Sitotoksisitas yang bergantung pada bentuk dan serapan seluler dari nanopartikel emas yang disintesis menggunakan ekstrak teh hijau
Abstrak
Dalam laporan ini, tiga bentuk berbeda dari nanopartikel emas yang tertutup kitosan (nanospheres, nanostars, dan nanorods) disintesis untuk menyelidiki efek bentuk pada sitotoksisitas dan serapan seluler dalam sel kanker. Ekstrak teh hijau digunakan sebagai zat pereduksi untuk mereduksi garam emas menjadi nanosfer emas. Bintang nano emas disiapkan menggunakan larutan nanosfer yang disiapkan sebagai solusi benih. Nanorods emas disintesis menggunakan metode konvensional. Ketiga jenis nanopartikel emas menunjukkan karakteristik pita resonansi permukaan plasmon pada spektrofotometri UV-tampak. Dalam gambar mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi, struktur kisi diamati dengan jelas dalam ketiga bentuk, mengkonfirmasikan sifat kristal dari nanopartikel. Ketiga larutan koloid nanopartikel emas mempertahankan stabilitas koloid dalam berbagai larutan. Untuk menilai sitotoksisitas, uji 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dilakukan pada empat garis sel kanker. Sitotoksisitas adalah yang tertinggi di nanorods, diikuti oleh nanostars dan akhirnya nanospheres. Serapan seluler nanopartikel emas dalam sel karsinoma hepatosit manusia (HepG2) diukur, dan hasilnya mengikuti urutan nanospheres> nanorods> nanostars. Hasil dari studi saat ini dapat membantu dalam desain bentuk nanopartikel emas untuk aplikasi terapeutik sebagai kendaraan penghantaran obat di bidang nanomedicine.
Pengantar
Tumbuhan mengandung metabolit primer dan sekunder alami, antara lain flavonoid, saponin, alkaloid, steroid, kumarin, tanin, fenol, terpenoid, karbohidrat, protein, dan asam amino. Ekstrak tumbuhan akhir-akhir ini telah dimanfaatkan untuk sintesis nanomaterial, khususnya nanopartikel logam seperti emas, perak, titanium oksida, tembaga, paladium, seng oksida, dan nanopartikel platinum [1]. Berbagai fitokimia secara aktif berpartisipasi dalam mengubah garam logam menjadi nanopartikel logam sebagai agen pereduksi. Selain itu, ekstrak tumbuhan berperan sebagai zat penstabil untuk menjaga stabilitas koloid nanopartikel logam dalam larutan. Agen pereduksi kimia umumnya berbahaya dan beracun bagi organisme hidup. Sebaliknya, penggunaan ekstrak tumbuhan dalam sintesis nanopartikel logam bersifat hijau, ramah lingkungan, dan berkelanjutan. Berbagai bagian tanaman, seperti batang, buah, biji, daun, dan bunga, digunakan untuk mensintesis nanopartikel logam [1, 2]. Tinjauan ekstensif telah mensurvei sintesis hijau nanopartikel emas (AuNPs) menggunakan ekstrak tumbuhan sebagai agen pereduksi [2,3,4]. Dengan menggunakan strategi hijau ini, langkah sintetis dilakukan dalam satu langkah dan dalam satu pot. Selain itu, prosesnya sederhana, mudah, hemat biaya, dan ramah lingkungan. Ukuran, bentuk, dan topografi AuNP bergantung pada konsentrasi garam dan ekstrak emas, waktu reaksi, suhu reaksi, dan pH larutan. Teknik spektroskopi dan mikroskopis digunakan untuk mengkarakterisasi AuNPs, termasuk spektrofotometri UV-tampak, difraksi sinar-X, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR), mikroskop elektron transmisi (TEM), mikroskop gaya atom (AFM), mikroskop elektron pemindaian ( SEM), dan ukuran hidrodinamik dan pengukuran potensial zeta. AuNPs hijau ini digunakan sebagai katalis, antioksidan, dan agen antimikroba dan antikanker [5,6,7,8].
Di laboratorium penulis, ekstrak tumbuhan (Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum , dan Garcinia mangostana ) telah digunakan sebagai agen pereduksi untuk mensintesis hijau baik AuNPs dan nanopartikel perak (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Bagian udara dari A. kapiler diekstraksi dan digunakan untuk sintesis AgNPs dan AuNPs [9, 15, 16]. AgNPs yang disiapkan memberikan aktivitas antibakteri yang sangat baik terhadap Escherichia coli , Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes , dan Klebsiella oxytoca dibandingkan dengan ekstrak saja [15]. Hasil ini menunjukkan bahwa efek sinergis dari penggabungan AgNPs dan ekstrak berkontribusi pada peningkatan aktivitas antibakteri. Menariknya, AgNPs disintesis menggunakan A. kapiler di hadapan cetyltrimethylammonium bromide menunjukkan aktivitas antibakteri melawan methicillin-resistant Staphylococcus aureus [16]. Selain itu, AuNP disintesis menggunakan A. kapiler menunjukkan aktivitas katalitik terhadap reaksi reduksi 4-nitrofenol [9]. L. japonicus ekstrak digunakan untuk sintesis AgNPs menunjukkan peningkatan yang luar biasa dalam aktivitas antibakteri [10]. Kami mengamati bahwa aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram-negatif lebih besar daripada melawan bakteri Gram-positif. Ekstrak akar P. tenuifolia juga digunakan untuk sintesis AuNPs dan AgNPs [11, 17]. Peningkatan aktivitas antikoagulan dan aktivitas antibakteri diamati pada AuNPs dan AgNPs, masing-masing, disintesis menggunakan P. tenuifolia ekstrak. Yang paling menarik, AgNP disintesis menggunakan C. sappan ekstrak menunjukkan aktivitas antibakteri yang efektif terhadap resisten methicillin S. aureus [18]. Ekstrak G. manggis menghasilkan AgNP berbentuk halter asimetris dengan efek apoptosis [14].
Laporan sebelumnya telah meneliti sintesis hijau AuNPs dan AgNPs menggunakan ekstrak daun teh [19,20,21,22,23]. Kamal dan rekan kerja melaporkan keberhasilan sintesis 25 nm-AgNPs [19]. Dalam laporan lain, AgNPs bulat berukuran 20 hingga 90 nm disintesis menggunakan ekstrak daun teh [20]. AgNP yang disintesis menunjukkan sedikit aktivitas antibakteri terhadap E. koli . AgNPs bulat berukuran 3,42~4,06 nm juga disiapkan oleh Loo dan rekan kerja menggunakan ekstrak daun teh [21]. Vaseeharan dan rekan kerja mensintesis AgNP antibakteri menggunakan ekstrak daun teh [22]. AgNP yang disintesis efektif melawan Vibrio harveyi pathogen patogen infeksi. Begum dan rekan kerja menggunakan ekstrak daun teh hitam untuk mensintesis AuNPs dan AgNPs [23]. Sampai saat ini, sebagian besar AgNP berbentuk bola telah disintesis menggunakan ekstrak daun teh.
Dalam laporan ini, kitosan digunakan sebagai agen capping untuk AuNPs. Kitosan telah dieksplorasi sebagai pembawa obat/gen karena biokompatibilitasnya yang tinggi, alergenisitas yang rendah, biodegradabilitas, dan toksisitas yang rendah [24,25,26]. Kitosan berasal dari kitin, yang banyak terdapat pada eksoskeleton serangga dan krustasea seperti kepiting, lobster, dan udang. Kitin adalah polisakarida yang terdiri dari N -asetil-D-glukosamin dihubungkan oleh ikatan (1-4) glikosidik. Kitosan dapat diperoleh dari kitin dengan cara yang heterogen N -proses deasetilasi Kitosan sendiri memiliki aktivitas antibakteri, antijamur, antitumor, dan antioksidan. Sebagai capping agent, kitosan langsung mengontak AuNPs melalui mekanisme elektrosterik [26]. Nanopartikel kitosan mempengaruhi mekanisme serapan seluler oleh sel A549 tanpa memodifikasi sitotoksisitas [24]. Selanjutnya, derajat deasetilasi kitosan lebih berpengaruh daripada berat molekul terhadap serapan seluler dan sitotoksisitas [24].
Sebagian besar penelitian berfokus pada sintesis AgNPs bulat menggunakan ekstrak daun teh. Di sini, ekstrak daun teh hijau digunakan untuk mensintesis emas nanospheres dan nanostars. Nanospheres digunakan sebagai benih untuk sintesis nanostars yang dimediasi benih. Sebagai perbandingan, nanorods disintesis dengan metode konvensional umum [27]. Tiga bentuk AuNP yang berbeda (nanospheres, nanostars, dan nanorods) ditutup dengan kitosan untuk meningkatkan biokompatibilitas dan stabilitas koloidnya. AuNPs ini dicirikan oleh spektrofotometri UV-tampak, mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM), dan FT-IR. Pengukuran ukuran hidrodinamik dilakukan dengan metode dynamic light scattering (DLS) dan pengukuran potensial zeta dilakukan sebelum dan sesudah capping dengan kitosan. Stabilitas koloid dinilai dalam larutan garam, buffer, dan media kultur sel. Untuk mengukur sitotoksisitas, uji 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) diterapkan pada empat sel kanker:AGS (sel adenokarsinoma lambung manusia), HeLa (adenokarsinoma serviks epitel manusia). sel), HepG2 (sel karsinoma hepatosit manusia), dan HT29 (sel adenokarsinoma kolorektal manusia). Serapan seluler AuNPs dalam sel HepG2 diukur secara kuantitatif dengan spektroskopi emisi optik plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-OES) dan ablasi laser yang digabungkan secara induktif spektrometri massa plasma (LA-ICP-MS).
Bahan dan metode
Material dan instrumentasi
Asam klorourat trihidrat (HAuCl4 ·3H2 O), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), chitosan (dari kulit udang, 75% deacetylated), dan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide dibeli dari Sigma-Aldrich (St .Louis, MO, AS). Semua reagen lainnya adalah kelas analitis. Spektrofotometer Shimadzu UV-1800 atau UV-2600 digunakan untuk memperoleh spektrum UV-tampak dalam kuarsa kuarsa (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang). Pengukuran ukuran hidrodinamik dilakukan dengan DLS dan pengukuran potensial zeta dilakukan menggunakan NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA). Varian 640 IR digunakan untuk memperoleh spektrum FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); sampel yang diukur disiapkan dengan metode cakram KBr. Gambar HR-TEM diambil menggunakan JEM-3010 yang dioperasikan pada 300 kV (JEOL, Tokyo, Jepang); sampel dimasukkan ke dalam kisi tembaga berlapis karbon (karbon tipe-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA) dan dibiarkan kering dalam oven pada suhu 37 °C selama 24 jam. Untuk sonikasi, model WUC-A22H digunakan (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, Republik Korea). Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Jerman) dan FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republik Korea) masing-masing digunakan untuk sentrifugasi dan pengeringan beku. Untuk penyerapan seluler AuNPs, Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) dan J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA) digunakan.
Persiapan ekstrak teh hijau
Institut Teh Hijau Hadong (Hadong, Gyeongnam, Republik Korea) dengan baik hati memberikan hadiah berupa daun teh hijau kering. Blender digunakan untuk membuat bubuk dari daun kering. Ekstraksi dilakukan dengan mencampurkan air deionisasi (2 L) dan bubuk daun (200 g). Ekstraksi dibiarkan berlangsung selama 1 jam dengan sonikasi pada suhu sekitar dengan tiga kali pengulangan. Kertas saring Whatman digunakan untuk menyaring fraksi air untuk menghilangkan bahan yang tidak larut. Kemudian, filtrat disentrifugasi (3.000g kekuatan, 18 °C, 25 min), dan supernatan dikumpulkan. Supernatan yang terkumpul disaring dengan jarum suntik, dan filtratnya dikeringkan-beku. Bahan beku-kering dilarutkan dalam air deionisasi untuk membuat larutan stok dengan konsentrasi akhir 2% (w/v ) untuk sintesis hijau yang dijelaskan di bagian berikut.
Sintesis nanosfer emas menggunakan ekstrak
Proses sintesis nanosphere diilustrasikan pada Gambar 1a. Larutan stok yang dijelaskan pada bagian sebelumnya digunakan untuk sintesis. Dalam botol kaca, ekstrak (konsentrasi akhir 0,03%) dan asam kloroaurat trihidrat (konsentrasi akhir 0,5 mM) dicampur, dan natrium hidroksida (konsentrasi akhir 1 mM) ditambahkan. Air deionisasi ditambahkan untuk membuat volume akhir 2 mL. Inkubasi oven dilakukan dalam oven kering pada suhu 80 °C selama 2 jam. Resonansi plasmon permukaan (SPR) dari nanospheres dipantau dengan memperoleh spektrum UV-terlihat pada kisaran 300~800 nm. Nanospheres juga digunakan sebagai benih untuk sintesis nanostar yang dijelaskan di bagian berikut.
Sintesis nanosfer emas. a Diagram skematik dari proses sintesis dan b Spektrum nanosfir UV-terlihat sebelum dan sesudah capping kitosan. Sebuah foto digital menunjukkan nanospheres segera setelah sintesis
Sintesis bintang nano emas
Proses sintesis nanostar diilustrasikan pada Gambar 2a. Nanospheres (50 μL) yang disintesis seperti yang dijelaskan pada bagian sebelumnya diaduk (750 rpm) dengan batang magnet pada hot plate pada suhu kamar. Asam klorourat trihidrat (0,25 mM, 5 mL) ditambahkan ke larutan ini. Setelah 15 detik, dua larutan ditambahkan secara bersamaan:perak nitrat (1 mM, 50 μL) dan asam askorbat (yang baru disiapkan, 100 mM, 25 μL). Kemudian, campuran diaduk pada 750 rpm selama 5 min. Spektrum UV-terlihat diperoleh pada kisaran 300~1100 nm.
Sintesis bintang nano emas. a Diagram skematik dari proses sintesis dan b Spektrum UV-terlihat dari nanostar sebelum dan sesudah capping kitosan. Foto digital menunjukkan bintang nano segera setelah sintesis
Sintesis nanorod emas
Proses sintesis nanorod diilustrasikan pada Gambar 3a. Untuk sintesis nanorod emas, sintesis yang dimediasi benih dilakukan menurut laporan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [27]. Solusi pertumbuhan disiapkan sebagai berikut. Dalam botol kaca 20 mL, asam kloroaurat trihidrat (10 mM, 500 μL) dan setiltrimetilamonium bromida (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) dicampur. Solusinya berwarna coklat kekuningan. Selanjutnya, asam askorbat (yang baru disiapkan, 100 mM, 55 μL) ditambahkan, dan larutan ini diaduk sampai berubah dari coklat kekuningan menjadi tidak berwarna. Perak nitrat (10 mM, 100 μL) ditambahkan dan dikocok selama 10 s. Solusi akhir ini diberi label solusi pertumbuhan. Solusi benih disintesis sebagai berikut. Dalam botol kaca 20 mL, asam kloroaurat trihidrat (10 mM, 250 μL) dan CTAB (100 mM, 9,75 mL) dicampur. Kemudian, ditambahkan natrium borohidrida yang dingin dan segar (10 mM, 600 μL) dan divorteks selama 2 menit. Larutan tersebut diberi label larutan benih. Larutan benih (12 μL) dicampur dengan larutan pertumbuhan yang telah disintesis sebelumnya. Spektrum UV-terlihat diperoleh pada kisaran 400~900 nm.
Sintesis nanorod emas. a Diagram skematik dari proses sintesis dan b Spektrum UV-terlihat dari nanorods sebelum dan sesudah capping kitosan. Foto digital menunjukkan nanorod segera setelah sintesis
Pembatasan kitosan pada nanosfer, bintang nano, dan batang nano
Pembatasan kitosan digunakan untuk meningkatkan stabilitas koloid dan biokompatibilitas AuNPs. Kitosan dilarutkan dalam asam asetat 1%, dan konsentrasi akhir diatur menjadi 0,01%. Kemudian dilakukan sonikasi untuk melarutkan kitosan secara sempurna; larutan ini digunakan sebagai larutan stok untuk capping kitosan dalam prosedur berikut. Baik nanospheres dan nanostars yang sebelumnya disintesis ditutup dengan larutan stok kitosan (0,01%). Larutan stok kitosan (30 %, v/v ) dicampur dengan larutan AuNP (70 %, v/v ). Campuran diaduk pada 900 rpm selama 2 h untuk menyelesaikan capping kitosan. Untuk nanorods, kelebihan CTAB digunakan, dan dengan demikian, sentrifugasi (14.000 rpm, 15 min, 25 °C) dilakukan untuk menghilangkan CTAB. Nanorod diambil dari pelet, dan capping kitosan dilakukan seperti yang disebutkan di atas. Kemudian, spektrum UV-tampak diperoleh.
Penilaian stabilitas koloid
Stabilitas koloid AuNPs penting untuk aplikasi in vitro dan in vivo. Tiga jenis AuNPs dengan chitosan capping dan nanospheres tanpa chitosan capping dievaluasi stabilitas koloid dalam larutan berikut:air deionisasi, 5% bovine serum albumin (BSA), 5% NaCl, PBS (pH 7.4), medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco ( DMEM), dan medium penuh. Medium penuh adalah DMEM yang mengandung 10% fetal bovine serum (FBS). Satu mililiter dari setiap jenis larutan AuNP dicampur dengan larutan pengujian seperti yang disebutkan di atas (0,5 mL). Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 25 °C selama 30 min, dan diperoleh spektrum sinar UV.
Kultur sel dan sitotoksisitas
Garis sel kanker berikut dibeli dari Korean Cell Line Bank (Seoul, Republik Korea):AGS, HeLa, HepG2, dan HT29. Uji MTT dilakukan untuk mengevaluasi sitotoksisitas in vitro AuNPs. DMEM yang mengandung natrium piruvat digunakan. Media kultur sel mengandung 10% serum janin sapi, 2 mM L-glutamin, 1% penisilin (100 unit/mL), dan streptomisin (100 unit/mL). Sel dikultur dalam cawan kultur 100 mm dan dipertahankan pada pertemuan sekitar 70%. Sebelum kultur sel, AuNPs dari tiga bentuk berbeda menjadi sasaran penguapan vakum untuk mendapatkan konsentrasi Au akhir 5 mM. Pada pelat 96-sumur, sel-sel diunggulkan dengan kepadatan 5,0 × 10
3
sel/sumur, dan inkubasi dilakukan selama 24 jam dalam oven pada suhu 37 °C di bawah CO2 (5%) atmosfer. Selanjutnya, lima konsentrasi AuNP yang berbeda (500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, dan 31,25 μM) diperlakukan dan diinkubasi dalam oven selama 24 jam pada 37 °C di bawah CO2 (5%) atmosfer. Selanjutnya, reagen MTT (5 μL, 5% dalam air deionisasi) ditambahkan dan diinkubasi dalam oven 37 °C di bawah CO2 (5%) atmosfer untuk 3 jam tambahan. Absorbansi diukur pada 570 nm menggunakan pembaca multi-deteksi fluoresensi (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol.
Serapan seluler
Serapan seluler dari setiap jenis AuNP diukur secara kuantitatif menggunakan sel HepG2. Pada pelat 24-sumur, sel-sel diunggulkan dengan kepadatan 5,0 × 10
4
sel/sumur, dan inkubasi dilakukan selama 24 jam dalam oven pada suhu 37 °C di bawah CO2 (5%) atmosfer. Selanjutnya, 5 μM (konsentrasi akhir) dari setiap jenis larutan AuNP diperlakukan dan diinkubasi dalam oven selama 24 h tambahan pada 37 °C di bawah CO2 (5%) atmosfer. Setelah inkubasi, larutan yang mengandung AuNP berlebih dihilangkan, dan sel diperlakukan dengan tripsin. Konsentrasi Au dalam sel tripsin diukur secara kuantitatif dengan ICP-OES dan LA-ICP-MS, yang memberikan konsentrasi serapan Au dalam sel. Kontrolnya adalah 5 μM larutan koloid asli dari setiap jenis AuNP, yang juga dianalisis dengan ICP-OES dan LA-ICP-MS untuk mendapatkan konsentrasi Au.
Hasil dan diskusi
Spektrum sinar UV
Spektrum UV-terlihat umumnya diperoleh untuk mengkonfirmasi sintesis AuNPs. SPR karakteristik AuNPs dapat diamati pada rentang panjang gelombang tampak-dekat-inframerah. Selain itu, pembatasan AuNP umumnya menginduksi pergeseran bathokromik (atau merah) atau hipsokromik (atau biru). Selanjutnya, pergeseran hipokromik umumnya diinduksi bersama dengan pergeseran merah dan biru. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1b, spektrum UV-tampak dipantau pada rentang 300~800 nm. Nanospheres menunjukkan SPR karakteristik 532 nm dengan warna merah anggur yang dalam. Setelah chitosan capping nanospheres, SPR maksimum bergeser merah menjadi 537 nm bersama dengan pergeseran hipokromik (Gbr. 1b). Berbagai panjang gelombang SPR (600~800 nm) dengan larutan biru tua diamati untuk nanostar (Gbr. 2b). Capping kitosan dari nanostar menunjukkan pergeseran hipokromik, di mana absorbansinya lebih rendah daripada AuNPs tanpa capping kitosan (Gbr. 2b). Nanorods menunjukkan dua panjang gelombang SPR yang berbeda yaitu 514 nm dan 815 nm, dengan pembentukan larutan merah muda terang (Gbr. 3b). Pembatasan kitosan pada nanorod menginduksi pergeseran biru ke 797 nm bersama dengan pergeseran hipokromik (Gbr. 3b). Mempertimbangkan semua hasil ini, pembatasan AuNPs dengan kitosan mengubah panjang gelombang SPR dan menginduksi pergeseran. Pemeriksaan cermat terhadap spektrum UV-tampak menunjukkan bahwa ketiga jenis AuNP berhasil ditutup dengan kitosan.
Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta
Selanjutnya, ukuran hidrodinamik dan potensial zeta diukur; hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Tanpa pembatasan kitosan, ukuran hidrodinamika nanosfer dan bintang nano masing-masing adalah 28,4 dan 97,8 nm. Ukuran hidrodinamik nanorod tidak diukur karena ukuran hidrodinamik disesuaikan dengan baik dengan bentuk bola nanopartikel. Dengan pembatasan kitosan, ukuran hidrodinamik ditingkatkan menjadi 190,7 nm untuk nanospheres dan 123,9 nm untuk nanostars. Pembatasan kitosan dikonfirmasi oleh peningkatan ukuran hidrodinamik. Perubahan potensi zeta juga mencerminkan capping kitosan pada permukaan AuNPs. Kitosan adalah polisakarida bermuatan positif; dengan demikian, pembatasan kitosan menghasilkan potensi zeta positif untuk ketiga jenis AuNP. Untuk nanospheres, potensi zeta diubah dari 12,73 menjadi 42,28 mV. Potensi zeta dari nanostar diubah dari 42,46 menjadi 47,44 nm. Dalam kasus nanorods, CTAB (surfaktan kationik) digunakan untuk sintesis. Dengan demikian, potensi zeta asli adalah 27,96 mV tanpa pembatasan. Pembatasan kitosan pada nanorod meningkatkan potensi zeta menjadi 33,23 nm. Oleh karena itu, perubahan potensial zeta dari nilai negatif ke nilai positif untuk nanosfer dan bintang nano jelas menunjukkan keberhasilan capping dengan kitosan. Selanjutnya, potensi zeta nanorod meningkat, menunjukkan bahwa permukaannya ditutup dengan kitosan.
Gambar HR-TEM
Mikroskopi sangat penting untuk penelitian nanopartikel, memberikan informasi penting tentang ukuran dan bentuk nanopartikel. Alat mikroskop memberikan berbagai informasi rinci, seperti keadaan dispersi, morfologi dan topografi dua dan tiga dimensi, dan kelembutan/kekerasan relatif bahan. Nanospheres diukur 8,7 ± 1,7 nm, berdasarkan rata-rata 75 nanopartikel diskrit yang dipilih secara acak dalam gambar HR-TEM (Gbr. 4). Ukuran yang paling melimpah adalah 8~9 nm (29,3%), diikuti oleh 9~10 nm (12,0%). Dengan pembatasan kitosan, bentuk nanosfer dipertahankan tanpa perubahan bentuk (Gbr. 4c, d). Sifat kristal dari partikel ditunjukkan dengan jelas oleh struktur kisi yang ditunjukkan pada Gambar. 4d. Jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,24 nm (Gbr. 4d). Selanjutnya, lapisan kitosan juga divisualisasikan, seperti yang ditunjukkan oleh panah merah pada Gambar. 4d. Nanostars divisualisasikan oleh HR-TEM, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5. Nanostars diukur 99,0 ± 47.0 nm, mewakili rata-rata 19 nanopartikel diskrit. Struktur kisi ditunjukkan dalam gambar yang diperbesar (Gbr. 5c). Seperti yang ditunjukkan, jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,24 nm (Gbr. 5c). Panah merah pada Gambar 5c menunjukkan lapisan kitosan. Nanorods divisualisasikan seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6. Panjang dan lebar partikel rata-rata adalah 60,4 nm dan 16,4 nm, masing-masing, menurut pengukuran yang dilakukan untuk 28 partikel. Rasio aspek, yang didefinisikan sebagai panjang partikel dibagi dengan lebar partikel, adalah 3,7. Struktur kisi ditunjukkan pada Gambar. 6c, mengkonfirmasikan struktur kristal dari nanorods. Jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,23 nm (Gbr. 6c). Panah merah menunjukkan lapisan kitosan (Gbr. 6c).
Gambar HR-TEM dari nanospheres emas. Bilah skala mewakili a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm, dan d 5 nm. Gambar a dan b diperoleh tanpa pembatasan kitosan, dan c dan d diperoleh dengan kitosan capping. Jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,24 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah ditutup
Gambar HR-TEM dari nanostar emas. Bilah skala mewakili a 200 nm, b 50 nm, dan c 5 nm. d Representasi skematis dari nanostar dengan ukuran rata-rata 99,0 ± 47.0 nm. Gambar a diperoleh tanpa pembatasan kitosan, dan b dan c diperoleh dengan kitosan capping. Jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,24 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah ditutup
Gambar HR-TEM dari nanorod emas. Bilah skala mewakili a 100 nm, b 200 nm, dan c 5 nm. d Representasi skematik nanorod dengan panjang dan lebar rata-rata masing-masing 60,4 nm dan 16,4 nm. Gambar a diperoleh tanpa pembatasan kitosan, dan b dan c diperoleh dengan kitosan capping. Jarak antara kisi-kisi tetangga diukur menjadi 0,23 nm. Panah merah menunjukkan lapisan kitosan setelah ditutup
Spektrum FT-IR
Teh hijau mengandung metabolit primer dan sekunder yang beragam. Secara khusus, konstituen utama teh hijau adalah polifenol, termasuk epigallocatechin-3-gallate, (-)-epicatechin-3-gallate, (-)-epigallocatechin, dan (-)-epicatechin [28]. Spektrum FT-IR diperoleh untuk memperoleh informasi tentang gugus fungsi yang berkontribusi pada sintesis AuNPs. Kami membandingkan spektrum FT-IR nanospheres dengan spektrum ekstrak (Gbr. 7). Gugus fungsi utama yang paling mungkin terlibat dalam reaksi reduksi garam Au adalah –OH. Dalam ekstrak, gugus fungsi –OH muncul pada 3255 cm
−1
(Gbr. 7a). Setelah sintesis, puncak ini digeser ke bilangan gelombang yang lebih tinggi pada 3300~3341 cm
−1
. Hasil ini menunjukkan bahwa gugus fungsi –OH berasal dari polifenol yang dioksidasi menjadi C=O sambil mereduksi garam Au menjadi AuNPs. Hebatnya, munculnya gugus fungsi C=O pada 1716 cm
−1
di nanospheres jelas mendukung oksidasi gugus fungsi –OH selama sintesis (Gbr. 7b).
Spektrum FT-IR a ekstrak teh hijau digunakan untuk sintesis dan b nanosfer emas
Penilaian stabilitas koloid pada berbagai larutan
Stabilitas koloid nanopartikel merupakan perhatian penting untuk aplikasi diagnostik dan terapeutik. Enam larutan yang berbeda diuji untuk stabilitas koloid:(i) air deionisasi, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7.4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, dan (vi ) sedang penuh (DMEM dengan 10% FBS). Setelah mencampur setiap jenis AuNPs dengan larutan pengujian, spektrum UV-tampak diperoleh; hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2 dan Gambar 8. Pergeseran hipokromik bersama dengan sedikit pergeseran merah atau biru diamati untuk ketiga jenis AuNP dalam spektrum UV-tampak (Gbr. 8a, c, dan e). Bentuk spektrum dipertahankan, dan tidak ada agregasi larutan koloid yang diamati (Gbr. 8b, d, dan f). Hasil ini menunjukkan bahwa stabilitas koloid dipertahankan dengan cukup baik dalam larutan pengujian yang disebutkan di atas.
Penilaian stabilitas koloid. a dan b nanospheres dengan chitosan capping, c dan d nanostars dengan chitosan capping, e dan f nanorods dengan penutup kitosan, g dan h nanospheres tanpa chitosan capping. DW mewakili air terdeionisasi
Pada Tabel 2, pergeseran hipokromik dinyatakan sebagai persentase absorbansi yang tertahan, dengan absorbansi larutan asli ditetapkan ke 100%. Di ketiga AuNP, stabilitas koloid paling baik dipertahankan dalam medium penuh, yang digunakan untuk percobaan sitotoksisitas berikutnya:nanospheres (65,3%), nanostars (93,4%), dan nanorods (80,2%). Solusi protein, BSA (5 %), juga memberikan stabilitas koloid yang wajar:nanospheres (61,8 %), nanostars (70,2 %), dan nanorods (72,0 %). Hasil ini menunjukkan bahwa protein yang menutupi nanopartikel memiliki efek menguntungkan lebih lanjut pada stabilitas koloid AuNPs bersama dengan capping kitosan. Stabilitas koloid dari nanospheres tanpa chitosan capping juga dinilai (Gbr. 8g, h). Semua solusi menginduksi pergeseran hipokromik. Di antara larutan yang diuji, hanya larutan NaCl (5%) yang menunjukkan pergeseran merah besar bersama dengan pergeseran hipokromik.
Sitotoksisitas
Uji MTT dilakukan untuk mengukur sitotoksisitas terhadap empat jenis sel kanker (Gbr. 9):AGS, HeLa, HepG2, dan HT29. The cytotoxicity of all three types of AuNPs was dependent on the Au concentration. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC50 value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.
Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). a AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells
It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.
Cellular uptake on HepG2 cells
HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.
Cellular uptake by HepG2 cells
The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.
Conclusion
The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.
