Nanopartikel Emas Fungsional Asam Litokolik Induksi Apoptosis Selektif pada Sel Kanker Hati

Latar Belakang

Nanopartikel emas memiliki resonansi optik unik, stabilitas kimia, dan luas permukaan yang ekstensif yang membuatnya menarik untuk aplikasi biomedis, termasuk pengiriman obat, citraan, dan terapi fototermal ^[1–5]. Geometri bola mereka memfasilitasi penyerapan sel yang efisien dan meminimalkan efek off-target ^[6–8]. Fungsionalisasi AuNPs dengan ligan target atau polimer lebih meningkatkan indeks terapeutik, terutama untuk onkologi ^[9–14].

Asam litokolik (LCA), asam bile sekunder, telah dilaporkan memiliki aktivitas antitumor yang kuat terhadap kanker hati melalui apoptosis ^[29–30]. Sebagai molekul yang terjadi secara alami, LCA dapat berfungsi sebagai ligan untuk mengarahkan AuNPs ke jaringan hati, meningkatkan keacuan, dan potensial memodulasi jalur sinyal intrakelular ^[20–28].

Kombinasi kompatibilitas biologis AuNPs dengan properti menindas tumor LCA dapat menghasilkan agen antikanker selektif yang mengeksploitasi jalur mitokondria yang diinduksi ROS untuk memicu apoptosis dalam sel karsinoma hepatoseluler.

Metode

Bahan

Semua reagen dibeli dari Sigma-Aldrich kecuali dinyatakan lain. Reagen kultur sel (RPMI-1640, FBS) diperoleh dari Invitrogen. Sel karsinoma hepatoseluler manusia (HepG2, SMMC-7721), hepatosit normal (QSG-7701), dan sel kanker payudara (MCF-7) diperoleh dari Institut Ilmu Biologi Shanghai.

Sintesis AuNP@MPA

AuNPs yang dicap citrat (diameter rata-rata 4,0 ± 0,5 nm) disintesis oleh metode Turkevich ^[38] menggunakan HAuCl₄ dan NaBH₄. Nanopartikel yang dihasilkan kemudian dicap dengan asam 3-merkaptopropionat (MPA) pada pH 11 untuk menyediakan grup karboxilat untuk konjugasi lebih lanjut.

Konjugasi dengan PEG

AuNP@MPA (0,0875 mmol) diaktifkan dengan NHS (0,0875 mmol) dan EDC (0,035 mmol) dalam larutan MES 50 mM, diikuti dengan penambahan NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂ (0,045 mmol). Setelah 24 jam pada 25 °C, nanopartikel yang di-PEGylate (AuNP@MPA-PEG) diisolasi melalui sentrifugasi.

Penambatan Asam Litokolik

AuNP@MPA-PEG dicampur dengan LCA (0,045 mmol) dalam DMF anhidrit dan diaduk selama 24 jam pada 25 °C. Produk akhir, AuNP@MPA-PEG-LCA, difurnir melalui sentrifugasi berulang.

Mikroskopi Transmisi Elektron (TEM)

Morfologi dan ukuran partikel diperiksa pada TEM JEOL JEM-200CX yang beroperasi pada 200 kV. Suspensi nanopartikel dicetak pada grid tembaga 300 mesh.

Uji Sitorositas

Viabilitas sel setelah paparan 48 jam terhadap AuNPs (0,2–1,0 mg mL⁻¹) diukur menggunakan uji MTT. Absorban pada 570 nm direkam pada pembaca plate Tecan Infinite M200.

Morfologi Apoptosis (Hoechst 33342)

Sel HepG2 dirawat dengan 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA selama 24 dan 48 jam, kemudian diwarnai dengan 10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342 selama 30 menit. Morfologi inti difoto dengan mikroskop konfokal Leica-SP8.

Apoptosis Dini (Annexin V-FITC)

Setelah 6 jam rawat dengan 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA, sel HepG2 diwarnai dengan annexin V-FITC dan dianalisis dengan sitometri aliran (FACSCalibur, BD). Citra konfokal juga diambil.

Potensi Membran Mitokondria (MMP)

Dye JC-1 (10 µg mL⁻¹) digunakan untuk menilai perubahan MMP pada sel HepG2 yang dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (6 jam). Kedua sitometri aliran dan mikroskopi konfokal digunakan.

Spesies Reaktif Oksigen (ROS)

ROS intrakelular diukur menggunakan H₂DCF-DA (10 µM) setelah 6 jam paparan terhadap 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA. Fluoresensi diukur dengan sitometri aliran dan mikroskopi konfokal.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Nanopartikel

AuNP@MPA-PEG-LCA mempertahankan bentuk bola dengan diameter rata-rata 16,0 ± 1,2 nm, dikonfirmasi oleh TEM (Gambar 1c). Lapisan PEG dan LCA berkontribusi pada ukuran hidrodinamik yang meningkat dibandingkan AuNP@MPA inti (4,0 nm). Dimensi ini ideal untuk efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR) pada jaringan tumor.

Representasi skematik sintesis AuNP@MPA-PEG-LCA

Gambar TEM dari a AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG, dan c AuNP@MPA-PEG-LCA

Sitorositas Selektif

Uji MTT (Gambar 2) menunjukkan sitorositas yang tidak signifikan dari AuNP@MPA di seluruh semua garis sel. Sebaliknya, AuNP@MPA-PEG-LCA secara bergantung pada dosis mengurangi viabilitas sel HepG2 dan SMMC-7721, dengan nilai IC₅₀ di bawah 0,6 mg mL⁻¹, sementara QSG-7701 dan MCF-7 terpengaruh minimal. Profil selektif ini menekankan kemampuan targeting yang diberikan oleh LCA.

Viabilitas sel AuNP@MPA dan AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNPs) yang diinkubasi dengan sel HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, dan MCF-7 selama 48 jam

Morfologi Apoptosis

Pewarnaan Hoechst (Gambar 3) mengungkapkan kondensasi, fragmentasi, dan marginasi kromatin inti yang progresif pada sel HepG2 yang dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA selama 48 jam, yang menunjukkan apoptosis akhir. Sel kontrol dan sel yang dirawat AuNP@MPA mempertahankan morfologi inti yang seragam.

Karakteristik morfologi inti sel HepG2 yang diwarnai dengan Hoechst 33342. Sel HepG2 diinkubasi dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg mL⁻¹) untuk a 0 jam, b 24 jam, dan c 48 jam, dan d AuNP@MPA (0,5 mg mL⁻¹) diinkubasi selama 48 jam. Sel apoptosis menampilkan inti yang kondensasi dan terfragmentasi, dan pengecilan volume sel; skala bar 20 µm

Konfirmasi Annexin V-FITC

Pewarnaan Annexin V (Gambar 4) menunjukkan translokasi yang jelas dari fosfatidilserin ke lapisan luar membran plasma pada sel yang dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA. Sitometri aliran mengukur 38,45 % kadar apoptosis versus 8,16 % dalam kontrol, mengonfirmasi induksi apoptosis dini.

Hasil apoptosis dari a citra konfokal dan b data sitometri aliran sel HepG2 yang dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg mL⁻¹). Sel diwarnai dengan annexin V-FITC (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 500–560 nm); skala bar 20 µm

Depolarisasi Mitokondria

Analisis JC-1 (Gambar 5) mengungkapkan kehilangan fluoresensi agregat merah dan peningkatan sinyal monomer hijau, yang menunjukkan keruntuhan MMP pada sel yang dirawat. Sitometri aliran mengonfirmasi penurunan yang signifikan dalam rasio merah/hijo, yang mengakui disfungsi mitokondria sebagai acara downstream apoptosis.

a Citra fluoresensi sel yang dilabeli JC-1 yang dilihat oleh mikroskopi konfokal dan b efek AuNP@MPA-PEG-LCA terhadap MMP dianalisis oleh sitometri aliran

Generasi ROS

Pewarnaan H₂DCF-DA (Gambar 6) menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam fluoresensi hijau pada sel HepG2 yang dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA, yang mencerminkan produksi ROS yang meningkat. Kuantifikasi sitometri aliran mengonfirmasi tren, yang menunjukkan bahwa stres oksidatif mendahului depolarisasi mitokondria dan apoptosis.

Analisis produksi ROS setelah sel HepG2 dirawat dengan AuNP@MPA-PEG-LCA selama 6 jam. Kandungan ROS pada sel HepG2 diselidiki oleh a mikroskopi konfokal (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 530 nm) dan b sitometri aliran (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 525 nm)

Kesimpulan

Kami berhasil memproduksi nanopartikel AuNP@MPA-PEG-LCA (~16 nm) yang secara selektif menghambat pertumbuhan sel karsinoma hepatoseluler dengan memicu apoptosis. Uji komprehensif—morfologi inti, binding annexin V, kehilangan potensi membran mitokondria JC-1, dan peningkatan ROS—mengonfirmasi bahwa tindakan terapeutik ditangani melalui disfungsi mitokondria yang diinduksi ROS. Hasil ini memposisikan AuNP@MPA-PEG-LCA sebagai nanoterapeutik yang menjanjikan dan spesifik target untuk pengobatan kanker hati.

Singkatan

AuNPs:

Nanopartikel emas

DMF:

Dimetilformamida

EDC:

1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimida hidroklorida

FBS:

Serum sapi janin

H₂DCF-DA:

2′,7′-Diklorofluoresesin diasetat

HepG2:

Sel karsinoma hati hepatoseluler manusia

JC-1:

5,5′,6,6′-Tetrakloro-1,1′,3,3′-tetraetilbenzimidazolilkarbosianin iodida

LCA:

Asam litokolik

MCF-7:

Sel kanker payudara manusia

MES:

4-Morfolinietanosulfat asam

MMP:

Potensi membran mitokondria

MPA:

Asam 3-merkaptopropionat

MTT:

3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolium bromida

NHS:

1-Hidroksipirrolidin-2,5-diona

PEG:

Polietilen glikol

PS:

Fosfatidilserin

QSG-7701:

Sel hepatosit normal manusia

ROS:

Spesies reaktif oksigen

SMMC-7721:

Sel karsinoma hati hepatoseluler manusia

TEM:

Mikroskopi transmisi elektron