Platform Nanopor Silika Mesoporos Lubung Terkapsel Chitosan Responsif Enzim untuk Pengiriman Obat Target Kolon

Abstrak

Sistem pengiriman obat khusus kolon responsif enzim dikembangkan berdasarkan bola silika mesoporos lubung (HMSS) yang chitosan (CS) terbiodegradasi dilekatkan melalui ikatan azo yang dapat dicabut (HMSS–N=N–CS). Doksorubisin (DOX) dienkapsulasi dalam keadaan nonkristal dalam lubung kosong dan mesoporos HMSS dengan jumlah pemuatan tinggi sebesar 35,2%. Pelepasan obat in vitro membuktikan bahwa HMSS–N=N–CS/DOX melakukan pelepasan obat responsif enzim. CS yang ditanam dapat meningkatkan kompatibilitas biologis dan stabilitas serta mengurangi adsorpsi protein pada HMSS. Hasil iritasi mukosa gastrointestinal dan sitotoksisitas sel menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik dari HMSS dan HMSS–N=N–CS. Hasil pengambilan sel menunjukkan bahwa pengambilan DOX jelas meningkat setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi sebelumnya dengan campuran enzim kolon. HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi dengan enzim kolon menunjukkan sitotoksisitas yang meningkat, dan nilai IC₅₀-nya tiga kali lebih rendah dari kelompok HMSS–N=N–CS/DOX tanpa enzim kolon. Pekerjaan ini menetapkan dasar untuk penelitian selanjutnya tentang pembawa mesoporos untuk pengiriman obat khusus kolon oral.

Pendahuluan

Akhir-akhir ini, sistem pengiriman obat (DDS) responsif rangsangan telah menarik perhatian luas untuk pemuatan yang efisien dan pelupasan selektif obat pada jaringan sakit target [1]. Sistem responsif rangsangan yang dirancang dapat dikirimkan ke lokasi sakit dan merealisasikan pelupasan obat sesuai permintaan untuk meningkatkan efek terapeutis dan menghambat efek samping yang disebabkan oleh kebocoran premature. Semua rangsangan internal dan eksternal, seperti potensial redoks [2], pH [1], enzim [3], dan suhu serta cahaya [4, 5], telah digunakan untuk merancang DDS responsif rangsangan. Di antara rangsangan ini, enzim, sebagai rangsangan internal, telah mendapat perhatian luas karena konsentrasinya yang berbeda dalam jaringan yang berbeda [6].

Selama dua dekade terakhir, bola silika mesoporos (MSSs) dengan mesoporos berkisar antara 2–50 nm telah ditetapkan sebagai pembawa obat responsif rangsangan [7, 8] karena MSSs memiliki volume pori yang sangat besar dan luas permukaan tinggi untuk kapasitas pemuatan obat tinggi, struktur pori yang terorganisir dengan baik, permukaan yang mudah difungsionalkan, dan kompatibilitas biologis yang baik [9]. Selanjutnya, nanopartikel bola silika mesoporos lubung (HMSS) dengan struktur cangkang mesoporos dan lubung kosong unggul dibandingkan MSS konvensional karena struktur lubung dapat menampung lebih banyak obat dengan kapasitas penyimpanan yang lebih tinggi daripada pembawa MSS [10, 11]. Segala jenis nanokarier responsif rangsangan berdasarkan MSSs telah dikembangkan untuk menampung molekul obat menggunakan berbagai gatekeeper, seperti polimer [12], nanopartikel anorganik [13], dendrimer, biomakromolekul [14], senyawa makrosiklik peptida [15], dan lipida [16]. Meskipun banyak DDS berdasarkan MSSs dengan capping fungsional dapat merealisasikan pelupasan responsif terhadap rangsangan eksternal atau internal, hanya sedikit yang telah digunakan dalam pengiriman obat target khusus kolon.

Diketahui bahwa pengiriman obat oral adalah cara favorit dan sederhana untuk memberikan obat. Pengiriman obat target khusus kolon sangat menarik untuk pengobatan penyakit kolon, termasuk penyakit Crohn, kanker kolorektal, dan kolitis ulseratif. Namun, pengiriman obat target khusus kolon mungkin menghadapi beberapa masalah, termasuk kadar air yang lebih rendah dan permukaan yang relatif lebih kecil untuk adsorpsi oral di sana daripada di lokasi lain di saluran pencernaan (GI) [17,18,19]. Selain itu, DDS oral juga menghadapi lingkungan asam yang kuat di lambung, yang dapat mempercepat degradasi obat yang dimuat di saluran pencernaan, sehingga menghilangkan kemampuan untuk merealisasikan pengiriman target kolon [19]. Untuk alasan ini, beberapa DDS tergantung pH telah dirancang untuk merealisasikan pelupasan obat yang dipicu pH pada nilai pH hampir netral (6–7) dari saluran pencernaan, menahan kondisi asam yang sangat tinggi di daerah lambung [20,21,22,23]. Hanya ada sedikit perbedaan keasaman antara wilayah usus (pH 6,8) dan kolon (pH 7,4); oleh karena itu, DDS responsif pH seperti ini sulit merealisasikan pelupasan khusus kolon.

Chitosan (CS), polisakarida kationik dan terbiodegradasi yang secara alami ada, terdiri dari unit glukosamin dan N-asetil-D-glukosamin yang terhubung β-(1-4) [24]. CS telah mendapat perhatian besar dalam medicina biologis karena sifat menariknya, termasuk terbiodegradasi, kompatibilitas biologis, mucoadhesivitas, dan aktivitas antibakteri [25,26,27,28,29]. Dibandingkan polimer, polielektrolit, dan supramolekul yang disintesis melalui proses yang rumit, CS relatif murah dan mudah tersedia melalui deasetilasi menyeluruh kitin [30,31,32]. Selain itu, telah dilaporkan bahwa CS dapat membuka junjian erat antara sel, sehingga meningkatkan penyerapan obat [33]. Oleh karena itu, polimer CS dipilih sebagai agen capping karena kompatibilitas biologis yang baik dan ukuran yang sesuai untuk menutupi mesoporos HMSS untuk mencegah pelupasan obat.

Dalam pekerjaan kami, DDS responsif enzim khusus kolon berdasarkan bahan HMSS (HMSS–N=N–CS) dirancang untuk pertama kalinya seperti yang ditunjukkan dalam Skema 1. Dalam sistem ini, pembawa HMSS disiapkan melalui strategi etsing selektif. Polimer CS dilekatkan pada permukaan HMSS dengan ikatan azo untuk bertindak sebagai gatekeeper untuk mencegah pembukaan HMSS. Ikat azo antara HMSS dan CS dapat dicabut oleh enzim di lokasi kolon [34, 35], menghasilkan pemisahan CS dari pembukaan HMSS. DOX digunakan sebagai obat model untuk disisipkan ke dalam lubung HMSS, dan eksperimen pelepasan obat in vitro dilakukan untuk mengevaluasi pelupasan responsif enzim dalam kehadiran enzim kolon. Mikroskop laser skaning konfokal (CLSM) dan sitometri aliran (FCM) digunakan untuk menyelidiki pengambilan sel oleh sel Caco-2. Akhirnya, sitotoksisitas HMSS–N=N–CS/DOX terhadap sel Caco-2 diukur.

Platform Nanopor Silika Mesoporos Lubung Terkapsel Chitosan Responsif Enzim untuk Pengiriman Obat Target Kolon

Bahan dan Metode

Bahan

Tetraetoksisilana (TEOS); N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilkarbodiimida hidroklorida (EDC); chitosan (DAC ≥ 95%); bromida setiltrimetilamonia (CTAB); 3-aminopropiltrietoksisilana (APTES); 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT); asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat; bromida kalium (kebersihan spektral, ≥ 99,5%); N-hidroxisuksinimida (NHS) dan DOX dibeli dari Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). Asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat disuplai oleh Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Media kultur sel DMEM, penisiptren-streptomisin, dan serum sapi bayi (FBS) disuplai oleh GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA). Semua reagen analitik tidak dipurnikan lebih lanjut sebelum penggunaan.

Persiapan HMSS–N=N–CS

Persiapan HMSS–NH₂

Nanopartikel HMSS disiapkan berdasarkan karya yang dipublikasikan menggunakan metode etsing selektif [36]. Bola silika padat pertama disintesis dengan metode Stober yang dimodifikasi. Secara singkat, 6 mL TEOS dicampur ke dalam larutan 10 mL air deionisasi, 74 mL etanol, dan 3 mL NH₃·H₂O terkoncentrasi. Selanjutnya, larutan diaduk selama 60 menit untuk mendapatkan suspensi silika koloidal pada suhu ruang. Bola padat diisentrifugasi, dicuci, dan dikeringkan untuk penggunaan selanjutnya. Kemudian, cangkang silika mesoporos dilapisi pada bola silika padat. Tiga ratus miligram bola silika dispersi dalam 50 mL air deionisasi dengan ultrasonikasi selama 45 menit. Dan suspensi silika dicampur ke dalam larutan 60 mL etanol, 450 mg CTAB, 90 mL air, dan 1,7 mL NH₃·H₂O. Setelah larutan diaduk selama 60 menit, TEOS (0,75 mL) ditambahkan. Selanjutnya, nanopartikel diisentrifugasi setelah diaduk selama 6 jam untuk mengumpulkan sampel dan kemudian didispersi ulang dalam 40 mL air. Sekitar 1,2 g Na₂CO₃ ditambahkan ke dalam suspensi air dengan diaduk kuat. Setelah larutan dipelihara pada 55 °C selama 12 jam, produk nanopartikel HMSS dikumpulkan dan dicuci dengan etanol anhydrous. Metode penanam pasca dengan rasio HMSS dan APTES sebesar 4:1 (m/v) untuk menyiapkan HMSS–NH₂ pada 80 °C dalam kondisi N₂ selama 8 jam, untuk CTAB dihilangkan oleh reflux [3].

Persiapan HMSS–N=N–COOH

Asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat (50 mg) ditambahkan ke dalam PBS pH 5,8. Kemudian (5 mg/mL) EDC dan (3 mg/mL) NHS ditambahkan untuk mengaktifkan asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat pada 30 °C selama 1 jam. Dan 10 mL PBS yang mengandung 15 mg/mL HMSS–NH₂ ditambahkan, dan larutan diaduk selama 24 jam. Dan HMSS–N=N–COOH yang dihasilkan dipisahkan oleh sentrifugasi dan dicuci dengan etanol.

Persiapan HMSS–N=N–CS

0,15 g CS dan 0,5 mL asam asetat ditambahkan ke dalam 50 mL air untuk menyiapkan larutan CS. Dan 100 mg HMSS–N=N–COOH didispersi dalam 25 mL PBS pH 5,0 dan diaktifkan oleh EDC dan NHS selama 0,5 jam. Kemudian, larutan CS (10 mL) dicampur ke dalam suspensi dengan diaduk terus menerus selama 1 hari. Akhirnya, HMSS–N=N–CS yang disintesis diisentrifugasi dan dicuci untuk mengumpulkan sampel.

Ekstraksi Campuran Enzim Kolon dari Mikroflora

Mikroflora kolon dikumpulkan sesuai dengan karya yang dipublikasikan [37]. Kemudian, kultur diinokulasi untuk mendapatkan campuran enzim yang tersisa mikroflora kolon pada 37 °C. Media kolon simulasi yang mengandung campuran enjang difilter melalui filter 0,22-μm untuk menghilangkan semua sisa sel dari cairan kultur. Selanjutnya, filtrat di-liophilize untuk mendapatkan campuran enzim dalam bentuk bubuk, yang digunakan dalam studi selanjutnya.

Proses Pemuatan Obat dan Pelepasan Responsif Enzim

Dua puluh lima miligram DOX dilarutkan dalam 5 mL larutan HCl pH 3,5. Dan 100 mg HMSS–N=N–CS ditambahkan ke dalam larutan DOX dan diaduk pada suhu ruang selama 12 jam. Selanjutnya, larutan NaOH 0,2 M digunakan untuk menyesuaikan pH larutan menjadi 7,0, dan suspensi diaduk selama 12 jam lagi. Kemudian, HMSS–N=N–CS yang dimuat DOX (disebut HMSS–N=N–CS/DOX) diisentrifugasi dan dicuci untuk menghilangkan DOX yang terserap pada permukaan HMSS–N=N–CS. Overnat dikumpulkan pada setiap langkah untuk mengukur efisiensi pemuatan (LE) DOX pada 480 nm dengan spektrofotometri UV-Vis. Massa total DOX yang dimuat dalam HMSS–N=N–CS dihitung dengan mengurangi DOX yang tidak dimuat setelah proses pemuatan obat dari massa awal DOX yang ditambahkan. HMSS/DOX disiapkan sebagai kontrol menggunakan HMSS sebagai pembawa awal. LE DOX dihitung sesuai dengan persamaan:

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

Di mana m_A adalah massa DOX yang ditambahkan, m_B adalah massa DOX dalam overnat, dan m_C adalah massa total HMSS–N=N–CS.

Pelepasan responsif enzim in vitro DOX dari HMSS–N=N–CS/DOX dievaluasi sebagai berikut. Dua miligram nanopartikel HMSS–N=N–CS/DOX dan HMSS/DOX didispersi dalam PBS pH 7,4 dengan getaran pada 125 rpm dengan berbagai konsentrasi campuran enzim kolon (0 mg/mL, 0,3 mg/mL, dan 1 mg/mL). Pada interval waktu yang ditentukan, 1 mL medium pelepasan diambil untuk mengukur absorbansi. Pelepasan DOX diukur pada 480 nm. HMSS/DOX digunakan sebagai kontrol.

Adsorpsi BSA

Jumlah adsorpsi BSA dievaluasi berdasarkan karya yang dipublikasikan [38, 39]. BSA ditambahkan ke dalam PBS pH 7,4 (0,5 mg/mL). Lima miligram HMSS dan HMSS–NH₂ dan HMSS–N=N–CS ditambahkan ke dalam 2,5 mL PBS (pH 7,4). Dan volume yang sama larutan BSA disediakan, dan suspensi ditempatkan dalam penggetar pada 100 rpm. Setelah 6 jam, sentrifugasi digunakan untuk mengumpulkan larutan atas. Terakhir, konsentrasi BSA diukur pada 595 nm setelah dicoret dengan larutan biru Coomassie brilliant.

Karakterisasi

Struktur jaringan mesoporos dan morfologi nanopartikel HMSS dievaluasi dengan citra TEM (EM–208S, CSIS, USA). Luas permukaan dan distribusi ukuran pori nanopartikel dikarakterisasi menggunakan analizator adsorpsi nitrogen (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Potensial ξ dan ukuran partikel dikarakterisasi pada Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK). Analisis TGA diukur pada peralatan TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Jepang) dengan laju pemanasan 10 °C/min dalam aliran nitrogen. Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR) diukur dengan spektrometer FT-IR (Bruker Tensor27, Swiss). Rentang dilakukan dari 400 hingga 4000 cm⁻¹ menggunakan teknik tablet KBr. Difraksi sinar X dilakukan pada difraktometer sinar X Siemens D5005 (Karlsruhe, Jerman) dengan radiasi Cu-Kα (λ = 1,5418 Å).

Kultur Sel dan Eksperimen Pengambilan Sel

Sel Caco-2 dikultur dalam media yang dilengkapi dengan 10% FBS, 1% asam amino non-esensial, 1% (v/v) natrium pyruvat, dan 1% streptomisin. Sel NIH-3T3 dikultur dalam DMEM dengan 1% streptomisin dan 10% FBS. Pengambilan sel Caco-2 terhadap nanokarier dikarakterisasi menggunakan FCM dan CLSM. Sel Caco-2 ditanam pada plate 24 lubang. Setelah kultur selama semalaman, DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi sebelumnya dengan nanopartikel campuran enzim kolon (sama dengan konsentrasi 5 μg/mL DOX) ditambahkan ke lubang yang sesuai. Setelah diinkubasi terus selama 2 jam, media sel dihilangkan dan dicuci bersih dengan PBS. Kemudian, sel diperbaiki dengan formaldehida 4% dan dicoret dengan Hoechst 33258 untuk pengamatan CLSM. FCM digunakan untuk mendapatkan evaluasi kuantitatif pengambilan sel. Sel Caco-2 ditanam pada plate 6 lubang dan lebih lanjut diinkubasi selama 24 jam. Setelah dicuci dengan PBS, sel Caco-2 diinkubasi dengan DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi sebelumnya dengan nanopartikel campuran enzim kolon (sama dengan konsentrasi 5 μg/mL DOX) dalam DMEM bebas serum selama 2 jam. Kemudian, sel Caco-2 dicuci dengan PBS dingin, di-trypsin, dan didispersi ulang dalam 0,5 mL PBS. Fluoresensi DOX dalam sel diukur menggunakan sitometer aliran FACS Canto (Becton, Dickinson, AS).

Uji Propagasi Sel In Vitro

Sitotoksisitas pembawa kosong HMSS dan HMSS–N=N–CS terhadap sel NIH-3T3 dan Caco–2 diuji dengan uji MTT [40, 41]. Secara singkat, sel Caco–2 dan NIH-3T3 secara terpisah ditanam pada plate 96 lubang dan lebih lanjut diinkubasi selama semalaman. Media sel lama diganti dengan media bebas serum yang mengandung berbagai konsentrasi nanopartikel. Setelah diinkubasi selama 2 hari, 50 μL larutan MTT (2 mg mL^–1) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam untuk mengukur sel hidup. Kemudian, larutan MTT dihilangkan, dan 150 μL DMSO ditambahkan untuk melarutkan formazan. Selanjutnya, absorbansi diukur pada pembaca microplate (Tecan, Männedorf, Swiss) pada 570 nm. Sitotoksisitas DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi sebelumnya dengan campuran enzim yang diekstraksi dari mikroflora kolon diukur menggunakan sel Caco-2 dengan konsentrasi DOX yang sesuai (0,1, 1, 5, 10, dan 20 μg/mL). Waktu inkubasi adalah 48 jam, dan proses eksperimen lainnya sama seperti yang dijelaskan di atas.

Studi Toksisitas

Uji iritasi mukosa gastrointestinal sangat penting untuk evaluasi biosafety in vivo pengiriman obat oral. Tikus Sprague–Dawley jantan (180 ± 10 g) secara acak dibagi menjadi tiga kelompok (tiga tikus untuk setiap kelompok). Tikus diberi administrasi salin, HMSS, dan nanopartikel HMSS–N=N–CS dengan dosis 100 mg/kg setiap hari. Setelah 7 hari, semua tikus disembelih, dan jaringan dikumpulkan dan diperiksa dengan pemeriksaan histopatologis (H&E). Untuk mengevaluasi biosafety nanopartikel HMSS dan HMSS–N=N–CS, berat badan tikus BALB/c (18–20 g) dicatat setelah administrasi oral pada dosis 100 mg/kg setiap hari selang. Semua prosedur eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Universitas Medis Qiqihar dan disetujui oleh Komite Etika Universitas Medis Qiqihar.

Statistik

Data statistik dianalisis dengan perangkat lunak SPSS menggunakan uji t Student dua sisik. Bar kesalahan yang disajikan dalam studi ini adalah SD. p < 0,05 dianggap bermakna secara statistik.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan dan Karakterisasi HMSS–N=N–CS

HMSS disiapkan berdasarkan karya sebelumnya dengan perubahan kecil [36]. Pertama, bola silika nanodiatas SiO₂ padat disiapkan, dan cangkang mesoporos dilapisi pada permukaan bola silika padat yang mengandung cetakan CTAB. Kemudian, Na₂CO₃ digunakan untuk secara selektif mengatsi bola silika nanodiatas SiO₂ padat sementara cangkang mesoporos dilindungi oleh cetakan CTAB. Persiapan HMSS–N=N–CS dengan CS yang dilekatkan sebagai “gatekeeper” melalui ikatan azo dijelaskan pada Gambar 1a. Pertama, permukaan nanopartikel HMSS dimodifikasi dengan APTES sebagai agen coupling alquil untuk menjadi HMSS berfungsi amino (HMSS–NH₂) dengan metode modifikasi pasca. Selanjutnya, HMSS–N=N–COOH disiapkan dengan reaksi amidasi antara kelompok amino HMSS–NH₂ dan kelompok karboksil asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat. Kemudian, CS dikovalen modifikasi pada permukaan nanopartikel HMSS dengan reaksi amidasi antara kelompok karboksil HMSS–N=N–COOH dan kelompok amino dalam CS.

Seperti yang ditampilkan pada citra mikroskop transmisi elektron (TEM) dalam Gambar 1a, diameter rata-rata HMSS adalah 280 nm, dan HMSS memiliki struktur lubung yang seragam dan cangkang mesoporos yang sangat terorganisir. Ketebalan rata-rata cangkang mesoporos sekitar 90 nm. Dibandingkan dengan permukaan licin HMSS, permukaan polimer yang ditanam HMSS–N=N–CS (Gambar 1b) kasar, menunjukkan bahwa CS menutupi pembawa HMSS.

Luas permukaan dan distribusi pori bahan mesoporos memainkan peran krusial dalam pemuatan dan pengiriman molekul tuan rumah untuk pelupasan yang terkontrol. Kurva distribusi ukuran pori dan isoterm diukur dengan analisi adsorpsi dan desorpsi N₂ (Gambar 2). Parameter terperinci (luas permukaan Brunauer–Emmett–Teller (BET) (S_BET), volume pori total (V_P), dan distribusi ukuran pori (D_P)) ditampilkan dalam Tabel 1. S_BET dan V_P HMSS murni adalah 810,7 m²/g dan 0,969 cm³/g, masing-masing, dan D_P sekitar 3,8 nm. D_P HMSS–NH₂ hampir sama dengan HMSS setelah aminosasi, menunjukkan bahwa mesoporos tidak tersumbat setelah fungsionalisasi amino. S_BET dan V_P HMSS–N=N–CS secara signifikan menurun setelah modifikasi oleh senyawa azo dan lapisan CS, menunjukkan bahwa CS telah melapisi permukaan HMSS [1].

Penggantian yang berhasil HMSS–N=N–CS diverifikasi dengan berbagai metode. Potensial ξ HMSS–NH₂ mengalami perubahan besar setelah fungsionalisasi, bervariasi dari − 27,9 ke + 31,4 mV, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, yang dikaitkan dengan penambahan kelompok amino pada permukaan HMSS. Setelah HMSS–NH₂ bereaksi dengan asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat untuk membentuk HMSS–N=N–COOH, potensial ξ lebih menurun menjadi − 2,0 mV karena kelompok karboksil pada permukaan HMSS. Setelah polimer CS lebih lanjut ditanam pada permukaan HMSS untuk membentuk HMSS–N=N–CS, potensial ξ kembali menjadi + 32,4 mV. Hasil ini dikaitkan dengan lapisan CS positif yang kaya amino pada permukaan HMSS [1]. Kurva analisis termogravimetri (TGA) HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, dan HMSS–N=N–CS ditunjukkan pada Gambar 3b. Dibandingkan HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS kehilangan bobot tambahan sekitar 19%, yang disebabkan oleh penghilangan rantai CS. Penggantian ikatan azo pada permukaan HMSS juga dikonfirmasi oleh perubahan warna selama persiapan HMSS–N=N–COOH, seperti yang ditunjukkan pada inset Gambar 3b. Reaktan HMSS–NH₂ berwarna putih, sementara produk HMSS–N=N–COOH berwarna coklat kekuningan setelah asid azobenzen-3,3′-dikarboksilat bereaksi dengan kelompok amino HMSS. Diameter hidrodinamis (D_H) dan indeks polidispersi (PDI) HMSS, HMSS–NH₂, dan HMSS–N=N–CS ditentukan dalam air tisu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3c. HMSS memiliki diameter 309 nm dan PDI 0,190. Setelah penambahan kelompok amino pada permukaan HMSS untuk membentuk HMSS–NH₂, D_H meningkat menjadi 324 nm. Diameter HMSS–N=N–CS adalah 342 nm, yang lebih besar daripada HMSS–NH₂ karena rantai CS yang ditanam. PDI HMSS–N=N–CS (0,177) lebih kecil daripada HMSS–NH₂, menunjukkan bahwa ukuran partikel rata-rata telah lebih kecil setelah penggantian CS. Dibandingkan diameter yang diperoleh dari TEM, diameter HMSS dan HMSS–N=N–CS yang diukur oleh DLS lebih besar. D_H nanopartikel diukur dalam lingkungan air dengan lapisan hidrasi, sementara ukuran nanopartikel yang disediakan oleh TEM diperoleh dari nanopartikel kering [3]. Spektra FT-IR HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS, dan CS ditunjukkan pada Gambar 4d. Dibandingkan puncak untuk HMSN–NH₂, peningkatan puncak adsorpsi pada 2853 dan 2925 cm⁻¹ dikaitkan dengan getaran − CH₂ dalam penggantian ikatan azo berujung karboksil. Setelah CS ditambahkan pada permukaan HMSS–N=N–COOH, terjadi peningkatan puncak adsorpsi pada 1660 cm⁻¹ dan 3435 cm⁻¹, yang dikaitkan dengan υ_(C=O) dalam band amida dan getaran N–H dalam CS. Semua hasil membuktikan pembuatan yang berhasil HMSS–N=N–CS.

Status Obat dan Efisiensi Pemuatan

DOX dipilih untuk menyelidiki perilaku pemuatan dan pelepasan HMSS–N=N–CS. Saat nilai pH suspensi nanopartikel HMSS–N=N–CS disesuaikan menjadi pH 3,5, biopolimer CS menjadi bermuatan positif (pKa CS adalah 6,3) karena kelompok amino yang protonasi dalam lingkungan asam [24]. Polimer CS menjadi bermuatan positif dan bengkak, menghasilkan pembukaan mesoporos HMSS yang dikaitkan dengan interaksi repulsif antara muatan CS. Jadi, DOX mendapatkan akses ke mesoporos HMSS–N=N–CS oleh difusi. Namun, setelah larutan yang dimuat obat disesuaikan menjadi 7,4, rantai CS dideprotonasi dan runtuh untuk mencegah pelepasan premature DOX.

LE HMSS–N=N–CS/DOX adalah 35,2%, yang jauh lebih besar daripada sistem pengiriman silika mesoporos yang dimuat DOX lainnya [3, 16]. LE tinggi DOX dalam pembawa nano HMSS dikaitkan dengan lubung kosong, luas permukaan besar, dan jaringan mesoporos, yang dapat digunakan sebagai reservoar obat. Status fisik DOX dalam HMSS–N=N–CS/DOX dievaluasi oleh difraksi sinar X bubuk (XRD). Seperti yang ditunjukkan pada profil XRD (Gambar 4), DOX mentah menunjukkan puncak difraksi kristal obat yang khas dan kuat. Campuran fisik (PM) HMSS–N=N–CS dan DOX juga menunjukkan puncak difraksi kristal yang jelas. Namun, tidak ada puncak kristal yang jelas yang ditampilkan oleh HMSS–N=N–CS/DOX, yang membuktikan bahwa status fisik DOX dalam HMSS–N=N–CS/DOX adalah nonkristal karena batasan struktur mesoporos HMSS.

Pelepasan Responsif Enzim In Vitro dalam Lingkungan Simulasi Kolon

Untuk menyelidiki pelepasan responsif enzim HMSS–N=N–CS, nanopartikel HMSS–N=N–CS/DOX dan HMSS/DOX ditambahkan ke dalam PBS pH 7,4 dengan berbagai konsentrasi campuran enzim kolon. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 5a, HMSS–N=N–CS/DOX menunjukkan pelepasan DOX yang lambat dalam PBS pada pH 7,4, dan persentase pelupasan kumulatif hanya sekitar 10% dalam 24 jam, yang menunjukkan kemampuan capping yang baik dari polimer CS dan ikatan azo. Seperti yang diharapkan, dalam kasus enzim yang dihaluskan dalam PBS pada pH 7,4, pelupasan kumulatif DOX meningkat menjadi lebih dari 20% dalam periode yang sama. Selain itu, jumlah pelepasan DOX secara dramatis meningkat hingga hampir 40% dalam kehadiran enzim terkoncentrasi. Dibandingkan pelepasan responsif enzim dari HMSS–N=N–CS/DOX, pelepasan DOX dari HMSS/DOX memiliki tren yang sama dalam kehadiran atau tidaknya enzim terkoncentrasi. Persentase pelepasan obat yang relatif rendah disebabkan oleh interaksi elektrostatis antara HMSS yang bermuatan negatif dan DOX yang bermuatan positif [42]. Hasil di atas membuktikan bahwa pelepasan DOX dari HMSS–N=N–CS/DOX secara signifikan dipercepat oleh enzim yang diekstraksi dari mikroflora di wilayah kolon. Mekanisme pelepasan responsif enzim dapat karena ikatan azo dalam HMSS–N=N–CS terdegradasi oleh enzim, menyebabkan pemisahan CS dari permukaan HMSS dan pelepasan cepat dari HMSS. Ikat azo telah dilaporkan dapat dicabut oleh enzim yang diserap mikroflora kolon [34, 35].

Selanjutnya, untuk mengevaluasi lebih lanjut pelepasan responsif enzim dari HMSS–N=N–CS/DOX dalam lingkungan GIT mimetik, platform nano HMSS–N=N–CS/DOX awalnya didispersi dalam SGF selama 2 jam dan kemudian lebih lanjut didispersi dalam SIF selama 6 jam, dan akhirnya, pembawa ditambahkan ke dalam PBS pH 7,4 yang mengandung 1 mg/mL enzim yang diekstraksi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5b, dalam susus lambung simulasi, pelepasan DOX relatif cepat, dan jumlah kumulatif mencapai 15% dalam 2 jam. Pelepasan yang relatif cepat disebabkan oleh interaksi yang lebih lemah antara HMSS–N=N–CS dan DOX dalam kondisi asam dibandingkan kondisi netral [1]. Kemudian, pelepasan DOX melambat dalam SIF selama 2–8 jam. Namun, setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi dengan enzim yang diekstraksi dalam PBS pH 7,4, pelepasan DOX terus meningkat secara signifikan, dan jumlah pelupasan kumulatif mencapai lebih dari 50% dalam 24 jam. Pelepasan DOX yang tidak lengkap dari HMSS–N=N–CS/DOX disebabkan oleh interaksi yang kuat antara DOX yang bermuatan positif dan HMSS yang bermuatan negatif.

Adsorpsi Protein dan Stabilitas HMSS–N=N–CS

Untuk administrasi oral, sifat permukaan nanokarier tidak terhindari akan mempengaruhi perilaku pelepasan obat dan bioadsorpsi [43]. Uji adsorpsi protein pada permukaan digunakan untuk mengevaluasi efek CS yang ditanam pada permukaan HMSS. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 6a, pembawa nano HMSS polos memiliki adsorpsi BSA yang dramatis hingga 16,5%, yang dikaitkan dengan luas permukaan dan lubung kosong HMSS yang besar, kemampuan adsorpsi yang kuat, dan interaksi tidak spesifik antara kelompok silanol HMSS dan BSA [38, 39]. Selain itu, HMSS–NH₂ juga memiliki jumlah BSA yang terserap yang relatif tinggi sebesar 10,2%. Namun, persentase BSA yang terserap pada permukaan secara signifikan menurun menjadi 2,5% setelah polimer CS ditambahkan sebagai penutup, sehingga secara dramatis mengurangi efek pada perilaku in vivo HMSS–N=N–CS. Untuk mengamati lebih lanjut stabilitas sampel HMSS–N=N–CS dan HMSS, 20 mg HMSS–N=N–CS dan HMSS ditambahkan ke dalam PBS pH 7,4 dan air deionisasi. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 6b, meskipun HMSS–N=N–CS dan HMSS relatif stabil dalam air, HMSS cepat mengendap dalam PBS pH 7,4. Sebaliknya, dispergasi HMSS–N=N–CS jelas ditingkatkan setelah polimer CS ditanam pada permukaan HMSS. Selain itu, pembawa HMSS–N=N–CS dapat tetap stabil selama lebih dari 12 jam tanpa presipitat dalam PBS pH 7,4. Hasil ini membuktikan bahwa penutupan dengan polimer CS hidrofilik dapat meningkatkan dispergasi dan mengurangi adsorpsi protein pada permukaan HMSS–N=N–CS.

Pengambilan Sel

Sel Caco–2, sebagai sel adenocarcinoma kolorektal epitelial manusia, banyak digunakan sebagai sel model dalam pengiriman obat oral. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7a, sel Caco–2 yang diinkubasi dengan DOX bebas menunjukkan sinyal fluoresensi yang relatif kuat yang dihasilkan oleh DOX karena DOX bermuatan positif dapat masuk ke sel dan kemudian ke inti sel. Dibandingkan kelompok DOX bebas, kelompok HMSS–N=N–CS/DOX menunjukkan intensitas sinyal fluoresensi yang lebih lemah karena pelepasan obat yang tidak lengkap dari HMSS–N=N–CS/DOX. Namun, setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi sebelumnya dengan campuran enzim kolon selama 1 jam, ia menunjukkan sinyal fluoresensi yang meningkat secara signifikan. Ini dikaitkan dengan ikatan azo yang dicabut oleh campuran enzim, yang mengakibatkan penghapusan CS dari permukaan HMSS, sehingga secara signifikan mempercepat pelepasan DOX dari HMSS–N=N–CS/DOX. Untuk mengevaluasi secara kuantitatif perbedaan pengambilan sel untuk HMSS–N=N–CS/DOX dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi dengan enzim yang diekstraksi, FCM digunakan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7b, intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) untuk kelompok HMSS–N=N–CS/DOX adalah 124,7, yang lebih lemah daripada kelompok DOX bebas, dengan nilai p kurang dari 0,001. Dengan menggembirakan, setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi sebelumnya dengan campuran enzim kolon selama 1 jam, MFI secara signifikan meningkat menjadi 357 dan bahkan melebihi kelompok DOX bebas karena pelepasan obat yang dipercepat dari HMSS–N=N–CS/DOX setelah patahnya ikatan azo. Semua hasil ini menunjukkan bahwa ikatan azo dalam HMSS–N=N–CS/DOX dapat dicabut dalam kehadiran enzim kolon, yang mengakibatkan pelepasan CS dari permukaan HMSS dan mempercepat pelepasan DOX dari HMSS.

Evaluasi Kelangsungan Hidup Sel In Vitro

Untuk membuktikan efek pelepasan responsif enzim HMSS–N=N–CS/DOX dalam kondisi simulasi kolon, uji kelangsungan hidup sel in vitro dilakukan menggunakan sel Caco-2. Obat antikanker klasik DOX digunakan dalam uji kelangsungan hidup sel. Sebelum uji ini, berbagai konsentrasi pembawa kosong HMSS dan HMSS–N=N–CS digunakan untuk menentukan kompatibilitas biologis platform nano terhadap sel Caco-2 dan sel NIH-3T3 (fibroblast embrio tikus) normal pada berbagai konsentrasi dari 10 hingga 250 μg/mL dengan uji MTT [44, 45]. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 8a, b, HMSS dan HMSS–N=N–CS pada berbagai konsentrasi menunjukkan sitotoksisitas yang tidak signifikan setelah diinkubasi dengan sel Caco–2 atau NIH-3T3, dan kelangsungan hidup sel Caco–2 adalah 87,9% dan 88,3% pada konsentrasi tinggi sebesar 100 μg/mL, masing-masing, yang cukup tinggi untuk aplikasi klinis karena pemuatan obat tinggi HMSS. Selain itu, sel NIH-3T3 yang diinkubasi dengan HMSS dan HMSS–N=N–CS selama 48 jam memiliki kelangsungan hidup sel yang tinggi (di atas 80%) pada konsentrasi yang relatif tinggi sebesar 100 μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa HMSS dan HMSS–N=N–CS kompatibel sel dan dapat digunakan untuk pengiriman oral.

Efek pembawa nano yang dimuat DOX HMSS–N=N–CS/DOX pada kelangsungan hidup sel Caco–2 ditampilkan pada Gambar 8c. DOX bebas menunjukkan sitotoksisitas yang kuat dan bergantung pada konsentrasi terhadap sel 4T1, yang dikaitkan dengan fakta bahwa DOX bebas yang bermuatan positif dapat dengan mudah melewati membran sel 4T1. Nilai IC₅₀ untuk kelompok DOX bebas ditentukan sebesar 10,18 μg/mL menggunakan perangkat lunak SPSS Statistics. Dibandingkan DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX menunjukkan kelangsungan hidup sel yang lebih tinggi pada konsentrasi DOX yang sama karena pelepasan DOX yang tidak lengkap dari HMSS–N=N–CS yang diinduksikan oleh interaksi elektrostatis yang kuat antara pembawa HMSS yang bermuatan negatif dan DOX yang bermuatan positif. Nilai IC₅₀ untuk kelompok HMSS–N=N–CS/DOX adalah 32,22 μg/mL, yang jauh lebih tinggi daripada DOX bebas. Namun, HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi sebelumnya dengan enzim kolon terkoncentrasi menunjukkan sitotoksisitas yang jelas bergantung pada konsentrasi, dan nilai IC₅₀ dihitung sebesar 9,41 μg/mL, yang jauh lebih rendah daripada HMSS–N=N–CS/DOX. Alasan ini dapat dikaitkan dengan enzim kolon yang mendegadasi ikatan azo dalam HMSS–N=N–CS, yang akan mengakibatkan pelepasan CS yang ditanam dari permukaan HMSS, menyebabkan pelepasan cepat DOX dari pembawa HMSS.

Studi Toksisitas

Bahaya penggunaan HMSS–N=N–CS adalah faktor vital yang perlu dipertimbangkan sebelum aplikasi klinisnya di masa depan. Pewarnaan H&E iritasi mukosa gastrointestinal sangat penting untuk mengevaluasi biosafety in vivo sistem pengiriman untuk administrasi oral (Gambar 9a). Dibandingkan kelompok salin, baik kelompok HMSS maupun HMSS–N=N–CS tidak menunjukkan perubahan histopatologis atau hiperemia yang signifikan setelah administrasi oral selama satu minggu dengan dosis administrasi 100 mg/kg. Tidak ada kematian atau perilaku tidak biasa tikus yang diamati selama proses eksperimen. Penurunan berat badan dianggap luas sebagai indeks penting dan sederhana untuk toksisitas sistemik in vivo [46]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 9b, berat badan tikus dalam kelompok HMSS dan HMSS–N=N–CS meningkat sedikit dan mirip dengan kelompok salin. Hasil di atas menunjukkan bahwa HMSS dan HMSS–N=N–CS menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik sebagai pembawa obat untuk administrasi oral.

Kesimpulan

Secara ringkasan, CS terbiodegradasi dilekatkan melalui ikatan azo untuk menutupi pembukaan HMSS untuk mencapai pengiriman obat khusus kolon responsif enzim. DOX dimuat dalam lubung kosong dan mesoporos HMSS dalam keadaan nonkristal dengan efisiensi pemuatan tinggi sebesar 35,2%. Hasil stabilitas dan adsorpsi BSA menunjukkan bahwa gerbang CS dapat meningkatkan kompatibilitas biologis dan stabilitas HMSS. Hasil pelepasan in vitro membuktikan bahwa HMSS–N=N–CS/DOX menunjukkan perilaku pelepasan obat responsif enzim dalam kehadiran enzim kolon. Hasil pengambilan CLSM dan FCM menunjukkan bahwa pengambilan sel DOX jelas meningkat setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi dengan campuran enzim kolon. Hasil kelangsungan hidup sel menunjukkan bahwa HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi dengan enzim kolon menunjukkan sitotoksisitas yang meningkat, dan nilai IC₅₀ jelas menurun dari 32,22 μg/mL untuk HMSS–N=N–CS/DOX menjadi 9,41 μg/mL setelah inkubasi.