Maghemite Nanoparticles Bertindak sebagai Nanozymes, Meningkatkan Pertumbuhan dan Toleransi Stres Abiotik di Brassica napus
Abstrak
Yttrium doping-stabil -Fe2 O3 nanopartikel dipelajari untuk potensinya sebagai pupuk tanaman dan, melalui aktivitas enzimatik, mendukung manajemen cekaman kekeringan. Tingkat hidrogen peroksida dan peroksidasi lipid, setelah kekeringan, berkurang ketika -Fe2 O3 nanopartikel dikirim melalui irigasi dalam larutan nutrisi ke Brassica napus tanaman yang tumbuh di tanah. Hidrogen peroksida berkurang dari 151 menjadi 83 μM g
−1
dibandingkan dengan kontrol, dan pembentukan malondialdehid berkurang dari 36 menjadi 26 mM g
−1
. Laju pertumbuhan daun ditingkatkan dari 33 menjadi 50% pertumbuhan dibandingkan dengan tanaman yang dibuahi sepenuhnya dan pengukuran SPAD dari klorofil meningkat dari 47 menjadi 52 menunjukkan peningkatan sifat agronomi dengan penggunaan -Fe2 O3 nanopartikel sebagai pupuk dibandingkan dengan besi chelated.
Latar Belakang
Ketahanan pangan adalah hal yang sangat penting dan merupakan masalah mendesak dari dunia kita yang terus berubah. Perubahan iklim dan pertumbuhan populasi mengarahkan ilmuwan tanaman dan insinyur pertanian untuk berinovasi alat yang lebih baik untuk mengamankan produksi pangan dengan dampak lingkungan yang lebih sedikit. Nanoteknologi adalah salah satu alat baru yang dapat dieksplorasi untuk memecahkan masalah lama ini [1,2,3]. Nanoteknologi telah diprediksi menjadi bagian penting dan integral dari rantai produksi pangan, melayani, misalnya, peran dalam perlindungan tanaman [4,5,6], pupuk [7, 8], biosensor dan pertanian presisi [9], dan pengemasan dan keamanan pangan [10]. Nanopartikel ada di mana-mana di alam, dan tanaman telah berevolusi terkena berbagai nanopartikel [11]. Nanopartikel oksida besi (ION) merupakan bagian penting dari nanopartikel alami [12]. Ada bukti bahwa tanaman dan mikroba tanah menghasilkan ION [11, 13, 14]. Sementara beberapa peneliti telah prihatin dengan toksisitas tanaman ION direkayasa [15, 16], yang lain telah berfokus pada kemungkinan menggunakan ION sebagai pupuk [17,18,19,20,21,22]. Nanopartikel magnetik dari magnetit Fe3 O4 dan maghemite -Fe2 O3 struktur telah disarankan untuk menjadi nanozymes efektif dari kedua kemampuan mimetik peroksidase (pada pH rendah) dan kemampuan mimetik katalase (pada pH netral) [23,24,25]. Telah ditunjukkan bahwa, pada konsentrasi tertentu, oksida besi nano meningkatkan pertumbuhan tanaman dibandingkan dengan penambahan jumlah ion besi yang setara dalam bentuk kelat [17]. Kami berhipotesis bahwa kemampuan enzimatik oksida besi nano dapat merangsang pertumbuhan tanaman di atas pemupukan besi saja. Lebih lanjut, kami menyarankan bahwa ini harus membantu tanaman selama tekanan abiotik umum seperti kekeringan, di mana katalase dan peroksidase menjadi penting untuk mengais spesies oksigen reaktif (ROS) yang dilepaskan. Di sini, kami menyajikan penyelidikan untuk menguji hipotesis ini pada -Fe2 O3 dan lobak biji minyak, tumbuh di tanah dan lingkungan yang terkendali.
Hasil
Pengaruh Partikel pada Sifat Tumbuhan
Dengan menambahkan ION, kami meningkatkan pertumbuhan lobak biji minyak dibandingkan dengan hanya menambahkan besi chelated dalam jumlah yang cukup. Panjang daun menunjukkan peningkatan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol, menunjukkan peningkatan baik pembelahan sel atau pemanjangan sel (Gbr. 1a). Sebelum tanaman mengalami kekeringan, ada peningkatan kandungan klorofil yang signifikan secara statistik yang diukur dengan SPAD-meter, menunjukkan peningkatan kebugaran tanaman ini dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 1b).
Parameter fisiologis berbeda dari tanaman yang ditanam dalam pot dengan tanah yang diairi dengan nutrisi atau nutrisi yang mengandung ION. a Panjang daun individu meningkat dari sebelum sampai setelah 5 hari pengobatan ION (n = 16, p nilai = 0,053). b Kandungan klorofil dalam daun, yang diukur dengan pengukuran SPAD (n = 16, p nilai = 0,000). Huruf yang berbeda menandakan perbedaan yang signifikan secara statistik
Kehilangan air tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik tetapi ada kecenderungan retensi air yang lebih besar dalam perawatan dengan ION (Gbr. 2a). Bobot segar, yang juga memperhitungkan pertumbuhan tanaman, selalu menunjukkan nilai yang lebih tinggi untuk perlakuan ION (Gbr. 2b) dan signifikan secara statistik dalam beberapa kasus. Misalnya, satu eksperimen dengan kekeringan yang berkepanjangan dapat dilihat pada Gambar. 3.
Parameter tanaman setelah cekaman kekeringan. a Persentase berat tanaman yang merupakan air. b Biomassa tanaman setelah 5 hari kekeringan (n = 8, p nilai = 0,127). Huruf yang berbeda menandakan perbedaan yang signifikan secara statistik
Bobot segar tanaman, diukur setelah 5 hari kekeringan. Perbedaan signifikan secara statistik dengan 15 ulangan biologis dan p nilai 0,01
Mengingat kontrol itu juga memiliki jumlah zat besi yang cukup, perbedaan besar dalam berat segar akan menjadi luar biasa. Diamati bahwa tanaman yang diberi ION mengatasi lebih baik daripada kontrol selama kekeringan dan pulih lebih baik setelah penyiraman ulang (Gbr 4).
Foto tanaman setelah penyiraman ulang setelah 5 hari stres kekeringan. a Kontrol tanaman yang diairi dengan larutan nutrisi. b Tanaman diairi dengan larutan nutrisi yang mengandung 0,8 mg/ml ION. c Tanaman diairi dengan larutan nutrisi yang mengandung 2 mg/ml ION
Pengaruh ION terhadap Konsentrasi Hidrogen Peroksida Daun
Jumlah hidrogen peroksida di daun setelah kekeringan secara substansial berkurang ketika ION ditambahkan ke larutan nutrisi yang digunakan untuk penyiraman. Variasi tinggi pada 0,8 mg ml
−1
perlakuan; karenanya, perbedaan terhadap perlakuan lain tidak signifikan secara statistik. Namun, perbedaan antara kontrol dan konsentrasi tertinggi 2 mg ml
−1
signifikan secara statistik dengan p nilai 0,004 dan rata-rata 84% lebih besar pada perlakuan kontrol (Gbr. 5).
Jumlah hidrogen peroksida terlarut per gram jaringan daun dari lobak biji minyak diperlakukan dengan larutan nutrisi yang mengandung ION dan ditantang dengan kekeringan selama 5 hari (n = 16, p nilai = 0,004)
Pengaruh ION pada Peroksidasi Lipid
Peroksidasi lipid dengan tingkat MDA sebagai proksi berkurang dengan penambahan ION, dengan konsentrasi rata-rata MDA 36% lebih rendah di daun tanaman dengan 200 mg ION ditambahkan. Kami menambahkan kontrol positif dengan konsentrasi molar yang sama dari ion besi (III); namun, variasinya terlalu besar untuk membuat kesimpulan. Rata-rata konsentrasi ION yang lebih rendah juga lebih rendah dari kontrol, menunjukkan kecenderungan penurunan peroksidasi lipid pada daun lobak biji minyak (Gbr. 6).
Konsentrasi MDA produk peroksidasi lipid dalam daun lobak yang diberi perlakuan dengan larutan nutrisi yang mengandung ION dan kekeringan selama 5 hari (n = 8, p nilai = 0,052)
Serapan Partikel Tumbuhan
Untuk menyelidiki penyerapan partikel ke dalam jaringan daun, kami mengukur kandungan besi daun dengan spektroskopi emisi atom plasma (ICP-AES) yang digabungkan secara induktif. Memang, peningkatan besi yang signifikan secara statistik diamati dalam perawatan dengan nanopartikel maghemite. Menariknya, konsentrasi besi berkurang pada daun yang diairi dengan ion besi (III) yang berlebihan (Gbr. 7).
Konsentrasi besi dalam daun tanaman brassica setelah perlakuan dengan nanopartikel maghemite, dibandingkan dengan kontrol dengan larutan nutrisi yang sama atau larutan nutrisi yang sama dengan rasio 1:1 M ion besi (III). Huruf yang berbeda menandakan perbedaan yang signifikan secara statistik (n = 15)
Untuk lebih menguatkan peningkatan kandungan besi sebagai bukti penyerapan partikel, kami mengukur magnetisasi suhu rendah di daun yang sama. Sebuah magnetisasi yang lebih besar diamati dalam kontrol di bawah medan magnet yang kuat, tetapi tanpa medan magnet, magnetisasi remanen lebih besar pada daun diperlakukan dengan nanopartikel maghemite (Gbr. 8 dan 9). Karena ukuran sampel yang kecil dan variasi yang besar, perbedaannya tidak signifikan secara statistik tetapi tren dengan jelas menunjukkan adanya ION superparamagnetik karena magnetisasi lebih tinggi dalam kontrol di bawah medan magnet tinggi tetapi lebih rendah ketika tidak ada medan magnet. Hal ini diselimuti oleh variasi, tetapi dalam sampel tertentu, keberadaan ION terlihat jelas (File tambahan 1:Gambar S2). Di satu sisi, pada suhu yang cukup rendah dan medan magnet yang cukup tinggi, magnetisasi untuk ion besi akan lebih besar daripada ion ferimagnetik. Di sisi lain, pada suhu rendah yang sama tetapi pada medan magnet nol, magnetisasi remanen akan lebih besar untuk ION karena momen magnetik nanopartikel terhalang.
Magnetisasi suhu rendah (2 K) dari abu daun tanaman yang diperlakukan dengan nanopartikel maghemite dibandingkan dengan tanaman kontrol. Bilah kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata (n = 6)
Magnetisasi suhu rendah (2 K) daun abu di bawah medan magnet yang berbeda. Plot di atas pada 10.000 Oe memiliki p nilai 0,8, dan plot di bawah pada bidang nol memiliki p nilai 0,08 (n = 6)
Karakterisasi Material
ION yang dihasilkan dengan metode Cui et al. (2013) membentuk gel, menunjukkan keberhasilan produksi nanopartikel pada urutan ~ 1–10 s nm. Gel kering digiling menjadi bubuk. SEM resolusi rendah tidak dapat menunjukkan partikel individu tetapi struktur hierarki serbuk terlihat jelas; EDS sampel tidak mendeteksi Y, hanya besi (Gbr. 7).
Ketika terdispersi dalam air, partikel membentuk agregat, dengan ukuran hidrodinamik hingga 500 nm, namun 84% partikel agregat lebih kecil dari 300 nm dan setidaknya 11% lebih kecil dari 50 nm. Dalam nilai absolut, menurut pengukuran Nanosight, ada 4,28 × 10
6
partikel yang lebih kecil dari 20 nm ml
−1
, dalam 50 kali dispersi encer yang diperlukan untuk pengukuran (Gbr. 8). Menghitung kembali, itu berarti ada sekitar 2 × 10
8
partikel yang lebih kecil dari 20 nm ml
−1
dalam perawatan.
Gambar yang dibuat oleh AFM menunjukkan pola yang sama seperti NTA yang dikombinasikan dengan XRD vide infra, dengan ukuran partikel dari beberapa nanometer hingga agregat beberapa ratus nanometer (Gbr. 9).
XRD partikel diperoleh 1 tahun setelah produksi dan masih menunjukkan pola struktur maghemite yang jelas, bukti keberhasilan stabilisasi maghemite (Gbr. 10). Ukuran kristal dihitung menjadi 3,8 nm dengan menggunakan persamaan Scherrer. Meskipun strukturnya kekal, pengenalan 13% berat Y, tentu saja, mempengaruhi keadaan vibrasi atom (File tambahan 1:Gambar S3).
Memindai citra elektron -Fe2 O3 disintesis melalui sintesis sol-gel terarah yttrium dan spektrum EDS dari bahan yang sama
Diskusi
Usulan penggunaan ION sebagai pupuk besi telah diselidiki sebelumnya di sistem lain [17,18,19]. Dalam penyelidikan ini, untuk pertama kalinya diuji apakah ada efek enzimatik dari pupuk serupa, selain efek pemberian nutrisi mikro, zat besi, pada spesies tanaman penting. Kontrol diberi besi chelated dalam jumlah yang cukup. Kami juga menguji, kontrol positif, di mana jumlah ekuivalen molar ion besi (III) ditambahkan ke kontrol negatif dengan jumlah yang memadai dari besi yang tersedia di pabrik. Oleh karena itu, efek positif dari ION yang terlihat dalam percobaan kami muncul dari sifat-sifat ION. Kami ingin menyarankan bahwa itu adalah efek enzimatik yang diketahui dari ION yang berperan [23, 25, 26]. Mekanisme lain masih tidak dapat dikesampingkan—ION juga dapat berinteraksi dengan protein, lipid, dan biomolekul lain [27], atau nanopartikel dapat menyerap ion besi asli ke permukaan dan karenanya mengurangi reaksi Fenton yang berbahaya. Fakta bahwa tingkat hidrogen peroksida daun berkurang dalam perlakuan ION itu sendiri merupakan bukti tidak langsung dari serapan partikel nano. Seiring dengan peningkatan konsentrasi besi dan perubahan magnetisasi pada maghemite, gambarannya menjadi lebih lengkap. Kontrol positif dengan ion besi (III) memiliki penurunan konsentrasi kandungan besi di daun, menunjukkan bahwa tanaman memiliki kemampuan untuk mengurangi serapan ion besi sebagai mekanisme pertahanan. Ini lebih lanjut menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi zat besi di daun dalam perawatan maghemite memang nanopartikel, yang tidak beracun bagi tanaman seperti halnya peningkatan kadar ion besi. Pengukuran magnetik menunjukkan perilaku superparamagnetik dan momen magnetik partikel nano yang diblokir pada suhu rendah khas -Fe2 yang sangat kecil. O3 di daun diperlakukan dengan maghemite [28], jelas menunjukkan serapan nanopartikel. Jumlah Y yang sangat kecil yang diberikan seharusnya tidak menimbulkan efek apa pun pada tanaman; ada sedikit yang diketahui tentang efek Y pada tanaman, tetapi Fu et al. (2014) menetapkan bahwa 2 mg L
−1
Y adalah dosis mematikan median (LD50) dalam sistem hidroponik, dan Maksimovic et al. (2014) mulai melihat efek racun pada 10
−5
mol L
−1
Y [29, 30]. Dalam konsentrasi tertinggi yang digunakan dalam eksperimen kami, jumlah perkiraan 50 mg (5,6 10
−4
mol) Y ditambahkan per pot dengan irigasi ke tanah, dari mana hanya sebagian kecil yang dapat diambil. Apa yang diambil seharusnya tidak tersedia sebagai ion, melainkan terikat dalam partikel maghemite. Tujuan memasukkan Y ke dalam sintesis adalah untuk mengurangi kelarutan nanopartikel maghemite dan juga untuk mencegah transformasi menjadi hematit, bentuk oksida besi yang kurang enzimatik. Tidak diragukan lagi, adalah bermanfaat untuk meningkatkan aktivitas katalase selama kondisi stres [31], karena seluruh rentang kondisi stres diketahui menyebabkan akumulasi toksik H2 O2 [32]. Selanjutnya, semakin jelas bahwa H2 O2 juga berfungsi sebagai molekul sinyal untuk stres [32, 33]. Peningkatan produksi biomassa masih harus dikuatkan, sebaiknya juga melihat hasil dan kualitas benih minyak. Ciri-ciri lain, seperti peningkatan kecepatan pertumbuhan daun, sifat yang sangat baik dalam lingkungan pertanian di mana persaingan melawan gulma sangat penting, dapat dengan mudah dipertimbangkan. Telah ditampilkan di Arabidopsis bahwa partikel besi valensi nol nano dapat menginduksi ekstrusi proton ke dalam apoplas daun dan dengan demikian memungkinkan ekspansi dinding sel yang digerakkan oleh turgor [34]. Efek yang sama juga diamati pada akar, yang juga dapat bermanfaat selama cekaman kekeringan [35]. Mereka juga mengamati peningkatan bukaan stomata daun yang dapat menyebabkan kehilangan air, tetapi ketika diukur, hanya ada sedikit perbedaan dibandingkan dengan kontrol. Ini adalah paradoks yang diketahui bahwa hubungan antara pembukaan stomata dan transpirasi air tidak linier [36]. Hubungan ini juga sangat dipengaruhi oleh lingkungan, misalnya kelembaban relatif atau angin [37]. Meskipun, nanopartikel valensi nol tentu saja tidak dianggap sama dengan maghemite, mekanisme pemanjangan daun yang terlihat dalam percobaan kami harus diselidiki. Ghafariyan dkk. (2013) mengamati, seperti yang kami lakukan, peningkatan konsentrasi klorofil di daun setelah penambahan ION dibandingkan dengan kontrol negatif tanpa besi sama sekali. Ketika mereka dibandingkan dengan besi chelated tidak ada perbedaan. Namun, menambahkan jumlah yang sama dari besi chelated sebagai ION akan menghasilkan lebih banyak besi yang tersedia di pabrik, karena dalam kasus partikel sebagian besar besi disimpan dalam struktur kristal. Oleh karena itu, ada kemungkinan tanaman hanya dipupuk dengan ION padahal sebenarnya mengalami defisiensi besi. Kami menemukan jumlah klorofil yang lebih tinggi di daun (menurut pengukuran SPAD, lihat Gbr. 1) ketika ION ditambahkan tambahan ke besi chelated. Kami juga mengukur pengurangan jumlah hidrogen peroksida dan MDA di daun, setelah kekeringan, ketika kami menambahkan ION. Rui dkk. (2016) tidak mengukur hidrogen peroksida tetapi MDA dan enzim yang terkait dengan stres oksidatif. Mereka menyarankan bahwa stres oksidatif tidak terjadi dari penambahan ION, dan memang, mereka juga menemukan jumlah MDA yang berkurang di daun, dibandingkan dengan besi chelated, pada 10 mg kg
−1
konsentrasi. Di akar, mereka melihat pengurangan MDA karena mereka meningkatkan konsentrasi ION. Mereka juga mengukur jumlah aktivitas superoksida dismutase dan peroksidase yang berkurang dibandingkan dengan besi chelated yang menunjukkan bahwa hipotesis kami bahwa ION dapat bekerja sebagai pemulung oksigen reaktif, in vivo, mungkin benar. Pemulungan oksigen reaktif lebih lanjut ditunjukkan oleh pengurangan hidrogen peroksida yang terukur dalam daun Brassica napus . Ini menjelaskan peningkatan resistensi terhadap kekeringan yang diamati pada penambahan ION.
Kesimpulan
Eksperimen kami telah memberikan bukti untuk mekanisme ION yang bertindak sebagai nanozim di planta , mengungkapkan hubungan antara penurunan kandungan hidrogen peroksida dalam daun Brassica napus dan pengenalan ION. Peningkatan resistensi terhadap kekeringan yang diamati setelah penambahan ION dapat dikaitkan dengan pengurangan stres oksidatif.
Metode
Kondisi dan Desain Eksperimental
Brassica napus benih, dari varietas lobak musim semi Larissa (Benih Skandinavia AB, Lidköping, Swedia), disterilkan dan berkecambah di piring agar selama 3 hari sebelum bibit dengan ukuran yang sama dipindahkan ke pot dengan S-Soil yang disterilkan (Hasselfors garden, rebro, Swedia) . Ini adalah tanah untuk pertumbuhan profesional bibit dengan jumlah rendah semua nutrisi makro dan mikro, perlit untuk aerasi, asam humat yang merangsang pertumbuhan dan pH 6. Tanaman dibiarkan tumbuh di pot selama 7 hari, diairi dengan deionisasi. air. Sebelum perawatan dimulai, tanaman didistribusikan di antara nampan, sehingga ukuran tanaman sekonsisten mungkin. Sejak hari ketujuh, setelah dipindahkan ke pot, tanaman diairi dengan larutan nutrisi, larutan nutrisi dengan tambahan FeCl3 atau larutan nutrisi dengan konsentrasi -Fe2 yang berbeda O3 ION. Setiap pot diairi dengan 40 ml setiap hari. Tanaman ditanam di ruang pertumbuhan dengan cahaya 16 jam (180 μE m
−2
s
−1
) dan kegelapan 8 jam. Suhu diatur ke 25 °C selama iradiasi dan 22 ° selama kegelapan dan kelembaban relatif hingga 65%. Tanaman ditanam dalam pot berukuran 8 × 8 cm dalam baki yang masing-masing berisi delapan pot. Setiap perlakuan memiliki dua baki dan 16 ulangan biologis. Baki dipindahkan dalam urutan yang berputar setiap hari untuk mengimbangi setiap variasi di dalam ruangan. Perawatan berlangsung selama 5 hari dengan menambahkan total 200 ml 0,5, 0,8, 1, atau 2 mg ml
−1
, masing-masing 100, 160, 200 atau 400 mg per tanaman. Setelah 5 hari penambahan ION, semua perlakuan disiram dengan larutan nutrisi (File tambahan 1:Tabel S1), selama 5 hari sebelum 4 hari kekeringan dimulai. Setelah 4 hari kekeringan, pengukuran hidrogen peroksida dan peroksidasi lipid dilakukan dan tanaman disiram lagi dengan larutan nutrisi yang sama selama 3 hari untuk mempelajari pemulihan. Eksperimen tersebut direplikasi empat kali.
Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel
Partikel maghemite diproduksi sesuai dengan metode [38] dengan sekitar 13% berat yttrium (Y) dan dicirikan oleh difraksi sinar-x (XRD), pemindaian mikroskop elektron (SEM), analisis pelacakan partikel nano (NTA), spektroskopi inframerah (FTIR), analisis termogravimetri (TGA), dan mikroskop gaya atom (AFM). Gambar SEM diperoleh dengan Hitachi TM1000, dengan spektrometer x-ray dispersif elektron Oxford DeX (EDS). Ukuran hidrodinamik diukur melalui analisis pelacakan nano (NTA) pada Nanosight 300 (Gbr. 11). Spektrum Perkin-Elmer 100 digunakan untuk melakukan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dalam pelet kalium bromida (KBr). Untuk analisis termogravimetri (TGA), Perkin-Elmer Pyris 1 digunakan dan untuk mikroskop gaya atom (AFM), Bruker FastScan (Gbr. 12). XRD dilakukan pada difraktometer multiguna Bruker Smart ApexII dengan sumber molibdenum; ukuran kristal dihitung dengan persamaan sherrer menggunakan puncak terbesar pada sudut 2θ° 16.197 dengan lebar penuh setengah maksimum (FWHM) sebesar 1,01358489355378 yang dihitung dengan fungsi pencari puncak perangkat lunak Origin (Gbr. 13). ION kering disuspensikan dalam larutan nutrisi, dengan 3,4 mg L
−1
besi chelated, sama digunakan sebagai kontrol. Untuk daftar lengkap semua nutrisi, lihat File tambahan 1:Tabel S1.
Distribusi ukuran partikel hidrodinamik dalam air, yang diukur dengan NTA, sebesar -Fe2 O3 disintesis melalui sintesis sol-gel terarah yttrium. Nilai dirata-ratakan dari empat pengukuran berulang, dan area di dalam garis tipis menunjukkan kesalahan rata-rata
Nanopartikel maghemite disintesis melalui sol-gel yang diarahkan yttrium, didispersikan ke wafer silikon dan dicitrakan dengan AFM. Gambar yang sama direpresentasikan dalam 3D dan 2D
Difraktogram serbuk dari nanopartikel maghemite yang dihasilkan. Puncak sejajar dengan posisi maghemite standar dari database terlihat sebagai titik dengan garis jatuh di dasar gambar. Ukuran kristal dihitung dari puncak terbesar pada 16,197 2θ derajat sudut
Pengukuran Sifat Tumbuhan
Sebelum perlakuan dimulai, diukur panjang daun terpanjang, daun sejati pertama, pada setiap tanaman. Kemudian, setelah 5 hari irigasi berurutan dengan ION dalam larutan nutrisi atau larutan nutrisi saja, daun yang sama diukur kembali. Hasilnya dilaporkan sebagai peningkatan persentase. Klorofil daun dinilai dengan SPAD-pengukuran dengan Minolta SPAD-meter, sebelum selama dan setelah pengobatan dan kemudian setelah kekeringan. Tiga pengukuran, pada dua daun per tanaman, dirata-ratakan untuk masing-masing dari 16 ulangan biologis. Terakhir, biomassa di atas tanah dari semua tanaman ditimbang dan dimasukkan ke dalam aluminium foil untuk dikeringkan pada suhu 110 °C selama 72 jam.
Kandungan Besi dan Pengukuran Magnetik
Setelah kekeringan selama lima hari, percobaan berakhir dan semua jaringan tanaman di atas tanah diabusi pada suhu 450 °C selama 24 jam. Setelah abu dihomogenkan, 10 mg ditimbang per sampel dan dilarutkan dalam 3 ml asam klorida 36% pada shaker semalaman. Kemudian, sampel diencerkan dengan 44,74 ml etanol 10% dalam air Milli-Q dan selanjutnya diukur besi dengan ICP-AES pada 238,204 nm. Untuk pengukuran magnetik, abu yang sama ditempatkan ke dalam wadah sampel dan berat yang tepat untuk setiap sampel ditimbang dengan neraca presisi. Kemudian, sampel didinginkan hingga 2 K, dan sapuan medan magnet dari 10.000 hingga 0 Oersted dilakukan pada magnetometer perangkat interferensi kuantum superkonduktor (SQUID). Momen magnetik akibat pemegang sampel dikurangi dari momen magnetik terukur sebelum dinormalisasi dengan berat besi dalam sampel.
Pengukuran Hidrogen Peroksida
Hidrogen peroksida dalam daun diukur dengan metode eFOX yang dilaporkan oleh [39]. Ke-16 tanaman dikumpulkan menjadi empat ulangan biologis dengan masing-masing empat tanaman. Lima puluh miligram diambil dari daun termuda dan masih segar dari setiap tanaman. Kemudian, 200 mg bahan daun dihaluskan dalam mortar yang telah didinginkan sebelumnya dalam nitrogen cair. Pada bubuk, kami menambahkan 4 ml 100 mM buffer fosfat (pH 6,9) dan mengaduk es menjadi cairan homogen. Dari cairan homogen ini, kami memindahkan 1900 l ke dalam tabung Eppendorf 2 ml dan menambahkan 20 l ferro amonium sulfat (garam Mohrs) 20 l 20 l, 20 l sorbitol 10 mM, 20 l 10 mM xylenol orange, 20 μl 99 % etanol, dan 20 l asam sulfat 250 mM. Spektrum absorbansi terlihat penuh diambil untuk setiap sampel, tetapi perbedaan antara 550 dan 800 nm digunakan untuk kuantifikasi hidrogen peroksida. Kurva kalibrasi dari 2 hingga 40 μM hidrogen peroksida dibuat dengan R
2
nilai 0,9946.
Peroksidasi Lipid
Peroksidasi lipid diukur menurut metode [40]. Sampel dipanen dengan cara yang sama seperti untuk pengukuran hidrogen peroksida, kecuali bahwa sampel tersebut dihomogenkan dalam 4 ml 0,1% w /v asam trikloroasetat (TCA). Absorbansi diukur pada 532 nm dan dikoreksi untuk kekeruhan nonspesifik dengan mengurangkan absorbansi pada 600 nm. Koefisien kepunahan 155 mM cm
−1
digunakan untuk menghitung konsentrasi malondialdehid (MDA).
Analisis Statistik
Semua statistik dilakukan dalam perangkat lunak Minitab 17. Semua data dijalankan melalui ANOVA satu arah dengan uji Fisher untuk pengelompokan. t Student siswa tes dilakukan untuk menemukan p . tertentu nilai antara kelompok yang ditemukan memiliki perbedaan yang signifikan secara statistik.
