Carbon Dots @ Platinum Porphyrin Composite sebagai Theranostic Nanoagent untuk Terapi Kanker Fotodinamik yang Efisien

Metode

Trans-platinum diammine dichloride (transplatin) dibeli dari Aladdin®. 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Semua pelarut dibeli dari Reagen Kimia Tianjin Fu Chen. Bahan kimia lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. dan digunakan saat diterima.

Sintesis [Trans-PtCl(NH₃ )₂ <₄ -5,10,15,20-Tetra(4-piridil)-Porfirin Nitrat

Transplatin (0,193 mmol, 58 mg) dan perak nitrat (0,193 mmol, 33 mg) dilarutkan dalam 5 mL DMF. Setelah pengikatan selama 24 jam, perak klorida putih yang terbentuk dihilangkan dari larutan keruh yang dihasilkan melalui sentrifugasi untuk memperoleh larutan yang jernih, yang kemudian ditambahkan ke suspensi 5,10,15,20-Tetra(4-piridil)porfirin. (0,487 mmol, 30 mg) dalam 3 mL DMF. Setelah diaduk pada suhu 50 °C selama 48 jam, campuran didinginkan hingga suhu kamar. Kemudian ditambahkan 10 mL dietil eter untuk mendapatkan endapan merah, yang kemudian dicuci dengan metanol, diklorometana, dan dietileter. Akhirnya, sampel dikeringkan di bawah vakum untuk memperoleh produk 81 mg. Hasil 86%. ¹ H NMR (400 MHz; DMSO-d₆ ):9,45 (d, 8H), 9,14 (s, 8H), 8,52 (m-piridil, d, 8H), 4,70 (NH₃ , s, 24H), 3,04 (s, 2H); MS (ESI):m /z =1209 [M-3(TIDAK₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }] ⁺ , 1074 [M-4(TIDAK₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }-2NH₃ -Cl-2H] ⁺ , 883 [M-4(TIDAK₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }] ⁺ , 866 [M-4(TIDAK₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }-NH₃ < ⁺ , 812 [M-4(TIDAK₃ )-3{PtCl(NH₃ )₂ }-Cl-2(NH₃ )] ⁺ , 574 [M-4(TIDAK₃ )-2{PtCl(NH₃ )₂ }] ²⁺ .

Persiapan CQD

Umumnya, asam sitrat (0,45 g) dan etilendiamin (500 L) dilarutkan dalam DI-air (10 mL). Kemudian larutan dipindahkan ke autoklaf berlapis poli (tetrafluoroetilen) (Teflon) (30 mL) dan dipanaskan pada suhu 200 °C selama 5 jam. Setelah reaksi, reaktor didinginkan sampai suhu kamar dengan air atau secara alami. Produk mentah, yang berwarna coklat-hitam, dimurnikan dalam centrifuge selama 30 menit untuk menghilangkan partikel yang menggumpal, dan kemudian didialisis dengan air DI untuk mendapatkan CD.

Persiapan komposit CQDs@PtPor

Molekul PtPor, yang membawa empat muatan positif dalam cincin piridin, dapat mengikat permukaan CQD yang bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatik untuk mendapatkan komposit CQDs@PtPor. Secara umum, 20 mg PtPor yang dilarutkan dalam 3 mL DMSO didispersikan dalam 12 mL air. Larutan ditambahkan perlahan-lahan ke dalam suspensi CQDs (5 mg CQDs dilarutkan dalam 15 mL H₂ O) di bawah sonikasi. Setelah diaduk pada suhu kamar selama 24 jam, larutan dimurnikan dalam centrifuge selama 30 menit untuk menghilangkan partikel yang menggumpal, dan kemudian didialisis terhadap air DI selama 2 hari. Larutan berair CQDs@PtPor diliofilisasi pada 4 °C untuk menghasilkan produk yang diinginkan.

Penghitungan Hasil Kuantum CQD

Hasil kuantum CQD diukur dengan kina sulfat sebagai referensi (0,1 M H₂ JADI₄ larutan berair, hasil kuantum fluoresen 54%) dengan persamaan berikut:

Dimana adalah hasil kuantum fluoresensi, I adalah kemiringan kurva, dan adalah indeks bias pelarut. Subskrip “st” mengacu pada referensi hasil kuantum yang diketahui (kina sulfat dalam 0,1 M H₂ JADI₄ ). Penyerapan dijaga di bawah 0,1 pada panjang gelombang eksitasi 360 nm untuk meminimalkan reabsorpsi.

Pembangkitan Oksigen Tunggal

Larutan sampel dan 3-difenilisobenzofuran diiradiasi dalam kuvet kaca (3 mL), pada suhu kamar. Peluruhan serapan DPBF pada 415 nm diukur pada interval penyinaran 3 menit sampai 30 menit. Produksi oksigen singlet dievaluasi secara kualitatif melalui DPBF, quencher oksigen singlet. Persentase peluruhan penyerapan DPBF, sebanding dengan produksi ¹ O₂ , dinilai dengan perbedaan antara absorbansi awal dan absorbansi setelah periode penyinaran tertentu. Setiap percobaan diulang tiga kali.

Uji Sitotoksisitas CQD, PtPor, dan CQDs@PtPor

Sel karsinoma serviks manusia (HeLa) dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) yang dilengkapi dengan 5% serum janin (FCS), penisilin 100 U/mL, streptomisin 100 g/mL pada suhu 37 °C, dan 6% CO₂ . Uji viabilitas methylthiazolyltetrazolium (MTT) dilakukan menurut metode standar. Singkatnya, sel HeLa (3 × 10 ³ /well) diunggulkan di piring 96-sumur selama 24 jam sebelum paparan obat. Sel-sel diperlakukan dengan sampel semalaman dalam gelap. Sitotoksisitas ditentukan dengan uji reduksi MTT. Lapisan sel tunggal dibilas dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS) dan kemudian diinkubasi dengan 50 L larutan MTT (0,5 mg/mL) pada 37 °C selama 3 jam. Setelah media dihilangkan, ditambahkan 100 L DMSO. Larutan dikocok selama 30 menit untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk dalam sel hidup. Absorbansi diukur pada panjang gelombang ganda, 540 nm dan 690 nm, pada pembaca lempeng mikro Labsystem Multiskan (Merck Eurolab, Swiss). Setiap konsentrasi dosis dilakukan dalam sumur rangkap tiga, dan diulang dua kali untuk uji MTT.

Fotositotoksisitas sampel dinilai dengan protokol serupa. Secara umum, sel HeLa (3 × 10 ³ per sumur) diinkubasi di piring 96-sumur selama 24 jam sebelum mereka terpapar obat. Sel-sel diperlakukan dengan sampel dalam gelap semalaman. Setelah itu, sel-sel diekspos ke lampu xenon 50 W yang dilengkapi dengan filter isolasi panas dan filter jarak jauh 500 nm selama 10 menit. Laju pengaruhnya adalah 6 mW/cm ² . Viabilitas sel ditentukan oleh uji reduksi MTT.

Aplikasi Bioimaging CQDs@PtPor

Pencitraan seluler dievaluasi menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal. Sel HeLa (5 × 10 ⁴ sel per sumur) diunggulkan dalam piring kultur 6-sumur dan dibiarkan menempel selama 12 jam. Sel-sel tersebut kemudian dirawat dengan CQDs@PtPor (0,25 mg/mL) pada suhu 37 ° C selama 1 jam. Setelah itu, supernatan dibuang dengan hati-hati dan sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, slide dipasang dan diamati dengan mikroskop confocal (Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope; LSM7 DUO) menggunakan software ZEN 2009 (Carl Zeiss).

Hasil

Persiapan CQDs@PtPor

CQD dibuat melalui reaksi hidrotermal satu pot sesuai dengan metode yang dijelaskan dalam literatur [38], seperti yang ditunjukkan pada Skema 1. PtPor disintesis melalui kompleksasi transplatin tersubstitusi dengan 5, 10, 15, 20-Tetra (4-piridil )porfirin menurut metode yang dilaporkan [37]. Karena molekul PtPor memiliki empat muatan positif dalam cincin piridin, yang dapat mengikat permukaan CQD yang bermuatan negatif melalui interaksi elektrostatik, menghasilkan komposit CQDs@PtPor yang diinginkan.

Karakterisasi CQDs@PtPor

Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gbr. 1 kiri) menunjukkan bahwa CQD yang disiapkan dan CQD@PtPor terdistribusi secara homogen dengan ukuran yang seragam. Ukuran partikel yang ditunjukkan pada Gambar. 1 kanan sempit (1-9 nm) dan ukuran rata-rata, ditentukan oleh histogram, adalah 2,5 dan 7,6 nm untuk CQDs dan CQDs@PtPor, masing-masing. Ukuran rata-rata CQDs@PtPor lebih besar daripada CQD, kemungkinan karena adsorpsi molekul PtPor pada permukaan CQD melalui interaksi elektrostatik.

Gambar TEM (kiri) dan histogram distribusi ukuran yang sesuai (kanan) dari a CQD dan b CQDs@PtPor

Gambar 2a menunjukkan pola difraksi sinar-X (XRD) dari CQD yang disintesis. Puncak XRD yang luas dari CQD muncul sekitar 23°, menunjukkan struktur CQD yang tidak teratur [39]. Gugus fungsi CQD dikarakterisasi dengan spektroskopi FTIR. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2b, lebar puncak dari 3000 hingga 3500 cm ⁻¹ dikaitkan dengan getaran peregangan O-H dan N-H, yang menunjukkan adanya gugus hidroksil dan amino. Puncak pada 1150 dan 1230 cm ⁻¹ masing-masing dikaitkan dengan getaran peregangan C-O dan C-N. Ikatan amida dikonfirmasi oleh puncak tipikal pada 1678 dan 1392 cm ⁻¹ , yang disebabkan oleh getaran C=O dan C-N amida, masing-masing. Akhirnya, puncaknya di 1600 cm ⁻¹ diidentifikasi sebagai ikatan C=C/C=N. Dibandingkan dengan hasil FTIR asam sitrat, CQD tidak menunjukkan karakteristik penyerapan asam sitrat (CA) yang signifikan, yang menunjukkan bahwa CA sebagian besar harus dikarbonisasi selama proses hidrolisis. Selain itu, puncak tajam baru pada 1700 cm ⁻¹ , dianggap berasal dari ikatan amida ditemukan, menunjukkan bahwa etilendiamin harus difungsikan pada permukaan CQD melalui hubungan -CONH-. Diameter rata-rata dan distribusi ukuran partikel CQDs dan CQDs@PtPor ditentukan dengan pengukuran DLS (File tambahan 1:Gambar S1 dan Gambar 2c). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, ukuran rata-rata CQDs@PtPor adalah sekitar 9,2 nm, yang konsisten dengan hasil uji TEM. Pengukuran potensial zeta selanjutnya dilakukan untuk mengkonfirmasi konjugasi antara CQD dan PtPor. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3d, potensi zeta dari CQD bebas adalah 15,6 mV, karena muatan negatif pada permukaan. Setelah konjugasi dengan PtPor, potensi zeta komposit CQDs@PtPor diubah menjadi 4,5 mV, yang menunjukkan keberhasilan cakupan CQD oleh molekul PtPor.

Pola XRD dari CQD (a ). Spektrum FTIR dari CQD (b ). Distribusi ukuran partikel CQDs@PtPor diukur dengan hamburan cahaya dinamis (c ). Potensi Zeta dari CQD dan CQD@PtPor (d )

Spektrum survei XPS (a ), dan C 1 (b ), N 1s (c ), dan O 1s (d ) spektrum XPS resolusi tinggi dari CQD

Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan untuk menyelidiki lebih lanjut komposisi kimia CQD (Gbr. 3) dan CQDs@PtPor (File tambahan 1:Gambar S2). Spektrum survei CQDs pada Gambar. 3a menunjukkan keberadaan elemen di permukaan adalah C, N, dan O, dengan sinyal terkait pada 535, 402, dan 283 eV, masing-masing [40]. Sinyal C1s ditunjukkan pada Gambar. 3b memiliki tiga puncak yang berbeda pada 284,4 eV, 286,3 eV, dan 288,2 eV, yang masing-masing ditetapkan untuk ikatan C-C, ikatan C-O, dan ikatan C=O. Resolusi tinggi XPS N 1s ditunjukkan pada Gambar. 3c dilengkapi dengan tiga puncak, dengan energi ikat pada 395,3, 399,1, dan 402,2 eV, sesuai dengan N seperti piridin, N pirolat, dan N kuaterner, masing-masing [41]. Dekonvolusi O1s menunjukkan puncak C-O dan O-H (Gbr. 3d), menunjukkan adanya gugus karboksilat besar pada permukaan CQD.

Properti Fotofisik CQDs@PtPor

Penyerapan UV-Vis dan spektrum fluoresensi dijalankan untuk menyelidiki sifat fotofisika komposit. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, komposit CQDs@PtPor menunjukkan puncak karakteristik dari CQD dan porfirin. Misalnya, puncak penyerapan yang signifikan sekitar 360 nm mungkin ditugaskan untuk transisi n → π* dari CQDs [42], sedangkan puncak sekitar pada 425 nm, 520 nm, dan 580 nm dikaitkan dengan soret dan pita Q dari porfirin. , masing-masing. Larutan berair CQD menunjukkan emisi biru di bawah penyinaran lampu ultraviolet (UV) 365 nm. Selain itu, CQD menunjukkan perilaku PL yang bergantung pada eksitasi, di mana puncak emisi bergeser dari 460 menjadi 552 nm ketika panjang gelombang eksitasi berubah dari 280 menjadi 500 nm, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4b. Hasil kuantum fluoresensi dari CQD yang disiapkan adalah 36% dengan kina sulfat sebagai referensi.

Penyerapan UV-Vis (a ) dan fluoresensi (b ) spektrum CQDs, PtPor, dan CQDs@PtPor. Spektrum fluoresensi (c ) dari CQD dengan panjang gelombang eksitasi yang berbeda. Peluruhan fluoresensi (d ) dari CQD dan CQD@PtPor. Konsentrasi sampel:CQDs (5 g/mL), CQDs@PtPor (5 g/mL, 3 g/mL), dan PtPor (3 g/mL)

Diskusi

Efek transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) dalam komposit CQDs@PtPor dapat diselidiki dengan membandingkan intensitas fluoresensi CQDs@PtPor dengan CQDs dan PtPor. Spektrum fluoresensi dan intensitas CQDs, PtPor, dan CQDs@PtPor dengan konsentrasi yang sama diukur di bawah eksitasi 360 nm (Gbr. 4c). Karena CQD menunjukkan penyerapan yang sangat kuat pada 360 nm (Gbr. 4a) dengan hasil kuantum PL setinggi 36%, ia memancarkan fluoresensi yang sangat kuat. Sebaliknya, karena penyerapan PtPor pada 360 nm sangat rendah, dan hasil kuantum PL-nya kurang dari 1%, PtPor menunjukkan emisi yang sangat lemah. Hebatnya, intensitas emisi biru (500 nm) di CQDs@PtPor jelas menurun dibandingkan dengan CQD bebas, sedangkan emisi merah (660 nm) meningkat secara signifikan relatif terhadap PtPor saja, menunjukkan transfer energi yang efisien dalam komposit CQDs@PtPor . Masa pakai fluoresensi CQD dalam komposit CQDs@PtPor menurun relatif terhadap CQD bebas, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4d. Penurunan nyata dalam masa pakai donor lebih lanjut menunjukkan transfer energi resonansi efektif dari CQD ke PtPor dalam komposit CQDs@PtPor.

Karena produksi oksigen singlet merupakan faktor kunci dalam PDT, ¹ O₂ generasi ditentukan dengan metode kimia menggunakan 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) sebagai ¹ O₂ pemulung. Secara umum, intensitas penyerapan DPBF akan menurun secara bertahap dengan adanya oksigen singlet. Oleh karena itu, tingkat penurunan intensitas penyerapan DPBF dapat digunakan untuk mengevaluasi hasil relatif oksigen singlet. Dalam percobaan ini, CQD (5 mg/mL), PtPor (5 mg/mL), atau CQDs@PtPor (5 mg/mL) masing-masing dicampur dengan DPBF (10 mM), dilanjutkan dengan penyinaran dengan lampu xenon. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, setelah penambahan CQD, penyerapan DPBF tidak menunjukkan perubahan dengan perpanjangan waktu penyinaran, menunjukkan bahwa CQD tidak memiliki produksi oksigen singlet yang signifikan. Selain itu, komposit CQDs@PtPor menunjukkan degradasi yang sangat jelas terhadap DPBF, yang jauh lebih tinggi daripada PtPor, menunjukkan bahwa ¹ O₂ hasil porfirin dapat ditingkatkan di bawah peran CQD. Sedangkan produksi ¹ O₂ selanjutnya diukur menggunakan reagen dichlorofluorescein (DCFH). Fluoresensi hijau (λ_em = 525 nm) DCFH diketahui meningkat secara kuantitatif ketika bereaksi dengan ¹ O₂ dihasilkan dari fotosensitizer. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5b, komposit CQDs@PtPor menunjukkan efisiensi yang lebih tinggi dari ¹ O₂ produksi dari PtPor murni. Hasil ini sangat konsisten dengan yang diperoleh dengan metode DPBF.

Pembuatan oksigen tunggal CQD, PtPor, dan CQDs@PtPor dari metode DPBF (a ) dan metode DCFH (b )

Sitotoksisitas CQDs, PtPor, dan CQDs@PtPor pada sel HeLa diuji melalui uji methylthiazolyltetrazolium (MTT). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, ketiga sampel menunjukkan sitotoksisitas yang dapat diabaikan terhadap sel HeLa setelah perawatan selama 24 jam dalam gelap. Lebih dari 90% sel kanker masih hidup dengan konsentrasi yang meningkat menjadi 50 g/mL, menunjukkan bahwa ketiga sampel tidak memiliki efek buruk pada sel kanker dalam gelap. Selain itu, fotositotoksisitas dari tiga sampel dievaluasi lebih lanjut menggunakan metode serupa. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 6b, setelah pengobatan sel kanker dengan CQDs@PtPor selama 24 jam diikuti dengan penyinaran cahaya, viabilitas sel menurun secara bertahap dengan peningkatan konsentrasi sampel. Ketika konsentrasi CQDs@PtPor adalah 50 g/mL, tingkat kelangsungan hidup sel kanker hanya 8%, yang tampaknya lebih rendah daripada PtPor saja (18%) dan CQD (90%). Artinya, komposit CQDs@PtPor menunjukkan kemanjuran terapeutik yang lebih kuat daripada PtPor saja, menunjukkan bahwa CQDs@PtPor lebih menguntungkan daripada formulasi konvensional, yang mungkin dianggap berasal dari peningkatan efisiensi pembangkitan oksigen tunggal PtPor oleh CQD.

Sitotoksisitas gelap (a ) dan fotositotoksisitas (b ) dari CQD, PtPor, dan CQDs@PtPor pada konsentrasi yang berbeda

Serapan seluler CQD murni, PtPor, dan CQDs@PtPor dipelajari menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal di bawah eksitasi laser 405-nm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, komposit CQDs@PtPor terutama didistribusikan di sitoplasma sel HeLa. Selain itu, pencitraan fluoresensi biru dari CQD hampir tumpang tindih dengan emisi merah dari PtPor dalam komposit CQD @ PtPor, menunjukkan bahwa CQD dan PtPor tetap dalam keadaan mengikat setelah komposit CQD @ PtPor masuk ke dalam sel. Hasil ini memverifikasi bahwa komposit CQDs@PtPor stabil di lingkungan seluler dan masih dapat melakukan transfer energi resonansi fluoresensi dalam sel.

Gambar mikroskop fluoresensi confocal sel HeLa di bawah eksitasi 405 nm setelah perawatan dengan 50 g/mL CQD murni (a –c ), PtPor (d –f ), dan CQDs@PtPor (g –i ) selama 24 jam. a , d , g Lapangan cerah. b , e , h Saluran pencitraan CQD, terdeteksi pada wilayah panjang gelombang 410–450 nm. c , f , i Saluran pencitraan PtPor, terdeteksi dengan wilayah lintasan panjang 590 nm; (bilah skala =20 m)

Kesimpulan

Agen nano theranostik baru (CQDs@PtPor) berhasil dirancang dan dikembangkan melalui interaksi elektrostatik antara kompleks porfirin tetraplatinasi (PtPor) dan CQD bermuatan negatif. Komposit CQDs@PtPor yang disiapkan menunjukkan dispersibilitas air yang tinggi, stabilitas dan biokompatibilitas yang baik, dan deteksi fluoresensi fotosensitizer yang ditingkatkan. Efek PDT dari CQDs@PtPor ditingkatkan secara signifikan dibandingkan dengan PtPor saja, menunjukkan bahwa CQDs@PtPor lebih menguntungkan dibandingkan formulasi konvensional karena peningkatan efisiensi ¹ O₂ generasi PtPor oleh CQDs. Dengan demikian, agen nano berbasis CQD ini menunjukkan peningkatan kemanjuran terapeutik pada sel kanker serta efek samping yang rendah secara in vitro, menunjukkan potensi besar untuk aplikasi di klinik untuk mengobati pasien kanker dalam waktu dekat.

Riwayat perubahan

Singkatan

CA:

Asam sitrat

CQD:

Titik kuantum karbon

DPBF:

1,3-Difenilisobenzofuran

EDA:

Etilendiamina

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

PDT:

Terapi fotodinamik

PS:

Fotosensitizer

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

UV:

Ultraviolet

XPS:

Spektroskopi fotoelektron sinar-X

XRD:

difraksi sinar-X

Transportasi Spin-Polarized dan Efek Seebeck Spin pada Titik Kuantum Tiga dengan Kopling Interdot Bergantung-Putar Sintesis Solusi Mudah dari Nanopartikel Fosfor Merah untuk Anoda Baterai Lithium Ion