Longitudinal Zeolite-Iron Oxide Nanocomposite Deposited Capacitance Biosensor for Interleukin-3 dalam Deteksi Sepsis
Abstrak
Sepsis adalah kondisi ekstrem yang melibatkan respons fisik terhadap infeksi mikroba parah dan menyebabkan masalah yang fatal dan mengancam jiwa. Sepsis dihasilkan selama pelepasan bahan kimia dengan sistem kekebalan ke dalam aliran darah untuk melawan infeksi, yang menyebabkan peradangan dan mengarah ke keadaan darurat medis. Zeolit memanjang kompleks dan nanokomposit besi oksida diekstraksi dari abu terbang tambang batubara dan digunakan untuk meningkatkan karakteristik permukaan biosensor kapasitansi untuk mengidentifikasi serangan sepsis. Antibodi anti-interleukin-3 (anti-IL-3) dilekatkan pada permukaan elektroda kapasitansi kompleks zeolit dan besi oksida melalui penghubung amina untuk berinteraksi dengan biomarker sepsis IL-3. Komponen morfologi dan kimia dari nanokompleks diselidiki dengan analisis FESEM, FETEM, dan EDX. Pada sekitar 30 nm, zeolit longitudinal dan nanokomposit besi oksida membantu mencapai batas deteksi IL-3 sebesar 3 pg/mL pada kurva linier, dengan koefisien regresi (R
2
) dari 0,9673 [y = 1.638x 1.1847]. Batas deteksi yang lebih rendah dicapai dalam rentang yang bergantung pada dosis (3–100 pg/mL) karena jumlah imobilisasi antibodi yang lebih tinggi pada permukaan penginderaan karena bahan nano dan arus permukaan yang ditingkatkan. Lebih lanjut, eksperimen kontrol dengan biomolekul yang relevan tidak menunjukkan perubahan kapasitansi, dan peningkatan kapasitansi IL-3 dalam serum manusia, menunjukkan deteksi spesifik dan selektif IL-3. Studi ini mengidentifikasi dan mengukur IL-3 melalui metode yang berpotensi berguna dan membantu dalam mendiagnosis serangan sepsis.
Pengantar
Sepsis adalah kondisi fatal yang terjadi ketika tubuh merespons infeksi secara parah [1]. Karena serangan sepsis, tubuh menghasilkan tingkat biomolekul pensinyalan yang lebih tinggi yang disebut 'sitokin', yang menarik sel-sel kekebalan. Peningkatan jumlah sel-sel ini mengeluarkan lebih banyak sitokin, dan badai sitokin merekrut lebih banyak sel imun. Alih-alih mengendalikan infeksi awal, faktor kekebalan menyerang organ dan jaringan tubuh. Selanjutnya, infeksi ini memicu reaksi berantai di seluruh tubuh dan menyebabkan kegagalan organ dan kerusakan jaringan [2]. Secara khusus, sepsis dimulai di paru-paru, kulit, saluran kemih dan saluran pencernaan dan menyebar secara luas.
ke organ lain, yang menyebabkan cedera organ. Oleh karena itu, perlu untuk menghentikan proses lebih awal untuk mencegah serangan pada organ lain. Identifikasi sepsis pada tahap awal dengan biomarker yang sesuai membantu memberikan pengobatan yang cepat kepada pasien dan menyelamatkan nyawa. Para peneliti menemukan bahwa faktor inflamasi interleukin-3 (IL-3) merupakan prediktor independen dari serangan sepsis dan kematian yang dihasilkan oleh sel B aktivator respon bawaan (IRA) setelah aktivasi reseptor seperti Toll. Lebih lanjut, ditemukan bahwa tingkat IL-3 yang lebih tinggi dikaitkan dengan tingkat kematian yang lebih tinggi pada pasien sepsis dan menegaskan bahwa IL-3 memainkan peran utama dalam regulasi kekebalan dan respons yang lebih tinggi terhadap kortikosteroid selama sepsis. Penelitian ini bertujuan untuk mengukur kadar IL-3 menggunakan sensor elektrokimia kapasitansi zeolit-besi oksida (zeolit-besi) termodifikasi nanokomposit.
Deteksi biomolekul dengan biosensor sangat bergantung pada imobilisasi target atau molekul pendeteksi pada permukaan elektroda transduser [3]. Jumlah yang lebih tinggi dari probe penangkap yang tidak bergerak dengan orientasi yang tepat mengarah ke batas deteksi target yang lebih rendah [4]. Dalam kebanyakan kasus, imobilisasi probe penangkapan telah dilakukan melalui adsorpsi fisik, interaksi elektrostatik, ikatan kovalen, dan jebakan biomolekul dengan polimer [5, 6]. Mungkin sulit untuk mencapai reproduktifitas dan biokompatibilitas biomolekul amobil dengan metode imobilisasi di atas. Secara khusus, perlekatan molekul penangkap yang lebih kecil seperti RNA, DNA, aptamer, dan peptida ke permukaan penginderaan rumit [7, 8]. Berbagai peneliti telah menggunakan teknik yang berbeda untuk imobilisasi yang efisien. Baru-baru ini, nanomaterial sangat menarik untuk digunakan dalam proses imobilisasi biomolekuler pada permukaan penginderaan [9,10,11]. Nanopartikel emas telah diimobilisasi secara efisien pada berbagai permukaan penginderaan, seperti substrat ELISA polistiren dan elektroda aluminium, dan telah menangkap molekul potensial, termasuk antibodi, protein, DNA, dan aptamers. Selain silika, aluminium dan graphene adalah bahan yang biasa digunakan untuk imobilisasi biomolekul. Nanomaterials ini meningkatkan jumlah molekul penangkap dan menghasilkan biokompatibilitas dan stabilitas biomolekul pada permukaan penginderaan, yang membantu meningkatkan strategi deteksi. Baru-baru ini, bahan anorganik seperti zeolit, tanah liat, dan sol-gel telah menarik perhatian para peneliti untuk memecahkan masalah ini. Selain itu, sintesis bahan nano dengan pendekatan yang lebih ramah lingkungan telah didorong karena keuntungan terkait yang besar, seperti tidak melibatkan bahan berbahaya dan lebih murah [12,13,14,15]. Selanjutnya, pendekatan yang disesuaikan dapat digunakan untuk mencapai ukuran dan bentuk material nano yang diinginkan. Studi saat ini sejalan dengan pendekatan ini dan menghasilkan nanomaterial zeolit dikombinasikan dengan besi terisolasi untuk membuat nanokomposit.
Zeolit adalah aluminosilikat mikro berpori kristal yang terdiri dari TO4 tetrahedra dan atom O [16]. Ini adalah bahan yang menjanjikan untuk imobilisasi biomolekul karena luas permukaannya yang lebih besar, kemampuan untuk pertukaran ion, hidrofobisitas / hidrofilisitas yang dapat dikontrol, dan konduktivitas mekanik dan termal yang tinggi. Oleh karena itu, berbagai penelitian di bidang biosensor telah dilakukan dengan menggunakan bahan zeolit untuk proses imobilisasi biomolekuler dan mencapai batas deteksi yang lebih rendah untuk mengembangkan biosensor seperti sensor glukosa dan sensor urea [17,18,19]. Demikian pula, nanomaterial besi meningkatkan efek sifat pertukaran kation dan memberikan respon cepat terhadap perubahan saat ini pada interaksi dengan biomolekul. Nanokomposit zeolit-besi oksida dengan komposisi unik yang digunakan dalam penelitian ini meningkatkan kinerja sensor yang tinggi, yang selanjutnya memberikan peningkatan sensitivitas karena peningkatan konduktivitas. Penelitian ini berfokus pada nanomaterial zeolit-besi yang diekstraksi dari abu layang tambang batubara dan memanfaatkannya sebagai substrat elektroda kapasitansi untuk melumpuhkan probe penangkap yang merupakan antibodi anti-IL-3. Dibandingkan dengan deteksi sebelumnya yang dimediasi nanomaterial dari interleukin yang berbeda [20,21,22], sistem penginderaan saat ini memberikan peningkatan dalam beberapa cara. Misalnya, kesesuaiannya yang lebih tinggi untuk sensor elektrokimia memerlukan langkah eksperimental yang lebih sedikit, dan ini menunjukkan kesesuaian untuk fungsionalisasi kimia permukaan dan kemampuan nonfouling yang tinggi.
Biosensor kapasitif adalah sensor elektrokimia yang dibuat dengan mendaftarkan daya tarik antara probe dan target yang berinteraksi pada permukaan elektroda. Sebuah biosensor kapasitif membantu mengukur perubahan lapisan dielektrik pada antarmuka elektroda ketika biomolekul target mengikat dengan probe bergerak pada permukaan penginderaan [23]. Kapasitansi antara elektroda dan elektrolit digambarkan oleh C = (2nε0εA )/d , di mana ε :konstanta dielektrik, A :luas permukaan pelat, ε0 :permitivitas ruang kosong, n :jumlah jari berulang, dan d :ketebalan lapisan isolasi [24, 25]. Sebuah biosensor kapasitif nonfaradic membantu menghindari denaturasi protein yang disebabkan oleh metalisasi dan meningkatkan interaksi target dan pengikatan probe [26, 27]. Berbagai penelitian telah memanfaatkan biosensor kapasitif untuk mengidentifikasi berbagai molekul target, termasuk nukleotida, logam berat, protein dan molekul organik [23, 28,29,30,31]. Pada penelitian ini dilakukan percobaan biosensor kapasitansi nonfaradik pada permukaan elektroda termodifikasi zeolit-besi. Zeolit-besi dilekatkan pada elektroda kapasitansi melalui (3-aminopropil)-trimethoxysilane sebagai amine linker, dan kemudian anti-IL-3 melekat pada permukaan melalui gaya tarik antara permukaan amina dan gugus karboksilat (COOH) dari antibodi. Elektroda anti-IL-3 yang dimodifikasi antibodi digunakan untuk mengukur IL-3 dan mendiagnosis serangan sepsis.
Bahan dan Metode
Peralatan dan Reagen
Fly ash diterima dari pembangkit listrik termal di India. Natrium hidroksida dan asam sulfat dibeli dari Sigma Aldrich (Missouri, USA). (3-Aminopropil)-trimethoxysilane (APTMS) diterima dari Merck (NJ, USA). Kertas saring Whatman diperoleh dari Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, USA). Antibodi IL-3 dan anti-IL-3 diterima dari Santa Cruz Biotechnology (Texas, USA). Mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Jepang) dan mikroskop elektron transmisi emisi lapangan (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Jepang) digunakan untuk menganalisis bahan nano zeolit-besi dengan metode yang diuraikan sebelumnya [ 32].
Sintesis Nanomaterial Zeolit-Besi
Nanomaterial zeolit-besi disintesis menggunakan besi, silika, dan alumina yang diekstraksi dari abu layang. Tiga langkah utama berikut terlibat dalam prosedur ini:(1) pemisahan partikel besi; (2) ekstraksi natrium aluminosilikat; dan (3) preparasi nanopartikel zeolit-besi dengan metode sintesis sol-gel.
Pemisahan Besi dari Fly Ash
Sebanyak 25 g abu layang dicampur dengan 500 L air suling dan diaduk selama 30 menit menggunakan pengaduk magnet. Partikel besi yang menempel pada pengaduk magnet dipisahkan, kemudian 1 g partikel yang dipisahkan dicampur dengan asam sulfat 25% dan diaduk selama 1 jam pada suhu 50 °C. Kemudian, larutan yang mengandung besi dan partikel besi dipisahkan dengan kertas saring Whatman dan digunakan sebagai dasar oksida besi untuk mensintesis zeolit-besi nanomaterial.
Ekstraksi Sodium Aluminosilikat dari Fly Ash
Metode ekstraksi alkali digunakan untuk mengekstraksi natrium aluminosilikat dari fly ash dengan metode ekstraksi alkali [33]. Pertama, 25 g abu layang yang dipisahkan besi dicampur dengan 500 L natrium hidroksida 2 M dan dipanaskan pada suhu 100 °C sambil diaduk selama 6 jam. Setelah larutan didinginkan, natrium aluminosilikat (larutan dalam campuran) dipisahkan dengan kertas saring Whatman. Larutan hasil penyaringan tersebut digunakan sebagai bahan dasar untuk mensintesis zeolit.
Zeolite-Besi Nanomaterial Disintesis dengan Metode Sol–Gel
Ekstraksi besi dan natrium aluminosilikat digunakan sebagai bahan dasar untuk mensintesis nanomaterial besi zeolit dengan metode sol-gel. Pada langkah pertama, sebuah gelas kimia yang berisi 200 mL natrium aluminosilikat pada pH 12 ditempatkan di atas hotplate sambil diaduk. Kemudian larutan dititrasi dengan larutan besi pada pH 1 dengan menambahkan larutan besi sedikit demi sedikit hingga mencapai pH 7. Pada pH 7 terbentuk gel berwarna putih, dan gel ini diaduk terus menerus selama semalam untuk mendapatkan nanopartikel zeolit-besi yang terdistribusi secara merata. . Keesokan harinya, gel dipisahkan dengan sentrifugasi (10.000×g selama 10 menit) dan kemudian dicuci dengan etanol 25% dan air suling. Produk akhir dikeringkan pada 100 °C selama 1 jam untuk mendapatkan bubuk yang terdiri dari nanomaterial zeolit-besi. Permukaan nanomaterial zeolit-besi dikarakterisasi dengan FETEM dan FESEM. Analisis energi-dispersive X-ray (EDX) juga dilakukan untuk mengidentifikasi unsur-unsur dalam zeolit-besi.
Modifikasi Amina Zeolit-Besi dan Fungsionalisasi Permukaan Elektroda Kapasitansi
Amina dilapisi ke permukaan besi zeolit oleh agen kopling silan APTMS. Untuk ini, 1 g zeolit-besi dicampur dengan KOH 1% selama 10 menit, dan kemudian kelebihan KOH dihilangkan dengan air suling. Setelah itu, zeolit-besi yang diberi perlakuan KOH dicampur dengan 1% APTMS, dan campuran ditempatkan pada pengaduk yang dipanaskan semalaman. Keesokan harinya, nanomaterial dicuci dengan etanol dan dipisahkan dengan sentrifugasi (10.000×g selama 10 menit). APTMS-zeolit-besi ini ditempelkan pada permukaan elektroda kapasitansi untuk mengidentifikasi IL-3. Untuk imobilisasi ini, APTMS-zeolit-besi dijatuhkan pada elektroda terhidroksilasi dan disimpan di RT selama 3 jam. Ikatan antara nanokomposit zeolit-besi oksida, APTMS dan permukaan penginderaan adalah karena kopling silan dengan kelompok oksida yang dihasilkan. Secara umum, kopling silan terjadi dengan beberapa lengan yang tersedia untuk kelompok oksida, menghasilkan hubungan antara nanokomposit zeolit-besi oksida, APTMS dan permukaan penginderaan. Karena hubungan ganda ini, pengaturan spasial pada permukaan penginderaan terbentuk. Setelah mencuci permukaan dengan etanol diikuti dengan air, proses imobilisasi antibodi anti-IL-3 dilakukan untuk berinteraksi dengan IL-3.
Penentuan IL-3 pada Permukaan Elektroda Kapasitansi Modifikasi Anti-IL-3
Permukaan yang dijelaskan di atas dibentuk oleh penambatan amina, yang memungkinkan reaksi dengan gugus COOH yang tersedia saat antibodi menempel. IL-3 diidentifikasi pada permukaan elektroda kapasitansi amobil anti-IL-3. Untuk ini, IL-3 pada 100 pg/mL diencerkan dalam buffer PBS dan dijatuhkan ke permukaan elektroda yang dimodifikasi antibodi. Setelah imobilisasi antibodi, permukaan tidak terikat yang tersisa diblokir oleh PEG-COOH (1 mg/ml). Reaksi serupa terhadap antibodi-APTMS terjadi ketika PEG-COOH terpasang. Nilai kapasitansi dicatat sebelum dan sesudah berinteraksi dengan IL-3. Perbedaan nilai dipertimbangkan untuk pengikatan IL-3 dengan antibodinya. Selanjutnya, untuk menghitung batas deteksi, IL-3 dititrasi dari 3 hingga 50 pg/mL dan dijatuhkan secara independen ke permukaan yang dimodifikasi antibodi. Prosedur eksperimental lainnya dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Perbedaan nilai kapasitansi untuk setiap konsentrasi IL-3 dihitung dan diplot untuk menghitung deteksi IL-3 dengan R
2
nilai. Ketika IL-3 dilekatkan pada permukaan yang diimobilisasi antibodi, akan ada interaksi asli.
Penentuan Biofouling dan Selektif IL-3 pada Permukaan Elektroda Kapasitansi Modifikasi Zeolit-Besi
Eksperimen biofouling dilakukan di bawah tiga kondisi biomolekul yang berbeda, termasuk adanya antibodi nonimun atau protein kontrol dan tidak adanya antibodi IL-3. Dalam kasus pertama, sebagai ganti antibodi IL-3, antibodi nonimun digunakan; dalam percobaan kedua, sebagai ganti IL-3, protein kontrol digunakan; dan percobaan terakhir dilakukan tanpa antibodi IL-3. Nilai kapasitansi dibandingkan untuk interaksi spesifik antibodi IL-3 dengan IL-3. Eksperimen selektif dilakukan dengan spiking IL-3 dalam pengenceran 1:100 serum manusia dan menambahkannya tetes demi tetes ke permukaan elektroda yang dimodifikasi anti-IL-3. Perubahan kapasitansi dicatat untuk setiap konsentrasi IL-3 untuk mengidentifikasi identifikasi selektif IL-3. Reproduksibilitas dikonfirmasi dengan mengulangi percobaan tiga kali (dalam rangkap tiga) dengan perangkat serupa yang dibuat dari fabrikasi batch yang sama. Penyimpanan seumur hidup dan stabilitas permukaan yang diimobilisasi probe juga ditentukan.
Hasil dan Diskusi
Sepsis adalah kondisi dengan banyak bahan kimia yang dilepaskan dalam sistem kekebalan tubuh, dan memicu peradangan yang meluas dengan kerusakan organ yang paling parah. Gambar 1a menunjukkan ilustrasi skema identifikasi IL-3 pada permukaan elektroda kapasitansi yang dimodifikasi anti-IL-3 untuk menentukan kondisi yang terkait dengan sepsis. Zeolit-besi termodifikasi APTMS digunakan untuk menempelkan antibodi penangkap ke permukaan elektroda penginderaan. APTMS pada permukaan zeolit-besi diimobilisasi pada permukaan elektroda melalui interaksi antara amina pada nanomaterial dengan gugus OH pada permukaan elektroda. Gambar 1b mengonfirmasi keutuhan elektroda permukaan pada sensor kapasitansi, seperti yang ditangkap di bawah mikroskop daya tinggi. Antibodi dihubungkan ke permukaan melalui COOH dan amina dari besi zeolit. Zeolit-besi membantu melampirkan jumlah APTMS yang lebih tinggi pada elektroda penginderaan, yang membantu menangkap lebih banyak antibodi pada permukaan elektroda kapasitansi. Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa imobilisasi probe penangkapan pada permukaan penginderaan memainkan peran penting dalam menurunkan batas deteksi molekul target. Dalam penelitian ini, nanomaterial zeolit-besi digunakan untuk menempelkan antibodi anti-IL-3 pada permukaan elektroda penginderaan. Imobilisasi antibodi anti-IL-3 yang lebih tinggi dengan orientasi yang tepat membantu mencapai batas deteksi IL-3 yang lebih rendah.
a Ilustrasi skema identifikasi IL-3 pada permukaan penginderaan kapasitansi yang dimodifikasi anti-IL-3. Zeolit-besi termodifikasi APTMS digunakan untuk menempelkan antibodi penangkap dan kemudian berinteraksi dengan IL-3. PEG-COOH digunakan sebagai agen pemblokiran. b Analisis morfologi permukaan penginderaan kapasitansi dengan mikroskop daya tinggi. c Analisis morfologi zeolit-besi dengan FESEM. Nanomaterials dibentuk dengan distribusi yang seragam dan dalam dimensi longitudinal. d analisis EDX. Ditemukan adanya unsur utama Si, Al, Fe, dan O. Sisipan gambar diperoleh dengan FESEM dengan perbesaran rendah
Analisis Morfologi Nanomaterial Zeolit-Besi oleh FESEM dan FETEM
Gambar 1c, d (inset) menampilkan gambar morfologi nanomaterial zeolit-besi yang diperoleh dari FESEM pada perbesaran berbeda dan analisis unsur EDX. Bahan nano zeolit-besi yang diperoleh halus dan terdistribusi secara merata, dengan struktur nano longitudinal yang ditumpuk rapat. Ukuran struktur nano ini adalah ~ 30 nm, dan gambar yang diperoleh menunjukkan bahwa nanokomposit tersusun dengan bentuk yang seragam dan terdistribusi dengan baik pada jarak yang tepat. Gambar FETEM juga membuktikan bentuk yang serupa dengan yang diperoleh FESEM untuk nanokomposit besi-zeolit yang terbentuk (Gbr. 2a, b). Hasil EDX mengkonfirmasi adanya Fe, Al, Si, dan O dalam nanokomposit zeolit-besi yang disintesis (Gbr. 2c, d). Persentase atom unsur utama dari Si, Al, Fe dan O ditemukan masing-masing sebesar 3,46, 0,78, 2,13 dan 24,39%. Hasil FESEM dan EDX ini mengkonfirmasi pembentukan material nano zeolit-besi.
Gambar FETEM dari zeolit-besi di a skala 50 nm dan b skala 200 nm. Nanomaterial dibentuk dengan distribusi yang seragam. c Analisis EDX mengkonfirmasi adanya unsur utama Si, Al, Fe, C, dan O
Preparasi Sensor Sensor untuk Penentuan IL-3
Imobilisasi antibodi anti-IL-3 pada biosensor kapasitansi dikonfirmasi dengan mengubah tingkat kapasitansi setelah setiap imobilisasi biomolekuler. Gambar 3a menunjukkan perubahan kapasitansi selama proses penempelan antibodi pada permukaan yang dimodifikasi zeolit-besi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, permukaan elektroda kapasitansi yang ditambatkan KOH menunjukkan nilai kapasitansi 1,74 × 10
09
nF, dan setelah penambahan tetes demi tetes APTMS-zeolit-besi, meningkat menjadi 2,02 × 10
09
nF. Peningkatan kapasitansi ini mengkonfirmasi lampiran bahan nano ke elektroda penginderaan. Selanjutnya, setelah menambahkan antibodi anti-IL-3, nilai kapasitansi meningkat drastis menjadi 3,42 × 10
09
nF. Peningkatan yang lebih tinggi ini dicatat karena jumlah imobilisasi antibodi yang lebih tinggi pada besi zeolit yang dimodifikasi APTMS. Selain itu, bahan nano menunjukkan pengaturan yang tepat dengan jumlah APTMS yang lebih tinggi pada permukaan elektroda penginderaan, yang pada akhirnya menarik lebih banyak antibodi. Akhirnya, PEG-COOH ditambahkan untuk tujuan pemblokiran, dan kapasitansi ditemukan meningkat menjadi 3,64 × 10
09
nF. Sensor bekerja berdasarkan perubahan muatan permukaan dan, pada akhirnya, perubahan kapasitansi. Perubahan muatan permukaan bervariasi dengan perlekatan/interaksi molekul. Setiap molekul membawa muatan yang berbeda dan mempengaruhi kapasitansi sensor. Oleh karena itu, perbedaan kapasitansi dipertimbangkan untuk pengukuran. Perubahan kapasitansi yang lebih tinggi dicatat karena hunian yang lebih tinggi dari antibodi IL-3 pada permukaan elektroda penginderaan (Gbr. 3b). PEG-COOH membantu mengurangi pengikatan nonspesifik IL-3 pada permukaan elektroda penginderaan dan menghilangkan hasil positif palsu. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa polimer berbasis PEG pada permukaan penginderaan meningkatkan biokompatibilitas, mengurangi rasio signal-to-noise dan memberikan orientasi yang tepat dari biomolekul amobil pada permukaan penginderaan, yang mengarah ke batas deteksi sensor yang lebih rendah [34,35, 36,37]. Karena permukaan APTMS menarik biomolekul lain secara elektrostatis, PEG-COOH digunakan untuk menutupi permukaan APTMS berlebih pada bahan nano zeolit-besi, yang membantu mengurangi biofouling. Permukaan modifikasi anti-IL-3 ini digunakan untuk mengidentifikasi IL-3.
a Proses pelekatan antibodi pada permukaan modifikasi zeolit-besi. nilai kapasitansi meningkat setelah setiap imobilisasi molekuler. b Perbedaan kapasitansi. Imobilisasi antibodi anti-IL-3 menunjukkan perubahan nilai kapasitansi yang lebih tinggi. Nilai rata-rata menggunakan tiga bacaan sebagai rangkap tiga. [Zeolite-IO—Zeolite-iron oxide]
Penentuan dan Kuantifikasi IL-3 pada Permukaan Antibodi Anti-IL-3
IL-3 diukur pada permukaan penginderaan elektroda kapasitansi yang dimodifikasi anti-IL-3. Awalnya, konsentrasi IL-3 yang lebih tinggi (100 pg/mL) diuji pada permukaan yang dimodifikasi antibodi, dan nilai kapasitansinya meningkat dari 3,74 × 10
10
nF hingga 13 × 10
10
nF. Peningkatan ini menegaskan interaksi IL-3 dengan antibodi anti-IL-3 (Gbr. 4a). Eksperimen serupa dilakukan dengan konsentrasi IL-3 3 hingga 50 pg/mL. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, nilai kapasitansi meningkat menjadi 4,56 × 10
10
nF, 5,84 × 10
10
nF, 6.64 × 10
10
nF, 8.39 × 10
10
nF, dan 12 × 10
10
nF. Tercatat bahwa dengan meningkatnya konsentrasi Il-3, nilai kapasitansi meningkat secara bertahap (Gbr. 5a). Perbedaan nilai kapasitansi dihitung dan diplot dalam lembar Excel, dan deteksi IL-3 dihitung sebagai 3 pg/mL dengan nilai R2 0,9673 (Gbr. 5b). Respon tergantung dosis linier dengan konsentrasi IL-3 yang berbeda (3–100 pg/mL) ditemukan saat berinteraksi dengan anti-IL-3. Namun, ketika dititrasi pada konsentrasi lebih lanjut, sampel menjadi jenuh.
Penentuan IL-3 pada permukaan yang dimodifikasi anti-IL-3. a Identifikasi 100 pg/mL IL-3. Perubahan kapasitansi yang jelas dicatat setelah penambahan IL-3 secara bertahap. Gambar inset menampilkan skema. b Titrasi konsentrasi IL-3 yang berbeda ke antibodi anti-IL-3. Dengan semua konsentrasi IL-3, perubahan kapasitansi dicatat
a Nilai kapasitansi untuk setiap konsentrasi IL-3. Peningkatan konsentrasi IL-3 menghasilkan peningkatan nilai kapasitansi secara bertahap. b Perbedaan nilai kapasitansi untuk setiap konsentrasi IL-3. Nilai diplot dalam lembar Excel, dan batas deteksi IL-3 dihitung sebagai 3 pg/mL. Nilai dirata-ratakan menggunakan tiga bacaan sebagai rangkap tiga
Biofouling/Nonfouling pada Elektroda Kapasitansi APTES-Zeolite-Iron-Modified
Biofouling adalah masalah terbesar dalam semua jenis biosensor, yang mengarah pada identifikasi positif palsu dari target pada permukaan penginderaan. Agen penghambat seperti BSA, etanolamin dan polimer berbasis PEG adalah molekul umum yang mengurangi biofouling pada permukaan penginderaan. Di sini, PEG-COOH digunakan sebagai zat penghambat, dan efek biofouling dikonfirmasi dalam tiga percobaan kontrol yang berbeda, yaitu, tanpa antibodi IL-3, dengan antibodi nonimun dan dengan protein kontrol (IL-8). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, ketiga eksperimen kontrol gagal meningkatkan nilai kapasitansi, yang menunjukkan identifikasi spesifik IL-3 tanpa biofouling.
a Deteksi spesifik IL-3. Molekul kontrol tidak menunjukkan peningkatan nilai kapasitansi, menunjukkan deteksi spesifik IL-3. b Spiking IL-3 dalam serum manusia. Spiking dalam serum manusia meningkatkan kapasitansi dengan meningkatnya konsentrasi IL-3. Hasil ini menegaskan deteksi selektif IL-3. Nilai dirata-ratakan menggunakan tiga bacaan sebagai rangkap tiga
Spiking IL-3 dalam Serum dan Stabilitas Manusia
Konsentrasi IL-3 yang berbeda dibubuhi dalam serum manusia dan mengalami prosedur eksperimental yang sama untuk mengidentifikasi IL-3 dalam situasi kehidupan nyata. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 6b, IL-3 yang berduri dalam serum manusia jelas menghasilkan peningkatan nilai kapasitansi dengan peningkatan konsentrasi IL-3. Hasil ini mengkonfirmasi identifikasi IL-3 selektif oleh elektroda kapasitansi yang dimodifikasi anti-IL-3.
Mempertimbangkan reproduktifitas, permukaan penginderaan berperilaku baik, dengan nilai kesalahan minimal. Masa pakai operasional dari bahan nano yang terpasang di permukaan penginderaan yang dibuat dapat diperpanjang selama tiga bulan dengan penyimpanan yang tepat dalam desikator. Namun, setelah memasang probe, permukaan stabil selama 2 minggu dan cenderung kehilangan 19% stabilitas, dan hilangnya stabilitas menjadi curam mulai minggu ke-3. Untuk membuktikan kinerja tinggi dari sensor saat ini, studi perbandingan telah dilakukan dengan sensor yang tersedia saat ini, dan hasilnya menunjukkan bahwa sensor tersebut sebanding dan berperilaku lebih baik dalam beberapa kasus (Tabel 1).
Kesimpulan
Sepsis mengancam jiwa, melibatkan reaksi kekebalan yang luar biasa, sangat berbahaya dan mempengaruhi seluruh tubuh. Studi ini menunjukkan identifikasi biomarker sepsis (IL-3) pada elektroda kapasitansi. Bahan nano zeolit-besi diekstraksi dari elektroda kapasitansi yang dimodifikasi lalat batubara untuk meningkatkan aliran arus pada pengikatan biomolekul ke elektroda penginderaan. Modifikasi amina dilakukan untuk menempelkan antibodi anti-IL-3 pada besi zeolit. Deteksi IL-3 dilakukan pada elektroda yang dimodifikasi antibodi dan mencapai batas deteksi IL-3 hingga 3 pg/mL. Eksperimen kontrol lebih lanjut gagal menunjukkan peningkatan nilai kapasitansi, mengkonfirmasi deteksi spesifik IL-3, dan eksperimen selektif dengan IL-3 berduri dalam serum manusia menunjukkan peningkatan kapasitansi yang jelas. Metode eksperimental ini mengukur kadar IL-3 dan membantu mendiagnosis serangan sepsis.
