Pemulihan miR‑133a‑3p atau Pengurangan PSAT1 Membatasi Aneurisma Intrakranial yang Dipicu Kerusakan Endotel dengan Menghambat Jalur GSK3β/β‑Katenin
Abstrak
Tidak jelas peran fungsional mikroRNA-133a-3p (miR-133a-3p) dalam aneurisma intrakranial (IA). Oleh karena itu, tujuan penelitian saat ini adalah untuk menyelidiki peran regulasi miR-133a-3p pada regulasi IA yang diinduksi cedera endotel vaskular melalui jalur sinyal fosfoserin aminotransferase 1 (PSAT1)/glikogen sintase kinase 3β (GSK3β)/β-katenin. Jaringan arteriolus intrakranial normal dan jaringan IA dikumpulkan dari pasien dengan trauma otak dan IA. Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam jaringan ditentukan dengan RT-qPCR dan analis western blot. Sel endotel (ECs) dari IA manusia dikultur dan dirawat dengan miR-133a-3p mimic dan si-PSAT1 untuk menentukan fungsi mereka dalam migrasi, apoptosis, dan proliferasi sel endotel. Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-katenin, Ki-67, CyclinD1, Bax, dan Bcl-2 dalam ECs diuji dengan RT-qPCR atau analis western blot. Selain itu, model tikus IA dibuat untuk mendeteksi perubahan patologis dan ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-katenin, VEGF, dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo. Ekspresi miR-133a-3p berhubungan dengan jumlah dan ukuran IA. Ekspresi miR-133a-3p menurun dan ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin meningkat dalam IA. Pemulihan miR-133a-3p dan depleksi PSAT1 mengurangi perubahan patologis; mengurangi ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam IA; menekan apoptosis dan meningkatkan proliferasi serta migrasi ECs IA, serta mengurangi ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo. Penelitian kami menyarankan bahwa ekspresi berlebih miR-133a-3p atau pengregulasi bawah PSAT1 menahan cedera sel endotel dan meningkatkan proliferasi sel endotel melalui penghambatan jalur GSK3β/β-katenin dalam IA. miR-133a-3p mungkin menjadi penanda potensial dan target terapeutik untuk IA.
Presentasi Hipotesis
Dalam penelitian saat ini, kami dapat berspekulasi bahwa sumbu miR-133a-3p/PSAT1 mungkin memengaruhi IA yang diinduksi cedera sel endotel melalui modulasi jalur GSK3β/β-katenin.
Pengujian Hipotesis
Untuk memverifikasi hipotesis ini, kami mengumpulkan sampel klinis, sel endotel (ECs) IA manusia, dan membuat model tikus IA untuk menguraikan fungsi miR-133a-3p dan PSAT1 dalam proses IA.
Implikasi Hipotesis
Penelitian kami mengonfirmasi hipotesis kami bahwa ekspresi berlebih miR-133a-3p atau pengregulasi bawah PSAT1 menahan cedera sel endotel dan meningkatkan proliferasi sel endotel melalui penghambatan jalur GSK3β/β-katenin dalam IA. Temuan ini memberikan wawasan baru dalam terapi target baru untuk IA.
Pendahuluan
Aneurisma intrakranial (IA) adalah jenis gangguan serebrovaskular yang ditandai dengan adanya arteri yang membengkuk tidak biasa di otak serta perdarahan subaraknoid (SAH) yang disebabkan oleh pecahnya aneurisma, disertai dengan fatalitas dan morbidity tinggi [1]. Sebagai penyakit merusak, patogenesis IA belum terurai [2]. IA adalah bentuk famili yang langka, tetapi umumnya diyakini sebagai hasil cedera vaskular yang didapat akibat hipertensi, merokok, dan faktor risiko tradisional lainnya [3]. Pengonteran intravaskular atau kliping mikrobedah telah digunakan untuk mencegah pecahnya aneurisma yang belum pecah pada pasien dengan risiko pecah tinggi [4]. Meskipun telah dicapai kemajuan signifikan dalam operasi bedah IA, pemulihan pasca-operasi yang buruk masih muncul pada pasien IA [5]. Situasi sulit pengobatan IA membuat perlu untuk mengeksplorasi mekanisme lebih lanjut dan menemukan strategi terapeutik baru.
MicroRNAs (MiRNAs) adalah kelas RNA non-koding yang mengatur ekspresi gen target melalui penghambatan translasi pada tingkat pasca-transkripsi atau media degradasi mRNA [6]. Telah terungkap bahwa miR-133a-3p sebagai penangkal tumor dalam beberapa neoplasma maligan dan ekspresi berlebih miR-133a-3p dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolorektal (CRC) [7]. Sebuah studi sebelumnya telah berpendapat bahwa dengan memblokir glutosinolisis yang diinduksi otophagi, miR-133a-3p lebih menekan metastase dan pertumbuhan kanker lambung [8]. Juga, sebuah studi telah menyajikan bahwa miR-133a-3p terlibat dalam regulasi pembentukan jantung dan hipertrofi kardiak [9]. Sebuah studi telah mendemonstrasikan bahwa pengaturan atas miR-195-5p menurunkan angiogenesi dan resistensi sisplatin pada kanker ovarium melalui menekanan jalur sinyal GSK3β/β-katenin yang bergantung pada fosfoserin aminotransferase 1 (PSAT1) [10]. Sebuah studi lainnya telah melaporkan bahwa miR-365 menekan invasi dan pertumbuhan sel pada kanker sel siku eofagus (ESCC) melalui modulasi PSAT1 [11]. PSAT1 adalah enzim yang terlibat dalam biosintesis serin; awalnya dipurnikan dari otak domba dan memiliki level tinggi dalam banyak jaringan [12]. Terdokumentasi bahwa PSAT1 ditemukan memediasi progresi siklus sel pada kanker payudara melalui modulasi jalur sinyal GSK3β/β-katenin [13]. Liu et al. juga menunjukkan bahwa PSAT1 berfungsi pada perkembangan ESCC dan meramalkan kelangsungan hidup buruk; oleh karena itu, itu mungkin menjadi target terapeutik antikanker yang menjanjikan [14]. Menganalisis di atas, penelitian ini diharapkan dapat berkontribusi pada pendekatan baru untuk peran fungsional sumbu miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-katenin dalam IA.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Penelitian ini disetujui oleh Dewan Etika Rumah Sakit Perguruan Tinggi Universitas Tradisional China Tianjin. Semua peserta menandai dokumen persetujuan yang diinformasikan. Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium oleh Komite Internasional.
Subjek Studi
Dari Januari 2016 hingga Maret 2018, kasus SAH yang disebabkan oleh IA yang dirawat di neurobedah Rumah Sakit Perguruan Tinggi Universitas Tradisional China Tianjin dipilih. Sampel patologis 75 kasus IA yang diperoleh melalui mikrobedah dikumpulkan dan diklasifikasikan sebagai kelompok IA, termasuk 29 pria dan 46 wanita berusia 31–55 tahun, dengan usia rata-rata 44,98 ± 6,79 tahun. Pasien dengan trauma otak yang dirawat di neurobedah pada waktu yang sama di Rumah Sakit Perguruan Tinggi Universitas Tradisional China Tianjin dipilih sebagai kelompok kontrol. Juga, 75 kasus jaringan arteriolus intrakranial normal dikumpulkan melalui operasi trauma atau dekompresi internal, termasuk 43 pria dan 32 wanita berusia 34–56 tahun, dengan usia rata-rata 48,14 ± 8,68 tahun. Pasien dikecualikan jika mereka memiliki riwayat hipertensi, diabetes, atau tumor. Tidak ada perbedaan yang mencolok dalam gender dan usia antara kelompok IA dan kelompok kontrol (kedua P > 0,05).
Perawatan dan Pelestarian Sampel
Setelah resesi bedah, sebagian sampel dalam dua kelompok diobati dengan formaldehida, didesidrasi dengan alkohol bertingkat dari konsentrasi rendah ke tinggi, dan diembed dengan parafin. Kemudian, sampel diiris untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia. Beberapa sampel dengan cepat ditempatkan dalam tangki nitrogen cair dan kemudian dipindahkan ke pendingin kriogenik − 80 °C untuk deteksi analis western blot dan reaksi rantai polimerase transkripsi balik kuantitatif (RT-qPCR). Beberapa sampel diobati dengan glutaraldehida untuk pengamatan mikroskop elektron, dan beberapa sampel digunakan untuk isolasi ECs.
Pengamatan Mikroskop Elektron
Sampel diobati dengan glutaraldehida 3%, kemudian diobati ulang dengan tetroksida osmium 1%. Sampel didesidrasi dengan aseton, diembed dengan Epon812, dan diiris menjadi saran setengah tipis dengan ketebalan 3 μm. Terakhir, sampel dicat ganda dengan asetat uranil dan sitrat timbal dan diamati oleh mikroskop transmisi elektron H-600IV (Hitachi, Tokyo, Jepang).
Pewarnaan HE
Saran parafin yang disiapkan dipanggang pada 60 °C selama 30 menit. Setelah langkah-langkah di atas selesai, irisan jaringan diobati dalam xilena, didesidrasi dengan alkohol murni bertingkat, dan dibersihkan dengan salin fosfat (PBS). Irisan jaringan dicat dengan hematoxylin, diobati dalam amonia selama beberapa detik, dicat dengan eosin selama 2 menit, didesidrasi, dan dijernihkan. Kemudian, irisan jaringan ditetapkan dengan gumpal netra dan dicoret dengan kaca tutup. Akhirnya, mikroskop (Nikon, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengamati dan mencatat.
Pewarnaan Imunohistokimia
Kit imunohistokimia diproduksi oleh Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Irisan parafin dilemaskan dan dihidrasi, dan irisan parafin direndam dalam larutan xilena selama 5 menit × 3 kali. Irisan ditempatkan dalam alkohol murni 100% selama 3 menit × 2 kali dan kemudian direndam dalam alkohol 95–75% secara bergantian. Setelah dilemaskan, irisan diobati dengan peroksida hidrogen 3% selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Irisan ditetapkan dengan larutan pemblokir dan diobati dengan larutan kerja serum kambing normal selama 15 menit, kemudian diusapkan dengan antibodi primer terhadap matriks metaloproteinase (MMP)-9 (5 μg/mL) dan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) (1:250, Abcam, Cambridge, MA, USA) (PBS untuk kontrol negatif (NC)) dan diobati selama 1–2 jam. Irisan diusapkan ulang dengan larutan kerja antibodi sekunder biotinilasi selama 30–60 menit. Irisan ditambahkan dengan cairan kerja streptavidin/peroksidase yang dilabeli dengan peroksidase hidrogen, ditetapkan dengan larutan diaminobenzidin (DAB) yang baru disiapkan, dicat tambahan, dan diblokir. Citra diperoleh oleh sistem citra Nikon SPOT FlexTM. Luas ekspresi protein MMP-9 dan VEGF diukur oleh perangkat lunak analisis kuantitatif imunohistokimia. Lima bidang visual daya tinggi secara acak terdeteksi dalam area akumulasi sel positif dalam setiap sampel, dan rata-rata absorpsi setiap layar digunakan sebagai nilai rata-rata untuk analisis statistik.
Isolasi dan Budaya ECs
ECs diisolasi dari jaringan arteriolus intrakranial normal dan jaringan IA dan dibudidayakan. Jaringan diiris menjadi fragmen 3 mm2 dan diobati selama 25 menit dalam kolagenase B 0,1%/dispase 0,1% (Roche, Basel, Swiss). Jaringan dilepaskan, dihaluskan selama 2 menit dengan pipet 2 mL, difilter dengan saringan 100-μm (BD Biosciences, NJ, USA) untuk mengisolasi ECs. Suspensi sel diosentrifug dan kemudian dire-suspend dalam medium budaya MV2 yang mengandung faktor pertumbuhan dan serum fetal sapi 20% (PromoCell, Heidelberg, Jerman). Selanjutnya, sel dirombak pada pinggan yang dilapisi fibronectin (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) dengan densitas 104 sel/cm2 (1 μg/cm2) dan dibudidayakan selama 1 hari dengan 5% CO2. Hari setelah rombakan, sel dicuci dengan PBS untuk menghilangkan sel yang tidak melekat dan ditempatkan dalam medium segar. Saat mencapai konsfluensi sekitar 80–100%, budaya diekspose pada imunopemisahan dengan managed Ulex europaeus Agglutinin I (UEA)-coated (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) managed (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) untuk memperoleh ECs murni. ECs yang melekat pada managed yang dilapisi lectin dikumpulkan dengan konsentrat partikel magnetik sementara sel yang tidak melekat dihilangkan melalui pencucian dengan medium dasar dua kali. Sel positif UEA dire-suspend dalam medium budaya dan dirombak pada pinggan yang dilapisi fibronectin untuk memperbaiki adhesi dan pertumbuhan mereka. Budaya menjadi konfluen dalam 4–6 hari.
Identifikasi ECs
ECs diidentifikasi dengan pewarnaan imunositokimia dengan antibodi sel permukaan CD31 dan antgen terkait FVII. Sel dibersihkan dua kali dengan PBS, diobati dengan paraformaldehida 4%, diobati dengan H2O2 3% selama 10–15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen dan kemudian diobati dengan Triton X-100 0,1% selama 10 menit untuk membuat lubang sel. Sel ditetapkan dengan antibodi primer spesifik: Faktor VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basel, Swiss) dan diobati pada 4 °C selama malam hari. Kemudian, sel ditetapkan dengan imunoglobulin G (1:50) yang dilabeli dengan antibodi sekunder peroksidase hidrogen. Sel diobati pada 37 °C selama 45 menit dan dikembangkan dengan DAB menghindari cahaya selama 4 menit. Kemudian, pengembangan warna dihentikan dengan air destilasi dan foto diamati di bawah mikroskop. Sel diamati di bawah mikroskop terbalik fasa-perbedaan, dan sel positif dan jumlah total sel dihitung secara acak dari 10 bidang visual. Tingkat pewarnaan sel positif = (jumlah sel positif/jumlah total sel) × 100%. Kelompok NC yang sesuai dibuat dan antibodi primer diganti dengan PBS, dan langkah-langkah lainnya dilakukan seperti di atas.
Pengelompokan dan Transfeksi Sel
Untuk mempelajari efek antara miR-133a-3p dan PSAT1 pada ECs IA, ECs dikelompokkan menjadi kelompok kontrol (ECs vaskular normal tanpa transfeksi), kelompok IA (ECs vaskular IA tanpa transfeksi), kelompok mimic NC (transfeksi dengan miR-133a-3p mimic NC), kelompok miR-133a-3p mimic (transfeksi dengan miR-133a-3p mimic), kelompok si-NC (transfeksi dengan si-PSAT1 NC), kelompok si-PSAT1 (transfeksi dengan si-PSAT1), dan kelompok miR-133a-3p mimic + overexpression (oe)-PSAT1 (transfeksi dengan miR-133a-3p mimic dan oe-PSAT1). Di antaranya, mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-PSAT1, si-NC, dan oe-PSAT1 dirancang dan disusun oleh GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Transfeksi dilakukan secara ketat sesuai dengan instruksi reagen transfeksi LipofectamineTM 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA).
Sitofluorometri
Medium dalam pinggan budaya dibuang, dan sel dicuci dua kali dengan PBS. Sel dilepas dengan tripsin 0,25%, diosentrifug pada 800 rpm selama 5 menit, dan dire-suspend dengan larutan ikatan 1 ×, dan densitas sel disesuaikan menjadi 1 × 107 sel/mL. Suspensi sel (100 μL) diobati dengan propidium iodida (PI, 20 μg/mL) 5 μL dan annexin V-FITC selama 20 menit, kemudian dicampur dengan larutan ikatan 1 × 400 μL. Sitofluorometer (BD FACSArial I cell sorter) digunakan untuk mendeteksi apoptosis sel dalam 1 jam. Hasilnya adalah kuadran kiri bawah (Q4) pada peta sebar menunjukkan sel hidup sehat (FITC−/PI−), kuadran kanan bawah (Q3) sebagai sel apoptosis awal (FITC+/PI−), dan kuadran kanan atas (Q2) adalah sel apoptosis akhir dan apoptosis (FITC+/PI+); tingkat apoptosis = persentase apoptosis awal (Q3) + persentase apoptosis akhir (Q2).
Sel dilepas dengan tripsi untuk menyiapkan suspensi sel. Sel dihitung di bawah mikroskop terbalik. Konsentrasi sel disesuaikan menjadi 5 × 104 sel/mL. Sel dirombak pada pinggan budaya 96-lubang. Setelah 48 jam, sel diobati dengan larutan MTT 20 μL selama 4 jam. MTT di setiap larutan larut dengan dimetil sulfoksida 150 μL. Nilai kekerapan optik (OD) ECs diukur pada panjang gelombang 570 nm. Tingkat proliferasi ECs dihitung berdasarkan nilai OD.
Uji Scratch
Sel dalam setiap kelompok dirombak pada pinggan 24-lubang dengan 2 × 105 sel/lubang. Tiga larutan paralel ditetapkan dalam setiap kelompok. Saat mencapai konsfluensi sekitar 90%, bidang pertumbuhan sel diiris dengan ujung mikropipet satu kali pakai steril 1 mL; setiap larutan diiris sekali dan panjang serta kedalaman iris di setiap larutan konsisten. Setelah diiris, sel yang melayang dihilangkan, medium budaya diganti dengan yang segar, dan jarak iris diamati di bawah mikroskop setelah budaya selama 24 jam. Area penyembuhan luka iris dihitung oleh perangkat lunak National Instrument Vision Assistant 8.6. Migrasi sel = area penyembuhan luka iris/area luka iris awal × 100%.
Hewan Eksperimen dan Pembuatan Model Aneurisma Tikus
Delapan puluh empat tikus Sprague-Dawley (SD) berusia 7 minggu dan berat badan dari 180 hingga 200 g (Pusat Hewan Laboratorium, Akademi Ilmu Militer, Beijing, China) dipilih. Tikus diwakili di pusat eksperimen hewan. Kondisi pemeliharaan dikontrol pada 22–25 °C dan kelembaban 50–60% dengan cahaya alami. Semua tikus diwakili dalam kandang tikus standar dengan 4 tikus per kandang. Tikus diberi minuman air sanitasi perkotaan dan pakan tikus umum. Bantal diganti setiap 3 hari, dan kandang dicuci dan dikeringkan. Tikus IA dimodelkan sesuai dengan referensi [15]. Aneurisma pecah diidentifikasi ketika gejala berikut terjadi pada tikus [16]: 1, aktivitas makan atau minum menurun yang ditunjukkan oleh penurunan berat badan (sekitar 10% penurunan berat badan) selama 24 jam; 2, fleksi torso dan lengan atas saat diangkat; 3, berjalan di satu sisi dalam postur normal; 4, condong ke satu sisi saat beristirahat, tidak ada aktivitas spontan. Tikus dengan gejala ini diutanasikan 3 bulan setelah operasi. Jaringan IA diperoleh selama operasi dan diperfusi dengan PBS, dan pewarna biru yang mengandung asam glutamat diperfusi ke dalam arteri serebrum.
Perawatan dan Intervensi Tikus IA
84 tikus di atas secara acak dipisahkan menjadi 7 kelompok dengan 12 tikus dalam setiap kelompok. Metode perawatan sebagai berikut: kelompok normal (tidak dilakukan pemodelan); kelompok IA (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL PBS dan Lipofectamine 2000); kelompok mimic NC (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL miR-133a-3p mimic NC dan Lipofectamine 2000); kelompok miR-133a-3p mimic (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL miR-133a-3p mimic dan Lipofectamine 2000); kelompok si-NC (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL si-PSAT1 NC dan Lipofectamine 2000); kelompok si-PSAT1 (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL si-PSAT1 dan Lipofectamine 2000); dan kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (diinjeksikan stereotaktik dengan campuran 100 μL miR-133a-3p mimic dan oe-PSAT1 dan Lipofectamine 2000). Semua injeksi di atas dilakukan sekali sehari, dan tikus ini dibudidayakan di laboratorium hewan bebas patogen spesifik (SPF) selama 12 minggu. Setelah 12 minggu, tikus dalam setiap kelompok dianesteshi dan rongga dada dibuka seperti yang dijelaskan di atas. Dari ventrikel kiri melalui aorta, darah dilepaskan dengan memotong cava. Pada saat yang sama, 30 mL larutan garis yang mengandung heparin sodium (37 °C) diperfusi melalui saluran, dan kemudian, formaldehida 10%/0,1 M salin fosfat (pH 7,4) disuntik perlahan ke dalam otak melalui saluran. Setelah perfusi diobati, otak dibuka. Lingkaran arteri di dasar tengkorak dipisahkan dan dikeluarkan di bawah mikroskop bedah, perubahan aneurisma diamati di bawah mikroskop, dan karakteristik patologis dikaji. mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-NC, si-PSAT1, dan oe-PSAT1 disusun oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).
Deteksi Hemodinamika
Laju aliran darah di ujung arteri karotis umum kiri tikus diuji sebelum 3 hari operasi dan 12 minggu setelah perawatan intervensi. Metode adalah sebagai berikut: tikus ditempatkan dalam kerangka hewan mesin anestesi untuk hirup, dan parameter aliran disesuaikan. Setelah tikus bernapas stabil dan tidak ada reaksi yang jelas ketika ekor tikus disentuh, tikus diikat pada meja operasi eksperimen dengan karet. Rambut di leher tikus dicukur dengan mesin cukur listrik. Detektor ultrason Doppler dinyalakan, dan kecepatan aliran darah di ujung arteri karotis umum kiri diukur dan data dicatat setelah sonda diolesi dengan agen penghubung yang sesuai. Setelah pengukuran, tikus dengan hati-hati dikembalikan ke kandang untuk menjaga saluran pernapasan tetap terbuka hingga tikus bangun dari anestesi.
RT-qPCR
Total RNA diekstraksi berdasarkan kit ekstraksi total RNA simple RNA (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China). RNA berkualitas tinggi dikonfirmasi oleh analisis ultraviolet dan elektroforesis denaturasi formaldehida, dan RNA ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer oleh kit PrimeScript RT reagent. Reaksi PCR dilakukan oleh SYBR Permix Ex TaqII (Takara, Dalian, Liaoning, China). Primer PCR dirancang dan disusun oleh Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China) (Tabel 1). U6 dipilih sebagai parameter internal untuk miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-katenin, Bax, Bcl-2, Ki-67, dan CyclinD1 dengan gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai parameter internal. Data diukur oleh 2−ΔΔCt.
Analis Western Blot
Total protein diekstraksi dari sel dan jaringan, dan sampel protein dikuantifikasi oleh kit Analis Protein Asam Bikoniokinat (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China). Sampel dicampur dengan 1/4 volume larutan sampel 5 × dan direbus selama 5 menit. Gel pemisahan 10% dan gel konsentrasi 5% dipilih untuk elektroforesis. Membran diobati dengan bubuk susu drip 5% selama 60 menit. Membran ditambahkan antibodi primer PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-katenin (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 μg/mL), VEGF (1:1000) (semua dari Abcam, Cambridge, MA, USA). Kemudian, membran diobati dengan antibodi sekunder (1:2000) selama 60 menit. Membran direndam dalam larutan reaksi kemiluminesensi elektrokimia (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) selama 1 menit, kemudian dilapisi dengan selang plastik setelah cairan dikeluarkan. Membran diekspose dengan X-ray, dan hasil diamati setelah dikembangkan dan diperbaiki. GAPDH (1:10000, Abcam) digunakan sebagai kontrol pemuatan, dan citra protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Uji Gen Laporan Dual Luciferase
Hubungan target antara miR-133a-3p dan PSAT1 dan ikatan antara miR-133a-3p dan wilayah 3′ tak diterjemahkan (3′UTR) PSAT1 diramalkan oleh situs web bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Urutan wilayah promotor 3′UTR PSAT1 yang mengandung ikatan miR-133a-3p diamplifikasi dan dikloningkan ke dalam plasmid luciferin pGL3-basic (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Jepang) untuk membuat plasmid tipe liar (WT) (PSAT1-WT) 3′UTR PSAT1, sementara plasmid rekombinan mutant (MUT) PSAT1-MUT disusun dengan memutar ikatan miR-133a-3p pada PSAT1-WT dengan kit titik mutasi (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Jepang). Sel endotel vaskular dalam fase pertumbuhan logaritmik dirombak pada pinggan 96-lubang. Saat konsfluensi mencapai sekitar 70%, plasmid PSAT1-WT dan PSAT1-MUT dicampur dengan plasmid mimic NC dan miR-133a-3p mimic oleh Lipofectamine 2000 dan ditransfeksi bersama ke dalam sel endotel vaskular. Sel dikumpulkan dan dilisis 48 jam setelah transfeksi, dan aktivitas luciferin diverifikasi oleh kit deteksi luciferin (Promega Corporation, Madison, WI, USA).
Analisis Statistik
Semua data dijelaskan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Data hitung ditunjukkan oleh tingkat atau persentase, dan analisis ditentukan oleh uji chi-square atau uji Fisher. Data pengukuran yang tunduk pada distribusi normal disampaikan oleh rata-rata ± deviasi standar. Perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh uji t, sementara perbandingan antara beberapa kelompok dianalisis oleh analisis variansi satu arah (ANOVA) diikuti oleh uji lanjutan Tukey. Nilai P < 0,05 dianggap signifikan.
Hasil
Data Umum Pasien dengan IA
Seperti yang ditunjukkan dalam Tabel 2, data umum kelompok IA dan kelompok kontrol dibandingkan. Informasi spesifik dicantumkan dalam Tabel 2.
Ekspresi miR-133a-3p Berhubungan dengan Jumlah dan Ukuran IA
Dengan menganalisis hubungan antara ekspresi miR-133a-3p dan fitur klinis-patologis IA, terperinci dalam Tabel 3 bahwa berdasarkan ekspresi relatif rata-rata miR-133a-3p dalam IA, 75 kasus IA didistribusikan ke dalam dua kelompok: kelompok ekspresi tinggi miR-133a-3p (n = 47) dan kelompok ekspresi rendah miR-133a-3p (n = 28). Hubungan antara miR-133a-3p dan parameter klinis-patologis yang berbeda dianalisis secara statistik oleh uji chi-square atau uji Fisher. Hasil menunjukkan bahwa ekspresi miR-133a-3p tidak berhubungan dengan usia, gender, bentuk dan posisi aneurisma (semua P > 0,05), tetapi terkait dengan jumlah dan ukuran aneurisma (keduanya P < 0,05).
Ekspresi miR-133a-3p Menurun dan Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-Katenin Meningkat dalam Jaringan IA
Ekspresi miR-133a-3p dalam IA ditentukan oleh RT-qPCR, dan hasilnya mengungkapkan bahwa relatif terhadap jaringan arteriolus intrakranial normal (kelompok kontrol), ekspresi miR-133a-3p berkurang dalam jaringan IA (kelompok IA) (P < 0,05) (Gambar 1a). RT-qPCR dan analis western blot menunjukkan bahwa ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin meningkat dalam jaringan IA relatif terhadap jaringan arteriolus intrakranial normal (semua P < 0,05) (Gambar 1a–c).
Ekspresi miR-133a-3p menurun dan ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin meningkat dalam jaringan IA. a Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA dan kelompok normal. b Pita protein ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin. c Ekspresi protein PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA dan kelompok normal oleh analis western blot. n = 75, *P < 0,05 vs. kelompok kontrol. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh uji t sampel independen
Perubahan Patologis Aneurisma dan Ekspresi MMP-9 dan VEGF dalam Jaringan IA
Dengan mengamati secara langsung jaringan arteriolus intrakranial normal dan jaringan IA, ditunjukkan bahwa dalam kelompok kontrol, pembuluh dalam jaringan arteri berwarna merah cerah dan tidak ada plak aterosklerotik yang jelas dan trombus lateral yang ditemukan dalam lumen. Tumor jaringan aneurisma kelompok IA sebagian besar berwarna cokelat atau merah tua, dan penampilannya seperti scrotiform atau fusiformis, dan teksturnya sebagian besar keras. Ketika tumor dibuka, terlihat plak aterosklerotik putih atau merah tua pada dinding tumor beberapa sampel tumor, yang berbentuk datar, bundar, atau oval. Dalam beberapa sampel tumor, ada trombus dinding dalam rongga tumor, dan tekstur trombusnya lembut. Ketebalan dinding tumor bertipis secara bertahap dari leher tumor, sebagian hanya memiliki membran serat tipis di puncak tumor, dan sebagian bahkan telah pecah. Retakan aneurisma pecah terletak di atau di dekat puncak tumor.
Pewarnaan HE menunjukkan bahwa di bawah mikroskop cahaya, ketebalan dinding jaringan arteriolus intrakranial normal seragam; struktur anatomi lapis dalam, tengah, dan luar jelas dan utuh; morfologi sel di setiap lapis normal; sarcolemma sel yang berdekatan sering membentuk erat; dan sel inflamasi dalam dinding jarang. Dalam kelompok IA, protrusi lokal terbentuk dalam ronguh vaskular lateral distal di puncak bifurkasi arteri intrakranial dalam dinding aneurisma menjadi tumpul dan lebih kecil, dan ECs lokal hilang. Sejumlah kecil sampel menunjukkan migrasi dari lapis sel otot halus ke lapis intima dan proliferasi sel intima otot. ECs berkurang atau bahkan hilang. Lapis endotel terdiri dari sel miointima yang proliferatif dan ECs yang tersusun secara linier, atau oleh ECs yang apoptotik dan sel darah yang melekat pada lumen. Vakuolanya mengalami degenersi dan menunjukkan gangguan kontinuitas. Beberapa melepas bersama dengan membran basement, dan serat kolagen intima meningkat. Aterosklerosis berubah, dan dinding arteriolus jauh lebih tipis dan diisi dengan sejumlah besar jaringan tangga konektif. Infiltrasi sel inflamasi dan difusi parsial diamati di semua lapis, terutama di membran tengah dan luar. Deposit lipid dan kristal kolesterol diamati di beberapa sel. Beberapa dinding tumor tipis sepenuhnya atau sebagian dan membesar ke luar (Gambar 2a, b).
Perubahan patologis aneurisma dan ekspresi MMP-9 dan VEGF dalam IA. a Irisan jaringan arteriolus intrakranial normal dalam kelompok kontrol di bawah pewarnaan HE (× 10). b Irisan jaringan IA yang dicat dengan HE (× 10). c Ultrastruktur jaringan arteriolus intrakranial normal dalam kelompok kontrol di bawah mikroskop elektron (× 10.000). d Ultrastruktur jaringan IA di bawah mikroskop elektron (× 10.000). e Ekspresi MMP-9 dalam kelompok kontrol dan kelompok IA oleh pewarnaan imunohistokimia (× 200). f Ekspresi VEGF dalam kelompok kontrol dan kelompok IA oleh pewarnaan imunohistokimia (× 200)
Irisan jaringan arteriolus intrakranial normal dan jaringan IA diamati oleh mikroskop elektron, dan dilakukan bahwa dalam jaringan arteriolus intrakranial normal, serat matriks dinding vaskular serebrum dapat terlihat jelas, dan tidak ada cedera endotel, pikenosis sel, atau degenersi. Dalam jaringan IA, cedera sel endotel yang jelas, pikenosis sel, atau degenersi vakuol diamati, jumlah sel otot halus tengah menurun, sebagian besar pikenosis inti muncul, dan agregasi kromatin serta badan apoptosis dapat terlihat. Beberapa sel menunjukkan pembengkakan mitokondria dan hilangnya struktur internal normal. Matriks ekstraseluler yang membentuk sirkosel kabur dan menunjukkan floc amorf. Ada banyak fragmen di bagian hilang sel (Gambar 2c, d).
Pewarnaan imunohistokimia digunakan untuk menguji ekspresi MMP-9 dan VEGF, dan hasilnya mengungkapkan bahwa tidak ada ekspresi MMP-9 dan VEGF dalam 75 kasus kelompok kontrol. Ada 60 kasus ekspresi positif MMP-9 dalam 75 kasus sampel IA. Ekspresi positif MMP-9 muncul di membran dalam dan luar dinding IA, tetapi ekspresinya tidak seragam. Ekspresi positif terutama ditandai oleh sitoplasma berwarna cokelat keemasan. Ekspresi positif VEGF adalah 66 kasus dalam 75 kasus sampel IA. Dalam dinding IA, ada ekspresi positif yang tinggi di membran tengah dan luar dan ekspresi positif yang rendah di intima. Ekspresi positif juga terutama ditandai oleh sitoplasma berwarna cokelat keemasan (Gambar 2e, f). Ekspresi MMP-9 dan VEGF dalam kedua kelompok ditampilkan dalam Tabel 4.
Identifikasi Sel Endotel Vaskular
Ekspresi faktor VIII dan CD31 dalam ECs dianalisis oleh pewarnaan imunohistokimia. Hasilnya melaporkan bahwa vaskular ECs bereaksi positif terhadap antibodi antgen terkait faktor VIII dan CD31, dan tingkat positifnya 95%. Selain itu, ada sejumlah besar partikel cokelat dalam sitoplasma, dan pewarnaan cokelat pada sel kulturan pasang kelima secara dramatis lebih tinggi daripada sel kulturan primer (Gambar 3a, b).
Vaskular ECs bereaksi positif terhadap antibodi antgen terkait FVIII dan CD31. a Identifikasi ECs oleh CD31. b Identifikasi ECs oleh FVII
Pengaturan miR-133a-3p dan Penurunan PSAT1 Menahan Apoptosis dan Meningkatkan Proliferasi serta Migrasi ECs dalam IA
Sitofluorometri, RT-qPCR, dan analis western blot digunakan untuk mengamati apoptosis dan ekspresi Bax dan Bcl-2 dalam ECs IA setelah diobati dengan miR-133a-3p mimic atau si-PSAT1. Ditunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat apoptosis sel dan ekspresi Bax meningkat dalam kelompok IA dan ekspresi Bcl-2 menurun (semua P < 0,05). Apoptosis sel dan ekspresi Bax dan Bcl-2 dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara signifikan (semua P > 0,05). Dengan membandingkan kelompok si-NC dan kelompok mimic NC, tingkat apoptosis sel dalam kelompok si-PSAT1 dan kelompok miR-133a-3p mimic ditekan, ekspresi Bax menurun, dan ekspresi Bcl-2 meningkat (semua P < 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, tingkat apoptosis dan ekspresi Bax ditingkatkan, dan ekspresi Bcl-2 berkurang dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P < 0,05) (Gambar 4a–e).
Ekspresi tinggi miR-133a-3p dan ekspresi rendah PSAT1 menekan apoptosis dan mempromosikan proliferasi serta migrasi ECs IA. a Deteksi apoptosis ECs oleh sitofluorometri. b Deteksi tingkat apoptosis ECs dalam setiap kelompok. c Ekspresi Bax dan Bcl-2 dalam ECs terdeteksi oleh RT-qPCR. d Pita protein ekspresi Bax dan Bcl-2. e Ekspresi protein Bax dan Bcl-2 dalam ECs terdeteksi oleh analis western blot. f Uji MTT digunakan untuk mendeteksi aktivitas proliferasi ECs dalam setiap kelompok. g RT-qPCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 dalam setiap kelompok ECs. h Pita protein ekspresi Ki-67 dan CyclinD1. i Ekspresi protein Ki-67 dan CyclinD1 dalam ECs terdeteksi oleh analis western blot. j Deteksi migrasi ECs dalam setiap kelompok oleh uji scratch. k Hasil statistik migrasi sel endotel dalam setiap kelompok. N = 3, *P < 0,05 vs. kelompok kontrol. #P < 0,05 vs. kelompok mimic NC. &P < 0,05 vs. kelompok si-NC. +P < 0,05 vs. kelompok miR-133a-3p mimic. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar; data dievaluasi oleh analisis variansi satu arah diikuti oleh uji lanjutan Tukey
Uji MTT, RT-qPCR, dan analis western blot digunakan untuk mengamati proliferasi dan ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 dalam ECs IA setelah diobati dengan miR-133a-3p mimic atau si-PSAT1. Ditunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol, aktivitas proliferasi dan ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 berkurang dalam kelompok IA (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam aktivitas proliferasi dan ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 dari kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC (semua P > 0,05). Relatif terhadap kelompok si-NC dan kelompok mimic NC, aktivitas proliferasi dan ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 ditingkatkan dalam kelompok si-PSAT1 dan kelompok miR-133a-3p mimic (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok miR-133a-3p mimic, aktivitas proliferasi dan ekspresi Ki-67 dan CyclinD1 berkurang dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P < 0,05) (Gambar 4f, i).
Migrasi ECs dalam setiap kelompok setelah diobati dengan miR-133a-3p mimic atau si-PSAT1 selama 24 jam diamati oleh uji scratch. Ditunjukkan bahwa migrasi sel dalam kelompok IA terhambat relatif terhadap kelompok kontrol (P < 0,05). Tidak ada perubahan yang mencolok dalam migrasi sel dari kelompok IA, kelompok si-NC, dan kelompok mimic NC (semua P > 0,05). Dibandingkan dengan kelompok si-NC dan kelompok mimic NC, migrasi sel dalam kelompok si-PSAT1 dan kelompok miR-133a-3p mimic ditingkatkan (keduanya P < 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, migrasi sel menurun dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Gambar 4j, k).
Pemulihan miR-133a-3p dan Pengurangan PSAT1 Mengurangi Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-Katenin dalam ECs IA
RT-qPCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi miR-133a-3p dalam ECs IA; dihasilkan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol, ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok IA berkurang (P < 0,05). Ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara mencolok (P > 0,05). Ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok miR-133a-3p mimic ditingkatkan relatif terhadap kelompok mimic NC (P < 0,05). Berkontras dengan kelompok si-NC, tidak ada perubahan yang jelas dalam ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok si-PSAT1 (P > 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, ekspresi miR-133a-3p menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (P > 0,05) (Gambar 5a).
Pengaturan miR-133a-3p dan pengregulasi bawah PSAT1 mengurangi ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam ECs IA. a Ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam ECs terdeteksi oleh RT-qPCR. b Pita protein PSAT1, GSK3β, dan β-katenin. c Ekspresi protein PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam ECs dalam setiap kelompok terdeteksi oleh analis western blot. N = 3, *P < 0,05 vs. kelompok kontrol. #P < 0,05 vs. kelompok mimic NC. &P < 0,05 vs. kelompok si-NC. +P < 0,05 vs. kelompok miR-133a-3p mimic. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan data dievaluasi oleh analisis variansi satu arah diikuti oleh uji lanjutan Tukey
Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam ECs IA diuji oleh analis western blot dan RT-qPCR. Ditunjukkan bahwa relatif terhadap kelompok kontrol, ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA meningkat (semua P < 0,05). Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara dramatis (semua P > 0,05). Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok miR-133a-3p mimic dan kelompok si-PSAT1 menurun relatif terhadap kelompok mimic NC dan kelompok si-NC (semua P < 0,05). Relatif terhadap kelompok miR-133a-3p mimics, ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin meningkat dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P < 0,05) (Gambar 5a–c).
Pengaturan miR-133a-3p dan Pengregulasi Bawah PSAT1 Mengurangi Perubahan Patologis Jaringan IA
Dengan menguji perubahan hemodinamika tikus setelah pemodelan, kami memantau kecepatan aliran darah tikus dalam setiap kelompok 3 hari sebelum operasi dan 12 minggu setelah perawatan intervensi. Dilakukan bahwa tidak ada perbedaan yang jelas dalam kecepatan aliran darah dalam setiap kelompok 3 hari sebelum operasi (P > 0,05). Setelah 12 minggu intervensi, kecepatan aliran darah tikus dalam kelompok IA menurun relatif terhadap kelompok normal (P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang jelas dalam tingkat penurunan kecepatan aliran darah dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, kelompok si-NC, dan kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P > 0,05). Dengan membandingkan kelompok si-NC dan kelompok mimic NC, kecepatan aliran darah meningkat dalam kelompok miR-133a-3p mimic dan kelompok si-PSAT1 (keduanya P < 0,05). Berkontras dengan kelompok miR-133a-3p mimic, kecepatan aliran darah menurun dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Gambar 6a).
Pengaturan miR-133a-3p dan pengregulasi bawah PSAT1 mengurangi perubahan patologis jaringan IA. a Perubahan hemodinamika pada setiap titik waktu setelah pemodelan berhasil pada tikus. b Perubahan jaringan IA setelah transfeksi. n = 12, *P < 0,05 vs. kelompok normal. #P < 0,05 vs. kelompok mimic NC. &P < 0,05 vs. kelompok si-NC. +P < 0,05 vs. kelompok miR-133a-3p mimic. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan data dievaluasi oleh analisis variansi satu arah diikuti oleh uji lanjutan Tukey.
Perubahan jaringan IA diverifikasi oleh pewarnaan HE. Hasilnya menunjukkan bahwa dalam kelompok normal, serat elastis di lapis tengah jaringan vaskular intrakranial rapi, struktur gelombang protein elastis normal muncul, dan tidak ada retakan atau degenersi. Relatif terhadap kelompok normal, lumen jaringan vaskular intrakranial membesar, struktur gelombang protein elastis normal menghilang, serat elastis di lapis tengah lokal vaskular protein elastis patah, dan beberapa serat elastis sepenuhnya degradasi dalam kelompok IA. Tidak ada perubahan yang mencolok dalam morfologi jaringan IA dalam kelompok si-NC, kelompok mimic NC, kelompok IA, dan kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1. Berkontras dengan kelompok si-NC dan kelompok mimic NC, struktur gelombang protein elastis dalam jaringan vaskular intrakranial tikus dalam kelompok miR-133a-3p mimic dan kelompok si-PSAT1 ada, dan struktur vaskular protein elastis lokal sedikit acak, tetapi tidak ada retakan dan pelarutan (Gambar 6b).
Ekspresi Tinggi miR-133a-3p dan Ekspresi Rendah PSAT1 Mengurangi Ekspresi PSAT1, GSK3β, β-Katenin, VEGF, dan MMP-9 dalam Jaringan IA in Vivo
Ekspresi miR-133a-3p dalam jaringan IA in vivo diuji oleh RT-qPCR, disarankan bahwa relatif terhadap kelompok normal, ekspresi miR-133a-3p menurun dalam kelompok IA (P < 0,05). Ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara jelas (semua P > 0,05). Ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok miR-133a-3p mimic ditingkatkan relatif terhadap kelompok mimic NC (P < 0,05). Dengan membandingkan kelompok si-NC, tidak ada perubahan yang mencolok dalam ekspresi miR-133a-3p dalam kelompok si-PSAT1 (P > 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, ekspresi miR-133a-3p tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (P > 0,05) (Gambar 7a).
Overexpression miR-133a-3p dan ekspresi rendah PSAT1 mengurangi ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin, VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo dan PSAT1 adalah gen target miR-133a-3p. a Deteksi ekspresi miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam jaringan IA tikus dalam setiap kelompok oleh RT-qPCR. b Pita protein PSAT1, GSK3β, dan β-katenin. c Deteksi ekspresi protein PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam jaringan IA tikus dalam setiap kelompok oleh analis western blot. d Pita protein VEGF dan MMP-9. e Deteksi ekspresi protein VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA tikus dalam setiap kelompok oleh analis western blot. f Ramalan ikatan target PSAT1 yang berikatan dengan miR-133a-3p yang sesuai oleh Target Scan. g Hasil uji gen laporan dual luciferin. a–e, n = 12; f–g, N = 3, *P < 0,05 vs. kelompok normal/kelompok Wt + NC. #P < 0,05 vs. kelompok mimic NC. &P < 0,05 vs. kelompok si-NC. +P < 0,05 vs. kelompok miR-133a-3p mimic. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan data dievaluasi oleh analisis variansi satu arah diikuti oleh uji lanjutan Tukey
Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam jaringan IA in vivo diuji oleh analis western blot dan RT-qPCR. Ditunjukkan bahwa berkontras dengan kelompok normal, ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA meningkat (semua P < 0,05). Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara mencolok (semua P > 0,05). Ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin dalam kelompok miR-133a-3p mimic dan kelompok si-PSAT1 menurun dibandingkan dengan kelompok mimic NC dan kelompok si-NC (semua P < 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, ekspresi PSAT1, GSK3β, dan β-katenin ditingkatkan dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P < 0,05) (Gambar 7a–c).
Analis western blot digunakan untuk memverifikasi ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA in vivo; hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok normal, ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam kelompok IA ditingkatkan (keduanya P < 0,05). Ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam kelompok IA, kelompok mimic NC, dan kelompok si-NC tidak berubah secara jelas (semua P > 0,05). Relatif terhadap kelompok mimic NC dan kelompok si-NC, ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam kelompok miR-133a-3p mimic dan kelompok si-PSAT1 menurun (semua P < 0,05). Versus kelompok miR-133a-3p mimic, ekspresi VEGF dan MMP-9 ditingkatkan dalam kelompok miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (semua P < 0,05) (Gambar 7d, e).
PSAT1 adalah Gen Target miR-133a-3p
Perangkat lunak prediksi online (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) digunakan untuk meramalkan dan menganalisis ikatan target PSAT1 yang berikatan dengan miR-133a-3p, dan urutan wilayah 3′UTR yang dikombinasikan oleh PSAT1 dan miR-133a-3p. Untuk membuktikan bahwa ikatan target miR-133a-3p yang diramalkan mengakibatkan perubahan aktivitas luciferin, urutan mutasi dan urutan liar 3′UTR PSAT1 yang menghapus ikatan miR-133a-3p dirancang. Aktivitas luciferin diverifikasi oleh co-transfeksi miR-133a-3p mimic dan WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) atau MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) plasmid rekombinan dalam sel endotel vaskular. Hasilnya menunjukkan bahwa miR-133a-3p mimic tidak memiliki efek yang mencolok pada aktivitas luciferin dalam kelompok Mut-miR-133a-3p/PSAT1 (P > 0,05), sementara aktivitas luciferin dalam kelompok Wt-miR-133a-3p/PSAT1 menurun secara signifikan (P < 0,05) (Gambar 7f, g).
Pembahasan
IA adalah perluasan abnormal arteri intrakranial, yang melemahkan dinding arteri melalui mendorong dinding vaskular secara keluar secara berkelanjutan, yang menghasilkan risiko pecah aneurisma yang lebih tinggi [17]. Dalam studi yang dilakukan oleh Liu et al., telah ditunjukkan bahwa beberapa miRNA terlibat dalam modulasi proliferasi sel otot halus vaskular, yang terkait erat dengan IA [18]. Juga, studi terbaru telah memberikan bukti bahwa miRNA beredar dapat digunakan sebagai penanda baru untuk menilai kemungkinan terjadinya IA pada individu berisiko tinggi [19]. Umumnya diyakini bahwa PSAT1 mungkin terlibat dalam kondisi spektrum skizofrenia dan mengubah metabolisme serin [20]. Studi saat ini dirancang untuk mengeksplorasi peran regulasi miR-133a-3p yang memodulasi cedera endotel vaskular dan memicu IA melalui modulasi jalur sinyal PSAT1/GSK3β/β-katenin.
Dalam penelitian saat ini, hubungan antara ekspresi miR-133a-3p dan fitur klinis-patologis IA dianalisis, dan hasil menunjukkan bahwa ekspresi miR-133a-3p tidak berhubungan dengan usia, gender, bentuk, dan posisi aneurisma tetapi terkait dengan jumlah dan ukuran aneurisma. Beberapa sarjana berpendapat bahwa stres geser aliran darah regional di dinding arteri menginduksi ekspresi protein menarik monosit-1 (MCP-1) dan protein inflamasi makrofag 1α (MIP-1α) oleh fibroblast dan sel endotel vaskular (ECs) dalam dinding vaskular. Faktor kemotaksi yang sangat reaktif MCP-1 dan MIP-1α membuat agregasi makrofagosit dalam dinding vaskular dan memediasi respons inflamasi, kemudian, menginduksi excitasi faktor transkripsi nuklir c-Jun dan kemudian mengatur aktivasi protein aktivasi 1 (AP-1), kemudian mengaktifkan promotor MMP-9 dalam domain strukturalnya untuk meningkatkan ekspresi mRNA MMP-9, dan akhirnya menginduksi pelarutan matriks ekstraseluler dinding vaskular, yang menyebabkan pembentukan aneurisma intrakranial [21,22,23]. Saito et al. [24] menemukan bahwa sel positif MMP-9 berasal terutama dari membran tengah dan luar arteri makrofag, yang menyertifikasi bahwa MMP-9 yang diekspresikan oleh makrofag memediasi degenerasi dinding arteri, yang menyebabkan pembentukan aneurisma arteri. Studi-studi di atas telah menunjukkan bahwa MMP-9 terkait dengan pembentukan IA. Hasil penelitian kami mengungkapkan bahwa MMP-9 diupregulasi dalam IA; oleh karena itu, kami menduga bahwa mR-133a-3p mungkin terlibat dalam terjadinya dan perkembangan IA melalui regulasi jalur PSAT1/GSK3β/β-katenin dan lebih lanjut mengatur MMP-9. Dalam penelitian kami, kami menemukan bahwa pemulihan miR-133a-3p mengurangi ekspresi PSAT1, GSK3β, β-katenin, dan MMP-9 dalam jaringan aneurisma intrakranial. Kami akan melakukan penelitian yang relevan di masa depan untuk memverifikasi temuan kami.
Penelitian kami telah memberikan bukti yang besar dalam hal gagasan bahwa ekspresi miR-133a-3p berkurang dan PSAT1, GSK3β, dan β-katenin meningkat dalam IA. Bukti yang muncul telah menyarankan bahwa miR-133a-3p memainkan peran menahan dalam berbagai jenis tumor. Studi terbaru telah menyajikan bahwa ekspresi miR-133a-3p sangat degradasi dalam jaringan kanker payudara dibandingkan dengan jaringan non-kanker [25]. Studi lain telah menyangkal bahwa ekspresi miR-133a-3p menurun dalam jaringan kanker prostat lanjutan (PCa) relatif terhadap jaringan normal berdekatan atau jaringan lesi prostat benign, terutama dalam jaringan PCa metastatic tulang [26]. Efek promosi PSAT1 dalam berbagai jenis penyakit lainnya ditemukan dalam beberapa literatur. Dilaporkan bahwa ekspresi PSAT1 sangat meningkat pada kanker paru non-sel kecil (NSCLC) dan meramalkan hasil klinis buruk pasien NSCLC [27]. Selanjutnya, PSAT1 dianggap sebagai gen yang paling banyak diupregulasi dalam tumor CRC serta diekspresikan tinggi pada pasien resistensi kemoterapi [28]. Telah divalidasi bahwa aktivitas GSK3β meningkat pada jaringan kanker [29]. Selanjutnya, tingkat fosforilasi GSK3β serta ekspresi β-katenin nuklir juga meningkat, yang menunjukkan bahwa jalur GSK3β/β-katenin mungkin terlibat dalam regulasi osteopontin [30].
Hasil lain yang muncul dari data kami menyarankan bahwa pengaturan miR-133a-3p dan pengregulasi bawah PSAT1 menekan apoptosis dan meningkatkan proliferasi serta migrasi ECs IA, mengurangi ekspresi VEGF dan MMP-9 dalam jaringan IA. Telah disarankan sebelumnya bahwa overexpression miR-133a-3p menahan invasi, pertumbuhan, dan mitosis sel kanker sel siku eofagus tipe I kolagen (COL1A1) [31]. Dilaporkan bahwa ekspresi tinggi miR-133a-3p dapat menekan propagasi sel ESCC, memajukan apoptosis sel, dan menurunkan migrasi serta invasi sel ESCC melalui target COL1A1 [32]. Sebuah studi lain telah memverifikasi bahwa pengaturan sementara miR-133a-3p menekan kemampuan migrasi, invasi, dan pertumbuhan sel kanker kantung empedu melalui target langsung protein pengikat sinyal rekombinasi Jκ [33]. Seperti yang demikian, penelitian ini menyarankan bahwa miR-133a-3p memerankan perannya dalam IA melalui target PSAT1. Ditunjukkan bahwa overexpression PSAT1 meningkatkan pertumbuhan sel ESCC dan invasi matrigel in vitro, dan injeksi tikus dengan sel ESCC dengan ekspresi tinggi PSAT1 menginduksi pembentukan tumor in vivo [14]. Studi lain juga telah melaporkan bahwa PSAT1 diekspresikan tinggi dan meramalkan hasil klinis buruk pasien, serta meningkatkan tumorigenesis dan proliferasi sel in vivo dan in vitro [13]. Penelitian sebelumnya secara umum mengonfirmasi bahwa PSAT1 memajukan progresi siklus sel, proliferasi, dan tumorigenesis melalui eksperimen kehilangan dan pengayaan [27]. Telah diindikasikan bahwa MMP terdiri dari serangkaian enzim yang memotong substrat protein berdasarkan mekanisme yang dipertahankan yang merujuk aktivasi molekul air yang terikat situs aktif melalui ion Zn2+ [34]. MMP-9 adalah protease yang berbeda yang mendorong pengaruh besar pada banyak proses biologis [35]. Sebuah studi telah berpendapat bahwa MMP-9 meningkat dalam kelompok aneurisma dibandingkan dengan kelompok kontrol [36]. Faktor pertumbuhan endotel vaskular-A (VEGF-A) diakui sebagai modulator utama diferenciasi endovaskular trofoblast [37]. Sebuah studi telah mengungkapkan bahwa penekanan ekspresi PSAT1 menekan ekspresi VEGF, β-katenin, dan fosforilasi GSK3β [10].
Kesimpulan
Untuk meringkas, penelitian kami mengonfirmasi hipotesis kami bahwa overexpression miR-133a-3p atau pengregulasi bawah PSAT1 menahan cedera sel endotel dan meningkatkan proliferasi sel endotel melalui penghambatan jalur GSK3β/β-katenin dalam IA. Temuan ini memberikan wawasan baru dalam terapi target baru untuk IA. Temuan ini menekankan peran miR-133a-3p dalam IA dalam hubungan jalur PSAT1/GSK3β/β-katenin. Namun, kesimpulan tentang efek miR-133a-3p dan PSAT1 tidak dapat dibuat secara jelas karena penelitian yang diketahui tentang hal ini masih terbatas. Hal ini perlu dipantau secara ketat dan dilaporkan dengan baik dalam uji klinis di masa depan.
