Fluorescent Neoglycoprotein Gold Nanoclusters:Sintesis dan Aplikasi dalam Penginderaan Lectin Tumbuhan dan Pencitraan Sel
Abstrak
Interaksi karbohidrat-protein memediasi proses biologis mendasar, seperti fertilisasi, pensinyalan sel, atau komunikasi inang-patogen. Namun, karena kompleksitas yang sangat besar dari peristiwa pengenalan glikan, alat baru yang memungkinkan analisis atau aplikasinya muncul dalam beberapa tahun terakhir. Di sini, kami menjelaskan persiapan pertama neoglikoprotein yang difungsikan sebagai nanocluster emas fluoresen, yang mengandung biantennary N-glycan G0 sebagai molekul penargetan, ovalbumin sebagai antigen pembawa/model, dan inti emas fluoresen sebagai probe pencitraan (G0-OVA-AuNCs). Selanjutnya, kami mendemonstrasikan kegunaan G0-OVA-AuNCs yang dihasilkan untuk penginderaan spesifik lektin tanaman dan pencitraan in vitro sel dendritik.
Pengantar
Nanocluster emas (AuNCs) yang dibentuk oleh sepuluh hingga seratus atom emas telah menarik perhatian komunitas ilmiah karena sifat kimia dan fisiknya yang menarik [1]. Lebih kecil dari 3 nm, nanokluster emas mendekati panjang gelombang elektron Fermi sehingga menimbulkan emisi fluoresensi yang bergantung pada ukuran dan menawarkan peluang sebagai probe penginderaan dan pencitraan untuk aplikasi in vitro dan in vivo [2,3,4]. Tes fluoresen saat ini sebagian besar melibatkan pewarna organik, seperti rhodamin atau fluorescein, atau titik kuantum yang lebih jarang [5,6,7]. Namun, karena stabilitas fotokimia rendah, fluoresensi sensitif pH, atau kelarutan air yang buruk dari beberapa pewarna organik dan toksisitas titik kuantum, penggunaannya dapat dikompromikan [8]. Dalam konteks ini, nanocluster emas dapat dianggap sebagai fluorofor ultra-kecil alternatif, yang tidak memiliki keterbatasan yang disebutkan di atas. Selanjutnya, AuNCs dicirikan oleh pergeseran Stokes yang besar dan panjang gelombang emisi fluoresensi dari merah terlihat ke daerah inframerah dekat (IR) yang sangat menguntungkan dalam bioimaging karena tumpang tindih dengan jendela transparansi jaringan [8,9,10].
Sintesis berbantuan protein dari nanocluster emas pertama kali dilaporkan pada tahun 2009 menggunakan bovine serum albumin (BSA) [11] dan sejak itu, nanocluster yang dilindungi protein yang larut dalam air telah menjadi tren yang muncul dalam nanosains [9, 12, 13]. Jauh lebih sedikit perhatian telah diberikan pada glikoprotein [14] untuk persiapan AuNCs dan kami tidak mengetahui adanya laporan yang menggambarkan pembentukan AuNCs dari neoglikoprotein sintetis sebagai perancah. Secara umum, glikosilasi memodulasi sifat fisikokimia glikoprotein, misalnya lipat, waktu hidup sirkulasi, atau stabilitas. Ini juga mempengaruhi fungsi biologis penting dari protein, seperti pengenalan reseptor-ligan. Dengan demikian, generasi neoglikoprotein sintetik dari protein, dengan perlekatan kimia dari karbohidrat yang dirancang dan dikarakterisasi dengan hati-hati [15], dapat melengkapinya dengan sifat fungsional baru untuk aplikasi biologis. Karena karbohidrat berpartisipasi dalam sejumlah besar proses biologis yang berbeda melalui interaksi dengan protein pengikat karbohidrat [16, 17], kami membayangkan nanocluster emas neoglikoprotein sebagai probe baru untuk mempelajari dan mengeksploitasi peristiwa pengenalan karbohidrat baik secara in vitro maupun in vivo [18]. Dalam hal ini, keberadaan beberapa salinan glikan pada permukaan protein memberikan presentasi karbohidrat yang multivalen dengan peningkatan afinitas pengikatan berikutnya.
Di sini, kami mengeksplorasi penggunaan self-fluorescent neoglikoprotein yang difungsikan AuNCs sebagai probe penginderaan untuk lektin tanaman dan sebagai reagen penargetan reseptor lektin untuk pencitraan in vitro sel dendritik (DC). Lektin adalah protein pengikat karbohidrat yang membantu dalam berbagai fenomena pengenalan biologis. Pada tumbuhan tingkat tinggi, misalnya, lektin mencegah organisme pemakan tumbuhan dengan mengenali dan mengaglutinasi glikoprotein asing, menghambat pertumbuhan dan multiplikasinya [19]. Di DC mamalia, di sisi lain, reseptor lektin tipe-C (CLR) diekspresikan pada permukaan sel, memainkan peran utama dalam pengenalan patogen [20]. Antigen yang dihias dengan glikan dikenali oleh CLR spesifik, untuk diendositosis lebih lanjut, diproses, dan akhirnya disajikan ke sel T yang menginduksi respons imun spesifik. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menunjukkan [21] bahwa fungsionalisasi model antigen, ovalbumin (OVA), dengan GlcNAc biantennary sintetis yang mengakhiri N-glycan G0 meningkatkan penargetan ke DC dan pengambilan dan presentasi antigen berikutnya. Kami mendalilkan bahwa fenomena yang disebutkan di atas diprakarsai oleh interaksi G0 glikan dan reseptor lektin tipe-C endositik yang diekspresikan pada permukaan DC. Akibatnya, kami percaya bahwa nanocluster emas G0-OVA fluoresen dan multivalen dapat menjadi alternatif untuk G0-OVA berlabel fluoresen yang diterapkan dalam penelitian kami sebelumnya dan dapat digunakan sebagai alat baru untuk visualisasi DC. Selain itu, penargetan DC yang dimediasi glikan yang memungkinkan inisiasi respons imun sel T yang kuat dapat digunakan untuk meningkatkan kemanjuran kandidat vaksin [22,23,24]. Dalam studi awal ini, kami akan menyajikan sintesis nanokluster emas mulai dari neoglikoprotein dan evaluasi fungsionalitas dan aksesibilitas glikan G0 menggunakan eksperimen aglutinasi lektin. Terakhir, kami akan mendemonstrasikan potensi nanokluster emas fluoresen untuk pencitraan sel dendritik.
Hasil dan Diskusi
Kami mengoptimalkan sintesis nanocluster emas ovalbumin yang didekorasi dengan G0 glikan (G0-OVA-AuNCs) berdasarkan laporan sebelumnya yang menggunakan protein OVA tak terkonjugasi [25, 26]. AuNC yang dilindungi protein dibuat dengan penambahan asam tetrakloroaurat (III) emas (HAuCl4
.
3H2 O) ke dalam larutan protein, diikuti dengan 1 M larutan natrium hidroksida dalam air. Peningkatan pH reaksi meningkatkan potensi reduksi residu triptofan dan tirosin yang ada dalam OVA (Gbr. 1a) [14]. Perancah protein bertindak sebagai reagen reduktif dan penstabil, menjebak gugus emas kecil di dalam struktur protein dan mengisolasinya dari lingkungan. Protokol sebelumnya untuk sintesis fluorescent OVA-AuNCs memerlukan larutan OVA yang sangat pekat (hingga 65 mg mL
−1
) [25]. Untuk membatasi penggunaan neoglikokonjugat OVA yang berharga untuk persiapan AuNCs, kami menentukan jumlah minimum OVA tak terkonjugasi yang dapat secara efisien menghasilkan OVA-AuNCs. Kami menemukan bahwa konsentrasi OVA 15 mg mL
−1
cukup untuk menghasilkan cluster dengan emisi fluoresensi yang kuat (File tambahan 1:Gambar S1). Pembentukan OVA-AuNCs secara signifikan dipercepat oleh iradiasi gelombang mikro yang mengurangi waktu reaksi dari 18 jam menjadi 6 menit [25]. Selain itu, iradiasi gelombang mikro memberikan pemanasan homogen pada larutan yang mendukung pembentukan kluster yang seragam dan monodispersi [1]. OVA-AuNCs disiapkan dengan cara ini menunjukkan warna coklat pucat dan memancarkan fluoresensi merah yang kuat di bawah penerangan sinar UV (Gbr. 1b). Spektrum UV-Vis dari OVA-AuNCs tidak memiliki absorbansi yang sesuai dengan pita resonansi plasmon permukaan lokal yang menunjukkan tidak adanya nanopartikel emas yang lebih besar dari 5 nm [27] yang selanjutnya dikonfirmasi oleh mikroskop elektron transmisi (TEM). Kami mengukur diameter rata-rata inti emas OVA-AuNCs dalam kisaran 1,9 ± 0,7 nm (File tambahan 1:Gambar S2). Akhirnya, ukuran hidrodinamik rata-rata OVA-AuNCs sebesar 8,7 nm ± 2,5 nm ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (File tambahan 1:Gambar S2). Rentang ukurannya yang mirip dengan OVA (diameter 6,5-7 nm [28]) menunjukkan adanya molekul protein tunggal per inti emas. Analisis lebih lanjut dari OVA-AuNCs dengan elektroforesis gel agarosa menunjukkan mobilitas yang sama untuk OVA dan OVA-AuNCs menuju elektroda positif yang selanjutnya menegaskan ukuran yang sama untuk kedua spesies dan muatan negatifnya pada pH netral (Gbr. 1c). Spektrum emisi fluoresensi OVA-AuNCs menunjukkan puncak emisi maksimum pada 670 nm setelah eksitasi pada 350 nm (Gbr. 1d). Spektrum eksitasi AuNCs luas dan Stokes bergeser besar (di atas 200 nm) yang ideal untuk aplikasi deteksi spektral multiwarna dengan adanya probe fluoresen lain (multipleks) yang dicirikan oleh panjang gelombang eksitasi serupa, seperti pewarna Alexa Fluor® 405 yang memancarkan biru [26]. Hasil kuantum (QY) dari OVA-AuNCs dihitung menjadi 4% ketika fluorescein dalam 0,1 M NaOH (QY = ≈ 92%) digunakan sebagai standar referensi [29]. Keadaan oksidasi inti emas ditetapkan untuk campuran spesies Au(I) dan Au(0) berdasarkan pengukuran spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) (File tambahan 1:Gambar S3) [11, 30]. Studi tentang struktur sekunder protein dichroism melingkar (CD) mengungkapkan organisasi kumparan acak menunjukkan hilangnya lipatan asli untuk OVA di AuNCs mungkin karena kondisi basa yang keras selama sintesis (File tambahan 1:Gambar S4) [31]. Akhirnya, kami juga telah mengamati stabilitas luar biasa dari OVA-AuNCs dalam kisaran pH yang luas (3-11) serta dalam larutan yang mengandung serum fetal bovine serum (FBS), suplemen serum yang paling umum digunakan untuk kultur sel in vitro. (File tambahan 1:Gambar S5). Fitur nanocluster emas OVA ini menyoroti kegunaannya untuk bioassay in vitro dan in vivo dan membuka aplikasi baru yang menarik. Misalnya, emisi fluoresensi pH-insensitif dari OVA-AuNCs dapat memungkinkan pelacakan partikel yang efisien di dalam sel tanpa kehilangan sinyal bahkan di dalam kompartemen endosom, yang ditandai dengan pH yang sedikit asam [32, 33]. Sebaliknya, di bawah kondisi ini, penggunaan konjugat fluorescein tertentu dapat dikompromikan, karena emisi fluoresensi maksimal pewarna ini dicapai pada pH dasar. OVA-AuNCs juga menunjukkan kelarutan yang sangat baik baik dalam air maupun dalam media pertumbuhan sel. Kelarutan lengkap OVA-AuNCs diamati hingga konsentrasi 40 mg/mL baik dalam air maupun dalam media pertumbuhan sel. (File tambahan 1:Gambar S6). Spektrum emisi fluoresensi pada pengenceran OVA-AuNCs yang berbeda diukur dan diperiksa agar stabil di bawah inkubasi pada 37 °C hingga 24 jam.
a Representasi skematis sintesis OVA-AuNCs. b Spektrum UV-terlihat dari OVA (garis biru) dan OVA-AuNCs (garis oranye). Sisipkan:gambar OVA-AuNCs (a ) dan OVA (b ) di bawah penerangan cahaya tampak (kiri) dan di bawah penerangan sinar UV (365 nm) (kanan). c Elektroforesis gel agarosa dari OVA (diwarnai dengan Coomassie Blue G-250) dan OVA-AuNCs (di bawah penerangan sinar UV). d Eksitasi fluoresensi (garis hijau) dan spektrum emisi (garis merah muda) dari OVA-AuNCs
Untuk sintesis AuNCs yang dilindungi neoglikoprotein G0-OVA, kami awalnya menyiapkan neoglikoprotein OVA yang difungsikan G0. N-glycan G0 biantennary yang dilengkapi dengan penghubung amino C5 disintesis seperti yang dijelaskan sebelumnya [34] dan konjugasi dengan OVA dicapai dengan menggunakan disuccinimidyl suberate ester (DSS) sebagai reagen pengikat silang (Gbr. 2a) [21, 35]. Singkatnya, konjugasi dilakukan dalam reaksi dua langkah:N-glycan G0 difungsikan dengan kelebihan 13 kali lipat penaut DSS dan kemudian digabungkan ke gugus amino bebas pada OVA. Dengan mengontrol rasio glikan/protein, kami dapat secara efektif menyesuaikan tingkat substitusi OVA (lihat SI). Keberhasilan pembentukan neoglikoprotein dibuktikan dengan munculnya pita migrasi yang lambat secara elektroforesis difus pada gel SDS-PAGE (Gbr. 2b), sedangkan jumlah rata-rata glikan yang dimasukkan selanjutnya ditentukan oleh spektrometri massa MALDI-TOF [21] (Gbr. .2c). Mengikuti strategi ini, kami memproduksi neoglikokonjugat OVA yang menampilkan 2-3, 3-4, dan 5-6 salinan N-glycan G0 per protein.
a Sintesis neoglikokonjugat G0-OVA (n =valensi). b Elektroforesis gel SDS-PAGE dari neoglikoprotein OVA dan G0-OVA yang mengandung valensi N-glikan G0 yang berbeda. c Spektrum massa MALDI-TOF neoglikoprotein OVA dan G0-OVA yang mengandung valensi N-glikan G0 yang berbeda
Selanjutnya, kami menggunakan neoglikoprotein sintetis dalam persiapan AuNCs (Gbr. 3a) di bawah kondisi yang dioptimalkan sebelumnya dan menyelidiki efek fungsionalisasi glikan dan valensinya pada sifat fisik dan optik cluster. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3, penyerapan UV-Vis dan emisi fluoresensi G0-OVA-AuNCs identik dengan OVA-AuNCs dengan absorbansi karakteristik pada 278 nm dan emisi fluoresensi merah dengan maksimum sekitar 670 nm (Gbr. 3b, c).
a Representasi skematis dari sintesis OVA-AuNCs yang diturunkan dari glikan. b Spektrum emisi fluoresensi G0-OVA-AuNCs (garis biru, oranye dan hijau) dibandingkan dengan OVA-AuNCs (garis merah muda). c Spektrum UV-terlihat dari G0-OVA-AuNC (garis biru, oranye dan hijau) dan OVA-AuNC (garis merah muda)
Selanjutnya, dengan pengukuran TEM, kami menetapkan diameter rata-rata 1,6 ± 0,5 nm (Gbr. 4) untuk inti G0-OVA-AuNCs, yang sebanding dengan ukuran OVA-AuNCs (1,9 ± 0,7 nm). Jadi, berdasarkan hasil kami, kami berpikir bahwa glikan terkonjugasi ke OVA melalui residu lisin atau N-terminus tidak mempengaruhi potensi reduktif keseluruhan glikoprotein dan pembentukan lebih lanjut dari cluster pada valensi yang diuji [36]. Selain itu, gula tampaknya tidak menghambat pembentukan polimer tiolat Au (I) yang menstabilkan gugus [37, 38] antara gugus sistein dari protein dan inti emas, bahkan jika jumlahnya lebih banyak (5–6 salinan).
Gambar TEM G0-OVA-AuNCs (3/4). Sisipan:distribusi ukuran diameter inti emas G0-OVA-AuNCs (3/4)
Akhirnya, dengan cara yang sama seperti OVA-AuNCs, struktur sekunder protein G0-OVA-AuNCs (3/4) ditetapkan oleh CD dan mengungkapkan organisasi koil acak (File tambahan 1:Gambar S4). Namun, dengan penempelan glycans ke perancah protein AuNCs, kami memperkenalkan molekul penargetan yang memungkinkan interaksi dengan protein pengikat karbohidrat dan pada saat yang sama, protein OVA tetap hanya sebagai pembawa yang perubahan konformasinya tidak akan mengubah pengenalan lektin dari sistem keseluruhan. Kapasitas antigenik OVA terdenaturasi dalam produksi antibodi pada tikus [39] dan dalam aktivasi sel T telah dijelaskan. Aktivasi sel T tidak bergantung pada struktur sekunder antigen karena dimediasi melalui pengenalan urutan asam amino tertentu yang disajikan dalam OVA asli dan terdenaturasi [40]. Faktanya, antigen OVA 323-339 peptida bertanggung jawab atas respons sel T spesifik utama terhadap OVA dan peptida ini telah digunakan dalam nanopartikel untuk menginduksi respons imun [41].
Untuk menyelidiki fungsionalitas rantai glikan yang baru diperkenalkan pada nanocluster emas yang dilindungi neoglikoprotein, kami memeriksa interaksinya dengan lektin tanaman yang berbeda dalam eksperimen aglutinasi. Kami melakukan inkubasi G0-OVA-AuNCs dan OVA-AuNCs dengan dua lektin tumbuhan yang berbeda, Bandeiraea simplicifolia lectin-II (BSL-II) khusus untuk gugus terminal GlcNAc dan Solanum tuberosum lektin (STL), mengenali inti chitobiose yang ada di N-glycans [34, 42]. Selain dan untuk membuang interaksi non-spesifik antara G0-OVA-AuNCs dan lektin, Aleuria aurantia lektin (AAL) khusus untuk L-fucose dimasukkan sebagai kontrol. Kami menambahkan peningkatan konsentrasi lektin BSL-II, STL, dan AAL ke dalam larutan G0-OVA-AuNCs (5/6). Setelah inkubasi dalam gelap, larutan disentrifugasi dan fluoresensi supernatan diukur. Seperti yang ditunjukkan pada Gbr. 5, kita dapat mengamati penurunan intensitas fluoresensi dengan cara yang bergantung pada konsentrasi setelah inkubasi dengan BSL-II dan STL (Gbr. 5a–d), sedangkan intensitas fluoresensi tetap tidak berubah dengan adanya AAL (Gbr. .5e). Setelah inkubasi G0-OVA-AuNCs (5/6) dengan STL, terlihat endapan di bawah penyinaran lampu UV, sedangkan tidak ada pengendapan yang muncul pada inkubasi dengan AAL (Gbr. 5f). Hubungan nilai fluoresensi awal (F0) dengan nilai akhir (F) setelah inkubasi lektin direpresentasikan terhadap peningkatan konsentrasi lektin (Gbr. 5b, d). Interaksi STL dengan G0-OVA-AuNCs (5/6) menunjukkan linearitas dari 0 hingga 7,5 μM dan batas deteksi dihitung berdasarkan persamaan SD*3/S (dengan SD adalah standar deviasi kurva kalibrasi dan S adalah nilai kemiringan) [12, 13] menjadi 2,35 μM (y = 1,95x + 0.4266, R
2
= 0.97). Dengan cara yang sama, interaksi BSL-II dengan G0-OVA-AuNCs (5/6) menunjukkan linearitas dari 0 hingga 10 μM dan batas deteksi (LOD) dihitung menjadi 2,83 μM (y = 0.5687x + 0,5838, R
2
= 0.965). Menariknya, kluster yang mengandung jumlah gula terkonjugasi yang lebih rendah seperti G0-OVA-AuNCs (2/3) (File tambahan 1:Gambar S7, AB) tidak menunjukkan perubahan signifikan dalam intensitas fluoresensi setelah penambahan BSL-II dan STL, menunjukkan kurangnya aglutinasi. Perilaku ini menyoroti efek penting dari presentasi multivalen glikan pada aktivitas ikatan silang lektin, bahkan ketika hanya perbedaan kecil dalam kepadatan glikan yang diterapkan. Yang penting, tidak ada perubahan dalam intensitas emisi fluoresensi dari OVA-AuNCs tak terkonjugasi yang diinkubasi dengan lektin yang diamati (File tambahan 1:Gambar S7, C-D). Meskipun OVA ayam asli mengandung satu situs glikosilasi N-linked (Asn-292) yang sebagian besar disubstitusi dengan mannose tinggi atau hibrida yang kurang melimpah dan tipe kompleks N-glycans [43], modifikasi gula ini tidak dikenali baik oleh STL maupun BSL-II. , mungkin karena presentasi monovalen. Ini mengkonfirmasi adanya interaksi karbohidrat-lektin spesifik antara G0 yang diperkenalkan secara kimia pada G0-OVA-AuNCs dan STL/BSL-II dan mengesampingkan pengikatan OVA-AuNCs yang tidak spesifik ke lektin. Kami membayangkan kemungkinan penerapan sistem ini untuk mendeteksi biomarker protein pengikat karbohidrat. Namun demikian, persiapan neoglikoprotein yang menampilkan jumlah salinan glikan yang tinggi akan meningkatkan aviditas konstruksi menuju lektin yang diinginkan meningkatkan batas deteksi [44].
Uji aglutinasi lektin dari G0-OVA-AuNCs (5/6). a Spektrum fluoresensi representatif dari supernatan larutan OVA-G0 (5/6)-AuNCs setelah inkubasi dengan BSL-II. b Representasi F0/F terhadap peningkatan konsentrasi BSL-II. c Spektrum fluoresensi representatif dari supernatan larutan OVA-G0 (5/6)-AuNCs setelah inkubasi dengan STL. d Representasi F0/F terhadap peningkatan konsentrasi STL. e Spektrum fluoresensi representatif dari supernatan OVA-G0 (5/6)-AuNCs setelah inkubasi dengan AAL. f Gambar yang sesuai dengan inkubasi G0-OVA-AuNCs (5/6) dengan AAL dan STL, di bawah penerangan sinar UV (365 nm). Setelah inkubasi dengan STL, endapan yang terlihat terbentuk. Di sebelah kanan:ilustrasi skema ikatan antara G0-OVA-AuNCs dan lektin tumbuhan
Kami juga mempelajari interaksi G0-OVA-AuNCs (5/6) dengan STL dengan adanya media pertumbuhan seluler untuk membedakan kemungkinan efek komponen media dalam interaksi protein karbohidrat. G0-OVA-AuNCs (5/6) dilarutkan dalam medium Dulbecco Iscove yang dimodifikasi lengkap (IMDM) yang dilengkapi dengan serum janin anak sapi dan diinkubasi dengan peningkatan jumlah STL; larutan yang dihasilkan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. (File tambahan 1:Gambar S8). Mobilitas elektroforesis G0-OVA-AuNCs (5/6) dipertahankan baik dalam air maupun dalam medium kompleks. Namun demikian, dengan adanya peningkatan jumlah STL, ada perpindahan tergantung dosis dari G0-OVA-AuNCs (5/6) ke kutub negatif yang menyoroti interaksi protein karbohidrat bahkan dengan adanya media seluler yang kompleks. Hal ini menunjukkan bahwa interaksi protein karbohidrat dengan G0-OVA-AuNCs (5/6) tidak terhalang oleh adanya komponen media.
Potensi cluster untuk pencitraan fluoresensi dan keberhasilan sebelumnya dengan penargetan DC oleh neoglikoprotein G0-OVA [21] mendorong kami untuk mempelajari G0-OVA-AuNCs dalam penyerapan oleh DC murine in vitro. Kami menggunakan mikroskop fluoresensi confocal untuk memvisualisasikan internalisasi self-fluorescent G0-OVA-AuNCs (3/4). DC limpa diisolasi dari tikus C57BL/6J dan CD11c
+
populasi dimurnikan dengan penyortiran sel yang diaktifkan magnet (MACS) (File tambahan 1:Gambar S9) dan diunggulkan pada kaca penutup berlapis poli-d-lisin semalaman. Sebagai bukti konsep, DC yang dimurnikan diinkubasi dengan G0-OVA-AuNCs (3/4), dicuci untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat, dan diperbaiki. Setelah 40 menit inkubasi, gambar mikroskop fluoresensi confocal diperoleh (Gbr. 6) dan kami mengamati fluoresensi kuat untuk sel dendritik yang diinkubasi dengan G0-OVA-AuNCs (3/4) yang menunjukkan internalisasi efektifnya (Gbr. 6a) dan kurangnya fluoresensi dalam kontrol negatif (CD11 yang tidak distimulasi
+
sel; File tambahan 1:Gambar S9). Internalisasi nanocluster dikonfirmasi lebih lanjut dengan menumpuk gambar DC tunggal yang diambil di sepanjang Z -sumbu (z-stack) dan dengan rekonstruksi gambar 3D DC tunggal untuk memvisualisasikan emisi fluoresensi yang berasal dari dalam sel (Gbr. 6b dan File tambahan 1:Gambar S10).
Serapan G0-OVA-AuNCs (3/4) oleh DC murine diukur dengan mikroskop confocal. a Gambar representatif dari CD11c
+
sel setelah inkubasi dengan G0-OVA-AuNCs (3/4). b Gambar tumpukan-Z dari sel dendritik tunggal yang mewakili penyerapan G0-OVA-AuNCs di dalam sel
Singkatnya, kami telah menyiapkan dan mengkarakterisasi nanocluster emas yang dilindungi neoglikoprotein yang telah digunakan dalam eksperimen aglutinasi dan dalam uji serapan DC. Pada contoh penginderaan lektin tanaman tertentu, kami telah menunjukkan kegunaan G0-OVA-AuNCs untuk analisis interaksi karbohidrat-protein. Kami juga menunjukkan pencitraan in vitro sel dendritik dengan mikroskop fluoresensi. Namun, percobaan lebih lanjut harus dilakukan untuk pertama lebih memahami peran glikan dalam penyerapan nanocluster oleh DC (misalnya, dengan mengikuti lokalisasi nanocluster di kompartemen seluler) dan kedua, untuk mempelajari bio dan sitokompatibilitasnya. Berdasarkan hasil kami sebelumnya yang menjelaskan sifat penargetan G0 glikan dan peningkatan penyerapan G0-OVA oleh DC dibandingkan dengan OVA tak terkonjugasi, kami percaya bahwa G0-OVA-AuNCs dapat menjadi alternatif yang menarik untuk neoglikoprotein berlabel fluoresen.
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, dalam studi awal ini, kami menyajikan sintesis pertama nanocluster emas yang dilindungi neoglikoprotein dan evaluasi sifat fisik dan optiknya dibandingkan dengan cluster protein tak terkonjugasi. Kami mengkonfirmasi aksesibilitas gula G0 pada AuNCs dalam uji aglutinasi melalui interaksi spesifik dengan lektin tanaman, yang juga menyoroti pentingnya kepadatan glikan minimal untuk aktivitas ikatan silang yang efektif dari lektin. Sebagai bukti konsep, kami juga menunjukkan kesesuaian G0-OVA-AuNCs dalam pencitraan DC murine model.
Kami percaya bahwa AuNCs yang berfungsi neoglikoprotein self-fluorescent dapat menjadi alat yang menarik yang memungkinkan analisis dan aplikasi interaksi karbohidrat-protein. Berdasarkan sifat fisik dan kimianya yang unik, seperti pergeseran Stokes yang besar, kelarutan dalam air, atau stabilitas pH, G0-OVA-AuNCs dapat menjadi alternatif untuk label pewarna organik dan digunakan untuk visualisasi DC, studi penyerapan yang dimediasi karbohidrat, dan tanaman. penginderaan lektin. Akhirnya, dengan menggunakan pembawa imunogenik seperti OVA untuk perlekatan glycans, nanocluster emas yang difungsikan neoglikoprotein tidak hanya memungkinkan studi mendalam tentang pengambilan, pemrosesan, dan penyajian antigen, tetapi juga di masa depan, dapat menemukan aplikasi sebagai terapi fluoresen atau molekul adjuvant.
Metode/Eksperimental
Materi
Semua larutan disiapkan dalam air murni nano (18 MΩ cm) dari sistem pemurnian air UV Diamond (Branstead International, IA, Madrid, Spanyol). Semua peralatan gelas yang digunakan dalam pembuatan AuNCs sebelumnya dicuci dengan larutan aqua regia (HNO3 :HCl, 1:3, v /v ) dan dibilas secara ekstensif dengan air murni nano. Emas (III) klorida trihidrat, natrium hidroksida, dan trietilamina dibeli dari Sigma Aldrich. Ovalbumin bebas LPS dibeli dari Hyglos (Bernried, Jerman). Disuccinimidyl suberate (DSS) dan DMSO dibeli dari Thermo Fisher Scientific. N-glycan G0 disintesis secara kimia seperti yang dijelaskan sebelumnya [21].
Sintesis AuNCs. Prosedur Umum
Ke larutan OVA atau neoglikoprotein yang diaduk (15 mg mL
−1
) dalam air murni nano, larutan 0,1 M encer HAuCl4 ·3H2 O (4,2 mM, konsentrasi akhir) ditambahkan tetes demi tetes. Campuran yang dihasilkan diaduk pada suhu kamar selama 5 menit dan larutan NaOH 1 M berair (konsentrasi akhir 150 mM) ditambahkan tetes demi tetes untuk meningkatkan pH campuran. Solusi yang dihasilkan diinkubasi pada 100 °C selama 6 menit dalam reaktor gelombang mikro Biotage® Initiator. Dialisis AuNC dilakukan pada kaset dialisis Slide-Z-lyser TM (10 K MWCO) dari Thermo Fisher Scientific di atas air nanopure.
Spektrum emisi fluoresensi dari OVA yang disintesis dan AuNC yang dilindungi neoglikoprotein diukur menggunakan pelat Nunc™ 96-Well Polystyrene Black, pada pembaca Varioskan Flashmicroplate (Thermo Scientific) dengan panjang gelombang eksitasi pada 350 nm yang dioperasikan dengan Perangkat Lunak ScanIt.
Elektroforesis gel agarosa dari OVA-AuNCs dan protein OVA dilakukan dalam gel agarosa 0,75% pada 80 V selama 30 menit. Visualisasi AuNC yang dilindungi OVA dilakukan di bawah penyinaran sinar UV (365 nm) dan protein OVA diwarnai dengan Coomassie Blue G-250.
Pencitraan TEM dilakukan pada TEM emisi medan JOEL JEM-2100F dengan tegangan akselerasi 200 kV. Solusi AuNCs dijatuhkan ke grid TEM tembaga yang dilapisi dengan dukungan karbon ultra tipis (Ted Pella, Redding, USA). Diameter rata-rata nanocluster emas diukur menggunakan ImageJ (Java).
Inkubasi G0-OVA-AuNCs (5/6) dengan Plant Lektin
Sepuluh mikroliter G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL
−1
] dalam buffer TSM (20 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 , 2 mM MgCl2 , pH = 7.4) ditempatkan pada pelat hitam polistiren sumur Nunc™ 384. Selanjutnya, 10 μL Aleuria aurantia lektin (AAL), Solanum tuberosum lectin (STL), dan Bandeiraea simplicifolia lectin-II (BSL-II) dalam buffer TSM ditambahkan sehingga menghasilkan konsentrasi protein akhir 0, 2.5, 5, 7.5, 10 μM. Solusi yang sesuai diinkubasi semalaman dalam gelap di bawah pengocokan lembut. Larutan protein disentrifugasi pada 11.000 g selama 1 jam dan spektrum emisi fluoresensi supernatan direkam dengan pembaca lempeng mikro Varioskan Flash (Thermo Scientific) dengan panjang gelombang eksitasi pada 350 nm. Untuk mengamati pengendapan pada pembentukan kompleks AuNCs-lektin, percobaan kontrol dilakukan. Kemudian, 10 μL G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL
−1
] diinkubasi selama 1 jam dengan 10 L AAL dan STL [40 μM], diikuti dengan sentrifugasi pada 11.000 g (1 jam). Gambar diambil di bawah penyinaran sinar UV (365 nm).
Isolasi Sel Dendritik Limpa Tikus
Sel dendritik murine yang digunakan dalam semua percobaan diisolasi dari tikus C57BL/6J yang dibiakkan oleh Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastian, Spanyol). Protokol eksperimental hewan telah disetujui oleh komite etika hewan dari biomaGUNE CIC dan dilakukan sesuai dengan pedoman ARRIVE dan Arahan Uni Eropa tentang etika dan kesejahteraan hewan. Tikus dipelihara dalam kondisi kandang konvensional (22 ± 2 °C, 55 ± 10% kelembaban, dan siklus 12 jam siang/malam) dan diberi diet standar ad libitum. Tikus dibius dengan isofluran 2,5% dalam 100% O2 dan di-eutanasia dengan dislokasi serviks.
Limpa diperoleh dari tikus C57BL/6J (n = 3, betina, 27–28 minggu). Untuk mengisolasi splenosit, limpa dibilas dengan media Dulbecco yang dimodifikasi Iscove (IMDM) yang dilengkapi dengan 2 mM l-glutamin, 100 U/mL penisilin, 100 g/mL streptomisin, dan 10% serum janin janin (FCS; PAN Biotech). Suspensi sel tetap dingin dan disaring melalui saringan sel 40 m untuk menghilangkan agregat sel. Setelah sentrifugasi (300 g, 5 mnt, 4 °C), pelet sel disuspensikan kembali dalam 5 mL buffer lisis eritrosit yang baru disiapkan (10% 100 mM Tris pH 7,5 + 90% 160 mM NH4 Cl), dicampur perlahan, dan diinkubasi pada RT selama 2 menit. Sel dicuci dua kali dalam media IMDM lengkap dan disentrifugasi sebelum resuspensi dalam buffer MACS (PBS, 0, 5% BSA, 2 mM EDTA). Sel dendritik (CD11c
+
sel) diisolasi dari suspensi sel limpa murine C57BL/6 dengan penyortiran sel yang diaktifkan secara magnetis menggunakan CD11c
+
MicroBeads (Miltenyi). Sel diinkubasi dengan microbeads magnetik dimuat pada kolom MACS ditempatkan di medan magnet. Unbound cells passed through the column, while remaining CD11c
+
cells were washed with MACS buffer and eluted from the column. To increase DC purity, the CD11c
+
cell purification was repeated. The cell suspension was centrifuged, resuspended in IMDM complete medium, and counted.
Uptake of G0-OVA-AuNCs (3/4) by DCs
CD11c
+
cells from C57BL/6J mice (2 × 10
6
cells) were seeded on poly-d-lysine-coated glass cover-slips overnight. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL
−1
) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.
