Sitotoksitas dan Serapan Sel yang Bergantung pada Bentuk Nanopartikel Emas Direduksi Teh Hijau di Sel Kanker

Pendahuluan

Tumbuhan mengandung metabolisme primer dan sekunder alami, termasuk flavonoid, saponin, alkaloid, steroid, kumarin, tanin, fenol, terpenoid, karbohidrat, protein, dan asam amino. Baru-baru ini, ekstrak tumbuhan telah digunakan untuk sintesis nanomaterial, khususnya nanopartikel logam mulia seperti emas, perak, dioksida titan, tembaga, paladium, oksida seng, dan platinum nanopartikel [1]. Fito kimia yang beragam aktif berpartisipasi dalam mengubah garam logam menjadi nanopartikel logam sebagai agen reduksi. Selain itu, ekstrak tumbuhan berperan sebagai agen stabilisasi untuk mempertahankan stabilitas koloid nanopartikel logam dalam larutan. Agen reduksi kimia secara umum beracun dan berbahaya bagi organisme hidup. Sebaliknya, penggunaan ekstrak tumbuhan dalam sintesis nanopartikel logam adalah hijau, ramah lingkungan, dan berkelanjutan. Berbagai bagian tumbuhan, seperti batang, buah, biji, daun, dan bunga, digunakan untuk sintesis nanopartikel logam [1, 2]. Ulasan luas telah menyelidiki sintesis hijau nanopartikel emas (AuNPs) menggunakan ekstrak tumbuhan sebagai agen reduksi [2,3,4]. Dengan strategi hijau ini, langkah sintesis dilakukan dalam satu langkah dan dalam satu wadah. Selain itu, prosesnya sederhana, mudah, hemat biaya, dan ramah lingkungan. Ukuran, bentuk, dan topografi AuNPs bergantung pada konsentrasi garam emas dan ekstrak, waktu reaksi, suhu reaksi, dan pH larutan. Teknik spektroskopi dan mikroskopi digunakan untuk karakterisasi AuNPs, termasuk spektrofotometri UV-visible, difraksi X-ray, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR), mikroskop elektron transmisi (TEM), mikroskop gaya atom (AFM), mikroskop elektron pemindaian (SEM), dan pengukuran ukuran hidrodinamis serta potensi zeta. AuNPs hijau ini digunakan sebagai katalis, antioksidan, dan agen antimikroba serta anticancer [5,6,7,8].

Di laboratorium penulis, ekstrak tumbuhan (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum, dan Garcinia mangostana) telah digunakan sebagai agen reduksi untuk sintesis hijau AuNPs dan nanopartikel perak (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Bagian udara dari A. capillaris diekstrak dan digunakan untuk sintesis AgNPs dan AuNPs [9, 15, 16]. AgNPs yang disiapkan menunjukkan aktivitas antibakteri yang luar biasa terhadap Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes, dan Klebsiella oxytoca dibandingkan dengan ekstrak saja [15]. Hasil ini menunjukkan bahwa efek sinergi dari kombinasi AgNPs dan ekstrak berkontribusi pada aktivitas antibakteri yang ditingkatkan. Menariknya, AgNPs yang disintesis menggunakan A. capillaris dalam kehadiran bromida setiltrimetilamonia menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus resistensi metisilin [16]. Selain itu, AuNPs yang disintesis menggunakan A. capillaries menunjukkan aktivitas katalitik terhadap reaksi reduksi 4-nitrofenol [9]. L. japonicus ekstrak digunakan untuk sintesis AgNPs yang menunjukkan peningkatan yang luar biasa dalam aktivitas antibakteri [10]. Kami amati bahwa aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram-negatif lebih besar daripada terhadap bakteri Gram-positif. Ekstrak akar dari P. tenuifolia juga digunakan untuk sintesis AuNPs dan AgNPs [11, 17]. Aktivasi anticoagulan yang ditingkatkan dan aktivitas antibakteri diamati pada AuNPs dan AgNPs, masing-masing, yang disintesis menggunakan ekstrak P. tenuifolia. Yang paling menarik, AgNPs yang disintesis menggunakan ekstrak C. sappan menunjukkan aktivitas antibakteri yang efektif terhadap S. aureus resistensi metisilin [18]. Ekstrak dari G. mangostana menghasilkan AgNPs berbentuk dumbbell tidak simetris dengan efek apoptosis [14].

Laporan sebelumnya telah menyelidiki sintesis hijau AuNPs dan AgNPs menggunakan ekstrak daun teh [19,20,21,22,23]. Kamal dan rekan-rekan melaporkan sintesis yang berhasil dari AgNPs 25 nm [19]. Dalam laporan lain, AgNPs sferis berukuran 20 hingga 90 nm disintesis menggunakan ekstrak daun teh [20]. AgNPs yang disintesis menunjukkan aktivitas antibakteri yang sedikit terhadap E. coli. AgNPs sferis berukuran 3,42~4,06 nm juga disiapkan oleh Loo dan rekan-rekan menggunakan ekstrak daun teh [21]. Vaseeharan dan rekan-rekan menyintesis AgNPs antibakteri menggunakan ekstrak daun teh [22]. AgNPs yang disintesis efektif terhadap infeksi patogen Vibrio harveyi. Begum dan rekan-rekan menggunakan ekstrak daun teh hitam untuk sintesis AuNPs dan AgNPs [23]. Hingga saat ini, sebagian besar AgNPs sferis disintesis menggunakan ekstrak daun teh.

Dalam laporan ini, kitosan digunakan sebagai agen capping untuk AuNPs. Kitosan telah dieksplorasi sebagai kendaraan pengobatan/gen karena kompatibilitas biologis yang tinggi, alergenikitas rendah, biodegradabilitas, dan toksisitas rendah [24,25,26]. Kitosan berasal dari kitosan, yang melimpah dalam eksoskeleton serangga dan krustasea seperti kepiting, lobster, dan udang. Kitosan adalah polisakarida yang terdiri dari N-asetil-D-glukosamin yang terhubung oleh ikatan glikosid β(1-4). Kitosan dapat diperoleh dari kitosan melalui proses deasetilasi N heterogen. Kitosan itu sendiri memiliki aktivitas antibakteri, antifungal, antitumor, dan antioksidan [25]. Sebagai agen capping, kitosan secara langsung bersentuhan dengan AuNPs melalui mekanisme elektrosterik [26]. Nanopartikel kitosan mempengaruhi mekanisme serapan sel oleh sel A549 tanpa memodifikasi sitotoksitas [24]. Selain itu, derajat deasetilasi kitosan lebih berpengaruh daripada bobot molekuler pada serapan sel dan sitotoksitas [24].

Sebagian besar studi telah berfokus pada sintesis AgNPs sferis menggunakan ekstrak daun teh. Di sini, ekstrak daun teh hijau digunakan untuk sintesis nanobola emas dan nanobintang emas. Nanobola digunakan sebagai benih untuk sintesis nanobintang yang diusulkan melalui metode benih. Untuk perbandingan, nanobatang disintesis dengan metode konvensional umum [27]. Tiga bentuk berbeda AuNPs (nanobola, nanobintang, dan nanobatang) dilapisi kitosan untuk meningkatkan kompatibilitas biologis dan stabilitas koloid. AuNPs ini dikarakterisir dengan spektrofotometri UV-visible, mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM), dan FT-IR. Pengukuran ukuran hidrodinamis dilakukan oleh pencaran cahaya dinamis (DLS) dan pengukuran potensi zeta dilakukan sebelum dan setelah capping dengan kitosan. Stabilitas koloid dievaluasi dalam larutan garam, buffer, dan medium kultur sel. Untuk mengukur sitotoksitas, uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) diterapkan pada empat sel kanker: AGS (sel adenocarcinoma gastric manusia), HeLa (sel adenocarcinoma serviks epitel manusia), HepG2 (sel kanker hepatosit manusia), dan HT29 (sel adenocarcinoma kolorektal manusia). Serapan sel AuNPs pada sel HepG2 diukur secara kuantitatif oleh spektroskopi emisi optik plasma terpadu induktif (ICP-OES) dan spektrometri massa plasma terpadu induktif ablasi laser (LA-ICP-MS).

Bahan dan Metode

Bahan dan Instrumentasi

Kloroaurat asam trihidrat (HAuCl₄·3H₂O), bromida setiltrimetilamonia (CTAB), kitosan (dari kulit udang, ≥ 75 % deasetilasi), dan 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Semua reagen lain kelas analitis. Spektrofotometer Shimadzu UV-1800 atau UV-2600 digunakan untuk mendapatkan spektrum UV-visible dalam cuvette kuarsa (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang). Pengukuran ukuran hidrodinamis dilakukan oleh DLS dan pengukuran potensi zeta dilakukan menggunakan NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, AS). Varian 640 IR digunakan untuk mendapatkan spektrum FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS); sampel yang diukur disiapkan dengan metode cak KBr. Citra HR-TEM ditangkap menggunakan JEM-3010 yang dioperasikan pada 300 kV (JEOL, Tokyo, Jepang); sampel dimuat pada grid tembaga dilapis karbon (jenis-B karbon, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, AS) dan diizinkan kering di oven pada 37 °C selama 24 jam. Untuk sonikasi, model WUC-A22H digunakan (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, Republik Korea). Sentrifuga 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Jerman) dan FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republik Korea) digunakan untuk sentrifugasi dan pengeringan beku, masing-masing. Untuk serapan sel AuNPs, Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, AS) dan J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, AS) digunakan.

Persiapan Ekstrak Teh Hijau

Institut Teh Hijau Hadong (Hadong, Gyeongnam, Republik Korea) dengan baik menyediakan kain teh hijau kering sebagai hadiah. Blender digunakan untuk menyiapkan bubuk daun kering. Ekstraksi dilakukan dengan mencampur air deionis (2 L) dan bubuk daun (200 g). Ekstraksi diizinkan berlangsung selama 1 jam oleh sonikasi pada suhu ambien dengan tiga pengulangan. Filter kertas Whatman digunakan untuk menyaring fraksi air untuk menghilangkan bahan tidak larut. Kemudian, filtrat di sentrifuga (3.000g gaya, 18 °C, 25 menit), dan supernatant dikumpulkan. Supernatan yang dikumpulkan difilter dengan serin, dan filtrat dikeringkan beku. Bahan yang dikeringkan beku dilarutkan dalam air deionis untuk menciptakan larutan stok dengan konsentrasi akhir 2 % (w/v) untuk sintesis hijau yang dijelaskan di bagian berikutnya.

Sintesis Nanobola Emas menggunakan Ekstrak

Proses sintesis nanobola diilustrasikan dalam Gambar 1a. Larutan stok yang dijelaskan di bagian sebelumnya digunakan untuk sintesis. Dalam botol kaca, ekstrak (konsentrasi akhir 0,03 %) dan kloroaurat asam trihidrat (konsentrasi akhir 0,5 mM) dicampur, dan natrium hidroksida (konsentrasi akhir 1 mM) ditambahkan. Air deionis ditambahkan untuk membuat volume akhir 2 mL. Inkubasi oven dilakukan dalam oven kering pada 80 °C selama 2 jam. Resonansi plasmon permukaan (SPR) nanobola dipantau dengan mendapatkan spektrum UV-visible dalam rentang 300~800 nm. Nanobola juga digunakan sebagai benih untuk sintesis nanobintang yang dijelaskan di bagian berikutnya.

Sintesis nanobola emas. a Diagram skematis proses sintesis dan b Spektra UV-visible nanobola sebelum dan setelah capping kitosan. Sebuah foto digital menunjukkan nanobola segera setelah sintesis

Sintesis Nanobintang Emas

Proses sintesis nanobintang diilustrasikan dalam Gambar 2a. Nanobola (50 μL) yang disintesis seperti yang dijelaskan di bagian sebelumnya diaduk (750 rpm) dengan bar magnet pada panci panas pada suhu ambien. Kloroaurat asam trihidrat (0,25 mM, 5 mL) ditambahkan ke larutan ini. Setelah 15 detik, dua larutan ditambahkan secara bersamaan: nitrat perak (1 mM, 50 μL) dan asam askorbat (disiapkan segar, 100 mM, 25 μL). Kemudian, larutan diaduk pada 750 rpm selama 5 menit. Spektra UV-visible diperoleh dalam rentang 300~1100 nm.

Sintesis nanobintang emas. a Diagram skematis proses sintesis dan b Spektra UV-visible nanobintang sebelum dan setelah capping kitosan. Sebuah foto digital menunjukkan nanobintang segera setelah sintesis

Sintesis Nanobatang Emas

Proses sintesis nanobatang diilustrasikan dalam Gambar 3a. Untuk sintesis nanobatang emas, sintesis benih dilakukan sesuai laporan sebelumnya dengan modifikasi kecil [27]. Larutan pertumbuhan disiapkan sebagai berikut. Dalam botol kaca 20 mL, kloroaurat asam trihidrat (10 mM, 500 μL) dan bromida setiltrimetilamonia (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) dicampur. Larutan berwarna cokelat kehitaman. Kemudian, asam askorbat (disiapkan segar, 100 mM, 55 μL) ditambahkan, dan larutan ini diaduk sampai berubah dari cokelat kehitaman menjadi bening. Nitrat perak (10 mM, 100 μL) ditambahkan dan diayun selama 10 detik. Larutan akhir ini ditandai sebagai larutan pertumbuhan. Larutan benih disintesis sebagai berikut. Dalam botol kaca 20 mL, kloroaurat asam trihidrat (10 mM, 250 μL) dan CTAB (100 mM, 9,75 mL) dicampur. Kemudian, natrium borohidrat segar dan dingin (10 mM, 600 μL) ditambahkan dan di-vorteks selama 2 menit. Larutan ini ditandai sebagai larutan benih. Larutan benih (12 μL) dicampur dengan larutan pertumbuhan yang disintesis sebelumnya. Spektra UV-visible diperoleh dalam rentang 400~900 nm.

Sintesis nanobatang emas. a Diagram skematis proses sintesis dan b Spektra UV-visible nanobatang sebelum dan setelah capping kitosan. Sebuah foto digital menunjukkan nanobatang segera setelah sintesis

Capping Kitosan Nanobola, Nanobintang, dan Nanobatang

Capping kitosan digunakan untuk meningkatkan stabilitas koloid dan kompatibilitas biologis AuNPs. Kitosan dilarutkan dalam asam asetat 1 %, dan konsentrasi akhir disesuaikan menjadi 0,01 %. Kemudian, sonikasi dilakukan untuk melarutkan kitosan sepenuhnya; larutan ini digunakan sebagai larutan stok untuk capping kitosan dalam prosedur berikutnya. Keduanya nanobola dan nanobintang yang sebelumnya disintesis dicap dengan larutan stok kitosan (0,01 %). Larutan stok kitosan (30 %, v/v) dicampur dengan larutan AuNP (70 %, v/v). Larutan diaduk pada 900 rpm selama 2 jam untuk menyelesaikan capping kitosan. Untuk nanobatang, CTAB berlebih digunakan, dan dengan demikian, sentrifugasi (14.000 rpm, 15 menit, 25 °C) dilakukan untuk menghapus CTAB. Nanobatang dipulihkan dari pelet, dan capping kitosan dilakukan seperti yang disebutkan di atas. Kemudian, spektrum UV-visible diperoleh.

Penilaian Stabilitas Koloid

Stabilitas koloid AuNPs penting untuk aplikasi in vitro dan in vivo. Tiga tipe AuNPs dengan capping kitosan dan nanobola tanpa capping kitosan dievaluasi untuk stabilitas koloid dalam berbagai larutan berikut: air deionis, BSA 5 %, NaCl 5 %, PBS (pH 7,4), DMEM, dan medium penuh. Medium penuh adalah DMEM yang mengandung FBS 10 %. Satu mililiter setiap tipe larutan AuNP dicampur dengan larutan uji yang disebutkan di atas (0,5 mL). Larutan diinkubasi pada 25 °C selama 30 menit, dan spektrum UV-visible diperoleh.

Kultur Sel dan Sitotoksitas

Gar berikut sel kanker dibeli dari Bank Gar Sel Korea (Seoul, Republik Korea): AGS, HeLa, HepG2, dan HT29. Uji MTT dilakukan untuk mengevaluasi sitotoksitas in vitro AuNPs. DMEM yang mengandung natrium pyruvate digunakan. Medium kultur sel mengandung 10 % serum sapi janin, 2 mM L-glutamin, 1 % penitsilin (100 unit/mL), dan streptomisin (100 unit/mL). Sel dikultur dalam piring kultur sel 100 mm dan dipertahankan pada sekitar 70 % konfluensi. Sebelum kultur sel, AuNPs dari tiga bentuk berbeda disusulkan melalui penguapan vakum untuk mendapatkan konsentrasi Au akhir 5 mM. Pada papan 96-lubang, sel ditanam pada densitas 5,0 × 10³ sel/lubang, dan inkubasi dilakukan selama 24 jam dalam oven pada 37 °C di bawah atmosfer CO₂ (5 %). Kemudian, lima konsentrasi berbeda AuNPs (500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, dan 31,25 μM) dirawat dan diinkubasi dalam oven selama 24 jam lainnya pada 37 °C di bawah atmosfer CO₂ (5 %). Kemudian, reagen MTT (5 μL, 5 % dalam air deionis) ditambahkan dan diinkubasi dalam oven pada 37 °C di bawah atmosfer CO₂ (5 %) selama 3 jam tambahan. Absorbansi diukur pada 570 nm menggunakan pembaca deteksi multi fluresensi (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, AS). Sel yang tidak dirawat digunakan sebagai kontrol.

Serapan Sel

Serapan sel setiap tipe AuNP diukur secara kuantitatif menggunakan sel HepG2. Pada papan 24-lubang, sel ditanam pada densitas 5,0 × 10⁴ sel/lubang, dan inkubasi dilakukan selama 24 jam dalam oven pada 37 °C di bawah atmosfer CO₂ (5 %). Kemudian, 5 μM (konsentrasi akhir) dari setiap tipe larutan AuNP dirawat dan diinkubasi dalam oven selama 24 jam tambahan pada 37 °C di bawah atmosfer CO₂ (5 %). Setelah inkubasi, larutan yang berisi AuNP berlebih dihilangkan, dan sel dirawat dengan tripsin. Konsentrasi Au dalam sel yang ditripsin diukur secara kuantitatif oleh ICP-OES dan LA-ICP-MS, yang menyediakan konsentrasi Au yang terserap oleh sel. Kontrol adalah 5 μM dari larutan koloid asli dari setiap tipe AuNP, yang juga dianalisis oleh ICP-OES dan LA-ICP-MS untuk mendapatkan konsentrasi Au.

Hasil dan Pembahasan

Spektrum UV-visible

Spektrum UV-visible umumnya diperoleh untuk mengonfirmasi sintesis AuNPs. SPR karakteristik AuNPs dapat diamati pada rentang panjang gelombang terlihat-dekat merah muda. Selain itu, capping AuNPs umumnya menyebabkan pergeseran bathokromik (merah) atau hipsochromik (biru). Selain itu, pergeseran hipokromik umumnya terjadi bersama dengan pergeseran merah dan biru. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 1b, spektrum UV-visible dipantau dalam rentang 300~800 nm. Nanobola menunjukkan SPR karakteristik pada 532 nm dengan warna merah Burgundy yang dalam. Setelah capping kitosan nanobola, SPR maksimum bergeser merah menjadi 537 nm bersama dengan pergeseran hipokromik (Gambar 1b). Rentang panjang gelombang SPR yang luas (600~800 nm) dengan larutan biru gelap diamati untuk nanobintang (Gambar 2b). Capping kitosan nanobintang menunjukkan pergeseran hipokromik, di mana absorbansi lebih rendah dari pada AuNPs tanpa capping kitosan (Gambar 2b). Nanobatang menunjukkan dua panjang gelombang SPR yang berbeda pada 514 nm dan 815 nm, dengan terbentuknya larutan pink muda (Gambar 3b). Capping kitosan nanobatang menyebabkan pergeseran biru menjadi 797 nm bersama dengan pergeseran hipokromik (Gambar 3b). Dengan mempertimbangkan semua hasil ini, capping AuNPs dengan kitosan mengubah panjang gelombang SPR dan menyebabkan pergeseran. Pemeriksaan hati-hati pada spektrum UV-visible menunjukkan bahwa ketiga tipe AuNPs berhasil dicap dengan kitosan.

Ukuran Hidrodinamis dan Potensi Zeta

Selanjutnya, ukuran hidrodinamis dan potensi zeta diukur; hasilnya ditunjukkan dalam Tabel 1. Tanpa capping kitosan, ukuran hidrodinamis nanobola dan nanobintang adalah 28,4 dan 97,8 nm, masing-masing. Ukuran hidrodinamis nanobatang tidak diukur karena ukuran hidrodinamis telah disesuaikan dengan bentuk sferik nanopartikel. Dengan capping kitosan, ukuran hidrodinamis meningkat menjadi 190,7 nm untuk nanobola dan 123,9 nm untuk nanobintang. Capping kitosan dikonfirmasi oleh peningkatan ukuran hidrodinamis. Perubahan potensi zeta juga mencerminkan capping kitosan pada permukaan AuNPs. Kitosan adalah polisakarid yang bermuatan positif; dengan demikian, capping kitosan menghasilkan potensi zeta positif untuk ketiga tipe AuNPs. Untuk nanobola, potensi zeta berubah dari −12,73 menjadi 42,28 mV. Potensi zeta nanobintang berubah dari −42,46 menjadi 47,44 nm. Dalam kasus nanobatang, CTAB (surfaktan kationik) digunakan untuk sintesis. Dengan demikian, potensi zeta asli adalah 27,96 mV tanpa capping. Capping kitosan nanobatang meningkatkan potensi zeta menjadi 33,23 nm. Oleh karena itu, perubahan potensi zeta dari nilai negatif ke positif untuk nanobola dan nanobintang secara jelas mengindikasikan capping kitosan yang berhasil. Selain itu, potensi zeta nanobatang meningkat, yang menunjukkan bahwa permukaan dicap dengan kitosan.

Citra HR-TEM

Mikroskopi sangat penting untuk penelitian nanopartikel, memberikan informasi esensial tentang ukuran dan bentuk nanopartikel. Alat mikroskop menyediakan berbagai informasi rinci, seperti keadaan dispersi, morfologi dan topografi dua dan tiga dimensi, dan kekerasan relatif bahan. Nanobola mengukur 8,7 ± 1,7 nm, berdasarkan rata-rata 75 nanopartikel yang dipilih secara acak dalam citra HR-TEM (Gambar 4). Ukuran paling banyak adalah 8~9 nm (29,3 %), diikuti oleh 9~10 nm (12,0 %). Dengan capping kitosan, bentuk nanobola dipertahankan tanpa perubahan bentuk (Gambar 4c, d). Sifat kristal partikel dengan jelas ditunjukkan oleh struktur jaring yang ditampilkan dalam Gambar 4d. Jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,24 nm (Gambar 4d). Selain itu, lapisan kitosan juga divisualisasikan, seperti yang ditunjukkan oleh panah merah dalam Gambar 4d. Nanobintang divisualisasikan oleh HR-TEM, seperti yang ditampilkan dalam Gambar 5. Nanobintang mengukur 99,0 ± 47,0 nm, yang mewakili rata-rata 19 nanopartikel yang terpisah. Struktur jaring ditunjukkan dalam citra diperbesar (Gambar 5c). Seperti yang ditunjukkan, jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,24 nm (Gambar 5c). Panah merah dalam Gambar 5c menunjukkan lapisan kitosan. Nanobatang divisualisasikan seperti yang ditampilkan dalam Gambar 6. Panjang dan lebar partikel rata-rata adalah 60,4 nm dan 16,4 nm, masing-masing, berdasarkan pengukuran yang dilakukan untuk 28 partikel. Rasio aspek, didefinisikan sebagai panjang partikel dibagi lebar partikel, adalah 3,7. Struktur jaring ditampilkan dalam Gambar 6c, yang mengonfirmasi struktur kristal nanobatang. Jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,23 nm (Gambar 6c). Panah merah menunjukkan lapisan kitosan (Gambar 6c).

Citra HR-TEM nanobola emas. Skala bar mewakili a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm, dan d 5 nm. Citra a dan b diperoleh tanpa capping kitosan, dan c dan d diperoleh dengan capping kitosan. Jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,24 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah capping

Citra HR-TEM nanobintang emas. Skala bar mewakili a 200 nm, b 50 nm, dan c 5 nm. d Representasi skematis nanobintang dengan ukuran rata-rata 99,0 ± 47,0 nm. Citra a diperoleh tanpa capping kitosan, dan b dan c diperoleh dengan capping kitosan. Jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,24 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah capping

Citra HR-TEM nanobatang emas. Skala bar mewakili a 100 nm, b 200 nm, dan c 5 nm. d Representasi skematis nanobatang dengan panjang dan lebar rata-rata masing-masing 60,4 nm dan 16,4 nm. Citra a diperoleh tanpa capping kitosan, dan b dan c diperoleh dengan capping kitosan. Jarak antara jaring yang bersebelahan diukur menjadi 0,23 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah capping

Spektrum FT-IR

Teh hijau mengandung metabolisme primer dan sekunder yang beragam. Secara spesifikasi, konstituen utama teh hijau adalah polifenol, termasuk epigalokatekin-3-galat, (-)-epikatekin-3-galat, (-)-epigalokatekin, dan (-)-epikatekin [28]. Spektrum FT-IR diperoleh untuk mendapatkan informasi tentang grup fungsional yang berkontribusi pada sintesis AuNPs. Kami membandingkan spektrum FT-IR nanobola dengan spektrum ekstrak (Gambar 7). Grup fungsional utama yang kemungkinan besar terlibat dalam reaksi reduksi garam Au adalah –OH. Dalam ekstrak, grup fungsional –OH muncul pada 3255 cm⁻¹ (Gambar 7a). Setelah sintesis, puncak ini bergeser ke getaran yang lebih tinggi pada 3300~3341 cm⁻¹. Hasil ini menunjukkan bahwa grup fungsional –OH berasal dari polifenol yang dioksidasi menjadi C=O saat mengurangi garam Au menjadi AuNPs. Secara menakjubkan, munculnya grup fungsional C=O pada 1716 cm⁻¹ dalam nanobola secara jelas mendukung oksidasi grup fungsional –OH selama sintesis (Gambar 7b).

Spektrum FT-IR a ekstrak teh hijau yang digunakan untuk sintesis dan b nanobola emas

Penilaian stabilitas koloid di bawah berbagai larutan

Stabilitas koloid nanopartikel adalah perhatian penting untuk aplikasi diagnostik dan terapeutik. Enam larutan berbeda diuji untuk stabilitas koloid: (i) air deionis, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, dan (vi) medium penuh (DMEM dengan 10 % FBS). Setelah mencampur setiap tipe AuNPs dengan larutan uji, spektrum UV-visible diperoleh; hasilnya ditunjukkan dalam Tabel 2 dan Gambar 8. Pergeseran hipokromik bersama dengan pergeseran merah atau biru sedikit diamati untuk ketiga tipe AuNPs dalam spektrum UV-visible (Gambar 8a, c, dan e). Bentuk spektrum dipertahankan, dan tidak ada agregasi larutan koloid yang diamati (Gambar 8b, d, dan f). Hasil ini menunjukkan bahwa stabilitas koloid cukup baik dipertahankan dalam larutan uji yang disebutkan di atas.

Penilaian stabilitas koloid. a dan b nanobola dengan capping kitosan, c dan d nanobintang dengan capping kitosan, e dan f nanobatang dengan capping kitosan, g dan h nanobola tanpa capping kitosan. DW mewakili air deionis

Dalam Tabel 2, pergeseran hipokromik diekspresikan sebagai persentase absorbansi yang dipertahankan, dengan absorbansi larutan asli ditetapkan ke 100 %. Dalam ketiga AuNPs, stabilitas koloid paling baik dipertahankan dalam medium penuh, yang digunakan untuk eksperimen sitotoksitas berikutnya: nanobola (65,3 %), nanobintang (93,4 %), dan nanobatang (80,2 %). Larutan protein, BSA (5 %), juga memberikan stabilitas koloid yang wajar: nanobola (61,8 %), nanobintang (70,2 %), dan nanobatang (72,0 %). Hasil ini menunjukkan bahwa protein yang melapisi nanopartikel memberikan efek tambahan yang bermanfaat pada stabilitas koloid AuNPs bersama dengan capping kitosan. Stabilitas koloid nanobola tanpa capping kitosan juga dievaluasi (Gambar 8g, h). Semua larutan menyebabkan pergeseran hipokromik. Di antara larutan yang diuji, hanya larutan NaCl (5 %) yang menunjukkan pergeseran merah besar bersama dengan pergeseran hipokromik.

Sitotoksitas

Uji MTT dilakukan untuk mengukur sitotoksitas terhadap empat tipe sel kanker (Gambar 9): AGS, HeLa, HepG2, dan HT29. Sitotoksitas ketiga tipe AuNPs bergantung pada konsentrasi Au. Di antara empat tipe sel, sitotoksitas tertinggi diamati untuk sel HepG2. Selain itu, nanobatang menunjukkan toksisitas tertinggi terhadap keempat tipe sel, diikuti oleh nanobintang dan akhirnya oleh nanobola. Secara spesifik, nanobatang menunjukkan toksisitas sangat tinggi; dengan demikian, sitotoksitas nanobatang yang mengandung kisaran konsentrasi Au rendah juga dievaluasi (Gambar 9e). Pada konsentrasi rendah hingga 8 μM Au, nanobatang menunjukkan sitotoksitas yang bergantung pada konsentrasi. Terhadap sel HepG2, nilai IC₅₀ adalah 127,1 μM Au untuk nanobola, 81,8 μM Au untuk nanobintang, dan 22,7 μM Au untuk nanobatang. Dengan demikian, nanobatang adalah yang paling sitotoksik, diikuti oleh nanobintang, dan nanobola adalah yang paling sedikit sitotoksik terhadap sel HepG2.

Sitotoksitas dievaluasi oleh uji MTT (konsentrasi Au 31,25~500 μM). a AGS, b HeLa, c HepG2, dan d HT29. e Konsentrasi Au rendah (8~125 μM) dievaluasi pada sel HepG2

Telah dilaporkan bahwa sitotoksitas AuNPs dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, dan muatan permukaan [29, 30]. Favi dan rekan-rekan menyelidiki sitotoksitas Au nanobola (61 nm) dan Au nanobintang (34 nm) terhadap dua tipe sel (sel fibroblas kulit manusia dan sel endotel bungkus tikus) [31]. Dalam kedua tipe sel, konsensi letal diamati pada 40 μg/mL untuk nanobola dan pada 400 μg/mL untuk nanobintang. Hasil mereka menunjukkan bahwa nanobola lebih sitotoksik daripada nanobintang, yang menunjukkan bahwa ukuran, bentuk, dan kimia permukaan kemungkinan besar mempengaruhi sitotoksitas AuNPs. Woźniak dan rekan-rekan melaporkan sitotoksitas AuNPs dengan berbagai bentuk terhadap sel HeLa dan HEK293T (sel embrio ginjal manusia), yaitu nanobola (~10 nm), nanobunga (~370 nm), nanobatang (~41 nm), nanoprisma (~160 nm), dan nanobintang (~240 nm) [30]. Menariknya, nanobola dan nanobatang lebih sitotoksik daripada nanobunga, nanoprisma, dan nanobintang. Penulis menjelaskan bahwa ukuran kecil nanopartikel dan proses agregasi adalah daya dorong utama untuk sitotoksitas nanobola dan nanobatang dalam karya mereka. Memang, banyak studi telah membahas efek ukuran AuNPs terhadap sitotoksitas [32, 33]. Seiring AuNPs menjadi lebih kecil, serapan oleh sel meningkat. Serapan yang lebih tinggi menghasilkan konsentrasi AuNPs yang lebih tinggi dalam sel, yang mengarah pada sitotoksitas yang lebih tinggi terhadap sel. Namun, konsentrasi AuNPs yang rendah dalam sel juga menunjukkan sitotoksitas yang tinggi [34]. Konsentrasi AuNPs dalam sel mempengaruhi sitotoksitas; namun, sangat penting untuk mempertimbangkan dan memahami karakteristik AuNPs. Sitotoksitas AuNPs dari dua bentuk berbeda (nanobola 43 nm, nanobatang 38 × 17 nm) dievaluasi dalam sel epitel oleh Tarantola dan rekan-rekan [35]. Nanobola ditentukan lebih sitotoksik daripada nanobatang. Selain itu, nanobola menyebabkan disfungsi membran sel epitel, yang diukur oleh sensing impedansi substrat listrik sel [35. Seperti yang sebelumnya dibahas, banyak saat ini menyelidiki sitotoksitas berbagai bentuk AuNPs dalam berbagai sel. Meskipun bentuk AuNPs mungkin tetap sama, banyak faktor masih mempengaruhi sitotoksitas AuNPs. Dalam menilai sitotoksitas, faktor termasuk ukuran, bentuk, properti fisikokimia permukaan, konsentrasi, waktu paparan, dan tipe sel juga harus dipertimbangkan [34, 36,37,38]. Selain karakteristik AuNPs, mekanisme sitotoksik termasuk gangguan membran sel, stres oksidatif, destruksi sitoskeleton, dan kehilangan fungsi mitokondria juga penting [38, 39. Saat ini, otophagi dan disfungsi lisosom muncul sebagai penjelasan sitotoksitas nanomaterial. Dalam lisosom, nanomaterial menyebabkan sitotoksitas melalui stres oksidatif yang dimediasi besi lisosom dan rilis katepsin dan hidrolase lisosom terkait lainnya, yang menyebabkan disfungsi mitokondria dan kematian sel. Dalam laporan saat ini, nanobatang adalah yang paling sitotoksik terhadap keempat tipe sel kanker yang diuji. Dengan demikian, karya mendatang kami akan memeriksa mekanisme sitotoksitas secara rinci.

Serapan sel pada sel HepG2

Sel HepG2 menunjukkan sitotoksitas tertinggi di antara keempat tipe sel kanker; dengan demikian, kami memilih tipe sel ini untuk mengevaluasi serapan sel. Dua instrumen, ICP-OES dan LA-ICP-MS, digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif konsentrasi Au dalam sel, dan hasilnya ditunjukkan dalam Gambar 10. Konsentrasi Au 5 μM digunakan untuk mengevaluasi serapan sel karena tidak ada toksisitas yang diamati pada konsentrasi ini di antara keempat tipe sel kanker. Serapan tertinggi untuk nanobola (58,0 %), diikuti oleh nanobatang (52,7 %) dan nanobintang (41,5 %). Seperti yang disebutkan di bagian sebelumnya, sitotoksitas bergantung pada bentuk partikel (nanobatang > nanobintang > nanobola). Namun, urutan serapan sel (nanobola > nanobatang > nanobintang) tidak cocok dengan urutan sitotoksitas. Serapan sel nanobola adalah yang tertinggi; namun, sitotoksitas partikel ini adalah yang terendah. Hasil ini menunjukkan bahwa serapan sel yang tinggi tidak selalu mengindikasikan sitotoksitas yang tinggi. Seperti yang sebelumnya disebutkan, berbagai faktor termasuk ukuran, bentuk, properti fisikokimia permukaan, konsentrasi, waktu paparan, dan tipe sel penting dalam mempengaruhi sitotoksitas.

Serapan sel oleh sel HepG2

Tingkat serapan yang berbeda dari ketiga tipe AuNPs (41,5~58,0 %) mungkin tergantung pada persaingan antara pelindungan (yaitu, bagaimana membran melingkupi nanopartikel) di bawah daya dorong termodinamis dan kinetika difusi reseptor [41, 42]. Chithrani dan Chan membandingkan serapan sel Au nanobola dilapisi transferin dan Au nanobatang oleh sel HeLa [42]. Pada ukuran yang sama (yaitu, nilai yang sama untuk diameter nanobola dan lebar nanobatang), nanobola menunjukkan serapan yang lebih tinggi daripada nanobatang. Hasil ini konsisten dengan pengamatan kami dalam laporan saat ini tentang serapan nanobola yang lebih tinggi dibandingkan nanobatang. Untuk serapan nanobatang, lebar lebih penting daripada panjang, dan rasio aspek yang meningkat menurunkan laju serapan [42]. Ukuran nanobintang adalah 99,0 ± 47,0 nm, menjadikannya partikel terbesar di antara ketiga tipe AuNPs. Untuk nanopartikel besar (> 50 nm), kinetika difusi reseptor yang lambat menghasilkan waktu pelindungan yang pendek [42]. Dengan demikian, serapan sel nanopartikel besar rendah, yaitu nanobintang dalam laporan saat ini. Kitosan digunakan untuk capping AuNPs untuk meningkatkan stabilitas koloid dan kompatibilitas biologis. Capping kitosan juga dapat berperan dalam serapan sel AuNPs dengan berinteraksi dengan reseptor pada permukaan sel. Studi mekanisme yang rinci diperlukan untuk menguraikan masalah ini.

Kesimpulan

Pengembangan berkelanjutan nanoteknologi memerlukan desain bentuk dan ukuran nanopartikel yang rinci untuk aplikasi yang berhasil, termasuk sebagai kendaraan pengobatan atau kendaraan untuk senyawa aktif biologis seperti agen anticancer. Ekstrak teh hijau digunakan sebagai agen reduksi hijau untuk sintesis Au nanobola dan nanobintang. Menariknya, sitotoksitas nanobatang lebih tinggi daripada nanobola dan nanobintang, sementara nanobola menunjukkan sitotoksitas terendah terhadap keempat tipe sel kanker. Serapan sel oleh sel HepG2 kemungkinan besar bergantung pada bentuk dan ukuran; nanobola menunjukkan serapan tertinggi oleh sel, sedangkan nanobintang menunjukkan serapan terendah. Optimasi ukuran dan bentuk bersama dengan modifikasi permukaan dan fungsionalisasi akan mengarah pada pengembangan nanopartikel untuk penggunaan di masa depan dalam nanomedisin.

Singkatan

AFM:

Mikroskop gaya atom

AgNPs:

Nanopartikel perak

AGS:

Sel adenocarcinoma gastric manusia

AuNPs:

Nanopartikel emas

CTAB:

Bromida setiltrimetilamonia

DLS:

Pencaran cahaya dinamis

DMEM:

Medium DMEM modifikasi Dulbecco

FBS:

Serum sapi janin

FT-IR:

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier

HeLa:

Sel adenocarcinoma serviks epitel manusia

HepG2:

Sel kanker hepatosit manusia

HR-TEM:

Mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi

HT29:

Sel adenocarcinoma kolorektal manusia

ICP-OES:

Spektroskopi emisi optik plasma terpadu induktif

LA-ICP-MS:

Spektrometri massa plasma terpadu induktif ablasi laser

SEM:

Mikroskop elektron pemindaian

SPR:

Resonansi plasmon permukaan