atau ekspresi berlebih TGFBR3 (Gbr. 3b, f).
miR-18a dari makrofag M2 menginduksi viabilitas sel NPC dan kemampuan membentuk koloni. a miR-18a meniru atau si-TGFBR3 meningkatkan viabilitas sel SUNE-1. b miR-18a inhibitor atau OE-TGFBR3 menurunkan viabilitas sel CNE2. c Kultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfusikan miR-18a atau si-TGFBR3 meningkatkan viabilitas sel SUNE-1. d Kultur bersama dengan inhibitor miR-18a atau makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3 menurunkan viabilitas sel CNE2. e miR-18a meniru atau si-TGFBR3 meningkatkan jumlah koloni sel SUNE-1. f miR-18a inhibitor atau OE-TGFBR3 menurunkan jumlah koloni sel CNE2. g Kultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi miR-18a atau si-TGFBR3 meningkatkan jumlah koloni sel SUNE-1. h Kultur bersama dengan inhibitor miR-18a atau makrofag M2 yang ditransfeksi OE-TGFBR3 menurunkan jumlah koloni sel CNE2; *P <0,05; **P <0,01. Data pengukuran dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, N =3. Perbandingan antara beberapa kelompok dianalisis dengan ANOVA satu arah, diikuti dengan uji post hoc Tukey
Untuk menguji efek miR-18a dari makrofag M2 pada viabilitas dan kemampuan pembentukan koloni sel NPC, miR-18a meniru-, miR-18a inhibitor-, si-TGFBR3-, atau OE-TGFBR3-transfeksi makrofag M2 dikultur bersama dengan sel SUNE-1 atau sel CNE2 di ruang Transwell. Uji MTT dan pembentukan koloni menunjukkan bahwa sel SUNE-1 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang tidak ditransfeksi, atau miR-18a yang ditransfeksi meniru atau si-TGFBR3 disajikan dengan viabilitas sel yang diperkuat dan peningkatan jumlah koloni (Gbr. 3c, g) .
Sel CNE2 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang tidak ditransfeksi disorot dengan viabilitas sel yang diperkuat dan peningkatan koloni. Namun, sel-sel CNE2 yang dikultur bersama dengan makrofag M2 yang ditransfeksi inhibitor miR-18a atau yang ditransfeksi OE-TGFBR ditunjukkan dengan viabilitas sel yang berkurang dan koloni yang menurun (Gbr. 3d, h).
miR-18a dari M2 Makrofag Meningkatkan Kemampuan Invasi dan Migrasi Sel NPC
Untuk pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana miR-18a dan TGFBR3 memengaruhi migrasi dan invasi sel NPC, uji awal dan uji Transwell diterapkan. Hasilnya mengungkapkan bahwa sel SUNE-1 yang ditransfeksi dengan miR-18a meniru atau si-TGFBR3 ditandai dengan peningkatan jarak migrasi sel dan sel invasi (Gbr. 4a dan 5a).
miR-18a from M2 macrophages promotes NPC cell migration ability. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 increased migration of SUNE-1 cells. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 decreased migration of CNE2 cells. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased migration of SUNE-1 cells. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased migration of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
miR-18a from M2 macrophages promotes NPC cell invasion ability. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 increased invasion of SUNE-1 cells. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 decreased invasion of CNE2 cells. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased invasion of SUNE-1 cells. b Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased invasion of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
In CNE2 cells transfected with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3, the reductions appeared in cell migration distance and invasion cells (Figs. 4b and 5b).
How miR-18a from M2 macrophages influenced invasion and migration abilities of NPC cells were deciphered by miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages co-culturing with SUNE-1 or CNE2 cells. The results highlighted that SUNE-1 cells co-cultured with untransfected, or miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages were manifested with increased cell migration distance and invasion cells (Figs. 4c and 5c).
Both cell migration distance and invasion cells increased in CNE2 cells co-cultured with untransfected M2 macrophages. Upon co-culture with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages, CNE2 cells were showed with reduced migration distance and invasion cells (Figs. 4d and 5d).
miR-18a from M2 Macrophages Arrests Fewer NPC Cell at G0/G1 Phase and Suppresses Apoptosis
Cell cycle distribution and apoptosis were tested by flow cytometry to stratify the effects of miR-18a and TGFBR3 on NPC cells. It was indicated that transfection of miR-18a mimics or si-TGFBR3 reduced SUNE-1 cells arrested in the G0/G1 phase, increased cells in the S and G2/M phases, and reduced cell apoptosis rate (Figs. 6a and 7a).
miR-18a from M2 macrophages arrests fewer NPC cell at G0/G1 phase. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 decreased SUNE-1 cells in the G0/G1 phase, and increased SUNE-1 cells in the S and G2/M phases. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 increased CNE2 cells in the G0/G1 phase, and decreased CNE2 cells in the S and G2/M phases. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased SUNE-1 cells in the G0/G1 phase, and increased SUNE-1 cells in the S and G2/M phases. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased CNE2 cells in the G0/G1 phase, and decreased CNE2 cells in the S and G2/M phases; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
miR-18a from M2 macrophages inhibits NPC cell apoptosis. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 decreased apoptosis of SUNE-1 cells. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 increased apoptosis of CNE2 cells. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased apoptosis of SUNE-1 cells. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased apoptosis of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
Upon transfection with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3, CNE2 cells in the G0/G1 phase trended toward an elevation while those in the S and G2/M phases toward a reduction, and cell apoptosis rate raised (Figs. 6b and 7b).
With the purpose to decode the mechanism of miR-18a from M2 macrophages in NPC cell cycle distribution and apoptosis, M2 macrophages transfected with miR-18a mimics, miR-18a inhibitors, si-TGFBR3, or OE-TGFBR3 were co-cultured with SUNE-1 cells or CNE2 cells in the Transwell chamber. Co-cultured with untransfected, or miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages, reduced SUNE-1 cells were displayed in the G0/G1 phase and increased cells in the S and G2/M phases, and SUNE-1 cell apoptosis rate decreased (Figs. 6c and 7c).
Co-cultured with untransfected M2 macrophages, CNE2 cells in the G0/G1 phase reduced, cells in the S and G2/M phases increased, and apoptosis rate declined. On the contrary, co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages, CNE2 cells in the G0/G1 phase elevated while those in the S and G2/M phases decreased, and apoptosis rate elevated (Figs. 6d and 7d).
miR-18a from M2 Macrophages Reduces p-Smad1/t-Smad1 and Elevates p-Smad3/t-Smad3 in NPC Cells
Western blot assay detected TGF signaling pathway-related proteins in NPC cells to further explain the effects of miR-18a and TGFBR3 on TGF signaling pathway.
It was explained that transfection of miR-18a mimics or si-TGFBR3 reduced p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3 in SUNE-1 cells (Fig. 8a).
miR-18a from M2 macrophages decreases p-Smad1/t-Smad1 and increases p-Smad3/t-Smad3 in NPC cells. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 in SUNE-1 cells decreased p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 in CNE2 cells increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
Transfection with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 led to declined p-Smad3/t-Smad3 and increased p-Smad1/t-Smad1 in CNE2 cells (Fig. 8b).
miR-18a from M2 macrophages influencing TGF signaling pathway in NPC cells was determined by Western blot assay through testing TGF signaling pathway-related proteins in SUNE-1 cells and CNE2 cells which had co-cultured with miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages in the Transwell chamber.
SUNE-1 cells co-cultured with untransfected, miR-18a mimics-transfected, or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages were manifested with reduced p-Smad1/t-Smad1 and incremental p-Smad3/t-Smad3 (Fig. 8c).
Co-cultured with untransfected M2 macrophages, CNE2 cells trended toward declined p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. In an opposite way, CNE2 cells were demonstrated with increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3 when co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages (Fig. 8d).
miR-18a from M2 Macrophages Induces Tumor Growth in Nude Mice with NPC
Tumor xenografts were conducted on nude mice to further elucidate the impacts of miR-18a and TGFBR3 on tumor growth of NPC.
It was indicated that injected with miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected SUNE-1 cells, mice were manifested with enlarged tumor volume and heavier tumor weight (Fig. 9a).
miR-18a from M2 macrophages promotes tumor growth in nude mice with NPC. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 in SUNE-1 cells increased tumor volume and weight. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 in CNE2 cells decreased tumor volume and weight. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased tumor volume and weight. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased tumor volume and weight; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, three nude mice in each group. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test
Reduced tumor volume and weight were presented in mice with injection of miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected CNE2 cells (Fig. 9b).
Tumor growth was observed in mice which had injected with miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages to illustrate the mechanism of miR-18a from M2 macrophages in NPC.
After co-culture with untransfected, miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages, SUNE-1 cells were injected into mice and mice were observed with larger tumor volume and heavier tumor weight (Fig. 9c).
CNE2 cells were co-cultured with M2 macrophages and injected into mice with the results suggesting growing tumor volume and weight. Both tumor volume and weight were inclined to reduce when mice were injected with CNE2 cells which had co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages (Fig. 9d).
Discussion
NPC refers to a polygenic disease threatened by a wide range of factors [21]. MiRNAs are previously implied to participate in the pathogenesis of NPC via regulation of their target genes which are indicators of cellular processes and pathways [22]. Concretely, miR-18a advances NPC progression by miRNA biogenesis impairing [6]. Given that this study goes forward to decipher the combined interactions of miR-18a from M2 macrophages and TGFBR3 in NPC with the conclusion elucidating that miR-18a from M2 macrophages stimulates NPC progression via TGFBR3 inhibition (Fig. 10).
Schematic representation of macrophage-derived exosomal miR-18a in NPC and the involvement of TGFBR3-mediated TGF-β signaling pathway
At the start of this study, macrophages are stimulated by IL-4 to differentiate to M2 macrophages which are found to enrich the expression of miR-18a. As we know, during macrophage polarization, miRNA’s expression was altered [23]. In addition, M2 polarization enriches genes which are involved in the cell cycle and metabolic processes, and the M2 phenotype is conducive to tumor growth and angiogenesis in neoplastic tissues [24]. Based on the M2 macrophages-enriched miR-18a, a series of experiments were successfully conducted.
Initially, our study has uncovered that miR-18a is highly expressed while TGFBR3 is poorly expressed in NPC cells. Drawn from a previous study, it is concluded that miR-18a is overexpressed in NPC tissues with its association with lymph node metastasis and clinical stage [5]. Besides that, miR-17-92 cluster members including miR-18a are documented to be overexpressed in NPC tissues [25]. Furthermore, upregulated miR-18a is reported to demonstrate in NPC tissues which is connected with tumor node metastasis stage and tumor size [4]. Experimentally, except for the downregulated TGFBR3 in tongue squamous cell carcinoma [26], there has been another study depicting reduced TGFBR3 in clear-cell renal cell carcinomas accompanied by unwanted prognosis [27]. Anyhow, the results in this study are consistent with these study findings to some extent.
In order to explore the roles of miR-18a and TGFBR3 in NPC cell progression, we have conducted a series of assays with the results indicating that upregulated miR-18a or downregulated TGFBR3 triggers NPC cell progression while miR-18a repression or TGFBR3 elevation has the opposite effects on NPC cells. Widely, suppression of miR-18a is evidenced to hamper cell progression in malignancies including ovarian cancer, colitis-associated colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma [28,29,30]. Narrowly, an existed study has pronounced that upregulated miR-18a promotes NPC cell progression via mediation of DICER1 [6]. In addition, it is noticed that overexpressed miR-18a in NPC is believed to connect with NPC metastasis and repressed miR-18a partially contributes to better prognosis of NPC patients [31]. Lately, it is surveyed that downregulation of miR-18a is capable of discouraging NPC proliferation, invasion, and migration [4]. Additionally, a decrease in TGFBR3 expression is regarded to link with laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) invasion and miR-223/TGFBR3 axis regulation takes part in LSCC progression inhibition [32]. TGFBR3 elevation is documented to restrict NPC cell viability, induce apoptosis, and activate pro-apoptosis signaling pathways [14]. Previously, a study has indicated that upregulation of TGFBR3 promotes apoptosis and cells arrested in the G2/M phase, resulting in impaired cell viability and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma [33]. Intriguingly, it is formerly described that induction of TGFBR3 contributes to disrupt intrahepatic cholangiocarcinoma progression [34].
Despite the protective role of lowly expressed miR-18a and overexpressed TGFBR3 in NPC cell in vitro, we have performed tumor xenografts in nude mince in vivo for further verification with the results explaining that miR-18a knockdown or TGFBR3 elevation restrains tumor growth in nude mice. As demonstrated in a prior study, miR-18a-injected nude mice show with enhanced tumor growth [5] and conversely, the miR-18a antagomir-injected nude mice are displayed with suppressed tumor growth in NPC [4]. In the light of the TGFBR3 reduction in tumor growth, it is suggested that poorly expressed TGFBR3 provokes tumor formation in clear-cell renal cell carcinoma [27]. In the opposite way, an increase in TGFBR3 is recognized to hinder tumor growth in lung cancer with the presence of long non-coding RNA ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 antisense RNA 2 elevation, and miR-223-3p suppression [35]. This study has also predicted and verified that TGFBR3 is a target gene of miR-18a. But, more studies still need to be conducted for further verification.
Conclusion
Generally speaking, this study elaborates the concrete mechanisms that miR-18a from M2 macrophages inhibits TGFBR3 expression to exacerbate the progression of NPC via TGF-β signaling pathway, the results of which is abrogated by miR-18a knockdown or TGFBR3 elevation. This study updates the therapeutic target for NPC. However, a large cohort researches are still in need for in-depth explorations.
