Efek Apoptosis Sel Kanker Hati Nanopartikel Emas Dimodifikasi dengan Asam Lithocholic
Abstrak
Nanopartikel emas yang berfungsi (AuNPs) telah banyak diterapkan di berbagai bidang, karena biokompatibilitasnya yang baik, waktu paruh obat yang panjang, dan bioaktivitasnya terkait dengan ukurannya dan ligan yang dimodifikasi pada permukaannya. Di sini, kami mensintesis AuNP yang ditutup dengan ligan yang memiliki polietilen glikol (PEG) dan asam lithocholic (LCA) yang dihubungkan oleh gugus karboksil (AuNP@MPA-PEG-LCA). Hasil sitotoksisitas kami menunjukkan bahwa AuNP@MPA-PEG-LCA memiliki selektivitas sel yang lebih baik; dengan kata lain, dapat menghambat pertumbuhan beberapa sel kanker hati lebih efektif daripada sel kanker dan sel normal lainnya. Apoptosis berperan dalam proliferasi sel penghambatan AuNP@MPA-PEG-LCA, yang dibuktikan secara meyakinkan oleh beberapa eksperimen indeks apoptosis, seperti pewarnaan nuklir, annexin V-FITC, analisis potensi membran mitokondria (MMP), dan eksperimen pewarnaan AO/EB . AuNP@MPA-PEG-LCA yang paling kuat dikonfirmasi untuk menginduksi apoptosis secara efisien melalui spesies oksigen reaktif (ROS) yang memediasi disfungsi mitokondria. Dan AuNP@MPA-PEG-LCA bisa lebih efektif dalam mempromosikan kematian sel terprogram dari sel kanker hati.
Latar Belakang
Nanopartikel emas (AuNPs) sebagai bahan nano telah banyak diaplikasikan di berbagai bidang karena sifat optiknya yang unik, stabilitas kimia yang baik, dan biokompatibilitasnya [1,2,3,4,5]. Jadi, ia memiliki prospek aplikasi yang luas dalam nano-elektronik, nano-fotonik, katalisis, sensor, biomarker, dan banyak bidang lainnya [6,7,8]. Karena AuNPs memiliki luas permukaan yang besar dan bentuk bulat, mereka dapat digunakan sebagai pembawa obat antineoplastik [9,10,11,12]. Selain itu, banyak kompleks AuNP telah digunakan terutama untuk jenis obat antitumor baru untuk mengobati kanker [13, 14]. Sebagai pembawa obat antineoplastik, kompleks AuNP dapat mengontrol fungsi sel, mengatur ekspresi gen, dan mendeteksi analit dalam sel [15, 16]. Oleh karena itu, peningkatan fungsi AuNPs menjadi salah satu tren penting dalam penelitian pengobatan kanker [17,18,19].
Lithocholic acid (LCA) banyak terdapat pada asam empedu sekunder vertebrata yang lebih tinggi dalam empedu. Keanekaragaman spesies asam empedu telah dilaporkan dalam aplikasi berbagai jenis asam empedu dan turunannya dalam pengobatan dan beberapa bidang lainnya [20,21,22], seperti dapat digunakan dalam pengobatan defisiensi asam empedu, batu empedu, dan penyakit hati [23,24,25]. Dan beberapa asam empedu dan turunannya dapat sebagai pembawa obat menargetkan pengobatan penyakit hati, promotor penyerapan, dan agen penurun kolesterol. [26,27,28]. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa LCA memiliki efek antitumor yang sangat kuat pada sel kanker hati, dan mekanisme kematian sel adalah apoptosis [29, 30]. Apoptosis adalah proses kematian aktif sel biologis, dan merupakan mekanisme penting bahwa tubuh organisme multiseluler mengatur perkembangan tubuh, mengontrol penuaan sel, dan mempertahankan lingkungan internal yang stabil [31, 32]. Terutama, penghambatan proliferasi, diferensiasi, pengurangan derajat keganasan, dan promosi apoptosis sel tumor adalah tujuan pengobatan tumor [33,34,35,36,37].
Dalam penelitian ini, kami mensintesis AuNP dengan sifat penargetan biologis melalui penggabungan NP emas dengan turunan LCA. Kami mempelajari sitotoksisitasnya menggunakan metode MTT dengan sel HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, dan MCF-7 selama 48 jam. Hasil sitotoksisitas kami mengungkapkan bahwa AuNP@MPA-PEG-LCA dapat menghambat pertumbuhan beberapa sel kanker hati lebih efektif daripada sel kanker dan sel normal lainnya. Apoptosis berperan dalam penghambatan proliferasi sel, yang dikonfirmasi melalui pewarnaan Hoechst 33342, pewarnaan annexin V-FITC, analisis potensi membran mitokondria (MMP), dan eksperimen pewarnaan AO/EB. Dan tingkat ROS meningkat dalam sel kanker hati, menunjukkan bahwa AuNP@MPA-PEG-LCA dapat menginduksi apoptosis melalui disfungsi mitokondria yang dimediasi generasi ROS.
Metode
Materi
Kecuali ditentukan, bahan kimia dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Media RPMI-1640 dan serum janin sapi (FBS) berasal dari Invitrogen Corporation. HepG2 (sel karsinoma hati hepatoseluler manusia), SMMC-7721 (sel karsinoma hati hepatoseluler manusia), QSG-7701 (sel hepatosit normal manusia), dan MCF-7 (sel kanker payudara manusia) dibeli dari Shanghai Institute for Biological Science ( Shanghai, Cina).
Sintesis AuNP@MPA
Nanopartikel emas terbungkus sitrat (AuNP@MPA) dengan ukuran rata-rata 4,0 nm disiapkan menurut metode yang dipelopori oleh J. Turkevich et al. [38]. Secara singkat, 773 μl larutan natrium sitrat 38,8 mM dan 2 mL 15 mM HAuCl4 larutan dilarutkan ke dalam 30 mL Milli-Q H2 O, dan larutan diaduk pada suhu 25 °C. Kemudian, 3 mL 0,1 M NaBH4 (baru disiapkan) ditambahkan. Setelah bereaksi selama 2 jam 25 °C, larutan berubah dari tidak berwarna menjadi oranye terang. Kemudian, 3 mL 0,01 M asam 3-merkaptopropionat (MPA) dalam etanol anhidrat ditambahkan pada pH 11, dan terus bereaksi selama 2 jam pada suhu 25 °C. Campuran reaksi disentrifugasi untuk mendapatkan senyawa AuNP@MPA.
Sintesis AuNP@MPA-PEG
10,5 mg (0,0875 mmol) 1-Hydroxypyrrolidine-2,5-dione (NHS) dan 7 mg (0,035 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) ditambahkan ke dalam larutan 50 mM AuNP@MPA dalam 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES), dan larutan diaduk selama 30 menit pada 25 °C. Kemudian, 0,045 mmol NH2 -PEG1000-NH2 ditambahkan dan campuran diaduk selama 24 jam pada 25 °C. Setelah reaksi selesai, campuran disentrifugasi untuk mendapatkan senyawa AuNP@MPA-PEG.
Sintesis AuNP@MPA-PEG-LCA
Senyawa AuNP@MPA-PEG dalam air ultra murni ditambahkan ke dalam 200 μL larutan anhidrat dimetilformamida (DMF) termasuk 17 mg (0,045 mmol) LCA, dan larutan reaksi diaduk selama 24 jam pada 25 °C. Setelah reaksi selesai, campuran reaksi disentrifugasi untuk mendapatkan senyawa AuNP@MPA-PEG-LCA.
Transmission Electron Microscopy (TEM)
Morfologi dan ukuran AuNP terdeteksi pada JEOL JEM-200CX TEM, yang beroperasi hingga 200 kV. Solusi AuNP dijatuhkan pada kisi tembaga (300 jaring).
Uji Kemampuan Antitumor AuNP
Kami menggunakan empat jenis sel (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, dan MCF-7) untuk menyelidiki kemampuan antitumor AuNPs dengan 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 yang dimodifikasi -difeniltetrazolium bromida (MTT). 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, dan 1,0 mg/mL AuNPs dan nanopartikel emas asli (AuNP@MPA) digunakan dalam pengujian. OD570 dari setiap sumur diukur pada pembaca pelat multimode Tecan Infinite M200.
Penentuan Morfologi dengan Pewarnaan Hoechst
Setelah 24 dan 48 jam dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), sel HepG2 diwarnai dengan 10 g/mL Hoechst 33342 selama 30 menit dalam inkubator sel. Morfologi inti sel dideteksi dengan mikroskop confocal Leica-SP8.
Apoptosis Profase Sel:Pewarnaan Annexin V-FITC
Setelah 6 jam dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), sel HepG2 diwarnai dengan annexin V-FITC selama 10 menit dalam inkubator sel, kemudian diamati dengan mikroskop confocal Leica-SP8.
Untuk deteksi aliran cytometer AuNPs, setelah 6 jam pengobatan dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL), sel HepG2 diwarnai dengan annexin V-FITC selama 10 menit dalam inkubator sel dan dideteksi dengan FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ).
Analisis Potensi Membran Mitokondria (MMP)
Sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL) selama 6 jam pada 37 °C diinkubasi dengan 10 μg/mL JC-1 (5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1 ,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyanine iodide; probe molekuler) selama 10 menit pada 37°C. Sel-sel tersebut kemudian dideteksi dengan flow cytometer FACSCalibur.
Untuk pengamatan mikroskop fluoresensi, sel-sel HepG2 diperlakukan dengan AuNP@MPA-PEG-LCA selama 10 menit dengan 10 μg/mL JC-1 dan diamati dengan menggunakan mikroskop confocal Leica-SP8.
Pengukuran Spesies Oksigen Reaktif (ROS)
Akumulasi ROS intraseluler diuji menggunakan 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (H2 DCF-DA). Perlakuan sel HepG2 dengan sampel AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/mL) selama 6 jam diinkubasi dengan 10 μM H2 DCF-DA selama 30 menit pada 37°C. Dan intensitas fluoresensi sel dilihat dengan menggunakan FACSCalibur flow cytometer dan mikroskop confocal.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi AuNP
Pertama, AuNP@MPA yang larut dalam air disiapkan (Skema 1). Gambar 1a menggambarkan hasil TEM dari AuNP@MPA. Hal ini menunjukkan bahwa bentuk dan ukuran AuNP@MPA terlihat sangat mirip dengan bentuk sferis dengan ukuran kompak 4,0 ± 0,5 nm. AuNP@MPA-PEG-LCA kemudian disiapkan (Skema 1). Dan morfologi partikel juga dianalisis dengan TEM (Gbr. 1c). Gambar TEM menggambarkan bahwa morfologi AuNP@MPA-PEG-LCA mirip dengan AuNP@MPA. Dan diameter AuNP@MPA-PEG-LCA adalah ~ 16 nm melalui analisis statistik.
Representasi skematis sintesis AuNP@MPA-PEG-LCA
Gambar TEM dari a AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG, dan c AuNP@MPA-PEG-LCA
Hasil Sitotoksisitas
Untuk menyelidiki sitotoksisitas AuNPs, sel HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, dan MCF-7 dipilih dan diobati dengan AuNPs dan AuNP@MPA selama 48 jam. Dan uji MTT digunakan untuk mendeteksi toksisitas sel sampel. Viabilitas sel AuNPs dan AuNP@MPA pada sel yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 2. Hasilnya menunjukkan bahwa sitotoksisitas AuNP@MPA sangat rendah di semua sel. Namun, AuNP@MPA-PEG-LCA dapat menghambat pertumbuhan beberapa sel kanker hati secara lebih efektif dengan meningkatkan konsentrasi nanopartikel tetapi memiliki lebih sedikit kerusakan pada sel normal dan sel kanker lainnya. Yaitu, aktivitas antiproliferatif sel AuNP@MPA-PEG-LCA terhadap sel HepG2 dan SMMC-7721 sangat tinggi dibandingkan sel QSG-7701 dan MCF-7.
Viabilitas sel AuNP@MPA dan AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNPs) yang diinkubasi dengan sel HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, dan MCF-7 selama 48 jam
Induksi Apoptosis
Inti apoptosis adalah indeks umum dari apoptosis. Setelah perlakuan dengan AuNP@MPA-PEG-LCA selama waktu yang ditentukan, sel diinkubasi dengan Hoechst 33342. Kemudian karakter morfologi inti sel dilihat menggunakan mikroskop confocal. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, sel kontrol dan sel yang diinkubasi dengan AuNP@MPA menunjukkan pewarnaan inti sel yang utuh dan homogen; namun, jumlah sel apoptosis dalam sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA meningkat secara bertahap dengan meningkatnya waktu inkubasi dan inti sel menampilkan karakteristik apoptosis yang khas, seperti inti yang terfragmentasi, kromatin yang terkondensasi, dan pengurangan volume seluler.
Karakteristik morfologi inti sel sel HepG2 diwarnai dengan Hoechst 33342. Sel HepG2 diinkubasi dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) selama a 0 j, b 24 jam, dan c 48 jam, dan h AuNP@MPA (0,5 mg/ml) diinkubasi selama 48 jam. Sel-sel apoptosis menunjukkan inti yang padat dan terfragmentasi, dan penyusutan volume sel; bilah skala 20 μm
Seperti yang kita ketahui bersama, pewarnaan annexin V dapat membedakan tahap awal apoptosis dari sel nekrotik. Pada tahap awal apoptosis, annexin V dapat berikatan dengan membran fosfolipid fosfatidilserin (PS), yang dieksternalisasi dari permukaan dalam ke permukaan luar membran plasma [39]. Oleh karena itu, kami menyelidiki potensi menginduksi apoptosis AuNP@MPA-PEG-LCA melalui uji pewarnaan annexin V-FITC. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, tidak ada fluoresensi hijau yang jelas di membran sel dalam kontrol, tetapi ada fluoresensi hijau yang jelas di membran sel sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA. Fenomena ini merupakan indikator kuat dari apoptosis tahap awal. Seperti yang kita semua tahu, gambar mikroskop confocal hanya membuktikan terjadinya apoptosis; namun, flow cytometry dapat dengan cepat dan sensitif mengukur terjadinya apoptosis dan secara tepat menentukan tingkat apoptosis. Oleh karena itu, kami menyelidiki lebih lanjut tahapan apoptosis dengan menggunakan flow cytometry. Gambar 4b menunjukkan hasil laju apoptosis berdasarkan flow cytometry. Persentase apoptosis sekitar 38,45% dari sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA, tetapi persentase apoptosis hanya sekitar 8,16% pada sel kontrol. Persentase apoptosis yang signifikan menunjukkan bahwa sel yang diinkubasi dengan AuNP@MPA-PEG-LCA mempertahankan apoptosis.
Hasil apoptosis a gambar confocal dan b aliran data sitometri sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml). Sel diwarnai dengan annexin V-FITC (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 500–560 nm); bilah skala 20 μm
Penurunan MMP
Mitokondria berperan penting dalam apoptosis karena dapat melepaskan faktor proapoptosis, seperti sitokrom C dan faktor pemicu apoptosis [40,41,42]. Jadi, kami mengeksplorasi perubahan MMP dengan menggunakan mikroskop confocal dan flow cytometry. Gambar 5a menunjukkan gambar fluoresensi sel HepG2 berlabel JC-1 yang diperlakukan dengan AuNP@MPA-PEG-LCA dengan mikroskop confocal. Kita dapat mengamati bahwa ada fluoresensi JC-1 merah yang jelas dan mitokondria yang sehat dalam sel-sel HepG2 kontrol, yang menunjukkan adanya agregasi JC-1. Namun, ada lebih banyak fluoresensi hijau dalam sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA, yang menunjukkan bahwa terjadi keruntuhan membran. Gangguan mitokondria pada sel apoptosis menunjukkan bahwa JC-1 tidak terakumulasi di dalam mitokondria tetapi didistribusikan ke seluruh sel. Dan sebagai bentuk monomer, JC-1 yang tersebar yang ada berpendar hijau. Untuk lebih mengukur perubahan MMP, kami mengevaluasi sel HepG2 yang diwarnai dengan JC-1 dengan flow cytometry. Sinyal rasio merah/hijau representatif JC-1 yang direkam dalam sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA dan sel kontrol dengan flow cytometry ditunjukkan pada Gambar 5b. Kami dapat mengamati bahwa rasio merah/hijau menunjukkan penurunan yang signifikan dalam sel yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA dari analisis kuantitatif sel bernoda JC-1 sementara itu memiliki peningkatan yang signifikan dalam sel kontrol, yang menunjukkan bahwa AuNP@ MPA-PEG-LCA dapat menginduksi apoptosis pada sel HepG2.
a Gambar fluoresensi sel berlabel JC-1 dilihat dengan mikroskop confocal dan b efek AuNP@MPA-PEG-LCA pada MMP dianalisis dengan flow cytometry
Pengaruh AuNP@MPA-PEG-LCA pada ROS
Seperti yang kita semua tahu, apoptosis dapat dipicu dengan peningkatan kadar ROS intraseluler, yang juga merupakan bukti kuat yang terlibat dalam induksi apoptosis [43]. Untuk mengeksplorasi lebih lanjut apakah disfungsi mitokondria terkait dengan generasi ROS, kami menentukan tingkat ROS dalam sel HepG2 yang diwarnai dengan H2 DCF-DA dengan menggunakan mikroskop confocal dan flow cytometric. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, intensitas fluoresensi hijau H2 DCF-DA menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA dibandingkan dengan sel kontrol. Artinya, kandungan ROS dalam sel HepG2 yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA meningkat secara signifikan. Kemudian, analisis kuantitatif kandungan ROS dalam sel diselidiki dengan flow cytometry. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, intensitas fluoresensi yang lebih tinggi terdeteksi dalam sel yang diinkubasi dengan AuNP@MPA-PEG-LCA dibandingkan dengan sel kontrol, yang menunjukkan bahwa kandungan ROS lebih tinggi pada sel yang diobati dengan AuNP@MPA-PEG-LCA . Data menunjukkan bahwa disfungsi mitokondria mungkin terkait dengan generasi ROS. Hasil ini sebelumnya menunjukkan bahwa generasi ROS memiliki peran penting dalam AuNP@MPA-PEG-LCA yang menginduksi apoptosis.
Analisis produksi ROS setelah sel HepG2 diperlakukan dengan AuNP@MPA-PEG-LCA selama 6 jam. Kandungan ROS dalam sel HepG2 diselidiki oleh a mikroskop confocal (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 530 nm) dan b flow cytometry (eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 525 nm)
Kesimpulan
Singkatnya, kami mensintesis AuNP@MPA-PEG-LCA dengan diameter rata-rata 16,0 nm yang dapat menghambat pertumbuhan beberapa sel kanker hati. AuNP@MPA-PEG-LCA secara efektif menghambat proliferasi sel karena apoptosis, yang dibuktikan dengan pewarnaan nuklir, pewarnaan JC-1, analisis MMP, dan eksperimen pewarnaan annexin V-FITC. Dalam studi flow cytometry, penangkapan AuNP@MPA-PEG-LCA dalam sel kanker hati semakin membuktikan perilaku apoptosis mereka. Oleh karena itu, AuNPs dapat secara efisien menginduksi apoptosis melalui disfungsi mitokondria yang dimediasi ROS dan mereka lebih efektif dalam mempromosikan kematian sel terprogram dalam sel kanker hati dalam studi mekanistik pendahuluan.
