Perbandingan Pemeriksaan Vivo terhadap Nanopartikel Tembaga dan Seng Oksida Biosintesis dengan Rute Administrasi Intraperitoneal dan Intravena pada Tikus
Abstrak
Saat ini, fitur anti-mikroba dari nanopartikel tembaga (Cu) dan seng oksida (ZnO) (NP) banyak digunakan untuk memerangi pertumbuhan mikroba patogen. CuNPs dan ZnONPs berulang kali digunakan dalam kosmetik, obat-obatan dan bahan tambahan makanan, dan potensi mereka untuk dampak toksik pada manusia dan ekosistem menjadi perhatian yang tinggi. Dalam penelitian ini, nasib dan toksisitas tembaga terbiosintesis (Bio-CuNPs) dan seng oksida (Bio-ZnONPs) dengan rentang 16 hingga 96 nm dinilai pada tikus Wistar jantan. Eksposur in vivo dari dua nanopartikel dicapai melalui dua rute pemberian yang berbeda yaitu, injeksi intraperitoneal (i/p) dan intravena (i/v). Tiga konsentrasi yang berbeda, tidak ada konsentrasi efek samping yang dapat diamati (NOAEC), konsentrasi penghambatan (IC50 ) dan konsentrasi mematikan total (TLC), dinilai pada kisaran dosis 6,1 hingga 19,82 μg/kg dan 11,14 hingga 30,3 μg/kg untuk Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs masing-masing, untuk rute i/p dan i/v pada Pengamatan hari ke 14 dan 28. Rentang dosis ini dipertimbangkan berdasarkan penelitian sebelumnya tentang dosis antibakteri pada bakteri patogen yang resistan terhadap banyak obat. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek toksik dari Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs pada perilaku hewan, massa hewan, indeks hematologi, indeks organ dan histopatologi organ hati, limpa, ginjal dan otak. Kami menemukan bahwa pemberian Bio-ZnONPs i/v dan i/p dalam tiga dosis berbeda tidak menyebabkan kematian dan berat badan sedikit berkurang hingga minggu kedua pemberian dibandingkan dengan kelompok kontrol kendaraan. Pada rentang dosis 11-16 g/kg (i/v) dan 24-30 g/kg (i/p), tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada tingkat kreatinin serum serta ALT serum, tingkat AST serum, dan ALP. normal yaitu 40,7 mg/dl, 37,9 IU/L dan 82,4 IU/L dibandingkan dengan kontrol kendaraan pada hari ke 14 dan 28 pengamatan. Temuan ini dikonfirmasi dalam indeks hati, ginjal dan limpa dan studi histopatologi. Selanjutnya, cedera hati dan ginjal terjadi ketika konsentrasi Bio-CuNPs berada pada 9,5 μg/kg (IC50 ) dan 11,7 μg/kg (TLC) untuk rute pemberian i/v. Demikian pula, peningkatan serum ALT (67,7 mg/dl), tingkat AST (70 IU/L) dan ALP (128 IU/L) juga diamati. Dan berat badan secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol setelah hari ke-14, dan ada perbedaan yang signifikan secara statistik yang diamati dengan rute ini; menariknya, toksisitas Bio-CuNPs dalam serum diperpanjang (hingga hari ke-28). Pengaruh Bio-CuNPs melalui jalur i/p sangat rendah dibandingkan dengan kontrol. Hasil penelitian ini mengungkapkan bahwa Bio-ZnONPs tidak berpengaruh pada biomarker fungsi ginjal dan hati (baik i/v dan i/p) dibandingkan dengan Bio-CuNPs.
Seperti yang ditunjukkan dalam abstrak grafis (Gbr. 1), tujuan kami adalah untuk menilai toksisitas Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs melalui protokol in vivo. Menurut ulasan Kahru dan Dubourguier, AgNPs, CuNPs dan ZnONPs secara historis digunakan sebagai biosida, untuk mencegah pertumbuhan mikroorganisme dan alga (Kahru dan Dubourguier 2010). Oleh karena itu, seperti halnya pestisida, bahan nano harus dipantau respons toksiknya terhadap spesies non-target, termasuk manusia dan hewan. Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik apakah pelepasan TN yang mengandung logam secara tidak sengaja dapat menimbulkan ancaman bagi spesies non-target, penilaian efek toksik sangat diperlukan. 'Organisme non-target' adalah organisme yang akan terpapar NP setelah insidental mereka. melepaskan ke lingkungan.
Latar Belakang
Logam tertentu diperlukan untuk fungsi fisiologis normal dalam organisme hidup. Sejak dekade terakhir, telah terjadi peningkatan penggunaan NP berbasis logam dalam aplikasi bio-medis, penggunaan NP secara eksponensial mengingatkan masalah keamanan untuk mengurangi dan/atau mencegah efek samping yang diinduksi NP pada sistem kehidupan [1]. Di antara NP, Cu dan ZnO umumnya ditemukan dalam suplemen makanan dan tubuh manusia [2, 3]. Sifat fisikokimia yang unik dari Cu dan ZnONPs mencapai aplikasi fungsional dalam proses metabolisme fisiologis, sehingga meningkatkan nilai komersialnya di industri [4,5,6]. Namun, efek samping, termasuk hemolisis, gangguan pencernaan, dan kerusakan hati dan ginjal diamati pada kelebihan asupan Cu dan ZnONPs [7].
Khususnya, penyerapan CuNPs mudah terjadi setelah konsumsi, inhalasi dan paparan kulit [8, 9], secara signifikan melalui saluran pencernaan [8, 10]. CuNPs menargetkan sel-sel mukosa dan mempertahankan di dalam dengan ikatan dengan metallothionein atau glutathione [11]. Hal ini disimpan terutama di hati, otak, jantung, ginjal dan otot. Dilaporkan, 98% Cu berikatan dengan Ceruloplasmin, protein serum yang menyebabkan toksisitas seluler. [12, 13].Cu adalah penginduksi katalitik radikal superoksida, radikal hidroksil dan hidrogen peroksida melalui reaksi Haber-Weiss [14], konsentrasi Cu yang lebih tinggi dapat menyebabkan stres yang diinduksi oksidatif.
Berdasarkan tingkat kelarutan ZnONPs dianggap sebagai kelompok terpisah dari NP dalam NP oksida logam [15]. Unsur seng ditemukan dalam tubuh manusia dan ZnONPs diketahui memiliki toksisitas yang lebih rendah [3]. Namun, seng yang berlebihan dilaporkan menyebabkan efek toksik [16]. Pelepasan kation logam Zn
2
dari ZnONPs juga terbukti toksik pada mikroorganisme dan hewan pengerat [17]. NP ZnO mungkin masuk melalui rute yang berbeda untuk mencapai aliran darah dan menyebabkan dampak buruk pada organ [18]. Hasil awal menunjukkan sistem organ yang terpengaruh ZnONP mungkin menunjukkan peradangan, perubahan denyut jantung dan fungsi, dan stres oksidatif [19, 20]. Menurut [21], inhalasi 20 nm ZnONPs (2,5 mg/kg bb) oleh tikus dua kali sehari menghasilkan peningkatan kandungan Zn di hati setelah 12 jam dan di ginjal setelah 36 jam.
Peningkatan kesadaran terhadap nanotoksisitas, penelitian telah dilaporkan pada toksisitas in vivo CuNPs dan ZnONPs untuk pemberian intranasal [22, 23], pemberian intratrakeal [24, 25] dan pemberian oral [26,27,28], paparan dermal [29, 30]. Untuk mengevaluasi toksisitas pemberian intravena (i/v) dan intraperitoneal (i/p) harus dilakukan. Sepengetahuan kami, laporan minimal tersedia tentang toksisitas CuNPs dan ZnONPs untuk pemberian intravena dan intraperitoneal. Selain itu, mekanisme toksikologi dan distribusi jaringan dari dua NP belum dipelajari secara sistematis setelah injeksi i/v dan i/p.
Dengan ini, kami mendemonstrasikan toksisitas 16-96 nm CuNPs dan ZnONPs biosintesis jarak 16-96 nm pada tikus wistar jantan melalui injeksi intraperitoneal (i/p) dan intravena (i/v) pada hari ke-14 dan ke-28 pengamatan yang diinginkan.
Metode
Biosintesis bio-CuNPs dan bio-ZnONPs
Sintesis biologis CuNPs dan ZnONPs dari Enterococcus faecalis non-patogen diadaptasi dengan metode enzimatik ekstraseluler [31, 32]. Selanjutnya, bentuk dan ukuran nanopartikel yang disintesis dikonfirmasi menggunakan mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FeSEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM).
Studi in vivo
Hewan percobaan dan peternakan
Tikus Wistar jantan berusia 12 hingga 13 minggu yang bebas penyakit dibeli dari Mahaveera Enterprises, Hyderabad, India. Hewan dipilih dalam kisaran berat 160-200 g untuk setiap kelompok dan diaklimatisasi selama 1 minggu sebelum memulai pengobatan, dan status kesehatan tikus dipantau setiap hari. Hewan-hewan ditempatkan di bawah kondisi standar suhu (24 ± 1 °C) dan kelembaban relatif (55 ± 10%) masing-masing, dalam siklus terang/gelap 12 jam. Selama perawatan, hewan ditempatkan di kandang dengan tutup jaring stainless steel. Hewan diberi makan dengan diet pelet standar yang tersedia secara komersial (VRK Nutrition Solutions, Sangli, Maharashtra, India Ltd.). Air minum diberikan kepada hewan, ad libitum.
Studi toksisitas dilakukan di Luqman College of Pharmacy, Kalaburagi, India. Penanganan hewan dilakukan sesuai Good Laboratory Practice. Protokol penelitian telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Institut (Nomor persetujuan:346/CPCSEA).
Persiapan dan Pemberian Bio-Cu dan ZnONP
Suspensi stok Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs (50 mg/ml) dibuat dengan melarutkan secara terpisah dalam air suling ganda selama semalam dan disaring menggunakan filter spuit 0,22 μ. Filtrat digunakan untuk menyiapkan standar kerja mulai dari konsentrasi 1,25-175 μg/ml.
Hewan dibagi menjadi tiga kelompok dengan tiga konsentrasi berbeda untuk setiap jenis nanopartikel. Mempertimbangkan enam tikus/kelompok untuk rute intravena (diberi kode sebagai set eksperimen A) dan enam tikus/kelompok untuk rute intraperitoneal (diberi kode sebagai set eksperimen B), sesuai Tabel 1 dan 2. Dalam kedua set eksperimen grup A berfungsi sebagai kontrol (air suling kendaraan).
Item pengamatan dan pemeriksaan
Tanda-tanda klinis
Selama pengujian, observasi pasca perawatan dilakukan sekali sehari untuk memantau tanda-tanda toksisitas klinis dan/atau kematian.
Konsumsi pakan dan air
Konsumsi pakan dan air dicatat setiap hari setelah tanggal mulai perlakuan, dihitung dari selisih antara jumlah yang diberikan dan jumlah yang tersisa.
Perilaku hewan dan berat badan
Setiap dua hari setelah injeksi, tikus ditimbang dan dinilai perubahan perilakunya.
Indeks hematologi
Menggunakan teknik pengumpulan darah vena saphena standar, darah diambil untuk analisis hematologi (menggunakan tabung pengumpulan asam kalium-metilendiamintetraasetat). Menurut analisis hematologi standar, 300 l darah dikumpulkan dari tikus dan pada 14 dan 28 hari parameter hematologi standar, yaitu, jumlah trombosit, hematokrit, hemoglobin, jumlah sel darah merah, dan jumlah sel darah putih dianalisis [33].
Analisis panel biokimia serum
Untuk menentukan kadar biokimia serum termasuk alanine aminotransferase (ALT/GPT), creatinine (CRE), aspartate aminotransferase (AST) dan alkaline phosphatase (ALP), tikus kontrol dan perlakuan dikorbankan dan sampel darah dikumpulkan untuk sentrifugasi (3000 rpm ) selama 15 menit. Penilaian dilakukan oleh penganalisis biokimia otomatis untuk sampel hari ke-14 dan ke-28 [34].
Deteksi berat organel
Setelah 14 dan 28 hari, tikus dibius dengan eter dengan saline buffer fosfat dan dibedah. Organ kelompok kontrol dan perlakuan diambil segera. Jantung, paru-paru, timus, otak, ginjal, hati dan limpa dipisahkan dengan hati-hati dan dicuci dengan larutan natrium klorida dan dibilas dengan air deionisasi dingin dan dikeringkan dengan kertas saring. Morfologi dan warna organ yang dibedah diselidiki dan berat masing-masing organ diukur. Untuk memeriksa tingkat perubahan yang secara eksplisit disebabkan oleh Bio-Cu dan ZnONPs, indeks Organ (OX ) dihitung secara terpisah dengan menggunakan rumus [35]:
Satu tikus dari setiap kelompok termasuk kontrol difiksasi dengan formalin buffer 10% setelah eksanguinasi saline buffer fosfat. Sepotong kecil hati, ginjal, limpa dan otak difiksasi dengan formalin 10% dan dimasukkan ke dalam parafin. Blok parafin dipotong dan diproses untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin. Bagian yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop medan terang [36].
Analisis statistik
Semua data dinyatakan dalam mean ± SD dari mean dari tiga eksperimen independen; masing-masing dilakukan dalam rangkap tiga, N = 6 tikus per kelompok.
Hasil dan Diskusi
Sintesis Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs dilakukan dengan metode enzimatik ekstraseluler selama pemaparan reaktan Enterococcus faecalis supernatan. Analisis FeSEM Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs dapat dilihat dengan ukuran distribusi mulai dari 1 hingga 100 nm (file tambahan 1). Analisis TEM melaporkan keberadaan CuNP dan ZnONP yang dibiosintesis dengan morfologi cangkang inti berukuran 12–90 nm dan berbentuk bulat untuk CuNP [31] dan ZnONP mulai dari 16 hingga 96 nm [32] (File tambahan 2).
Evaluasi Bio-Cu dan ZnONPs pada tikus wistar jantan diselidiki tanpa tanda-tanda kematian pada pengobatan NP. Selanjutnya, setelah perawatan dan sampai akhir durasi percobaan, pemeriksaan feses putih sering dipantau setelah pemberian Bio-CuNPs i/v pada dosis 9,5 hingga 11,5 g/kg. Antara minggu ketiga dan keempat, tikus yang diberi Bio-CuNPs menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam konsumsi pakan dan air untuk i/v adalah 9,5 μg/kg (IC50 ) dan 11,5 g/kg (TLC) sedangkan untuk rute i/p (rentang dosis:24,8 hingga 30,3 g/kg) dan tikus kelompok kontrol dari minggu ke-3 hingga ke-4. Variasi bobot badan tikus setelah i/v dan i/ p administrasi Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs ditunjukkan pada Tabel 3 dan 4. Penurunan dan peningkatan berat badan merupakan indikator berharga dalam menilai toksisitas sampel uji [37]. Laporan sebelumnya dibuktikan dalam studi toksisitas pada 13,5 nm emas [33] dan 100 nm perak [38] efek NP pada berat badan dengan injeksi i/v kurang dari i/p dan pemberian oral. Menurut Rhiouani dkk., penurunan berat badan yang rendah setelah 4 hari perawatan pada semua kelompok yang diberi perlakuan dapat menunjukkan efek samping zat beracun pada hewan [39].
Dapat dilihat bahwa pemberian Bio-ZnONPs i/v dan i/p dalam tiga dosis yang berbeda (NOAEC, IC50 dan TLC) berat badan sedikit berkurang hingga minggu kedua pemberian dibandingkan dengan kelompok kontrol. Namun, setelah hari ke-14 berat badan kembali naik. Dalam hal pemberian i/p, penurunan berat badan diinduksi oleh Bio-ZnONPs (30,3 g/kg) pada konsentrasi mematikan total dan lebih rendah dari kelompok kontrol, sehingga menunjukkan toksisitas sepele melalui rute i/p melalui rute i/v (Tabel 4, Gbr. 1a). Demikian pula, tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs, pada konsentrasi 9,5 μg/kg dan 11,7 g/kg melalui rute i/v, terjadi sedikit penurunan berat badan. Hingga 14 hari pengobatan dengan Bio-CuNPs tidak ada tanda-tanda efek buruk pada pertumbuhan dan penambahan berat badan yang diamati. Variasi berat badan dalam 28 hari dengan dosis 11,7 g/kg (rute i/v) ditunjukkan pada Tabel 3. Setelah hari ke-14 pengobatan, ditemukan penurunan berat badan yang cukup besar melalui rute i/v bila dibandingkan dengan kontrol kelompok. Dengan demikian, menunjukkan toksisitas Bio-CuNPs melalui rute ini (Gbr. 1b). Tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui pemberian rute i/p menyebabkan sedikit penurunan berat badan dan tidak ada tanda-tanda kematian yang diamati pada rute i/p dan i/v. Oleh karena itu, injeksi i/p menginduksi toksisitas yang lebih rendah (ditunjukkan pada Tabel 4 dan Gambar 1a).
Perubahan berat badan tikus yang tidak diberi perlakuan (kontrol) dan diberi perlakuan dengan Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs. Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs diobati melalui (A) rute pemberian intraperitoneal (i/p) dan (B) intravena (i/v) hingga hari ke-28 pengamatan. Semua perlakuan Bio-CuNPs (Cu) dan Bio-ZnONPs (ZnO) pada konsentrasi total yang mematikan diberikan dan diamati selama 28 hari; T = 6 tikus per kelompok
Indeks hematologi
Estimasi parameter hematologi seperti, jumlah RBC, jumlah WBC, jumlah trombosit, tingkat hemoglobin dan waktu pembekuan darah adalah entitas penting untuk mengukur toksisitas NP diobati. Untuk hari ke 14 dan 28, hasil hematologi yang bergantung pada konsentrasi disajikan pada Tabel 5 dan 6 untuk rute pemberian i/p dan i/v. Dosis Bio-CuNPs pada 9,5 μg/kg (IC50 ) dan 11,7 μg/kg (TLC) melalui rute i/v telah menunjukkan penurunan jumlah RBC dibandingkan dengan Bio-ZnONPs. Namun, tren yang bergantung pada konsentrasi belum diperhatikan. Untuk tikus yang diobati dengan Bio-ZnONPs melalui rute pemberian i/v, kadar hemoglobin, jumlah trombosit, dan sel darah putih telah berubah, tetapi tidak ada perbedaan signifikan yang diamati di antara ketiga konsentrasi (NOAEC, IC50 dan TLC). Tetapi dalam hal rute pemberian i/p, penurunan dan perubahan yang signifikan dalam jumlah sel darah merah, sel darah putih, kadar hemoglobin dan jumlah trombosit telah ditemukan pada hari ke-14 pengamatan (Tabel 5) dibandingkan dengan kontrol dan Bio- CuNP diobati. Anehnya, efek hematologi ditemukan normal pada hari ke-28 (Tabel 6).
Efek hematologi dari metode injeksi yang berbeda (i/v, i/p) untuk dua Bio-NP yang berbeda pada hari ke 14 dan 28 pengamatan beragam. Dapat diamati bahwa hemoglobin, sel darah merah, sel darah putih dan trombosit menurun melalui rute i/v dalam pengobatan Bio-CuNPs dan melalui rute i/p pada tikus yang diobati dengan Bio-ZnONPs. Tetapi penurunan yang signifikan dalam jumlah sel darah merah diamati. Hal ini menunjukkan bahwa rute injeksi yang berbeda tidak menyebabkan perbedaan yang signifikan dalam jumlah trombosit, hemoglobin, atau sel darah putih kecuali pada tikus yang disuntik dengan Bio-CuNPs (rute i/v). Sel darah merah menunjukkan perbedaan yang signifikan setelah injeksi i/p dan i/v (seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5 dan 6).
Uji biokimia serum
Kreatinin serum adalah produk limbah; produksi kreatinin yang lebih tinggi menunjukkan kerusakan ginjal. Bio-ZnONPs (rute i/v:dosis 11-16 μg/kg, rute i/p:dosis 24-30 μg/kg) tidak berpengaruh nyata terhadap kadar kreatinin serum bila dibandingkan dengan kontrol pada hari ke-14 dan ke-28. (Tabel 7 dan 8, Gbr. 2a, b). Tikus yang diberi Bio-CuNPs (rute i/v:dosis 06-12 μg/kg) menunjukkan peningkatan kadar kreatinin serum menjadi 2,3 mg/dl bila dibandingkan dengan kontrol. Namun, rute injeksi i/p tidak menunjukkan perubahan yang signifikan (Tabel 7 dan 8). Serum darah memiliki sejumlah besar enzim tetapi untuk menilai gejala normal dan patologis hati, alanin transaminase (glutamat piruvat transaminase) dan transaminase aspartat (glutamat oksalat asetat transaminase) berguna. Aspartat transaminase berasal dari mitokondria yang terdapat dalam jumlah besar di hati, jantung, ginjal, dan otot rangka. Serum alkaline phosphatase adalah enzim globulin dengan berat molekul rendah, ditemukan dalam konsentrasi yang lebih tinggi di tulang, saluran hepatobilier dan ginjal. Aktivitas enzim ini dapat ditentukan dengan estimasi fosfat organik yang dibebaskan dari gliserol fosfat. Tingkat serum enzim meningkat pada penyakit kuning hepatoseluler dan obstruktif. Dalam rute pemberian i/v, Bio-ZnONPs (40,7 mg/dl, 37,9 IU/L, 82,4 IU/L) tidak memiliki efek signifikan pada kadar serum ALT, AST dan ALP serum dibandingkan dengan kontrol. Meskipun pemberian i/p menunjukkan peningkatan yang signifikan pada tingkat ALT, AST dan ALP dibandingkan dengan kontrol pada hari ke-14 dan ke-28 (Gbr. 2a dan b). Hasil studi toksisitas pada serum menunjukkan Bio-ZnONPs tidak ada perubahan kadar kreatinin, ALT, AST dan ALP untuk rute i/v hingga 28 hari.
Hasil biokimia tikus yang diberi Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs. Kadar S. kreatinin, ALT, AST dan ALP diukur pada tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs melalui rute pemberian intraperitoneal (i/p) dan intravena (i/v) pada (A) hari ke-14 dan (B) hari ke-28. Semua data dinyatakan dalam mean ± SD dari mean dari tiga eksperimen independen; masing-masing dilakukan dalam rangkap tiga, N = 6 tikus per kelompok. Catatan:Cu:Bio-CuNPs, ZnO:Bio-ZnONPs, i/p:intraperitoneal, i/v:intravena
Sebaliknya, tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui rute i/v, menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam serum ALT (67,7 mg/dl), tingkat AST (70 IU/L), dan ALP (128 IU/L). Pengaruh Bio-CuNPs melalui jalur i/p sangat rendah dibandingkan dengan kontrol. Perbedaan hasil dapat dikaitkan dengan perbedaan dalam rute dosis, toksisitas nanopartikel serta durasi administrasi. Kami menemukan Bio-ZnONP tidak berpengaruh pada biomarker fungsi ginjal dan hati (baik i/v dan i/p) dibandingkan dengan Bio-CuNPs.
Deteksi berat organel dan studi histologis
Perubahan berat organ tikus pada dosis Bio-NP yang berbeda, menggambarkan efek merugikan dari NP pada organ. Dapat dilihat bahwa bobot jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan otak pada tikus yang diberi perlakuan Bio-ZnONPs menurun seperti yang digambarkan pada Tabel 9 dan 10. Selanjutnya, pertimbangan reaksi organ dan tingkat perubahan diperiksa dengan menghitung indeks organ (OX ) masing-masing organ secara terpisah. Indeks organ untuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, otak, dan timus disajikan pada Tabel 9 dan 10.
Perbedaan berat limpa dan timus diamati setelah pemberian i/v dan i/p pada tikus yang diberi perlakuan Bio-CuNPs dan Bio-ZnONPs. Pada hari ke-14, Bio-ZnONPs telah menunjukkan penurunan indeks limpa melalui injeksi i/p, dan meningkat dengan pemberian i/v (Tabel 9). Dalam kasus tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui pemberian i/v menunjukkan penurunan indeks limpa yang signifikan pada hari ke-14 (0,265) dan hari ke-28 (0,49). Dengan demikian menunjukkan, sistem kekebalan telah dipengaruhi oleh pemberian Bio-CuNPs i/v dan pemberian Bio-ZnONPs i/p. Dalam hal pemberian i/p Bio-ZnONPs, sistem kekebalan tikus kembali ke keadaan normal setelah hari ke-14 dan terbukti efeknya tidak berkepanjangan. Dibandingkan dengan variasi berat badan sebelumnya, tampaknya rute pemberian Bio-CuNPs i/v dapat mempengaruhi jantung, hati, paru-paru, ginjal, dan otak; selanjutnya dapat merusak sistem kekebalan tubuh. Dari Gambar 3a, ini menyiratkan bahwa limpa dan timus adalah target utama organ oleh Bio-CuNPs.
Perubahan morfologi organel. Dimana a limpa, b hati, c ginjal, d otak, e paru-paru dan f jantung, tikus Wistar jantan yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui rute intravena dibandingkan dengan kontrol pada pengamatan hari ke-28
Dalam kasus kelompok perlakuan Bio-CuNPs i/v dan i/p efek yang jelas pada indeks organ telah diamati pada kedua IC50 dan dosis TLC. Selain itu, dari dua rute pemberian yang berbeda, injeksi intraperitoneal menunjukkan toksisitas sederhana pada kelompok perlakuan Bio-ZnONPs dan toksisitas tertinggi pada kelompok perlakuan Bio-CuNPs. Penyerapan obat yang efisien dengan injeksi i/p diketahui cepat karena pembuluh darah dan getah bening yang padat di peritoneum murine [40]. Sejalan dengan itu, injeksi intravena menunjukkan toksisitas paling rendah pada kelompok perlakuan Bio-ZnONPs dan toksisitas tertinggi pada kelompok perlakuan Bio-CuNPs.
Perubahan toksikologi pada tikus
Kami mencoba meneliti efek toksisitas, pada dosis dan interval waktu yang berbeda dari Bio-NP. Jaringan yang diobati dengan Bio-ZnONPs (rute i/v:kisaran dosis 11-16 μg/kg, rute i/p:kisaran dosis 24-30 μg/kg) tidak menunjukkan perubahan pada hati, ginjal, limpa dan otak bila dibandingkan dengan jaringan kontrol (Gbr. 4, 5, 6 dan 7). Pengamatan nekropsi (otopsi:pemeriksaan diseksi tikus mati) menetapkan bahwa semua organ tikus yang diobati dengan Bio-NP menunjukkan fitur anatomi (misalnya, karakteristik warna, bentuk, dan ukuran) yang diharapkan berdasarkan penampilan mereka pada hewan yang tidak diobati. Dibandingkan dengan Bio-ZnONPs, tikus yang diberi Bio-CuNPs menunjukkan perubahan yang lebih signifikan pada fitur anatomi ginjal, hati, limpa, dan jaringan otak dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 4, 5, 6 dan 7).
Bagian ginjal tikus yang diwarnai H&E. Tikus yang dirawat melalui rute i/v dan i/p dengan Bio-Cu dan ZnONPs; sampel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Dimana bagian yang dirawat dengan Bio-CuNPs diamati pada hari ke 14 (A–C) dan hari ke 28 (D–F). Bagian yang dirawat Bio-ZnONPs pada hari ke 14 (G–I) dan hari ke 28 (J–L). Kapsul BC Bowman, glomerulus G, tubulus proksimal PT, nekrosis glomerulus GN, kerusakan tubulus proksimal PTD
Bagian limpa tikus yang diwarnai H&E. Tikus yang dirawat melalui rute i/v dan i/p dengan Bio-Cu dan ZnONPs; sampel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Bagian yang dirawat dengan Bio-CuNPs diamati pada hari ke 14 (A–C) dan hari ke 28 (D–F). Bagian yang dirawat Bio-ZnONPs pada hari ke 14 (G–I) dan hari ke 28 (J–L). WP pulp putih, RP pulp merah, penurunan DRP pulp merah
Bagian hati tikus yang diwarnai H&E. Tikus yang dirawat melalui rute i/v dan i/p dengan Bio-Cu dan ZnONPs; sampel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Bagian yang dirawat dengan Bio-CuNPs diamati pada hari ke 14 (A–C) dan hari ke 28 (D–F). Bagian yang dirawat Bio-ZnONPs pada hari ke 14 (G–I) dan hari ke 28 (J–L). Vena sentral CV, sel KC Kupffer, vakuolisasi vena sentral CVV (vakuolisasi sitoplasma), perdarahan hepatik HH
Bagian otak tikus yang diwarnai H&E. Tikus yang dirawat melalui rute i/v dan i/p dengan Bio-Cu dan ZnONPs; sampel yang tidak diobati dianggap sebagai kontrol. Bagian yang dirawat dengan Bio-CuNPs diamati pada hari ke 14 (A–C) dan hari ke 28 (D–F). Bagian yang dirawat Bio-ZnONPs pada hari ke 14 (G–I) dan hari ke 28 (J–L). [Semua slide diamati dengan perbesaran × 40, NIKON Eclipse E200 (Mikroskop Trinakular)]
Bio-CuNPs menginduksi kerusakan melalui pemberian rute i / v dan menunjukkan tren yang bergantung pada dosis dalam jaringan. Pada konsentrasi TLC (11,7 g/kg), Bio-CuNPs menunjukkan kerusakan parah pada jaringan hati dan ginjal tikus Wistar. Selain itu, Bio-CuNPs yang diobati melalui rute i/v dan i/p telah menginduksi nekrosis sel glomerulus (atrofi glomerulus), kapsul bowman dan tubulus proksimal pada tikus kelompok hari ke-14 dan ke-28 (Gbr. 4b, e, c dan f ) bila dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan. Nekrosis glomerulus disebabkan oleh penggantian imunologis, tetapi kerusakan tubulus sebagian besar disebabkan oleh efek toksik dari NP. Kerusakan tubulus yang disebabkan oleh efek toksik Bio-CuNPs melalui jalur i/v dan i/p juga meningkatkan tekanan glomerulus dan menyebabkan atrofi glomerulus.
Kelompok kontrol normal menunjukkan struktur histologis lobulus hati dan vena sentral yang normal yang dikelilingi oleh hepatosit normal (Gbr. 6). Bio-CuNPs yang diobati melalui rute i/p (19,82 μg/kg) menunjukkan perubahan histologis ringan termasuk aktivasi sel Kupffer baik pada pengamatan hari ke-14 dan ke-28 (Gbr. 6b, e). Tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui rute i/v menunjukkan perubahan parah termasuk vakuolisasi sitoplasma dari vena sentral yang dikelilingi hepatosit dan perdarahan hati untuk pengamatan hari ke-14 (Gbr. 6c). Anehnya, kelompok hari ke-28 menunjukkan perubahan sedang termasuk perubahan lemak hepatosit dan piknosis inti hepatositik (Gbr. 6f). Jaringan hati yang diobati dengan Bio-ZnONPs, untuk kelompok pemberian rute i/p hari ke-14, menunjukkan perubahan sedang yang ditunjukkan oleh perubahan lemak hepatosit (Gbr. 6i). Kelompok perlakuan Bio-ZnONPs menunjukkan sedikit perbaikan, dan aktivitas hepatoprotektif yang signifikan diamati pada hari ke-28 dibandingkan dengan hari ke-14 (Gbr. 6l). Pada hari ke-14 dan seterusnya, pemulihan arsitektur hepar normal telah terjadi pada hewan yang diberi perlakuan Bio-ZnONPs.
Penurunan sel limpa (pulpa merah), sedangkan peningkatan limfosit (pulpa putih), pada jaringan limpa yang diekstraksi dari tikus yang diobati dengan Bio-CuNPs melalui rute i/v (Gbr. 5c, f) terlihat. Dalam pengamatan utama, akresi Bio-CuNPs di limpa terlihat pada pulpa merah dan berhubungan dengan hilangnya massa sel; pengurangan massa sel terlihat jelas pada titik waktu hari ke-28 bila dibandingkan dengan hari ke-14 pemberian i/v (Gbr. 5f), sedangkan perubahan kecil diamati pada penipisan pulpa merah ketika tikus diobati dengan Bio-CuNPs melalui rute i/p pada titik waktu hari ke-14 dan ke-28. Structural changes were not seen in the white pulp or in splenic blood vessels (arteries or venous sinuses) and intravascular erythrocytes (Fig. 5b, e). No morphological changes have been found in spleen tissues treated with Bio-ZnONPs (Fig. 5). The H&E-stained brain sections of rats, treated (i/v and i/p) with NPs, showed no changes in brain region, olfactory bulb (perivascular localization) and the choroid plexus and ependyma of the lateral ventricles (Fig. 7).
Conclusion
Animal toxicity studies using 16- to 96-nm-ranged biosynthesized copper (Bio-CuNPs) and zinc oxide (Bio-ZnONPs) was assessed in male Wistar rat at the dose range of 6.1 to 19.82 μg/kg and 11.14 to 30.3 μg/kg respectively for both i/p and i/v routes on 14th and 28th day of observation. We observed no mortality and normal behaviour in the animals treated with Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs in their specific dose range. The results also verified the Bio-CuNPs and Bio-ZnONPs at low concentrations do not cause identifiable toxicity even after their breakdown in vivo over time. Increased concentrations of these Bio-NPs induce weight reduction, but no significant statistical difference was observed for Bio-ZnONPs’ treated animals. In the case of i/v and i/p Bio-CuNPs’ treated groups, obvious effects on organ index have been observed at both IC50 and TLC doses. Moreover, of the two different administration routes, the intraperitoneal injection shows the modest toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Correspondingly, the intravenous injection shows the least toxicity in Bio-ZnONPs’ treated groups and highest toxicity in Bio-CuNPs’ treated groups. Considering all the results of studies, targeting Bio-ZnONPs by intravenous injection is promising for possible biomedical application.
