Chitosan-capped enzyme-responsive berongga silika nanoplatforms untuk pengiriman obat khusus usus besar
Abstrak
Sistem pengiriman spesifik usus yang responsif terhadap enzim dikembangkan berdasarkan bola silika mesopori berongga (HMSS) di mana kitosan (CS) yang dapat terurai secara hayati dilampirkan melalui ikatan azo yang dapat dibelah (HMSS–N=N–CS). Doksorubisin (DOX) dienkapsulasi dalam keadaan nonkristalin dalam rongga berongga dan mesopori HMSS dengan jumlah pemuatan tinggi 35,2%. Pelepasan obat in vitro membuktikan bahwa HMSS–N=N–CS/DOX melakukan pelepasan obat yang responsif terhadap enzim. CS yang dicangkok dapat meningkatkan biokompatibilitas dan stabilitas serta mengurangi adsorpsi protein pada HMSS. Hasil iritasi mukosa gastrointestinal dan sitotoksisitas sel menunjukkan biokompatibilitas yang baik dari HMSS dan HMSS–N=N–CS. Hasil serapan seluler menunjukkan bahwa serapan DOX jelas meningkat setelah HMSS–N=N–CS/DOX diprainkubasi dengan campuran enzim kolon. HMSS–N=N–CS/DOX yang diinkubasi dengan enzim usus besar menunjukkan peningkatan sitotoksisitas, dan IC-nya50 nilainya tiga kali lebih rendah dibandingkan kelompok HMSS–N=N–CS/DOX tanpa enzim usus besar. Karya ini meletakkan dasar untuk penelitian selanjutnya pada pembawa mesopori untuk pengiriman obat spesifik usus besar secara oral.
Pengantar
Baru-baru ini, sistem pengiriman obat yang responsif terhadap rangsangan (DDS) telah menarik perhatian luas untuk pemuatan yang efisien dan pelepasan obat secara selektif pada jaringan yang sakit yang ditargetkan [1]. Sistem yang responsif terhadap rangsangan yang dirancang dapat dikirim ke tempat yang sakit dan mewujudkan pelepasan obat sesuai permintaan untuk meningkatkan efek terapeutik dan menghambat efek samping akibat kebocoran dini. Semua rangsangan internal dan eksternal, seperti potensial redoks [2], pH [1], enzim [3], dan suhu dan cahaya [4, 5], telah digunakan untuk merancang DDS yang responsif terhadap rangsangan. Di antara rangsangan ini, enzim, sebagai rangsangan internal, telah mendapatkan perhatian luas karena konsentrasinya yang berbeda di jaringan yang berbeda [6].
Selama dua dekade terakhir, bola silika mesopori (MSSs) dengan mesopori mulai dari ukuran 2-50 nm telah ditetapkan sebagai pembawa obat yang responsif terhadap rangsangan [7, 8] karena MSS memiliki volume pori yang sangat besar dan luas permukaan yang tinggi untuk kapasitas pemuatan obat, struktur pori yang terorganisir dengan baik, permukaan yang mudah difungsikan, dan biokompatibilitas yang baik [9]. Selanjutnya, nanopartikel hollow mesopori silika sphere (HMSS) dengan struktur cangkang mesopori dan rongga berongga lebih unggul dari MSS konvensional karena struktur berongga secara efisien dapat menampung lebih banyak obat dengan kapasitas penyimpanan yang lebih tinggi daripada pembawa MSS [10, 11]. Semua jenis nanocarrier yang responsif terhadap rangsangan berdasarkan MSS dikembangkan untuk menampung molekul obat menggunakan berbagai gatekeeper, seperti polimer [12], nanopartikel anorganik [13], dendrimer, biomakromolekul [14], senyawa makrosiklik peptida [15], dan lipid [ 16]. Meskipun banyak DDS berdasarkan MSS dengan pembatasan fungsional dapat mewujudkan pelepasan sebagai respons terhadap berbagai rangsangan eksternal atau internal, beberapa di antaranya telah digunakan dalam penghantaran obat target spesifik usus besar.
Telah diketahui dengan baik bahwa pemberian obat oral adalah cara pemberian obat yang paling disukai dan sederhana. Penghantaran obat bertarget spesifik usus besar sangat menarik untuk pengobatan penyakit usus besar, termasuk penyakit Crohn, kanker kolorektal, dan kolitis ulserativa. Namun, penghantaran obat khusus usus besar mungkin menghadapi beberapa masalah, termasuk kandungan air yang lebih sedikit dan permukaan yang relatif lebih sedikit untuk adsorpsi oral di sana daripada di tempat lain di saluran gastrointestinal (GI) [17,18,19]. Selanjutnya, DDS oral juga memenuhi lingkungan asam yang kuat di lambung, yang mungkin mempercepat degradasi obat yang dimuat di saluran GI, sehingga menghilangkan kemampuan untuk mewujudkan pengiriman yang ditargetkan ke kolon [19]. Untuk alasan ini, beberapa DDS yang bergantung pada pH telah dirancang untuk mewujudkan pelepasan obat yang dipicu oleh pH pada nilai pH yang hampir netral (6-7) dari saluran GI, melawan kondisi yang sangat asam di daerah perut [20,21,22] ,23]. Hanya ada sedikit perbedaan keasaman antara daerah usus (pH 6,8) dan kolon (pH 7,4); oleh karena itu, DDS yang responsif terhadap pH mengalami kesulitan untuk mewujudkan pelepasan spesifik usus besar.
Kitosan (CS), polisakarida alami yang kationik dan biodegradable, dibentuk oleh unit -(1-4)-linked glucosamine dan N-acetyl-D-glucosamine [24]. CS telah mendapat perhatian besar dalam pengobatan biologis karena sifat menariknya, termasuk biodegradabilitas, biokompatibilitas, mukoadhesivitas, dan aktivitas antibakteri [25,26,27,28,29]. Dibandingkan dengan polimer, polielektrolit, dan supramolekul yang disintesis melalui proses yang rumit, CS relatif murah dan tersedia dengan deasetilasi lengkap kitin [30,31,32]. Selain itu, telah dilaporkan bahwa CS dapat membuka tight junction antar sel, sehingga meningkatkan absorpsi obat [33]. Oleh karena itu, polimer CS dipilih sebagai agen penutup karena biokompatibilitasnya yang baik dan ukuran yang sesuai untuk menutupi mesopori HMSS untuk memblokir pelepasan obat.
Dalam pekerjaan kami, DDS responsif-enzim spesifik usus besar berdasarkan bahan HMSS (HMSS–N=N–CS) dirancang untuk pertama kalinya seperti yang ditampilkan dalam Skema 1. Dalam sistem ini, pembawa HMSS disiapkan melalui selektif strategi etsa. Polimer CS dilekatkan pada permukaan HMSS oleh ikatan azo untuk bertindak sebagai penjaga gerbang untuk memblokir bukaan HMSS. Ikatan azo antara HMSS dan CS dapat dipecah oleh enzim di lokasi usus besar [34, 35], menghasilkan pemisahan CS dari bukaan HMSS. DOX digunakan sebagai obat model untuk dimasukkan ke dalam rongga HMSS, dan percobaan pelepasan obat in vitro dilakukan untuk mengevaluasi pelepasan yang responsif terhadap enzim dengan adanya enzim kolon. Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dan flow cytometry (FCM) digunakan untuk menyelidiki serapan seluler oleh sel Caco-2. Akhirnya, sitotoksisitas HMSS–N=N–CS/DOX terhadap sel Caco-2 diukur.
Ilustrasi skema dari a proses persiapan HMSS–N=N–CS dan b pemuatan obat dan pelepasan enzim-responsif dari HMSS–N=N–CS/DOX sebagai respons terhadap enzim usus besar
Bahan dan Metode
Materi
Tetraethoxysilane (TEOS); N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilkarbodiimida hidroklorida (EDC); kitosan (DAC 95%); setiltrimetilamonium bromida (CTAB); 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES); 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT); asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat; kalium bromida (kemurnian spektral, 99,5%); N-hydroxysuccinimide (NHS) dan DOX dibeli dari Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). Asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat dipasok oleh Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, Cina). Media kultur sel DMEM, penisilin-streptomisin, dan serum sapi janin (FBS) dipasok oleh GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA). Semua reagen analitis tidak dimurnikan lebih lanjut sebelum digunakan.
Persiapan HMSS–N=N–CS
Persiapan HMSS–NH2
Nanopartikel HMSS disiapkan berdasarkan karya yang diterbitkan menggunakan metode etsa selektif [36]. Bola silika padat pertama kali disintesis dengan metode Stober yang dimodifikasi. Secara singkat, 6 mL TEOS dituangkan ke dalam campuran 10 mL air deionisasi, 74 mL etanol, dan 3 mL NH3 pekat3 ·H2 O. Selanjutnya, campuran diaduk selama 60 menit untuk mendapatkan suspensi silika koloid pada suhu kamar. Bola padat disentrifugasi, dicuci, dan dikeringkan untuk digunakan lebih lanjut. Kemudian, cangkang silika mesopori ditutup pada bola silika padat. Tiga ratus miligram silika padat didispersikan dalam 50 mL air deionisasi dengan ultrasonikasi selama 45 menit. Dan suspensi silika dituangkan ke dalam campuran 60 mL etanol, 450 mg CTAB, 90 mL air, dan 1,7 mL NH3 ·H2 O. Setelah campuran diaduk selama 60 menit, TEOS (0,75 mL) ditambahkan. Selanjutnya, nanopartikel disentrifugasi setelah diaduk selama 6 h untuk mengumpulkan sampel dan kemudian didispersikan kembali dalam 40 mL air. Tentang 1.2 g Na2 CO3 ditambahkan ke dalam suspensi air dengan pengadukan kuat. Setelah campuran dipertahankan pada 55 ° C selama 12 jam, produk nanopartikel HMSS dikumpulkan dan dicuci dengan etanol anhidrat. Metode pasca sambung dengan perbandingan HMSS dan APTES 4:1 (m/v) untuk pembuatan HMSS–NH2 pada 80 °C di bawah N2 kondisi untuk 8 h, untuk CTAB telah dihapus oleh refluks [3].
Persiapan HMSS–N=N–COOH
Asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat (50 mg) ditambahkan pada pH 5,8 PBS. Kemudian (5 mg/mL), EDC dan (3 mg/mL) NHS ditambahkan untuk mengaktifkan asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat pada suhu 30 °C selama 1 jam. Dan 10 mL PBS yang mengandung 15 mg/mL HMSS–NH2 ditambahkan, dan campuran diaduk selama 24 jam. Dan HMSS–N=N–COOH yang dihasilkan dipisahkan dengan sentrifugasi dan dicuci dengan etanol.
Persiapan HMSS–N=N–CS
0,15 g CS dan 0,5 mL asam asetat ditambahkan dalam 50 mL air untuk membuat larutan CS. Dan 100 mg HMSS–N=N–COOH didispersikan dalam 25 mL pH 5,0 PBS dan diaktifkan oleh EDC dan NHS selama 0,5 h. Kemudian, larutan CS (10 mL) dituangkan ke dalam suspensi dengan pengadukan terus menerus selama 1 hari. Akhirnya, HMSS–N=N–CS yang disintesis disentrifugasi dan dicuci untuk mengumpulkan sampel.
Ekstraksi Campuran Enzim Kolon dari Mikroflora
Mikroflora kolon dikumpulkan menurut sebuah karya yang diterbitkan [37]. Kemudian, kultur diinokulasi untuk mendapatkan campuran enzim yang disekresikan oleh mikroflora kolon pada suhu 37 °C. Media kolon simulasi yang mengandung campuran enzim disaring melalui filter 0,22 m untuk menghilangkan semua puing seluler dari cairan kultur. Filtrat selanjutnya diliofilisasi untuk mendapatkan campuran enzim dalam bentuk bubuk, yang digunakan dalam penelitian selanjutnya.
Proses Pemuatan Obat dan Pelepasan Respons Enzim
Dua puluh lima miligram DOX dilarutkan dalam 5 mL pH 3,5 larutan HCl. Dan 100 mg HMSS–N=N–CS ditambahkan dalam larutan DOX dan diaduk pada suhu sekitar selama 12 h. Selanjutnya, larutan NaOH 0,2 M digunakan untuk mengatur pH campuran menjadi 7,0, dan suspensi diaduk selama 12 h lagi. Kemudian, HMSS–N=N–CS yang dimuat DOX (disebut HMSS–N=N–CS/DOX) disentrifugasi dan dicuci untuk menghilangkan DOX yang teradsorpsi pada permukaan HMSS–N=N–CS. Supernatan dikumpulkan pada setiap langkah untuk mengukur efisiensi pemuatan DOX (LE) pada 480 nm dengan spektrofotometri UV-Vis. Massa total DOX yang dimuat dalam HMSS–N=N–CS dihitung dengan mengurangkan DOX yang diturunkan setelah proses pemuatan obat dari massa awal DOX yang ditambahkan. HMSS/DOX disiapkan sebagai kontrol menggunakan HMSS sebagai pembawa awal. LE DOX dihitung menurut persamaan:
Di mana mA adalah massa tambahan DOX, mB adalah massa DOX dalam supernatan, dan mC adalah massa total HMSS–N=N–CS.
Pelepasan DOX yang responsif terhadap enzim secara in vitro dari HMSS–N=N–CS/DOX dievaluasi sebagai berikut. Dua miligram HMSS–N=N–CS/DOX dan HMSS/DOX nanopartikel didispersikan pada pH 7,4 PBS yang dikocok pada 125 rpm dengan konsentrasi campuran enzim kolon yang berbeda (0 mg/mL, 0,3 mg/mL, dan 1 mg/mL) . Pada interval waktu tertentu, media pelepasan 1 mL diambil untuk mengukur absorbansi. Pelepasan DOX diukur pada 480 nm. HMSS/DOX digunakan sebagai kontrol.
Adsorpsi BSA
Jumlah adsorpsi BSA dievaluasi berdasarkan karya-karya yang diterbitkan [38, 39]. BSA ditambahkan pada pH 7,4 PBS (0,5 mg/mL). Lima miligram HMSS dan HMSS–NH2 dan HMSS–N=N–CS ditambahkan ke dalam 2.5 mL PBS (pH 7,4). Dan larutan BSA dengan volume yang sama disuplai, dan suspensi ditempatkan dalam shaker pada 100 rpm. Setelah 6 h, sentrifugasi digunakan untuk mengumpulkan solusi atas. Akhirnya, konsentrasi BSA diukur pada 595 nm setelah diwarnai dengan larutan biru cemerlang Coomassie.
Karakterisasi
Struktur jaringan mesopori dan morfologi nanopartikel HMSS dievaluasi dengan gambar TEM (EM-208S, CSIS, USA). Luas permukaan dan distribusi ukuran pori nanopartikel dikarakterisasi menggunakan analisa adsorpsi nitrogen (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Potensi dan ukuran partikel dikarakterisasi pada Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK). Analisis TGA diukur pada peralatan TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Jepang) dengan laju pemanasan 10 °C/menit di bawah aliran nitrogen. Spektrofotometri inframerah transformasi Fourier (FT-IR) diukur menggunakan spektrometer FT-IR (Bruker Tensor27, Swiss). Rentang dilakukan dari 400 hingga 4000 cm
−1
menggunakan teknik pelet KBr. Power XRD dilakukan pada difraktometer sinar-X Siemens D5005 (Karlsruhe, Jerman) dengan radiasi Cu-Kα (λ =1,5418 Å).
Eksperimen Kultur Sel dan Serapan Sel
Sel Caco-2 dikultur dalam media yang dilengkapi dengan 10% FBS, 1% asam amino nonesensial, 1% (v/v) natrium asam piruvat, dan 1% streptomisin. Sel NIH-3T3 dikultur dalam DMEM dengan 1% streptomisin dan 10% FBS. Serapan sel Caco-2 dari nanocarrier dikarakterisasi menggunakan FCM dan CLSM. Sel Caco-2 diunggulkan ke dalam pelat 24-sumur. Setelah dikultur selama semalam, DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diprainkubasi dengan nanopartikel enzim kolon (sama dengan konsentrasi 5 μg/mL DOX) ditambahkan ke sumur yang sesuai . Setelah inkubasi lanjutan selama 2 jam, media sel dihilangkan dan dicuci bersih dengan PBS. Kemudian, sel-sel difiksasi dengan formaldehida 4% dan diwarnai dengan Hoechst 33258 untuk pengamatan CLSM. FCM digunakan untuk mendapatkan evaluasi kuantitatif serapan seluler. Sel Caco-2 diunggulkan dalam pelat 6-sumur dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Setelah dicuci dengan PBS, sel Caco-2 diinkubasi dengan DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang dipreinkubasi dengan nanopartikel enzim kolon (sama dengan konsentrasi 5 μg/ mL DOX) dalam DMEM bebas serum selama 2 jam. Kemudian, sel Caco-2 dibilas dengan PBS dingin, ditripsinisasi, dan disuspensikan kembali dalam 0,5 mL PBS. Fluoresensi DOX dalam sel diukur menggunakan sitometer aliran Canto FACS (Becton, Dickinson, USA).
Uji Proliferasi Sel In Vitro
Sitotoksisitas pembawa kosong HMSS dan HMSS-N=N-CS terhadap sel NIH-3T3 dan Caco-2 telah dibuktikan dengan uji MTT [40, 41]. Secara singkat, sel Caco-2 dan sel NIH-3T3 secara terpisah diunggulkan dalam pelat 96-sumur dan selanjutnya diinkubasi selama semalam. Media sel lama digantikan oleh media bebas serum yang mengandung konsentrasi nanopartikel yang berbeda. Setelah inkubasi selama 2 hari, 50 μL larutan MTT (2 mg mL
–1
) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam untuk mengukur sel hidup. Kemudian, larutan MTT dihilangkan, dan ditambahkan 150 μL DMSO untuk melarutkan formazan. Selanjutnya, absorbansi diukur pada pembaca lempeng mikro (Tecan, Männedorf, Swiss) pada 570 nm. Sitotoksisitas DOX bebas, HMSS–N=N–CS/DOX, dan HMSS–N=N–CS/DOX yang diprainkubasi dengan campuran enzim yang diekstraksi dari mikroflora kolon diukur menggunakan sel Caco-2 dengan konsentrasi DOX yang sesuai (0,1, 1, 5, 10, dan 20 μg/mL). Waktu inkubasi adalah 48 h, dan proses eksperimen lainnya sama seperti yang dijelaskan di atas.
Studi Toksisitas
Tes iritasi mukosa gastrointestinal sangat penting untuk evaluasi pengiriman obat oral in vivo biosafety. Tikus jantan Sprague–Dawley (180 ± 10 g) secara acak dibagi menjadi tiga kelompok (tiga tikus untuk setiap kelompok). Tikus diberi garam, HMSS, dan nanopartikel HMSS-N=N-CS dengan dosis 100 mg/kg untuk setiap hari. Setelah 7 hari, semua tikus dikorbankan, dan jaringan dikumpulkan dan diperiksa dengan pemeriksaan histopatologi (H&E). Untuk mengevaluasi biosekuriti nanopartikel HMSS dan HMSS-N=N-CS, berat badan tikus BALB/c (18-20 g) dicatat setelah pemberian oral dengan dosis 100 mg/kg setiap hari. Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Qiqihar dan disetujui oleh Komite Etik Universitas Kedokteran Qiqihar.
Statistik
Data statistik dianalisis dengan perangkat lunak SPSS menggunakan dua ekor Student's t -tes. Error bar yang disajikan dalam penelitian ini adalah SD. p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi HMSS–N=N–CS
HMSS disiapkan berdasarkan karya sebelumnya dengan sedikit perubahan [36]. Pertama, SiO padat2 nanospheres disiapkan, dan cangkang mesopori dilapisi pada permukaan nanospheres silika padat yang mengandung template CTAB. Kemudian, Na2 CO3 digunakan untuk secara selektif mengetsa SiO padat2 nanospheres sedangkan cangkang mesopori dilindungi oleh template CTAB. Persiapan HMSS-N=N-CS dengan CS yang terpasang sebagai "penjaga gerbang" oleh hubungan azo dijelaskan pada Gambar. 1a. Pertama, permukaan nanopartikel HMSS dimodifikasi dengan APTES sebagai reagen kopling alkil menjadi HMSS yang berfungsi amino (HMSS–NH2 ) dengan metode pascamodifikasi. Selanjutnya, HMSS–N=N–COOH dibuat dengan reaksi amidasi antara gugus amino HMSS–NH2 dan gugus karboksil dari asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat. Kemudian, CS dimodifikasi secara kovalen ke permukaan nanopartikel HMSS melalui reaksi amidasi antara gugus karboksil HMSS–N=N–COOH dan gugus amino dalam CS.
TEM dari a HMSS dan b HMSS–N=N–CS
Seperti yang ditampilkan dalam gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) pada Gambar. 1a, diameter rata-rata HMSS adalah 280 nm, dan HMSS memiliki struktur berongga yang seragam dan cangkang mesopori yang sangat teratur. Ketebalan cangkang mesopori rata-rata adalah sekitar 90 nm. Dibandingkan dengan permukaan halus HMSS, permukaan polimer cangkok HMSS–N=N–CS (Gbr. 1b) kasar, menunjukkan bahwa CS menutupi pembawa HMSS.
Area permukaan dan distribusi pori bahan mesopori memainkan peran penting dalam memuat dan mengirimkan molekul inang untuk pelepasan terkontrol. Kurva distribusi ukuran pori dan isoterm diukur dengan N2 analisis adsorpsi dan desorpsi (Gbr. 2). Parameter terperinci (luas permukaan Brunauer–Emmett–Teller (BET) (SBET ), volume pori total (VP ), dan distribusi ukuran pori (DP )) ditampilkan pada Tabel 1. SBET dan VP HMSS murni adalah 810.7 m
2
/g dan 0,969 cm
3
/g, masing-masing, dan DP adalah sekitar 3,8 nm. DP dari HMSS–NH2 hampir sama dengan HMSS setelah aminasi, menunjukkan bahwa mesopori tidak diblokir setelah fungsionalisasi amino. SBET dan VP HMSS–N=N–CS sangat menurun setelah dimodifikasi oleh senyawa azo dan lapisan CS, menunjukkan bahwa CS telah melapisi permukaan HMSS [1].
a Isoterm adsorpsi/desorpsi nitrogen dan b distribusi ukuran pori HMSS, HMSS–NH2 , dan HMSS–N=N–CS
Pencangkokan HMSS–N=N–CS yang berhasil diverifikasi dengan berbagai metode. Potensi HMSS–NH2 mengalami perubahan besar setelah fungsionalisasi, bervariasi dari 27,9 hingga + 31,4 mV, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, yang dianggap berasal dari penambahan gugus amina ke permukaan HMSS. Setelah HMSS–NH2 direaksikan dengan asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat untuk membentuk HMSS–N=N–COOH, potensial semakin menurun menjadi 2.0 mV karena adanya gugus karboksil pada permukaan HMSS. Setelah polimer CS dicangkokkan lebih lanjut ke permukaan HMSS untuk membentuk HMSS–N=N–CS, potensi dikembalikan ke + 32.4 mV. Hasilnya dianggap berasal dari lapisan CS bermuatan positif yang berlimpah amino pada permukaan HMSS [1]. Analisis termogravimetri (TGA) kurva HMSS, HMSS–NH2 , HMSS–N=N–COOH, dan spesies HMSS–N=N–CS ditunjukkan pada Gambar 3b. Dibandingkan dengan HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS kehilangan bobot tambahan sekitar 19%, yang disebabkan oleh penghilangan rantai CS. Penyambungan ikatan azo pada permukaan HMSS juga dikonfirmasi dengan perubahan warna selama preparasi HMSS–N=N–COOH, seperti yang ditunjukkan pada sisipan pada Gambar 3b. Reaktan HMSS–NH2 berwarna putih, sedangkan produk HMSS–N=N–COOH berwarna coklat kekuningan setelah asam azobenzena-3,3′-dikarboksilat bereaksi dengan gugus amino HMSS. Diameter hidrodinamik (DH ) dan nilai indeks polidispersitas (PDI) HMSS, HMSS–NH2 , dan HMSS-N=N-CS ditentukan dalam air suling, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3c. HMSS memiliki diameter 309 nm dan PDI 0,190. Setelah penambahan gugus amina pada permukaan HMSS membentuk HMSS–NH2 , DH meningkat menjadi 324 nm. Diameter HMSS–N=N–CS adalah 342 nm, lebih besar dari HMSS–NH2 karena rantai CS yang dicangkokkan. PDI HMSS–N=N–CS (0,177) lebih kecil dari HMSS–NH2 , menunjukkan bahwa ukuran partikel rata-rata menjadi lebih besar setelah pencangkokan CS. Dibandingkan dengan diameter yang diperoleh dari TEM, diameter HMSS dan HMSS–N=N–CS yang diukur dengan DLS lebih besar. DH nanopartikel diukur dalam lingkungan air dengan lapisan hidrasi, sedangkan ukuran nanopartikel yang disediakan oleh TEM diperoleh dari nanopartikel kering [3]. Spektrum FT-IR HMSS–NH2 , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS, dan CS ditunjukkan pada Gambar 4d. Dibandingkan dengan puncak HMSN–NH2 , peningkatan puncak adsorpsi pada 2853 dan 2925 cm
−1
dikaitkan dengan getaran CH2 dalam pencangkokan ikatan azo terminal karboksi. Setelah CS ditambahkan ke permukaan HMSS–N=N–COOH, terjadi peningkatan puncak adsorpsi pada 1660 cm
−1
dan 3435 cm
−1
, yang dikaitkan dengan υ(C=O) di pita amida dan getaran N-H di CS. Semua hasil tersebut membuktikan keberhasilan persiapan HMSS–N=N–CS.
a Potensi yang sesuai dari HMSS, HMSS–NH2 , HMSS–N=N–COOH, dan HMSS–N=N–CS; b Kurva TGA dari HMSS–NH2 , HMSS–N=N–COOH, dan HMSS–N=N–CS (sisipan:foto (a ) HMSS–N=N–COOH dan (b ) HMSS–NH2 ); c Distribusi ukuran HMSS, HMSS–NH2 , dan inset HMSS–N=N–CS:nilai PDI nanopartikel yang sesuai; dan d Spektrum FT-IR HMSS–NH2 , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS, dan CS
Pola XRD DOX, HMSS–N=N–CS, HMSS–N=N–CS/DOX, dan PM
Kondisi Obat dan Efisiensi Pemuatan
DOX dipilih untuk menyelidiki perilaku pemuatan dan pelepasan HMSS–N=N–CS. Ketika nilai pH suspensi nanopartikel HMSS–N=N–CS diatur ke pH 3,5, biopolimer CS menjadi bermuatan positif (pKa CS adalah 6,3) karena gugus amino terprotonasi dalam lingkungan asam [24]. Polimer CS menjadi bermuatan positif dan membengkak, yang mengarah ke pembukaan mesopori HMSS yang dikaitkan dengan interaksi tolak-menolak antara muatan CS. Dengan demikian, DOX memperoleh akses ke mesopori HMSS–N=N–CS melalui difusi. Namun, setelah campuran yang mengandung obat disesuaikan ke 7,4, rantai CS terdeprotonasi dan runtuh untuk menghalangi pelepasan dini DOX.
LE dari HMSS–N=N–CS/DOX adalah 35,2%, yang jauh lebih besar daripada sistem pengiriman silika mesopori bermuatan DOX lainnya [3, 16]. Tingginya LE DOX pada nanocarrier HMSS dikaitkan dengan rongga berongga, luas permukaan yang besar, dan jaringan mesopori, yang dapat digunakan sebagai reservoir obat. Keadaan fisik DOX dalam HMSS–N=N–CS/DOX dievaluasi dengan difraksi sinar-X daya (XRD). Seperti yang ditunjukkan pada profil XRD (Gbr. 4), DOX mentah menunjukkan karakteristik dan puncak difraksi kristal obat yang intens. Campuran fisik (PM) HMSS–N=N–CS dan DOX juga menunjukkan puncak difraksi kristal yang jelas. Namun, tidak ada puncak kristal berbeda yang ditunjukkan oleh HMSS–N=N–CS/DOX, yang membuktikan bahwa keadaan fisik DOX dalam HMSS–N=N–CS/DOX adalah nonkristalin karena kendala struktur mesopori HMSS.
Pelepasan Respons Enzim In Vitro di Lingkungan Kolon yang Disimulasikan
Untuk menyelidiki pelepasan HMSS-N=N-CS yang responsif-enzim, nanopartikel HMSS-N=N-CS/DOX dan HMSS/DOX ditambahkan ke pH 7,4 PBS dengan konsentrasi campuran enzim kolon yang berbeda. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 5a, HMSS–N=N–CS/DOX menunjukkan pelepasan DOX yang lambat dalam PBS pada pH 7,4, dan persentase pelepasan kumulatif hanya sekitar 10% dalam 24 jam, menunjukkan kemampuan capping yang baik dari CS polimer dan ikatan azo. Seperti yang diharapkan, dalam kasus enzim encer dalam PBS pada pH 7,4, pelepasan kumulatif DOX ditingkatkan menjadi lebih dari 20% dalam periode yang sama. Selain itu, jumlah pelepasan DOX secara dramatis meningkat menjadi hampir 40% dengan adanya enzim terkonsentrasi. Dibandingkan dengan pelepasan enzim-responsif dari HMSS–N=N–CS/DOX, pelepasan DOX dari HMSS/DOX memiliki tren yang sama di ada atau tidak adanya enzim terkonsentrasi. Persentase pelepasan obat yang relatif rendah disebabkan oleh interaksi elektrostatik antara HMSS yang bermuatan negatif dan DOX yang bermuatan positif [42]. Hasil di atas membuktikan bahwa pelepasan DOX dari HMSS–N=N–CS/DOX dipercepat secara nyata oleh enzim yang diekstraksi dari mikroflora di daerah kolon. Mekanisme pelepasan enzim-responsif bisa jadi ikatan azo di HMSS–N=N–CS didegradasi oleh enzim, menyebabkan pelepasan CS dari permukaan HMSS dan pelepasan cepat dari HMSS. Ikatan azo telah dilaporkan dipecah oleh enzim yang disekresikan oleh mikroflora kolon [34, 35].
a Profil pelepasan kumulatif HMSS/DOX dan HMSS–N=N–CS/DOX pada pH 7,4 PBS dengan adanya campuran enzim kolon pekat dan encer; dan b perilaku pelepasan DOX yang responsif terhadap pH in vitro dari HMSS–N=N–CS dalam media pelepasan dengan nilai pH yang berbeda
Selain itu, untuk mengevaluasi lebih lanjut pelepasan responsif-enzim dari HMSS–N=N–CS/DOX di lingkungan GIT mimetik, platform nano HMSS–N=N–CS/DOX awalnya didispersikan dalam SGF selama 2 h dan kemudian didispersikan lebih lanjut dalam SIF selama 6 h, dan akhirnya, pembawa ditambahkan ke pH 7,4 PBS yang mengandung 1 mg/mL enzim yang diekstraksi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, dalam jus lambung yang disimulasikan, pelepasan DOX relatif cepat, dan jumlah kumulatif mencapai 15% dalam 2 jam. Pelepasan yang relatif cepat disebabkan oleh interaksi yang lebih lemah antara HMSS-N=N-CS dan DOX dalam kondisi asam daripada dalam kondisi netral [1]. Kemudian, pelepasan DOX diperlambat dalam SIF selama 2-8 h. Namun, setelah HMSS–N=N–CS/DOX diinkubasi dengan enzim yang diekstraksi pada pH 7,4 PBS, pelepasan DOX terus meningkat secara nyata, dan jumlah pelepasan kumulatif mencapai lebih dari 50% dalam 24 jam. Pelepasan DOX yang tidak lengkap dari HMSS–N=N–CS/DOX disebabkan oleh interaksi yang kuat antara DOX yang bermuatan positif dan HMSS yang bermuatan negatif.
Adsorpsi Protein oleh dan Stabilitas HMSS–N=N–CS
Untuk pemberian oral, sifat permukaan nanocarrier akan mempengaruhi perilaku pelepasan obat dan bioadsorpsi [43]. Uji adsorpsi protein pada permukaan digunakan untuk mengevaluasi efek CS yang dicangkokkan pada permukaan HMSS. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 6a, nanocarrier HMSS telanjang memiliki adsorpsi BSA dramatis hingga 16,5%, yang dikaitkan dengan luas permukaan yang besar dan rongga berongga HMSS, kemampuan adsorpsi yang kuat, dan interaksi nonspesifik antara kelompok silanol HMSS dan BSA [ 38, 39]. Selain itu, HMSS–NH2 sama memiliki jumlah BSA teradsorpsi yang relatif tinggi yaitu 10,2%. Namun demikian, persentase BSA yang teradsorpsi pada permukaan secara nyata menurun menjadi 2,5% setelah polimer CS ditambahkan sebagai penutup, sehingga secara dramatis mengurangi efek pada perilaku in vivo HMSS–N=N–CS. Untuk mengamati lebih lanjut stabilitas sampel HMSS–N=N–CS dan HMSS, 20 mg HMSS–N=N–CS dan HMSS ditambahkan ke pH 7,4 PBS dan air deionisasi. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.
a BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH2 and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL
Cellular Uptake
Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.
a CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)
In Vitro Cell Viability Evaluation
To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.
Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h
The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. IC50 value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. IC50 value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC50 value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.
Toxicity Studies
The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.
a Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)
Kesimpulan
In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC50 value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.
