Nanogel Berbasis PNIPAM Responsif Suhu dan pH untuk Pengiriman Terkontrol β-Lapakson dengan Dua Stimulus

Abstrak

Poly-N-isopropil akrilamida (PNIPAM) dikopolimerisasi dengan asam akrilik (AAc) untuk menyesuaikan suhu solusi kritis bawah (LCST). Nanogel PNIPAM-kon-AAc yang dihasilkan menunjukkan dua transisi fase volume yang berbeda, dengan LCST naik seiring meningkatnya kandungan AAc. Ketika dimuat dengan β-lapakson (β-LP), pengobatan obat dikendalikan oleh suhu dan pH, dan sangat dipengaruhi oleh rasio AAc. Secara signifikan, formulasi PNIPAM-kon-AAc20 mempertahankan <10 % pengobatan obat pada pH asam–netral dan suhu tubuh, sementara melepaskan >70 % pada pH basa. Temuan ini menunjukkan bahwa nanogel PNIPAM responsif suhu dan pH adalah penjanji pengiriman obat spesifik usus melalui pengadaan oral.

Pendahuluan

Nanokarier responsif stimulus semakin banyak digunakan dalam pengiriman obat, imaging, dan diagnostik. Di antaranya, pH, suhu, redoks, medan magnet, dan cahaya—suhu dan pH tetap paling banyak dimanfaatkan untuk pengobatan terkontrol. PNIPAM, polimer termoresponsif, runtuh di atas LCST-nya (~32 °C) karena interaksi hidrofobik, sedangkan grup karboksil deprotonasi dalam AAc memperkenalkan repulsi elektrostatik tambahan yang menggeser LCST ke atas. Kopolimerisasi PNIPAM dengan AAc oleh karena itu menawarkan platform yang dapat disesuaikan yang dapat merespons baik suhu maupun pH. β-Lapakson, agen anti-kanker alami, memiliki jendela terapeutik yang terbatas karena metabolisme cepat dan toksisitas off-target; enkapsulasi dalam nanogel responsif dapat mengurangi kekurangan ini. Dalam penelitian ini, kami melaporkan sintesis nanogel PNIPAM-kon-AAc dengan berbagai kandungan AAc, perilaku pengobatan obat dengan dua stimulus, dan efikasi sitotoksiknya dalam sel fibroblas.

Metode

Bahan

NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich), N,N′-metilenbisakrilamida (MBA), AAc, air tisu, EtOH, persulfat kalium (KPS, 98 %, Dae Jung), β-LP (Natural Products), dan PBS bergrado analitik dan digunakan sebagaimana adanya.

Sintesis Nanogel PNIPAM-kon-AAc

Dalam kolong 500 mL, 2,26 g NIPAM, 0,154 g MBA, dan 0–0,145 g AAc dilarutkan dalam 200 mL air pada 75 °C. Setelah pengeringan nitrogen, 37,5 mg KPS ditambahkan dan campuran direfluks selama 10 menit, menghasilkan larutan keruh. Polimer dialisis (12–14 kDa) selama 7 hari, beku dalam nitrogen cair, dan liofilisasi selama 3 hari untuk menghasilkan nanogel kering (PNIPAM, PNIPAM-kon-AAc5, PNIPAM-kon-AAc10, PNIPAM-kon-AAc20).

Pemuatan β-LP

1 mg nanogel kering dilarutkan dalam 1 mL EtOH, dan 0,1 mg β-LP ditambahkan. Campuran diaduk selama semalam dalam gelap, kemudian dialisis (6–8 kDa), dibeku, dan liofilisasi. Nanogel yang dimuat β-LP yang dihasilkan disimpan pada 4 °C.

Karakterisasi

Morfologi diperiksa dengan TEM (200 kV) dan FE-SEM (15 kV). Spektra FT-IR direkam pada spektrometer Nicolet 6700. Pemuatan dan pengobatan obat dikuantifikasi dengan spektroskopi UV–Vis (200–800 nm). LCST ditentukan oleh pencaran cahaya dinamis (DLS) pada kenaikan 1 °C dari 30 hingga 50 °C.

Studi Pengobatan Obat

10 mL nanogel yang dimuat β-LP ditempatkan dalam tabung dialisis 3,5 kDa dan diinkubasi pada 24 °C dan 37 °C dalam PBS pada pH 2, 4, 7,4, dan 8,0. Pada titik waktu tertentu (0–12 jam), 2 mL alikot diambil dan dianalisis dengan UV–Vis. Pengobatan kumulatif dihitung relatif terhadap total β-LP yang dimuat.

Uji Kelayakan Sel

Sel fibroblas NIH3T3 (2×10⁴ sel/well) diobati dengan β-LP bebas, PNIPAM-kon-AAc5-β-LP, atau PNIPAM-kon-AAc20-β-LP pada 0–20 µg/mL. Setelah 3 jam, uji MTT (595 nm) dan pewarnaan LIVE/DEAD® dilakukan untuk menilai sitotoksisitas.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan dan Morfologi

Citra TEM dan SEM (Fig. 1) mengungkapkan nanogel monodisperse dengan diameter rata-rata ~250 nm untuk PNIPAM-kon-AAc5. Potensi zeta menurun dari −13,6 mV (PNIPAM) menjadi −23,6 mV (PNIPAM-kon-AAc20), yang mencerminkan peningkatan grup karboksil permukaan.

Perilaku Responsif Suhu

Pengukuran DLS (Fig. 2) menunjukkan dua transisi kembang-runtuh yang berbeda. Transisi pertama dimulai pada ~30 °C, dan yang kedua muncul di dekat 40 °C, bergeser ke 45 °C untuk PNIPAM-kon-AAc20. Jadi, LCST naik seiring kandungan AAc, sesuai dengan laporan sebelumnya.

Pengobatan Obat dengan Dua Stimulus

Pada 37 °C, PNIPAM-kon-AAc20 melepaskan hanya ~61 % β-LP dalam 6 jam, sedangkan PNIPAM dan PNIPAM-kon-AAc5 melepaskan ~80 %. Pada pH 8,0, pengobatan dari PNIPAM-kon-AAc20 meningkat sekitar 10 % dibandingkan pH netral atau asam (Fig. 3). Hasil ini mengonfirmasi bahwa pengobatan obat ditingkatkan sinergis oleh pH basa dan suhu yang lebih tinggi.

Sitotoksisitas In Vitro

β-LP bebas mengurangi kelayakan sel lebih dari formulasi nanogel. PNIPAM-kon-AAc20 menunjukkan kelayakan sel yang lebih tinggi pada 20 µg/mL, berkorelasi dengan pengobatan obat yang lebih rendah pada 37 °C. Pewarnaan hidup/mati (Fig. 4) menunjukkan sitotoksisitas yang mencolok untuk PNIPAM-kon-AAc5-β-LP pada 3 jam, sementara PNIPAM-kon-AAc20-β-LP tetap sebagian besar tidak toksis hingga 6 jam pada pH 8,0, di mana kematian sel sinergis diamati.

Kesimpulan

Kami berhasil merancang nanogel PNIPAM-kon-AAc yang LCST-nya dapat diatur oleh kandungan AAc. Formulasi AAc tinggi (20 %) menunjukkan pengobatan β-LP yang minimal pada suhu fisiologis tetapi melepaskan obat secara efisien pada pH basa, mencerminkan lingkungan usus kecil. Karena itu, nanogel responsif dua stimulus ini mewakili platform yang menjanjikan untuk pengiriman obat oral yang menargetkan usus dari β-lapakson.