Biosensor Transistor Efek Medan Magnetik Grafena untuk Deteksi DNA Untai Tunggal
Abstrak
Di sini, biosensor transistor efek medan magnet graphene disiapkan melalui transfer film graphene deposisi uap kimia ke substrat kaca untuk menghasilkan film penginderaan dan saluran konduktif. Dengan memperbaiki 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester ke film graphene sebagai jangkar, aptamer probe diimobilisasi pada film graphene untuk menangkap DNA untai tunggal komplementer berlabel magnetis. Eksperimen kami menunjukkan bahwa, dalam medan magnet periodik, impedansi biosensor menunjukkan osilasi periodik, amplitudonya berkorelasi dengan konsentrasi DNA komplementer. Berdasarkan prinsip ini, transistor efek medan grafena magnetik digunakan untuk mendeteksi DNA untai tunggal dengan batas deteksi 1 pM. Hasilnya dirasionalisasi menggunakan model di mana gaya magnet menyebabkan untai DNA menekuk, sehingga menghasilkan modulasi nanobeads/DNA magnetik dari lapisan konduktif ganda transistor graphene. Selanjutnya, karena medan magnet periodik dapat diperkenalkan untuk menghasilkan perubahan impedansi periodik MGFET, integrasi pengambilan sampel dapat digunakan untuk meningkatkan rasio signal-to-noise secara efisien dengan meningkatkan jumlah periode medan magnet eksternal. Oleh karena itu, biosensor baru untuk deteksi DNA dengan sensitivitas tinggi telah disajikan dalam karya ini. Berdasarkan prinsip deteksi, sistem ini juga dapat menjadi alat yang potensial untuk mendeteksi biomolekul lain, sel, dll.
Pengantar
Deteksi DNA sangat penting untuk studi biologi molekuler dan diagnosis penyakit genetik [1,2,3]. Sampai saat ini, berbagai biosensor untuk deteksi DNA telah dikembangkan, termasuk biosensor fluoresen [4, 5], biosensor elektrokimia [6,7,8,9], dan biosensor transistor efek medan (FET) [10,11,12,13] ], dengan yang terakhir telah menarik perhatian luas karena sensitivitas dan spesifisitasnya yang tinggi. Kaisti dkk. [12] mengembangkan biosensor FET untuk mendeteksi DNA untai tunggal yang tidak berlabel menggunakan probe asam nukleat peptida. Kim dkk. [13] membuat sensor muatan DNA tipe FET berdasarkan teknologi semikonduktor oksida logam komplementer standar.
Karena luas permukaan spesifik yang tinggi, konduktivitas listrik yang tinggi, dan mobilitas elektron yang sangat baik, graphene telah digembar-gemborkan sebagai bahan yang ideal untuk pembuatan biosensor FET [14,15,16]. Cai dkk. [15] mengembangkan biosensor graphene FET (GFET) untuk deteksi ultrasensitif DNA melalui hibridisasi DNA asam nukleat peptida. Kelompok kami juga telah mengusulkan biosensor GFET multi-saluran untuk menentukan kinetika pengikatan dan afinitas hibridisasi DNA dan ketidakcocokan basa tunggal [16].
Dalam GFET konvensional, medan listrik elektroda gerbang eksternal menghasilkan lapisan konduktif ganda pada antarmuka antara film graphene dan larutan elektrolit [17,18,19]. Berdasarkan model tawanan GFET [16], elektroda gerbang mengisi dan melepaskan lapisan konduktif ganda melalui elektrolit, sehingga memodulasi konduktivitas GFET. Oleh karena itu, konduktivitas GFET terkait dengan intensitas medan listrik eksternal dan konsentrasi ion dalam elektrolit.
Selama penelitian, ditemukan bahwa penelitian tentang sensitivitas GFET telah mencapai level fM. Misalnya, Ping dkk. [20] dan Zheng et al. [21] telah melaporkan biosensor GFET konvensional dengan batas deteksi di tingkat fM. Namun, literatur di atas mencapai sensitivitas yang sangat tinggi dengan deteksi penganalisis semikonduktor, yang mahal dan tidak nyaman untuk aplikasi praktis. Selain itu, elektroda Ag/AgCl biasanya digunakan sebagai elektroda gerbang eksternal, yang tidak cocok untuk konstruksi biosensor terintegrasi karena ukuran dan dapat digunakan kembali.
Di sini, biosensor magnetik GFET (MGFET), di mana medan magnet daripada medan listrik digunakan untuk memodulasi konduktivitas GFET, dikembangkan. Saluran konduktif dicapai dengan menggunakan film graphene deposisi uap kimia (CVD) yang ditransfer ke substrat kaca dengan dua elektroda indium timah oksida (ITO). Film graphene difungsikan dengan 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester (PBASE) untuk memungkinkan keterkaitan aptamer probe untuk menangkap dan hibridisasi dengan DNA untai tunggal berlabel magnetis komplementer (cDNA). Menerapkan medan magnet periodik di sisi belakang MGFET, impedansi listrik MGFET periodik tercapai. Selanjutnya, fluktuasi impedansi listrik MGFET dalam medan magnet periodik terkait dengan konsentrasi cDNA. Perangkat deteksi buatan laboratorium yang sesuai dibangun untuk mendeteksi impedansi MGFET secara real time. Karena medan magnet tidak bersentuhan dengan MGFET secara langsung, MGFET yang disiapkan di sini lebih mudah untuk diintegrasikan dan diterapkan daripada biosensor GFET konvensional. Persiapan MGFET, konstruksi sistem deteksi buatan lab, dan prinsip deteksi semuanya dijelaskan secara rinci dalam makalah ini.
Metode
Materi dan Instrumen
Substrat kaca dengan elektroda ITO dibeli dari Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (Cina). Probe aptamer, cDNA, dan DNA yang tidak cocok dibeli dari Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China). Urutan aptamer probe adalah (5′-NH2 -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3′), urutan DNA komplementernya adalah (5′-NH2 -GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′), urutan DNA yang benar-benar tidak cocok adalah (5′-NH2 -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3′), dan urutan DNA tidak cocok basa tunggal adalah (5′-NH2 -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′). PBASE dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina). Magnetic nanobeads (MBs) yang dimodifikasi dengan gugus karboksil (10 mg/mL) diperoleh dari Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida, N-hidroksisuksinimida, sodium dodecylbenzenesulfonate (SDS), dan sodium dodecyl sulfate phosphate-buffered saline (PBS, P5368-10PAK; pH 7,4) dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai , Cina).
Sistem mikroskopis Raman (SPEX-1403, SPEX) digunakan untuk mengkarakterisasi kualitas graphene serta untuk memverifikasi fungsionalitas MGFET. Sebuah fotometer fluoresensi (LS55, PerkinElmer) digunakan untuk mengkarakterisasi kopling nanopartikel magnetik untuk cDNA. Sistem akuisisi data buatan lab digunakan untuk merekam impedansi MGFET secara real time.
Menggabungkan cDNA ke MB
Setelah didispersikan secara merata melalui ultrasound selama 20 menit, suspensi 20 μL MB yang dimodifikasi dengan gugus karboksil dicampur dengan 200 μL 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida (2 mg/mL) dan 200 μL N- hydroxysuccinimide (2 mg/mL) selama 15 min untuk mendapatkan MB yang diaktifkan [22, 23]. Kemudian, 20 μL larutan cDNA ditambahkan ke dalam larutan MBs dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dengan pengocokan lembut terus menerus. Medan magnet kemudian diperkenalkan untuk memperkaya sampel cDNA melalui MB. Konjugat magnetic nanobeads/DNA (MB/cDNA) dicuci tiga kali dengan PBS dan didispersikan dalam PBS untuk penggunaan selanjutnya.
Fabrikasi MGFET
Persiapan MGFET dijelaskan secara rinci di bawah ini. Pertama, film graphene CVD dipindahkan ke pelat kaca sebagai saluran konduktif antara dua elektroda ITO (Gbr. 1a), seperti yang dijelaskan sebelumnya [18, 19]. Kedua, PBASE (10 mM) yang dilarutkan dalam DMSO disuntikkan ke dalam MGFET selama 12 h pada suhu kamar dan dibiarkan bereaksi sepenuhnya dengan graphene melalui susun –π (Gbr. 1b). MGFET kemudian dicuci berturut-turut dengan DMSO dan PBS untuk menghilangkan PBASE yang tidak bereaksi. Ketiga, 2 μM probe aptamer dimasukkan ke dalam MGFET dan diinkubasi dengan PBASE selama 4 jam pada suhu kamar, memungkinkan probe aptamer bereaksi cukup dengan PBASE (Gbr. 1c). MGFET kemudian masing-masing dicuci dengan 0,2% SDS tiga kali untuk menghilangkan aptamer probe yang tidak terikat.
Fungsionalisasi dan prinsip deteksi MGFET. a Film graphene ditumbuhkan dengan deposisi uap kimia. b Fungsionalisasi graphene oleh PBASE. c Imobilisasi probe aptamer melalui PBASE. d Hibridisasi aptamer probe dengan cDNA. e Foto alat pendeteksi
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi MGFET
Film graphene yang diproduksi dengan metode CVD dipindahkan pada substrat kaca sebagai saluran konduktif antara dua elektroda ITO (Gbr. 1a). Film graphene yang ditransfer dikarakterisasi dengan spektrum Raman (Gbr. 2). Munculnya tiga puncak karakteristik graphene menunjukkan keberhasilan transfer film graphene ke substrat kaca [24, 25]. Rasio intensitas antara pita 2D dan pita G (I2D /IG ) menunjukkan bahwa graphene yang ditransfer adalah film multilayer [26]. Selanjutnya, rasio intensitas antara pita D dan pita G (ID /IG ) kecil, menunjukkan kepadatan cacat yang sangat rendah.
Spektrum Raman
Karena kurangnya gugus fungsi, rantai aptamer sulit dimodifikasi pada film graphene CVD. Oleh karena itu, berdasarkan gugus pirenil aromatiknya, PBASE dimodifikasi pada film graphene melalui susun –π sebagai penghubung. Di ujung lain PBASE, bagian suksinimida dari PBASE dapat digabungkan ke 5′-NH2 aptamer probe berlabel berdasarkan reaksi pengikatan silang N-hidroksisuksinimida (NHS) (Gbr. 1c). Untuk menilai pengikatan probe aptamer pada film graphene, ujung 3′ dari probe aptamer diberi label menggunakan FAM fluorofor (urutan:5′-NH2 -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3′). Segera setelah pengenalan aptamer, intensitas fluoresensi jelas ditingkatkan, menunjukkan modifikasi yang berhasil pada permukaan graphene (Gbr. 3). Meningkatkan konsentrasi probe aptamer menyebabkan peningkatan intensitas fluoresensi, mencapai nilai konstan, dan oleh karena itu menunjukkan saturasi probe aptamer pada MGFET, sekitar 2 μM. Oleh karena itu, eksperimen selanjutnya dilakukan pada konsentrasi probe aptamer 2 μM.
Karakterisasi modifikasi MGFETs oleh probe aptamer. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari 5 analisis independen
Karakterisasi MB/cDNA
Morfologi konjugat MB dan MB/cDNA dicirikan dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gbr. 4a, b). Distribusi ukuran partikel MB menunjukkan ukuran partikel rata-rata sekitar 7 nm (Gbr. 4c). Untuk memastikan sensitivitas dan akurasi dalam biosensing untuk cDNA, MBs harus berlebihan untuk cDNA untuk menangkap cDNA sepenuhnya. MB pada konsentrasi 4 mg/mL diaktifkan untuk memastikan pengikatan sampel cDNA yang digunakan di sini. Melalui pelabelan cDNA oleh FAM, intensitas fluoresensi dieksploitasi untuk mengkarakterisasi efisiensi kopling dan mengoptimalkan konsentrasi cDNA (Gbr. 4d). Memang, intensitas fluoresensi supernatan menurun dengan jelas setelah pengenalan MB ke dalam solusi cDNA, menunjukkan bahwa cDNA ditangkap dan diperkaya oleh MB. Keberhasilan penangkapan cDNA oleh MB dikonfirmasi oleh pengamatan bahwa, pada konsentrasi cDNA 10 nM, intensitas fluoresensi supernatan setara dengan PBS, yang menunjukkan bahwa semua cDNA ditangkap dan diperkaya oleh MB (Gbr. 4d ).
Karakterisasi kopling MB/cDNA. a TEM dari MB. b TEM konjugat MB/cDNA. c Distribusi ukuran partikel MB. d Karakterisasi kopling MB/cDNA (FAM). Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari 5 analisis independen
Analisis Intensitas Medan Magnet
Konjugat MB / cDNA ditambahkan ke dalam MGFET selama 10 menit untuk memungkinkan hibridisasi cDNA lengkap dengan probe aptamer. Karena aptamer probe tidak dapat berpasangan dengan MB tanpa gugus amino yang dimodifikasi, kelebihan MB dapat dihilangkan melalui pencucian MGFET tiga kali dengan PBS. Oleh karena itu, hanya konjugat MB/cDNA yang tersisa pada MGFET (Gbr. 1d). Magnet permanen dipasang ke motor yang berputar untuk menerapkan medan magnet periodik ke MGFET (Gbr. 1e). Perangkat pendeteksi buatan laboratorium digunakan untuk merekam fluktuasi impedansi MGFET.
Karena impedansi MGFET dimodulasi oleh medan magnet sebagai gerbang belakang, korelasi antara intensitas medan magnet dan impedansi MGFET diselidiki untuk mengoptimalkan parameter intensitas medan magnet (Gbr. 5). Secara umum diyakini bahwa lapisan konduktif ganda yang terbentuk antara graphene dan elektrolit dimodulasi oleh medan listrik eksternal, sehingga memodulasi konduktivitas GFET [19, 27, 28]. Dalam MGFET, melalui gaya magnet antara MB dan medan magnet, jarak antara konjugat MB/cDNA dan film graphene dikontrol secara mekanis, sehingga memodulasi lapisan konduktif ganda MGFET [29, 30]. Impedansi biosensor MGFET bervariasi dengan meningkatnya intensitas medan magnet dalam tiga tahap yang dapat dijelaskan melalui pengambilan rantai MB/cDNA sebagai batang tipis elastis [31]. Tahap pertama terjadi pada intensitas medan magnet kurang dari 100 mT dalam pekerjaan ini. Berdasarkan model batang tipis elastis rantai DNA, karena gaya medan magnet kurang dari gaya pendukung radial untai DNA, gaya medan magnet sulit menyebabkan untai DNA menekuk; oleh karena itu, MGFET tidak sensitif terhadap medan magnet. Pada tahap kedua dengan kekuatan medan magnet dari 100 hingga 200 mT, kekuatan medan magnet cukup untuk mengatasi gaya penopang radial dari batang tipis elastis DNA, menghasilkan pembengkokan cepat MB/cDNA dan kemudian respons sensitif dari MGFET ke medan magnet. Akhirnya, pada tahap ketiga dengan intensitas medan magnet di atas 220 mT, pembengkokan batang elastis DNA mencapai batasnya; oleh karena itu, MGFET tidak akan merespons perubahan medan magnet, menghasilkan impedansi yang stabil dari MGFET seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b.
Pengaruh intensitas medan magnet pada impedansi MGFETs. a Impedansi MGFET di bawah intensitas medan magnet yang bervariasi dalam domain waktu. b Hubungan antara impedansi MGFET dan intensitas medan magnet. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari 5 analisis independen
Deteksi cDNA
Perubahan impedansi MGFET dengan berbagai konsentrasi konjugat MB/cDNA diukur di bawah kekuatan medan magnet tetap sebesar 240 mT untuk menentukan kelayakan dan sensitivitas untuk deteksi cDNA.
Impedansi MGFET pada setiap konsentrasi cDNA dicatat secara real time (Gbr. 6a). Ketika magnet permanen dimuat ke bagian belakang MGFET, impedansi meningkat dengan cepat. Sebaliknya, ketika medan magnet periodik diterapkan, perubahan periodik dalam impedansi diamati. Berdasarkan periodisitas impedansi ini, algoritma integrasi sampel (SIA) digunakan untuk meningkatkan rasio signal-to-noise dari MGFET. Mengingat periode tanpa menerapkan medan magnet adalah T0 dan periode dengan penerapan medan magnet adalah TM (Gbr. 6a), SIA dapat dijelaskan dengan langkah-langkah berikut:(1) selama T0 , semua titik data, yang dihasilkan oleh noise, dinormalisasi menjadi nol, (2) titik data yang diperoleh selama setiap TM periode diambil sampelnya dan dirata-ratakan secara berurutan. Setelah pemrosesan SIA selama empat siklus, perubahan impedansi periodik dalam MGFET diperoleh seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b. Secara teori, rasio signal-to-noise dari MGFET dapat ditingkatkan secara efektif menggunakan waktu pengambilan sampel yang cukup lama.
a Domain waktu fluktuasi impedansi dengan konsentrasi cDNA yang berbeda. b Perubahan impedansi MGFET menurut konsentrasi cDNA
Perubahan impedansi pada MGFET memiliki korelasi positif dengan konsentrasi cDNA (Gbr. 6b). Korelasi antara perubahan impedansi MGFET dan konsentrasi cDNA dinilai (Gbr. 7). Sensitivitas tinggi biosensor MGFET dalam pekerjaan ini terutama didasarkan pada dua aspek berikut:pertama, gerakan mekanis konjugat MB/cDNA dapat meningkatkan efek modulasi pada lapisan konduktif ganda dibandingkan dengan kasus DNA saja, dan kedua, karena medan magnet periodik dapat diterapkan untuk menghasilkan perubahan impedansi periodik MGFET, berdasarkan prinsip integrasi pengambilan sampel, hanya impedansi MGFET dengan medan magnet yang diambil sampelnya dan diintegrasikan untuk mengurangi kebisingan. Oleh karena itu, rasio signal-to-noise sistem dapat sangat dioptimalkan dengan meningkatkan jumlah periode medan magnet eksternal.
Hubungan antara impedansi MGFET dan konsentrasi DNA target. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari 5 analisis independen
Selektivitas MGFET
Spesifisitas MGFET dievaluasi dengan mendeteksi dua urutan DNA target yang berbeda, termasuk rantai DNA yang benar-benar tidak cocok dan rantai DNA yang tidak cocok dengan basis tunggal. Mirip dengan prosedur yang dijelaskan di atas, DNA yang benar-benar tidak cocok (urutan:5′-NH2 -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3′) dan DNA basa tunggal yang tidak cocok (urutan:5′-NH2 -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′) masing-masing digabungkan ke MB. MB/DNA yang tidak cocok yang dilarutkan dalam larutan PBS ditambahkan ke dalam biosensor MGFET selama 10 menit untuk bereaksi dengan aptamer secukupnya. MGFET dicuci dengan PBS selama tiga kali untuk menghilangkan DNA yang tidak cocok. Untuk rantai DNA yang benar-benar tidak cocok, karena konjugat MB/DNA tidak dapat berhibridisasi dengan aptamer, hampir semua konjugat MB/DNA dihilangkan. Oleh karena itu, penambahan MB/DNA yang benar-benar tidak cocok hampir tidak berpengaruh pada konduktivitas graphene seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, yang menunjukkan selektivitas biosensor yang tinggi. Selanjutnya, kami juga telah menyelidiki selektivitas biosensor melalui rantai DNA yang tidak cocok basa tunggal seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7. Dapat ditemukan bahwa perubahan impedansi MGFET dengan rantai tidak cocok basa tunggal sedikit lebih rendah daripada untai komplementer dan lebih tinggi dari untai target nonkomplementer pada setiap konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, untai ketidakcocokan basa tunggal dapat dideteksi dalam pekerjaan ini. Meskipun aptamer dan rantai DNA komplementer semuanya adalah produk komersial yang terutama menentukan selektivitas biosensor, MGFET dan sistem deteksinya juga memberikan kontribusi terhadap sensitivitas tinggi untuk deteksi DNA.
Hubungan antara impedansi MGFET dan konsentrasi DNA yang sepenuhnya tidak cocok. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari 5 analisis independen
Kesimpulan
Di sini, biosensor MGFET berdasarkan graphene dan nanopartikel magnetik disajikan untuk mendeteksi cDNA. Dalam MGFET, nanopartikel magnetik dimodifikasi ke ujung urutan cDNA. Melalui gaya magnet antara MB dan medan magnet, jarak antara konjugat MB/cDNA dan film graphene dikontrol secara mekanis, sehingga memodulasi lapisan konduktif ganda MGFET. Selanjutnya, kita juga dapat menyimpulkan bahwa, untuk untai DNA tertentu, impedansi MGFET akan mencerminkan tekanan untai DNA, yang pada gilirannya mencerminkan pembengkokan untai DNA (inset, Gambar 5b). Dengan demikian, MGFET saat ini memiliki potensi untuk digunakan dalam studi parameter mekanis rantai DNA. Oleh karena itu, MGFET tidak hanya berfungsi sebagai biosensor untuk deteksi cDNA tetapi juga berpotensi mendeteksi parameter mekanis rantai DNA.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel.
