Restore microRNA-133a-3p atau Depleted PSAT1 Menahan Kerusakan Sel Endotel yang Diinduksi Aneurisma Intrakranial Melalui Menekan Jalur GSK3β/β-Catenin
Abstrak
Tidak jelas tentang peran fungsional microRNA-133a-3p (miR-133a-3p) dalam aneurisma intrakranial (IA). Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki peran regulasi miR-133a-3p pada regulasi IA yang diinduksi oleh cedera endotel vaskular melalui pensinyalan phosphoserine aminotransferase 1 (PSAT1)/glikogen sintase kinase 3β (GSK3β)/β-catenin. jalan. Jaringan arteriol intrakranial normal dan jaringan IA dikumpulkan dari pasien dengan trauma otak dan IA. Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan -catenin dalam jaringan ditentukan dengan RT-qPCR dan analisis western blot. Sel-sel endotel (EC) dari IA manusia dikultur dan diperlakukan dengan miR-133a-3p mimik dan si-PSAT1 untuk menentukan fungsinya dalam migrasi sel endotel, apoptosis, dan proliferasi. Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, -catenin, Ki-67, CyclinD1, Bax, dan Bcl-2 di EC diuji dengan RT-qPCR atau analisis western blot. Selain itu, model tikus IA dibuat untuk mendeteksi perubahan patologis dan ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, -catenin, VEGF, dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo. Ekspresi miR-133a-3p terkait dengan jumlah dan ukuran IA. Ekspresi MiR-133a-3p telah mati dan ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -catenin dinaikkan di IA. MiR-133a-3p yang dipulihkan dan PSAT1 yang habis mengurangi perubahan patologis; penurunan ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -catenin di IA; menekan apoptosis dan proliferasi dan migrasi lanjut IA ECs, serta mengurangi ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo. Studi kami menunjukkan bahwa ekspresi berlebih miR-133a-3p atau penurunan regulasi PSAT1 menahan kerusakan sel endotel dan memajukan proliferasi sel endotel melalui penghambatan jalur GSK3β/β-catenin di IA. MiR-133a-3p mungkin menjadi calon penanda potensial dan target terapi untuk IA.
Penyajian Hipotesis
Dalam penelitian ini, kami dapat berspekulasi bahwa sumbu miR-133a-3p/PSAT1 dapat memengaruhi IA yang diinduksi kerusakan sel endotel melalui modulasi jalur GSK3β/β-catenin.
Menguji Hipotesis
Untuk memverifikasi hipotesis ini, kami mengumpulkan sampel klinis, sel endotel (EC) dari IA manusia, dan membuat model tikus IA untuk menjelaskan fungsi miR-133a-3p dan PSAT1 dalam proses IA.
Implikasi Hipotesis
Studi kami mengkonfirmasi hipotesis kami bahwa ekspresi berlebih miR-133a-3p atau penurunan regulasi PSAT1 menahan kerusakan sel endotel dan memajukan proliferasi sel endotel melalui penghambatan jalur GSK3β/β-catenin di IA. Temuan ini memberikan wawasan baru dalam terapi target baru untuk IA.
Pengantar
Aneurisma intrakranial (IA) adalah sejenis gangguan serebrovaskular, yang ditandai dengan penonjolan arteri di otak yang tidak konvensional serta perdarahan subarachnoid (SAH) yang disebabkan oleh ruptur IA, disertai dengan kematian dan morbiditas yang tinggi [1]. Seperti penyakit destruktif, patogenesis IA belum diklarifikasi [2]. IA adalah bentuk familial yang jarang, tetapi umumnya dianggap sebagai akibat dari cedera vaskular didapat yang disebabkan oleh hipertensi, merokok, dan faktor risiko tradisional lainnya [3]. Endovascular coiling atau microsurgical clipping telah digunakan untuk mencegah ruptur aneurisma yang tidak pecah di masa depan pada pasien dengan risiko tinggi ruptur [4]. Meskipun kemajuan yang signifikan telah dibuat dalam operasi bedah IA, pemulihan pasca operasi yang buruk masih terjadi pada pasien IA [5]. Situasi sulit dari pengobatan IA membuatnya perlu untuk mengeksplorasi mekanisme lebih lanjut dan menemukan strategi terapi baru.
MicroRNAs (MiRNAs) adalah kelas RNA non-coding yang memodulasi ekspresi gen target melalui translasi menghambat pada tingkat pasca-transkripsi atau memediasi degradasi mRNA [6]. Telah terungkap bahwa miR-133a-3p sebagai penghambat tumor pada beberapa neoplasia ganas dan ekspresi berlebih miR-133a-3p dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolorektal (CRC) [7]. Sebuah penelitian sebelumnya berpendapat bahwa dengan memblokir glutaminolisis yang dimediasi autophagy, miR-133a-3p lebih lanjut menekan metastasis dan pertumbuhan kanker lambung [8]. Juga, sebuah penelitian telah mempresentasikan bahwa miR-133a-3p berpartisipasi dalam mengatur perkembangan jantung dan hipertrofi jantung [9]. Sebuah penelitian telah menunjukkan bahwa peningkatan regulasi miR-195-5p menurunkan angiogenesis dan resistensi cisplatin pada kanker ovarium melalui penekanan jalur pensinyalan GSK3β/β-catenin yang bergantung pada fosfoserin 1 (PSAT1) [10]. Studi lain telah melaporkan bahwa miR-365 menekan invasi sel dan pertumbuhan karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC) melalui modulasi PSAT1 [11]. PSAT1 adalah enzim yang terlibat dalam biosintesis serin; itu awalnya dimurnikan dari otak domba dan memiliki tingkat tinggi di banyak jaringan [12]. Telah didokumentasikan bahwa PSAT1 ditemukan untuk memediasi perkembangan siklus sel pada kanker payudara melalui modulasi jalur pensinyalan GSK3β/β-catenin [13]. Liu dkk. juga menunjukkan bahwa PSAT1 berfungsi pada pengembangan ESCC dan memperkirakan kelangsungan hidup yang buruk; oleh karena itu, ini mungkin menjadi target yang menjanjikan untuk terapi antikanker [14]. Mengingat analisis yang disebutkan di atas, penelitian ini diharapkan memberikan kontribusi pada pendekatan baru untuk peran fungsional sumbu miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-catenin di IA.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Penelitian ini disetujui oleh Institutional Review Board Rumah Sakit Pengajaran Pertama Universitas Tianjin Pengobatan Tradisional Cina. Semua peserta menandatangani dokumen informed consent. Semua eksperimen hewan dihitung dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium oleh Komite Internasional.
Mata Pelajaran
Dari Januari 2016 hingga Maret 2018, kasus SAH yang disebabkan oleh IA yang dirawat di bedah saraf Rumah Sakit Pengajaran Pertama Universitas Pengobatan Tradisional Tiongkok Universitas Tianjin dipilih. Sampel patologis dari 75 kasus IA yang diperoleh dengan bedah mikro dikumpulkan dan diklasifikasikan sebagai kelompok IA, termasuk 29 laki-laki dan 46 perempuan berusia 31-55 tahun, dengan usia rata-rata 44,98 ± 6,79 tahun. Pasien dengan trauma otak yang dirawat di bedah saraf pada saat yang sama di Rumah Sakit Pengajaran Pertama Universitas Pengobatan Tradisional China Universitas Tianjin dipilih sebagai kelompok kontrol. Juga, 75 kasus jaringan arteriol intrakranial normal dikumpulkan oleh operasi traumatis atau dekompresi internal, termasuk 43 pria dan 32 wanita berusia 34-56 tahun, dengan usia rata-rata 48,14 ± 8,68 tahun. Pasien dikeluarkan jika mereka memiliki riwayat hipertensi, diabetes, atau tumor. Tidak ada perbedaan mencolok dalam jenis kelamin dan usia antara kelompok IA dan kelompok kontrol (keduanya P> 0,05).
Perlakuan dan Pengawetan Sampel
Setelah reseksi bedah, beberapa sampel dalam dua kelompok difiksasi dengan formaldehida, didehidrasi dengan alkohol gradien dari konsentrasi rendah ke tinggi, dan disematkan dengan parafin. Kemudian sampel diiris untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia. Beberapa sampel dengan cepat ditempatkan dalam tangki nitrogen cair dan kemudian dipindahkan ke lemari es kriogenik 80 °C untuk mendeteksi analisis western blot dan reaksi rantai polimerase kuantitatif transkripsi balik (RT-qPCR). Beberapa sampel difiksasi dengan glutaraldehid untuk pengamatan mikroskop elektron, dan beberapa sampel digunakan untuk isolasi EC.
Pengamatan Mikroskop Elektron
Sampel difiksasi dengan glutaraldehid 3%, kemudian difiksasi kembali dengan osmium tetroksida 1%. Sampel didehidrasi dengan aseton, disematkan dengan Epon812, dan diiris menjadi bagian semi tipis dengan ketebalan 3 m. Terakhir, sampel dicelup ganda dengan uranil asetat dan timbal sitrat dan diamati dengan mikroskop elektron transmisi H-600IV (Hitachi, Tokyo, Jepang).
Pewarnaan HE
Bagian parafin yang disiapkan dipanggang pada suhu 60 ° C selama 30 menit. Setelah langkah-langkah di atas selesai, irisan jaringan difiksasi dalam xilena, didehidrasi dengan alkohol absolut gradien, dan dibersihkan dengan saline buffer fosfat (PBS). Irisan jaringan diwarnai dengan hematoxylin, diperlakukan dalam amonia selama beberapa detik, dicelup dengan eosin selama 2 menit, didehidrasi, dan dibersihkan. Kemudian potongan jaringan ditetesi dengan neutral gum dan ditutup dengan cover glass. Akhirnya, mikroskop (Nikon, Tokyo, Jepang) diadopsi untuk mengamati dan merekam.
Pewarnaan imunohistokimia
Kit imunohistokimia diproduksi oleh Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Irisan parafin didewax dan dihidrasi, dan irisan parafin direndam dalam larutan xilena selama 5 menit × 3 kali. Irisan ditempatkan dalam alkohol absolut 100% selama 3 menit × 2 kali dan kemudian direndam dalam alkohol 95-75% selama 3 menit secara bergantian. Setelah dewaxing, irisan diinkubasi dengan hidrogen peroksida 3% selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Irisan ditetesi larutan blocking dan diinkubasi dengan larutan kerja serum kambing normal selama 15 menit, kemudian diperiksa dengan antibodi primer terhadap matrix metalloprotease (MMP)-9 (5 g/mL) dan vascular endothelial growth factor (VEGF) (1:250 , Abcam, Cambridge, MA, USA) (PBS untuk kontrol negatif (NC)) dan diinkubasi selama 1-2 jam. Irisan diperiksa ulang dengan larutan kerja antibodi sekunder biotinilasi selama 30-60 menit. Irisan tersebut ditambahkan dengan cairan kerja streptavidin/peroksidase yang diberi label oleh horseradish peroksidase, ditetesi dengan larutan diaminobenzidine (DAB) yang baru disiapkan, diwarnai, dan diblokir. Gambar itu dikenalkan oleh sistem pencitraan Nikon SPOT FlexTM. Area ekspresi protein MMP-9 dan VEGF diukur dengan perangkat lunak analisis kuantitatif imunohistokimia. Lima bidang visual berdaya tinggi terdeteksi secara acak di area akumulasi sel positif di setiap sampel, dan absorbansi rata-rata setiap layar digunakan sebagai nilai rata-rata untuk analisis statistik.
Isolasi dan Budaya EC
EC diisolasi dari jaringan arteriol intrakranial normal dan jaringan IA dan dikultur. Jaringan dipotong menjadi 3 mm
2
fragmen dan diinkubasi selama 25 menit di 0.1% collagenase B/0.1% dispase (Roche, Basel, Swiss). Jaringan dilepaskan, ditriturasi selama 2 menit dengan pipet 2 mL, dan disaring OLEH saringan 100 m (BD Biosciences, NJ, USA) untuk mengisolasi EC. Suspensi sel disentrifugasi dan kemudian disuspensikan kembali dalam media kultur MV2 yang mengandung faktor pertumbuhan dan 20% serum janin sapi (PromoCell, Heidelberg, Jerman). Selanjutnya, sel-sel diunggulkan pada piringan berlapis fibronektin (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) dengan kepadatan 10
4
sel/cm
2
(1 g/cm
2
) dan ditanam selama 1 hari dengan 5% CO2 . Sehari setelah penyemaian, sel dibilas dengan PBS untuk menghilangkan sel yang tidak terikat dan ditempatkan dalam media segar. Ketika mencapai sekitar 80–100% pertemuan, kultur terpapar imunoseparasi oleh manik-manik berlapis Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) untuk mendapatkan EC murni. EC yang terikat pada manik-manik berlapis lektin dikumpulkan dengan konsentrator partikel magnetik sementara sel-sel yang tidak terikat dihilangkan melalui pencucian dengan media basal dua kali. Sel-sel positif UEA disuspensikan kembali dalam media kultur dan diunggulkan pada piringan berlapis fibronektin untuk memperbaiki adhesi dan pertumbuhannya. Budaya menjadi menyatu dalam 4–6 hari.
Identifikasi EC
EC diidentifikasi dengan pewarnaan imunositokimia dengan antibodi CD31 permukaan sel dan antigen terkait faktor FVII. Sel dibersihkan dua kali dengan PBS, difiksasi dengan 4% paraformaldehyde, diinkubasi dengan 3% H2 O2 selama 10-15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen dan kemudian diinkubasi dengan 0,1% Triton X-100 selama 10 menit ke sel berlubang. Sel-sel ditetesi dengan antibodi primer spesifik:Faktor VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basel, Swiss) dan diinkubasi pada suhu 4 °C semalaman. Kemudian, sel ditetesi imunoglobulin G (1:50) yang diberi label dengan antibodi sekunder peroksidase lobak. Sel-sel diinkubasi pada 37 ° C selama 45 menit dan dikembangkan oleh DAB menghindari cahaya selama 4 menit. Kemudian, pengembangan warna diakhiri dengan air suling dan foto diamati di bawah mikroskop. Sel-sel diamati di bawah mikroskop perbedaan fase terbalik fluoresensi, dan sel-sel positif dan jumlah total sel dihitung secara acak dari 10 bidang visual. Laju sel pewarnaan positif =(jumlah sel positif/jumlah total sel) × 100%. Grup NC yang sesuai dibentuk dan antibodi primer digantikan oleh PBS, dan langkah-langkah lainnya dilakukan seperti di atas.
Pengelompokan dan Transfeksi Sel
Untuk mempelajari efek antara miR-133a-3p dan PSAT1 pada EC IA, EC dikelompokkan ke dalam kelompok kontrol (EC vaskular normal tanpa transfeksi apa pun), kelompok IA (EC vaskular IA tanpa transfeksi apa pun), meniru kelompok NC (ditransfeksi dengan miR -133a-3p mimik NC), grup miR-133a-3p mimik (ditransfeksi dengan miR-133a-3p mimik), grup RNA (si)-NC kecil yang mengganggu (ditransfeksi dengan si-PSAT1 NC), grup si-PSAT1 (ditransfeksi dengan si-PSAT1), dan miR-133a-3p mimik + kelompok ekspresi berlebih (oe)-PSAT1 (ditransfeksi dengan miR-133a-3p mimik dan oe-PSAT1). Di antara mereka, mimik NC, miR-133a-3p mimik, si-PSAT1, si-NC, dan oe-PSAT1 dirancang dan disusun oleh GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Transfeksi dilakukan sesuai dengan instruksi Lipofectamine
TM
2000 reagen transfeksi (Thermo Fisher Scientific, MA, USA).
Flow Cytometry
Media dalam cawan kultur dibuang, dan sel dibilas dua kali dengan PBS. Sel dipisahkan oleh tripsin 0,25%, disentrifugasi pada 800 rpm selama 5 menit, dan disuspensikan dengan buffer pengikat 1 ×, dan kepadatan sel disesuaikan menjadi 1 × 10
7
sel/mL. Suspensi sel (100 L) diinkubasi dengan 5 L propidium iodida (PI, 20 g/mL) dan annexin V-FITC selama 20 menit, kemudian dicampur dengan 400 L 1 × buffer pengikat. Flow cytometer (penyortir sel BD FACSarial I) digunakan untuk mendeteksi apoptosis sel dalam 1 jam. Hasilnya adalah kuadran kiri bawah (Q4) pada peta sebar menunjukkan sel-sel hidup yang sehat (FITC
−
/PI
−
), kuadran kanan bawah (Q3) sebagai sel apoptosis awal (FITC
+
/PI
−
), dan kuadran kanan atas (Q2) adalah sel-sel apoptosis dan apoptosis akhir (FITC
+
/PI
+
); tingkat apoptosis =persentase apoptosis awal (Q3) + persentase apoptosis akhir (Q2).
Sel-sel dipisahkan dengan tripsin untuk menyiapkan suspensi sel. Sel dihitung di bawah mikroskop terbalik. Konsentrasi sel disesuaikan menjadi 5 × 10
4
sel/mL. Sel-sel diunggulkan dalam piring kultur 96-sumur. Setelah 48 jam, sel diinkubasi dengan 20 L larutan MTT selama 4 jam. MTT di setiap sumur dilarutkan dengan 150 L dimetil sulfoksida. Nilai densitas optik (OD) EC diukur pada panjang gelombang 570 nm. Tingkat proliferasi EC diperhitungkan berdasarkan nilai OD.
Uji Gores
Sel-sel di setiap kelompok diunggulkan dalam piring 24-sumur dengan 2 × 10
5
sel / sumur. Tiga sumur paralel dipasang di setiap kelompok. Ketika mencapai sekitar 90% pertemuan, bidang pertumbuhan sel digores dengan ujung mikropipet 1 mL sekali pakai yang disterilkan; setiap sumur digores satu kali dan panjang goresan serta kedalaman setiap sumur konsisten. Setelah penggoresan, sel-sel yang mengambang dihilangkan, media kultur diganti dengan yang baru, dan jarak goresan diamati di bawah mikroskop setelah 24 jam kultur. Area penyembuhan luka gores dihitung oleh perangkat lunak National Instrument Vision Assistant 8.6. Migrasi sel =area penyembuhan luka/area awal luka gores × 100%.
Hewan Percobaan dan Pembentukan Model Tikus IA
Delapan puluh empat tikus Sprague-Dawley (SD) berusia 7 minggu dan ditimbang dari 180 hingga 200 g (Pusat Laboratorium Hewan, Akademi Ilmu Kedokteran Militer, Beijing, Cina) dipilih. Tikus ditempatkan di pusat percobaan hewan. Kondisi makan dikontrol pada 22-25 °C dan kelembaban 50-60% dengan cahaya alami. Semua tikus diberi makan di kandang tikus standar dengan 4 ekor tikus per kandang. Tikus diberi makan dengan air minum sanitasi perkotaan dan pakan tikus biasa. Bantal diganti setiap 3 hari, dan kandang dicuci dan disterilkan. Tikus IA dimodelkan sesuai dengan referensi [15]. Aneurisma pecah diidentifikasi ketika gejala berikut terjadi pada tikus [16]:1, penurunan aktivitas makan atau minum yang dilakukan dengan penurunan berat badan (sekitar 10% penurunan berat badan) selama 24 jam; 2, fleksi batang tubuh dan kaki depan saat diangkat; 3, berjalan di satu sisi dalam postur normal; 4, condong ke satu sisi saat istirahat, tidak ada aktivitas spontan. Tikus dengan gejala ini di-eutanasia 3 bulan setelah operasi. Jaringan IA diperoleh selama operasi dan diperfusi dengan PBS, dan pewarna biru yang mengandung asam glutamat diperfusi ke dalam arteri serebral.
Perawatan dan Intervensi Tikus IA
84 ekor tikus di atas dipisahkan secara acak menjadi 7 kelompok dengan masing-masing kelompok 12 ekor. Metode pengobatan adalah sebagai berikut:kelompok normal (tidak ada pemodelan yang dilakukan); kelompok IA (stereotactic disuntik dengan 100 L campuran PBS dan Lipofectamine 2000); meniru kelompok NC (injeksi stereotaktik dengan 100 L campuran miR-133a-3p meniru NC dan Lipofectamine 2000); kelompok miR-133a-3p mimik (injeksi stereotaktik dengan 100 L campuran miR-133a-3p mimik dan Lipofectamine 2000); kelompok si-NC (injeksi stereotaktik dengan 100 L campuran si-PSAT1 NC dan Lipofectamine 2000); kelompok si-PSAT1 (injeksi stereotaktik dengan 100 L campuran si-PSAT1 dan Lipofectamine 2000); dan kelompok miR-133a-3p mimik + oe-PSAT1 (injeksi stereotaktik dengan 100 L campuran miR-133a-3p mimik dan oe-PSAT1 dan Lipofectamine 2000). Semua suntikan di atas dilakukan sekali sehari, dan tikus-tikus ini dibesarkan di laboratorium hewan tertentu yang bebas patogen (SPF) selama 12 minggu. Setelah 12 minggu, tikus di masing-masing kelompok dibius dan rongga dada dibuka seperti dijelaskan di atas. Dari intubasi ventrikel kiri ke dalam aorta, darah dikeluarkan dengan memotong cava. Pada saat yang sama, 30 mL saline yang mengandung heparin sodium (37 °C) diperfusi melalui saluran, dan kemudian, 10% poliformaldehida/buffer fosfat 0,1 M (pH 7,4) secara perlahan disuntikkan ke otak melalui saluran. Setelah perfusi diperbaiki, otak dibuka. Cincin arteri di dasar tengkorak dipisahkan dan diangkat di bawah mikroskop bedah, perubahan aneurisma diamati di bawah mikroskop, dan karakteristik patologis disurvei. NC mimik, miR-133a-3p mimik, si-NC, si-PSAT1, dan oe-PSAT1 digabungkan oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).
Deteksi Hemodinamik
Laju aliran darah pada ujung arteri karotis komunis kiri tikus diuji sebelum 3 hari operasi dan 12 minggu setelah perlakuan intervensi. Metodenya adalah sebagai berikut:tikus dimasukkan ke dalam kerangka hewan dari mesin anestesi untuk inhalasi, dan parameter aliran disesuaikan. Setelah tikus bernafas dengan stabil dan tidak ada reaksi yang jelas saat ekor tikus disentuh, tikus difiksasi di meja operasi percobaan dengan karet gelang. Rambut leher tikus dicukur dengan alat cukur listrik. Detektor ultrasound Doppler warna dihidupkan, dan kecepatan aliran darah di ujung arteri karotis komunis kiri diukur dan data dicatat setelah probe diolesi dengan bahan penghubung yang sesuai. Setelah pengukuran, tikus dimasukkan kembali ke dalam kandang dengan hati-hati agar saluran pernapasan tidak terhalang sampai tikus bangun setelah dibius.
RT-qPCR
Total RNA diabstraksikan berdasarkan kit ekstraksi RNA total sederhana RNA (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China). RNA berkualitas tinggi dikonfirmasi oleh analisis ultraviolet dan elektroforesis denaturasi formaldehida, dan RNA ditranskripsi secara terbalik menjadi DNA komplementer oleh Kit reagen PrimeScript RT. Reaksi PCR dilakukan oleh SYBR Permix Ex Taq
II
(Takara, Dalian, Liaoning, Tiongkok). Primer PCR dirancang dan diperparah oleh Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China) (Tabel 1). U6 dipilih sebagai parameter internal untuk miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, -catenin, Bax, Bcl-2, Ki-67, dan CyclinD1 dengan gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai parameter internal. Data diukur dengan 2
−ΔΔCt
.
Analisis Western Blot
Protein total diekstraksi dari sel dan jaringan, dan sampel protein diukur dengan Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China). Sampel dicampur dengan 1/4 volume 5 × buffer sampel dan direbus selama 5 menit. Gel pemisahan 10% dan gel pekat 5% dipilih untuk elektroforesis. Membran ditetaskan dalam susu bubuk skim 5% selama 60 menit. Membran ditambahkan dengan antibodi primer PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), -catenin (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 g/mL), VEGF (1:1000) (semua dari Abcam, Cambridge, MA, USA). Kemudian, membran ditetaskan dengan antibodi sekunder (1:2000) selama 60 menit. Membran direndam ke dalam larutan reaksi elektrokimia (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) selama 1 menit, kemudian ditutup dengan pembungkus makanan setelah cairan dikeluarkan. Membran diekspos dengan sinar-X, dan hasilnya diamati setelah dikembangkan dan diperbaiki. GAPDH (1:10000, Abcam) digunakan sebagai kontrol pemuatan, dan citra protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Hubungan target antara miR-133a-3p dan PSAT1 dan situs pengikatan antara miR-133a-3p dan PSAT1 3′ wilayah yang tidak diterjemahkan (3′UTR) diperkirakan oleh situs web bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22 /Dihitung sebelumnya/). Urutan wilayah promotor PSAT1 3′UTR yang mengandung situs pengikatan miR-133a-3p diamplifikasi dan diklon ke dalam plasmid luciferase dasar pGL3 (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Jepang) untuk membangun plasmid tipe liar (WT) ( PSAT1-WT) dari PSAT1 3′UTR, sedangkan plasmid rekombinan PSAT1-MUT mutan (MUT) diformulasikan dengan memutasikan situs pengikatan miR-133a-3p pada PSAT1-WT dengan kit mutasi titik (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga , Jepang). EC vaskular dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur. Ketika pertemuan mencapai sekitar 70%, plasmid PSAT1-WT dan PSAT1-MUT dicampur dengan plasmid mimik NC dan miR-133a-3p oleh Lipofectamine 2000 dan ditransfusikan bersama ke EC vaskular. Sel dikumpulkan dan dilisiskan 48 jam setelah transfeksi, dan aktivitas luciferase diverifikasi oleh kit deteksi luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, USA).
Analisis Statistik
Semua data dijelaskan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Data pencacahan ditunjukkan dengan laju atau persentase, dan analisis ditentukan dengan uji chi-square atau uji Fisher. Data pengukuran yang mengalami distribusi normal disampaikan dengan mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh t uji, sedangkan perbandingan antara beberapa kelompok dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post hoc Tukey. P nilai <0,05 dianggap signifikan.
Hasil
Data Umum Pasien IA
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, data umum dari kelompok IA dan kelompok kontrol dibandingkan. Informasi spesifik tercantum dalam Tabel 2.
Ekspresi miR-133a-3p Terkait dengan Jumlah dan Ukuran IA
Dengan menganalisis hubungan antara ekspresi miR-133a-3p dan fitur klinikopatologis IA, dirinci dalam Tabel 3 bahwa berdasarkan ekspresi relatif rata-rata miR-133a-3p di IA, 75 kasus IA didistribusikan menjadi dua grup:grup ekspresi tinggi miR-133a-3p (n =47) dan grup ekspresi rendah miR-133a-3p (n =28). Hubungan antara miR-133a-3p dan parameter klinikopatologi yang berbeda dianalisis secara statistik dengan uji chi-kuadrat atau uji Fisher. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi miR-133a-3p tidak berhubungan dengan usia, jenis kelamin, bentuk dan posisi aneurisma (semua P> 0,05), tetapi berhubungan dengan jumlah dan ukuran aneurisma (keduanya P <0,05).
Ekspresi MiR-133a-3p Ditolak dan Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -Catenin Dibesarkan di Jaringan IA
Ekspresi miR-133a-3p di IA ditentukan oleh RT-qPCR, dan hasilnya mengungkapkan bahwa dalam kaitannya dengan jaringan arteriol intrakranial normal (kelompok kontrol), ekspresi miR-133a-3p berkurang di jaringan IA (kelompok kontrol). Grup IA) (P <0,05) (Gbr. 1a). RT-qPCR dan analisis western blot menunjukkan bahwa ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -catenin meningkat di jaringan IA dibandingkan dengan di jaringan arteriol intrakranial normal (semua P <0,05) (Gbr. 1a–c).
Ekspresi MiR-133a-3p menurun dan ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -catenin meningkat di jaringan IA. a Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan -catenin pada kelompok IA dan kelompok normal. b Pita protein ekspresi PSAT1, GSK3β, dan -catenin. c Ekspresi protein PSAT1, GSK3β, dan -catenin pada kelompok IA dan kelompok normal dengan uji western blot. n =75, *P <0,05 vs. kelompok kontrol. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara dua kelompok dilakukan dengan sampel independen t tes
Perubahan Patologis Aneurisma dan Ekspresi MMP-9 dan VEGF di Jaringan IA
Dengan mengamati langsung jaringan arteriol intrakranial normal dan jaringan IA, ditunjukkan bahwa pada kelompok kontrol, pembuluh darah di jaringan arteri berwarna merah cerah dan tidak ditemukan plak aterosklerotik dan trombus lateral yang jelas di lumen. Tumor jaringan aneurisma kelompok IA sebagian besar berwarna coklat atau merah tua, penampakan skrotiformis atau fusiformis, dan tekstur sebagian besar keras. Saat tumor dipotong, tampak plak aterosklerotik berwarna putih atau merah tua pada dinding tumor beberapa sampel tumor, yang berbentuk datar, bulat, atau lonjong. Pada beberapa sampel tumor, terdapat trombus mural pada rongga tumor, dan tekstur trombus lunak. Ketebalan dinding tumor secara bertahap menipis dari leher tumor, beberapa di antaranya hanya memiliki membran serat tipis di bagian atas tumor, dan beberapa di antaranya bahkan sudah pecah. Celah aneurisma yang pecah terletak di atau dekat bagian atas tumor.
Pewarnaan HE menunjukkan bahwa di bawah mikroskop cahaya, ketebalan dinding jaringan arteriol intrakranial normal adalah seragam; struktur anatomi lapisan dalam, tengah, dan luar jelas dan utuh; morfologi sel pada setiap lapisan normal; sarkolema dari sel-sel yang berdekatan sering kali terbentuk rapat; dan sel-sel inflamasi dinding jarang terjadi. Pada kelompok IA, tonjolan lokal yang terbentuk di rongga vaskular lateral distal di bagian atas bifurkasi arteri intrakranial di dinding aneurisma menjadi tumpul dan lebih kecil, dan EC lokal hilang. Sejumlah kecil sampel menunjukkan migrasi dari lapisan sel otot polos ke lapisan intima dan proliferasi sel intima miogenik. EC menurun atau bahkan menghilang. Lapisan sel endotel tersusun oleh sel myointimal hiperplastik dan EC yang tersusun linier, atau oleh EC apoptosis dan sel darah yang menempel pada lumen. Vakuolanya mengalami degenerasi dan mengalami gangguan kontinuitas. Beberapa dari mereka terkelupas bersama dengan membran basal, dan serat kolagen intima meningkat. Aterosklerosis berubah, dan dinding arteriol jelas lebih tipis dan dipenuhi dengan sejumlah besar jaringan penghubung tangga. Infiltrasi sel inflamasi dan difusi parsial diamati di semua lapisan, terutama di membran tengah dan luar. Deposit kristal lipid dan kolesterol diamati pada beberapa sel. Beberapa dinding tumor benar-benar atau secara lokal menipis dan meluas ke luar (Gbr. 2a, b).
Perubahan patologis aneurisma dan ekspresi MMP-9 dan VEGF di IA. a Bagian jaringan arteriol intrakranial normal pada kelompok kontrol di bawah pewarnaan HE (× 10). b Bagian jaringan IA diwarnai dengan HE (× 10). c Ultrastruktur jaringan arteriol intrakranial normal pada kelompok kontrol di bawah mikroskop elektron (× 10.000). d Ultrastructure of IA tissues under an electron microscope (× 10,000). e Expression of MMP-9 in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200). f Expression of VEGF in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200)
The sections of the normal intracranial arterioles tissues and IA tissues were observed by an electron microscope, and it performed that in normal intracranial arterioles tissues, the matrix fibers of the cerebral vascular wall could be seen clearly, and there was no endothelial injury, cell pyknosis, or degeneration. In the IA tissues, obvious endothelial cell injury, cell pyknosis, or vacuole degeneration were observed, the number of middle smooth muscle cells was declined, most of the nucleus pyknosis was appeared, and chromatin aggregation and apoptotic bodies could be seen. Some cells showed swelling of the mitochondria and disappearance of normal internal structure. The extracellular matrix that formed the cytoskeleton was blurred and showed amorphous floc. There were many fragments in the missing parts of the cells (Fig. 2c, d).
Immunohistochemical staining was utilized to test MMP-9 and VEGF expression, and the results revealed that there was no expression of MMP-9 and VEGF in 75 cases of the control group. It existed 60 cases of positive expression of MMP-9 in the 75 cases of IA samples. MMP-9 positive expression appeared in the inner and the outer membranes of IA wall, but the expression was not uniform. The positive expression was mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm. The positive expression of VEGF was 66 cases in 75 cases of IA samples. In the wall of IA, there was a high positive expression in the middle and the outer membranes and a low positive expression in the intima. The positive expression was also mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm (Fig. 2e, f). The expression of MMP-9 and VEGF in the two groups is shown in Table 4.
Identification of Vascular ECs
The expression of factor VIII and CD31 in ECs were analyzed by immunohistochemical staining. The results reported that vascular ECs reacted positively to factor VIII and CD31-related antigen antibodies, and the positive rate was 95%. In addition, there were a large number of brown particles in the cytoplasm, and the fifth passage of cells of brown staining was dramatically higher than the primary passage of cells (Fig. 3a, b).
Vascular ECs react positively to FVIII and CD31 related antigen antibodies. a Identification of ECs by CD31. b Identification of ECs by FVII
Upregulation of miR-133a-3p and Downregulation of PSAT1 Suppress Apoptosis and Advance Proliferation and Migration of ECs in IA
Flow cytometry, RT-qPCR, and western blot analysis were adopted for observing the apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was indicated that compared to the control group, the apoptosis rate of cells and Bax expression was elevated in the IA group and the Bcl-2 expression was decreased (all P <0,05). The cell apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group had no significant change (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and mimic NC group, the apoptosis rate of cells in the si-PSAT1 group and miR-133a-3p mimic group was suppressed, the Bax expression was declined, and the Bcl-2 expression was raised (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the apoptosis rate and Bax expression were enhanced, and the Bcl-2 expression was reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4a–e).
Highly expressed miR-133a-3p and lowly expressed PSAT1 inhibit apoptosis and promote proliferation and migration of IA ECs. a Detection of apoptosis of ECs by flow cytometry. b Detection of apoptosis rate of ECs in each group. c Bax and Bcl-2 expression in ECs detected by RT-qPCR. d Protein band of Bax and Bcl-2 expression. e Bax and Bcl-2 protein expression in ECs detected by western blot analysis. f MTT assay was used to detect proliferation activity of ECs in each group. g RT-qPCR was used to detect the expression of Ki-67 and CyclinD1 in each group of ECs. h Protein band of Ki-67 and CyclinD1 expression. saya Ki-67 and CyclinD1 protein expression in ECs detected by western blot analysis. j Detection of the migration of ECs in each group by scratch test. k Statistical results of endothelial cell migration in each group. T =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation; data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test
MTT assay, RT-qPCR, and western blot analysis were utilized to observe the proliferation and the expression of Ki-67 and CyclinD1 in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was displayed that in contrast to the control group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the IA group (all P <0,05). There was no significant difference in the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression of the IA group, mimic NC group, and si-NC group (all P> 0,05). In relation to the si-NC group and the mimic NC group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were heightened in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group (all P <0,05). In comparison to the miR-133a-3p mimic group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4f, i).
The migration of ECs in each group after treatment with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1 for 24 h was observed by scratch test. It was revealed that the migration of cells in the IA group was inhibited relative to that in the control group (P <0,05). There was no markedly change in cell migration of the IA group, the si-NC group, and the mimic NC group (all P> 0,05). Compared to the si-NC group and the mimic NC group, the cell migration in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group was elevated (both P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the cell migration was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 4j, k).
Restored miR-133a-3p and Depleted PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, and β-Catenin Expression in ECs of IA
RT-qPCR was used to detect miR-133a-3p expression in ECs of IA; it was yielded that compared to the control group, miR-133a-3p expression in the IA group was reduced (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was enhanced relative to that in the mimic NC group (P <0,05). In contrast with the si-NC group, there was no distinct change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression was showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 5a).
Upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs of IA. a miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs detected by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in ECs in each group detected by western blot analysis. T =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test
The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in ECs of IA was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was indicated that in relation to the control group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was raised (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change dramatically (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was degraded relative to that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). In relation to the miR-133a-3p mimics group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 5a–c).
Upregulating miR-133a-3p and Downregulating PSAT1 Alleviate the Pathological Changes of IA Tissues
By testing the hemodynamic changes of rats after modeling, we monitored the blood flow velocity of rats in each group 3 days before operation and 12 weeks after intervention treatment. It was performed that there was no obvious difference in blood flow velocity in each group 3 days before operation (P> 0,05). After 12 weeks of intervention, the blood flow velocity of rats in the IA group depressed relative to that in the normal group (P <0,05). There was no distinct difference in the degree of decrease of blood flow velocity in the IA group, mimic NC group, si-NC group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and the mimic NC group, the blood flow velocity was heightened in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group (both P <0,05). In contrast to the miR-133a-3p mimic group, the blood flow velocity was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 6a).
Upregulated miR-133a-3p and downregulated PSAT1 alleviate the pathological changes of IA tissues. a Hemodynamic changes at each time point after successful modeling in rats. b Changes of IA tissue after transfection. n =12, *P <0.05 vs. the normal group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test.
The changes of IA tissues were verified by HE staining. The results displayed that in the normal group, the elastic fibers in the middle layer of intracranial vascular tissue were neat, the normal elastic protein wave-like structure was appeared, and there was no broken and degradation. In relation to the normal group, the lumen of intracranial vascular tissue was enlarged, the normal elastic protein wave-like structure was disappeared, the elastic fiber in the middle layer of local elastic protein vessel was broken, and some of the elastic fibers were completely degraded in the IA group. There was no distinct change in the morphology of IA tissues in the si-NC group, mimic NC group, IA group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group. In contrast with the si-NC group and the mimic NC group, the wave structure of elastic protein in intracranial vascular tissue of rats in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group was existed, and the local elastic protein vascular structure was slightly disordered, but there was no fracture and dissolution (Fig. 6b).
Highly Expressed miR-133a-3p and Lowly Expressed PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, β-Catenin, VEGF, and MMP-9 Expression in IA Tissues in Vivo
The expression of miR-133a-3p in IA tissues in vivo was tested by RT-qPCR, it was suggested that in relation to the normal group, miR-133a-3p expression was declined in the IA group (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was elevated relative to that in the mimic NC group (P <0,05). By comparison with the si-NC group, there was no marked change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 7a).
Overexpression of miR-133a-3p and low expression of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin, VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo and PSAT1 is a target gene of miR-133a-3p. a Detection of miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in IA tissues of rats in each group by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c Detection of PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. d Protein bands of VEGF and MMP-9. e Detection of VEGF and MMP-9 protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. f Prediction of the target site of PSAT1 binding to the corresponding miR-133a-3p by Target Scan. g Result of dual luciferase reporter gene assay. a –e , n =12; f –g , T =3, *P <0.05 vs. the normal group/the Wt + NC group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test
The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in IA tissues in vivo was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was appeared that in contrast with the normal group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was increased (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was decreased compared with that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was enhanced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7a–c).
Western blot analysis was used to verify the VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo; the results perceived that by comparison with the normal group, VEGF and MMP-9 expression in the IA group were enhanced (both P <0,05). VEGF and MMP-9 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). In relation to the mimic NC group and si-NC group, VEGF and MMP-9 expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group were declined (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, VEGF and MMP-9 expression were elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7d, e).
PSAT1 Is a Target Gene of miR-133a-3p
The online prediction software (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) was utilized to forecast and analyze the target site of PSAT1 binding to the miR-133a-3p, and the sequence of 3′UTR region combined by PSAT1 and miR-133a-3p. In order to prove that the predicted binding site of miR-133a-3p resulted in a change in the luciferase activity, the mutation sequence and the wild sequence of PSAT1 3′UTR deleting miR-133a-3p binding site were devised. Luciferase activity was verified by co-transfection of miR-133a-3p mimic and WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) or MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) recombinant plasmids in vascular ECs. The results revealed that miR-133a-3p mimic had no distinct effect on luciferase activity in the Mut-miR-133a-3p/PSAT1 group (P> 0.05), while the luciferase activity in the Wt-miR-133a-3p/PSAT1 group was markedly declined (P <0.05) (Fig. 7f, g).
Discussion
IA is an abnormal dilatation of the intracranial artery, which weakens the arterial wall through continuously pushing outwards the vascular wall, which results in a higher risk of aneurysm rupture [17]. In a study conducted by Liu et al., it has shown that some miRNAs are involved in modulating the cell proliferation of vascular smooth muscle cells, which is closely associated with IA [18]. Also, a recent study has provided a proof that circulating miRNAs can be used as a new biomarker to assess the possibility of IA occurred in high-risk individuals [19]. It is customarily considered that PSAT1 may be involved in schizophrenia spectrum conditions and alters serine metabolism [20]. The current study was designed to explore the regulatory role of miR-133a-3p modulated vascular endothelial injury and triggered IA through modulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin signaling pathway.
In this present study, the relationship among miR-133a-3p expression and clinicopathological features of IA was analyzed, and the results demonstrated that the expression of miR-133a-3p was not related to age, gender, shape, and position of aneurysm but associated with the number and size of aneurysm. Some scholars considered that the shear stress of regional blood flow in the arterial wall induced the induction of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage inflammatory protein 1α (MIP-1α) expression by fibroblasts and vascular ECs within the vascular wall. The highly reactive chemotactic factors MCP-1 and MIP-1α made an aggregation of macrophagocyte in the vascular wall and mediated inflammatory response, then, induced the excitation of nuclear transcription factor c-Jun and then regulated the activation of activated protein 1 (AP-1), then activated MMP-9 promoter in its structural domain to raise MMP-9 mRNA expression, and finally induced the dissolution of extracellular matrix of vascular wall, causing the formation of intracranial aneurysm [21,22,23]. Saito et al. [24] found that MMP-9 positive cells were mainly from the middle and the outer membranes of the artery macrophages, which certified that MMP-9 expressed by macrophages mediated the degeneration of the arterial wall, leading to the formation of arterial aneurysm. The above studies have indicated that MMP-9 was linked to the formation of IA. The results of our study revealed that MMP-9 was upregulated in IA; thus, we speculated that mR-133a-3p might be involved in the occurrence and development of IA by regulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway and further regulating MMP-9. In our study, we found that restoring miR-133a-3p reduced the expression of PSAT1, GSK3β, β-catenin, and MMP-9 in intracranial aneurysm tissues. We will carry out relevant research in the future study to verify our findings.
Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-133a-3p expression was decreased and the PSAT1, GSK3β, and β-catenin was elevated in IA. Emerging evidence has suggested that miR-133a-3p plays a suppressive role in different kinds of tumors. Recent study has presented that miR-133a-3p expression was dramatically degraded in breast cancer tissues in contrast with that in non-cancer tissues [25]. Another study has purported that miR-133a-3p expression is declined in advanced prostate cancer (PCa) tissues relative to that in the adjacent normal tissues or benign prostate lesion tissues, especially in bone metastatic PCa tissues [26]. The promoting effect of PSAT1 in other types of diseases are found in some literatures. It is reported that PSAT1 expression was remarkably heightened in non-small cell lung cancer (NSCLC) and forecasted poor clinical outcome of NSCLC patients [27]. Furthermore, PSAT1 is considered as the highest upregulated gene in CRC tumors as well as highly expressed in chemoresistant disease patients [28]. It has been manifested that GSK3β activity was elevated in cancerous tissues [29]. Moreover, the phosphorylation level of GSK3β as well as the expression of nuclear β-catenin are also enhanced, suggesting that GSK3β/β-catenin pathway may be participated in osteopontin regulation [30].
Other results emerged from our data suggested that upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 suppressed apoptosis and advanced proliferation and migration of IA ECs, reduced VEGF, and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that the over-expression of miR-133a-3p retrains the invasion, growth, and mitosis of oral squamous cell carcinoma cells by targeting collagen type I alpha 1 (COL1A1) [31]. It is reported that highly expressed miR-133a-3p can repress the propagation of ESCC cells, advance cell apoptosis, and decline the migration and invasion of ESCC cells by targeting COL1A1 [32]. Another study has verified that transient upregulation of miR-133a-3p suppresses the migration, invasion, and growth abilities of gallbladder carcinoma cells through directly targeting recombination signal-binding protein Jκ [33]. In like manner, this study suggests that miR-133a-3p exerts its role in IA through targeting PSAT1. It is displayed that PSAT1 overexpression boosts ESCC cell growth and matrigel invasion in vitro, and injection of mice with ESCC cells with high expression of PSAT1 induces tumor formation in vivo [14]. Other study also has reported that PSAT1 is highly expressed and forecasts a poor clinical outcome of patients, as well as enhances cell tumorigenesis and proliferation in vivo and in vitro [13]. Prior research generally confirms that PSAT1 advances cell cycle progression, proliferation, and tumorigenesis through loss- and gain-of-function experiments [27]. It has been indicated that MMPs are composed of a series of enzymes which cleaves protein substrates on the basis of a conserved mechanism referring activation of an active site-bound water molecule through a Zn
2+
ion [34]. MMP-9 is a distinct protease which push forward an immense influence on many biological processes [35]. A study has contended that MMP-9 is elevated in the aneurysm groups compared to the control group [36]. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) is recognized as the key modulator of endovascular differentiation of trophoblast [37]. A study has revealed that silenced PSAT1 expression suppresses VEGF, β-catenin, and GSK3β phosphorylation expression [10].
Conclusion
To briefly conclude, our study confirms our hypothesis that overexpression of miR-133a-3p or downregulation of PSAT1 restrain endothelial cell damage and advance endothelial cell proliferation via inhibiting the GSK3β/β-catenin pathway in IA. These findings provide a new insight in a novel target therapy for IA. These findings underscore the role of miR-133a-3p in IA in relation the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway. However, a conclusion about the effects of miR-133a-3p and PSAT1 cannot be made clearly due to limited known researches on this. It needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.
