Fluorescent Nano-Biomass Dots:Ultrasonic-Assisted Extraction dan Aplikasinya sebagai Nanoprobe untuk deteksi Fe3+

Hasil dan Diskusi

Morfologi dan Komposisi Kimia

NBD telah disiapkan melalui metode UES; semua proses diilustrasikan dalam Skema 1. Ukuran dan morfologi NBD dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a dan b. Gambar TEM menunjukkan bahwa NBD hampir berbentuk bulat. Diameter NBD berkisar dari 1 hingga 3 nm dengan diameter rata-rata 2,4 nm, dan distribusi ukuran yang sesuai tercantum pada Gambar. 1c. Pinggiran kisi NBD tidak dapat diamati dari gambar TEM resolusi tinggi (sisipan Gambar 1b), yang menunjukkan sifat amorf NBD. Gambar mikroskop elektron transmisi medan gelap annular sudut tinggi (HAADF-STEM) dan pemetaan unsur yang sesuai (karbon, nitrogen, dan oksigen) dari NBD ditunjukkan pada Gambar. 1d–g. Terlihat bahwa unsur dominan dari NBD adalah karbon, nitrogen, dan oksigen. Selanjutnya, solid-state ¹³ Pengukuran resonansi magnetik nuklir (NMR) C dari NBD ditunjukkan pada Gambar 1h. Sinyal berkisar antara 160–180 ppm, dan puncak pada 164 ppm dan 170 ppm sesuai dengan ikatan C=O, yang menunjukkan sp ² atom karbon [25, 26].

Ilustrasi skema proses pembuatan NBD dari kedelai

Gambar TEM dari NBD (a ) dan (b ). c Distribusi ukuran partikel NBD. Gambar HAADF (d ) dan pemetaan distribusi unsur karbon yang sesuai (e ), nitrogen (f ), dan oksigen (g )

Untuk mempelajari lebih lanjut karakteristik struktural NBD, pola difraksi sinar-X (XRD) direkam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, pola XRD tipikal menampilkan puncak lebar yang terletak di sekitar 21,5 ^o dan puncak bahu sekitar 41,0 ^o , yang dapat dikaitkan dengan fase karbon amorf [27]. Selanjutnya, puncak serapan karakteristik kedelai dan NBD diselidiki dengan spektroskopi fourier-transform infrared (FTIR), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2(b). Pita serapan sekitar 3380 cm ⁻¹ dapat ditetapkan untuk getaran regangan O–H/–N–H, pita di sekitar 2906 cm ⁻¹ pada getaran uluran C–H, dan pita di sekitar 1650 cm ⁻¹ terhadap getaran ulur C=O. Puncaknya pada 1400 cm ⁻¹ dan 1071 cm ⁻¹ sesuai dengan getaran tekuk C-H dan C-O, masing-masing [28]. Ada perbedaan yang jelas antara spektrum kedelai dan NBD sekitar 1750 cm ⁻¹ , yang termasuk dalam vibrasi regangan ikatan C=O dari lipid dalam kedelai [29, 30]. Lipid yang tidak larut dalam larutan air dipisahkan dari sampel ketika direndam dalam air, yang menyebabkan hilangnya ikatan dalam spektrum FTIR dari NBDs. Ikatan C=O tereduksi dalam sampel berasal dari gugus karboksil dalam protein. Puncaknya berpusat di sekitar 1543 cm ⁻¹ juga menghilang, yang dapat dikaitkan dengan proteolisis dalam proses perendaman kedelai. Saat membandingkan semua puncak sebelum dan sesudah proses ultrasound, pembentukan gugus –OH, –C=O (amida I), dan –NH pada permukaan NBD dapat dilihat [31]. Hasil di atas menunjukkan adanya gugus hidroksil, amidogen, dan karboksilat pada permukaan NBD, dan gugus fungsi ini memainkan peran penting dalam hidrofilisitas dan stabilitas NBD dalam larutan berair. Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan untuk lebih menjelaskan komponen NBD, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c. Spektrum XPS menunjukkan tiga puncak kuat pada 532,0, 401.1, dan 286.1 eV, yang dapat dikaitkan dengan O 1s, N 1s (Gbr. 2d), dan C 1s (Gbr. 2e), masing-masing [32]. Hasil ini menunjukkan bahwa NBDs terutama mengandung C (64,33%), O (32,34%), dan N (2,72%), serta jumlah P yang terbatas, dan elemen P mungkin berasal dari fosfolipid kedelai [33] . Dalam spektrum XPS resolusi tinggi, spektrum C 1s menampilkan tiga puncak pada 287,6, 285,8, dan 284,6 eV, yang dapat ditetapkan ke C=O, C–O/C–N, dan C–C/C=C kelompok, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c. Ikatan C=O berasal dari gugus karboksil yang larut [24]. C–O/C=N dan C–C/C=C berasal dari karbon nitrit dan sp ² /sp ³ karbon, masing-masing [34]. Spektrum N 1s yang ditunjukkan pada Gambar. 2d menegaskan dua pita utama pada 399,5 eV dan 401,6 eV, mengungkapkan keberadaan piridinat N dan pirolat N, yang konsisten dengan analisis FTIR. Spektrum O 1s yang disajikan pada Gambar. 2f memiliki dua puncak pada 531.4 eV dan 533.0 eV, yang masing-masing dapat dikaitkan dengan gugus C–OH/C–O–C dan C=O [9].

a Pola XRD dari NBD. b Spektrum FTIR kedelai dan NBD. c Spektrum survei XPS dari NBD. Spektrum XPS resolusi tinggi dari C 1s (d ), N 1s (e ), dan O 1s (f )

Mekanisme yang mungkin untuk pembentukan NBD dari kedelai diusulkan berdasarkan analisis di atas. Pertama, beberapa partikel besar biomassa yang tersuspensi dalam larutan dipecah menjadi ukuran nanometer oleh gegar otak ultrasonik. Perubahan larutan sebelum dan sesudah perlakuan ekstraksi ultrasonik ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S1. Kemudian, protein dalam kedelai dihidrolisis menjadi peptida molekul kecil dan asam amino dalam proses di atas, dan banyak rantai peptida molekul kecil yang melekat pada biomassa ukuran nano untuk membentuk titik-titik biomassa fungsional permukaan yang sangat tinggi. Gugus fungsi pada permukaan titik biomassa adalah kontributor utama fluoresensi. Menurut mekanismenya, kacang hijau juga digunakan sebagai prekursor, dan NBD fluoresen biru juga diperoleh, seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S2.

Properti Optik

NBD menunjukkan sifat fluoresen yang bergantung pada eksitasi, dan ketika panjang gelombang eksitasi bervariasi dari 320 hingga 520 nm, puncak emisi bergeser merah secara bertahap, menunjukkan bahwa emisi NBD dapat disetel dengan mengubah panjang gelombang eksitasi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a. Larutan berair NBD transparan di bawah pencahayaan dalam ruangan dan menunjukkan fluoresensi biru di bawah iluminasi UV, seperti yang ditunjukkan pada sisipan Gambar 3b. Spektrum eksitasi fotoluminesensi (PLE) dari NBD ditampilkan di File tambahan 1:Gambar S3, dan panjang gelombang eksitasi optik berada dalam kisaran 360 hingga 420 nm. Untuk mengeksplorasi asal PL dari NBD, spektrum serapan UV-Vis dari NBD dengan konsentrasi yang berbeda telah dicatat pada suhu kamar (konsentrasi NBD dari bawah ke atas adalah 0,03, 0,06, 0,13, 0,25, 0,25, 0,50, 0,50 , 0,75, 1,00, dan 1,50 g/l), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b. Spektrum serapan UV-Vis dari NBD menunjukkan dua puncak serapan yang jelas masing-masing pada 270 nm dan 330 nm. Yang pertama dapat dikaitkan dengan -π ^* transisi ikatan C–C/C=C, sedangkan yang terakhir ke n-π ^* transisi ikatan C=O/N [35, 36]. Gugus fungsi ini adalah gugus kromogenik utama yang berkontribusi pada fluoresensi NBD [37, 38]. Spektrum PL kedelai selama ekstraksi ultrasonik ditunjukkan dalam file tambahan 1:Gambar S4, dan intensitas PL meningkat seiring waktu kemudian mencapai maksimum. Gambar 3c menunjukkan spektrum PL dari NBD yang diukur dari 80 hingga 300 K. NBD menunjukkan perilaku pendinginan termal yang khas, di mana semua puncak menurun secara monoton dalam intensitas dengan meningkatnya suhu. Perilaku PL ini dapat dikaitkan dengan peningkatan rekombinasi non-radiatif dan pengurangan rekombinasi radiasi dengan peningkatan suhu [39, 40]. Untuk mengevaluasi stabilitas NBD, fotostabilitas dan termostabilitas NBD telah dikarakterisasi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3d. Untuk fotostabilitas, gambar penyiapan pengukuran ditampilkan di File tambahan 1:Gambar S5. Nilai intensitas fluoresensi ditampilkan di File tambahan 1:Gambar S6 dan S7. Intensitas emisi NBD tetap di atas 90% di bawah penerangan lampu UV selama 6 h, menunjukkan fotostabilitas yang baik. Untuk termostabilitas, intensitas fluoresensi NBD sedikit berkurang ketika suhu bervariasi dari 20 hingga 80  ^° C, menunjukkan stabilitas termal yang tinggi.

a Spektrum fluoresensi NBD dengan panjang gelombang eksitasi berubah dari 320 menjadi 520 nm. b Spektrum serapan UV-Vis dari NBD. c Spektrum fluoresensi NBD pada suhu yang berbeda, inset adalah plot intensitas fluoresensi NBD sebagai fungsi suhu. d Intensitas fluoresensi dan gambar serbuk NBD di bawah penerangan lampu 365 nm untuk durasi yang berbeda dan serbuk NBD pada suhu pengukuran yang berbeda

Evaluasi Sitotoksisitas

Tes MTT digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas NBD. Viabilitas sel HeLa yang diinkubasi dengan NBD dan dua jenis CD lain yang disintesis melalui metode hidrotermal, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Seperti yang ditunjukkan pada gambar, viabilitas sel menurun sedikit ketika larutan NBD dimasukkan bahkan ketika konsentrasi NBD mencapai 800 μg/ml. Tingkat kelangsungan hidup sel adalah 70% dan 67% ketika sel HeLa diinkubasi dengan dua jenis CD lainnya pada konsentrasi 800 μg/ml. Jelas, NBD menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik daripada CD yang dibuat dari reagen kimia.

Viabilitas sel HeLa setelah 72 h inkubasi dengan konsentrasi NBD dan CD yang berbeda

Mengindra Properti NBD Menuju Fe ³⁺

Menariknya, fluoresensi NBD dapat dipadamkan secara efektif oleh Fe ³⁺ , seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, dan intensitas PL dari NBD menurun secara signifikan dengan peningkatan Fe ³⁺ konsentrasi. Selain itu, hubungan linier yang baik dapat diplot antara F₀ /F dan Fe ³⁺ konsentrasi mulai dari 0 hingga 30 μM (R ² = 0.99), di mana F₀ dan F adalah intensitas PL dari NBDs pada ex/em 370/445 nm dengan tidak adanya dan adanya Fe ³⁺ , seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b. Efisiensi pendinginan dilengkapi dengan Persamaan Stern-Volmer:

a Spektrum PL dari NBD dengan adanya konsentrasi Fe yang berbeda ^{3 +} . b Kurva kalibrasi sensor sebagai fungsi Fe ^{3 +} konsentrasi. c Intensitas fluoresensi NBD dengan adanya ion yang berbeda. d Gambar fotografi solusi NBD dengan ion logam berbeda di bawah pencahayaan dalam ruangan dan UV

dimana K _sv adalah konstanta pendinginan Stern-Volmer dan [Q ] adalah Fe ³⁺ konsentrasi. Persamaan regresi linier adalah Y = 0,0072X + 0.99479, R ² = 0,99. Batas deteksi (LOD) dari sensor yang diusulkan ditentukan sebagai 2,9 μM, yang lebih rendah dari tingkat Fe ³⁺ maksimum yang diizinkan. (5,37 μM) dalam air minum yang dibuat oleh Badan Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat (USEPA) [24]. Selektivitas adalah parameter penting lainnya untuk sensor kimia. Oleh karena itu, respons fluoresensi sensor terhadap beberapa ion logam yang mengganggu telah diselidiki, termasuk Ca ²⁺ , Cd ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ , Cr ³⁺ , Fe ³⁺ , Fe ²⁺ , Hg ²⁺ , Jn ²⁺ , Na ⁺ , Pb ²⁺ , dan Zn ²⁺ . Ion logam masing-masing pada konsentrasi 10 ⁻² M ditambahkan ke dalam 1 ml larutan NBDs dengan konsentrasi 3 g/l. Pada Gambar. 5c, dapat dilihat bahwa intensitas fluoresensi NBD lebih sensitif terhadap Fe ³⁺ dibandingkan ion logam lainnya. Foto-foto pada Gambar 5d adalah gambar NBD dengan berbagai ion di bawah pencahayaan dalam ruangan dan UV, dan konsentrasi ion logam adalah 100 μM. Jelas, NBD padam dengan adanya Fe ³⁺ , menunjukkan bahwa mereka dapat digunakan untuk deteksi visual.

Mekanisme Pendinginan

Mekanisme pendinginan NBD dengan adanya Fe ³⁺ dibahas berdasarkan spektrum penyerapan UV-Vis dan masa fluoresensi NBD. Dari spektrum serapan UV-Vis yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S8, tidak ada perubahan puncak serapan pada 270 nm dan 340 nm dengan masuknya Fe ³⁺ , menunjukkan bahwa Fe ³⁺ tidak mempengaruhi struktur NBDs [41]. Selain spektrum penyerapan UV-Vis, efek Fe ³⁺ pada masa NBD juga dipelajari. Pada Gambar. 6a, masa pakai fluoresensi menjadi lebih pendek setelah penambahan Fe ³⁺ , yang mungkin melibatkan transfer elektron parsial dari NBD ke d orbital Fe ³⁺ , sehingga mengurangi rekombinasi radiasi dari NBD [42]. Mekanisme pendinginan fluoresensi NBD yang disebabkan oleh Fe ³⁺ ditunjukkan pada Gambar. 6b. Efek pendinginan fluoresensi sensitif dari NBD dengan adanya Fe ³⁺ mungkin berasal dari interaksi yang kuat antara Fe ³⁺ dan kelompok permukaan NBD. Biaya ³⁺ memiliki afinitas pengikatan yang lebih kuat dan kinetika pengkelat yang lebih cepat dengan gugus amino dan karboksilat pada permukaan NBD. Koordinasi khusus antara Fe ³⁺ ion dan gugus fenolik hidroksil/amina NBD telah banyak digunakan untuk mendeteksi Fe ³⁺ ion atau reaksi berwarna dalam kimia organik tradisional [43, 44]. Selain itu, potensial redoks Fe ³⁺ /Fe ²⁺ (Ф = 0.77) terletak di antara orbital molekul kosong terendah (LUMO) dan orbital molekul terisi tertinggi (HOMO) dari NBD, menyebabkan transfer elektron yang diinduksi foto dari LUMO ke keadaan kompleks Fe ³⁺ [45]. Hasil ini menunjukkan bahwa NBD sangat sensitif terhadap Fe ³⁺ atas ion logam lainnya.

a Jejak peluruhan fluoresensi dari NCDs dengan tidak adanya dan adanya Fe ^{3 +} di bawah eksitasi pada 370 nm dan emisi pada 445 nm. b Ilustrasi skema untuk kemungkinan mekanisme pendinginan fluoresensi NBD dengan adanya Fe ^{3 +} ion