Biosensor Transistor Efek Medan Grafena Magnetik untuk Deteksi DNA Rangkaian Tunggal Sensitif Tinggi

Pendahuluan

Deteksi DNA sangat penting untuk penelitian biologi molekuler dan diagnosis gangguan genetik [1,2,3]. Sepanjang dekade terakhir, biosensor berdasarkan fluorescensi [4,5], elektrokimia [6–9], dan transistor efek medan (FET) [10–13] telah dikembangkan untuk tujuan ini, dengan sensor tipe FET mendapatkan perhatian khusus karena sensitivitas dan spesifikitas yang melekat. Kaisti et al. memperkenalkan FET yang difungsionalkan asam nukleik peptida untuk deteksi DNA rangkaian tunggal tanpa label [12], sementara Kim et al. membuat sensor muatan DNA berbasis komplementer-semikonduktor oksida logam-semikonduktor (CMOS) [13]. Grafena, dengan luas permukaan, konduktivitas listrik, dan mobilitas penangkap yang luar biasa, telah muncul sebagai platform ideal untuk membangun biosensor FET [14–16]. Cai dan rekan melaporkan FET grafena (GFET) yang mampu deteksi DNA ultra-sensitif melalui hibridisasi asam nukleik peptida [15], dan kelompok kami sebelumnya telah mendemonstrasikan GFET multikanal untuk mempelajari kinetika ikatan DNA dan ketidakcocokan pasangan basis [16]. Dalam GFET konvensional, elektroda gerbang eksternal menghasilkan medan listrik yang membentuk lapisan ganda pada antarmuka grafena–elektrolit [17–19], sehingga memodulasi konduktansi perangkat. Studi terbaru telah mencapai batas deteksi femtomolar dengan GFET [20,21]; namun, sensitivitas tinggi ini bergantung pada analyzer semiconductor mahal dan elektroda referensi Ag/AgCl, yang membatasi penerapan praktis. Untuk mengatasi tantangan ini, kami merancang transistor efek medan grafena magnetik (MGFET) yang menggunakan medan magnetik, bukan gerbang listrik, untuk memodulasi saluran grafena. MGFET menyatukan film grafena CVD yang ditransfer pada substrat kaca yang dilengkapi elektroda oksida timbal timah (ITO). Grafena difungsionalkan dengan PBASE, memungkinkan pasangan kovalen aptamer probe yang menangkap cDNA yang dilabeli magnetik. Saat subjek pada medan magnetik periodik, impedansi MGFET berosilasi dengan cara yang berkorelasi dengan konsentrasi cDNA. Pendekatan magnetik ini menghilangkan kontak elektroda langsung, menyederhanakan integrasi dan memperluas適用nya. Bagian-bagian berikut mendetail pembuatan, sistem deteksi, dan mekanisme deteksi yang mendasari biosensor MGFET baru ini.

Metode

Bahan dan Instrumen

Substrat kaca dengan elektroda ITO diperoleh dari Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (China). Aptamer probe, cDNA, dan DNA tidak cocok dibeli dari Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China). Sekuens aptamer adalah (5′‑NH₂‑TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC‑FAM‑3′); sekuens DNA komplementer (cDNA) adalah (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′); DNA yang tidak cocok sepenuhnya adalah (5′‑NH₂‑TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC‑3′); dan DNA yang tidak cocok satu basis adalah (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′). PBASE dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh dari Sigma‑Aldrich (Shanghai, China). Nanomanik magnetik (MB) dengan fungsionalisasi karboksil (10 mg mL⁻¹) diperoleh dari Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida, N-hidroxisuksinimid, natrium dodeklbensen sulfonat (SDS), dan garam fosfat (PBS, pH 7,4) dibeli dari Sigma‑Aldrich (Shanghai, China).

Spektrometer Raman (SPEX‑1403, SPEX) mengkarakterisir kualitas grafena dan mengonfirmasi fungsionalisasi PBASE. Fotometri fluoresensi (LS55, PerkinElmer) mengukur pasangan nanopartikel magnetik ke cDNA. Sistem pengambilan data khusus merekam impedansi MGFET secara real-time.

Pasangan cDNA ke MB

Setelah diikatsoni selama 20 menit, 20 µL suspensi MB 4 mg mL⁻¹ dicampur dengan 200 µL EDC 2 mg mL⁻¹ dan 200 µL NHS 2 mg mL⁻¹ selama 15 menit untuk mengaktifkan MB [22,23]. Selanjutnya, 20 µL cDNA ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang dengan pengadukan lembut. Medan magnetik kemudian memperkaya konjugat MB/cDNA, yang dicuci tiga kali dengan PBS dan disuspensi ulang untuk penggunaan selanjutnya.

Pembuatan MGFETs

MGFETs dibuat dalam proses tiga tahap: (1) film grafena CVD ditransfer pada piring kaca yang berfungsi sebagai saluran konduktif di antara dua elektroda ITO (Gambar 1a). (2) Larutan PBASE 10 mM dalam DMSO diinkubasi pada grafena selama 12 jam pada suhu ruang, memungkinkan tumpukan π–π dengan jaring grafena (Gambar 1b). PBASE berlebih dihapus dengan mencuci menggunakan DMSO dan PBS. (3) Larutan aptamer probe 2 µM diperkenalkan dan diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang, memungkinkan pasangan kovalen melalui ester NHS dari PBASE (Gambar 1c). Akhirnya, aptamer yang tidak terikat dicuci dengan SDS 0,2 % tiga kali.

Fungsionalisasi dan prinsip deteksi MGFETs. a Film grafena yang dibentuk oleh depo uap kimia. b Fungsionalisasi grafena oleh PBASE. c Immobilisasi aptamer probe melalui PBASE. d Hibridisasi aptamer probe dengan cDNA. e Foto perangkat deteksi

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi MGFETs

Film grafena CVD berhasil ditransfer pada substrat kaca, dikonfirmasi oleh spektrum Raman (Gambar 2). Keberadaan puncak G, D, dan 2D mengindikasikan grafena berkualitas tinggi; rasio I_2D/I_G mengonfirmasi film berlapis banyak, sementara rasio I_D/I_G yang rendah menunjukkan defek minimal [24–26].

Spektrum Raman film grafena yang ditransfer

Pasangan langsung aptamer pada grafena murni sulit karena kurangnya grup fungsional; oleh karena itu, PBASE berfungsi sebagai penaut ancor π–π. Grup suksinimid PBASE bereaksi dengan 5′-NH₂ aptamer melalui kimia NHS (Gambar 1c). Immobilisasi aptamer yang berhasil dikonfirmasi oleh intensitas fluoresensi label FAM di ujung 3′ (Gambar 3). Fluoresensi meningkat dengan konsentrasi aptamer hingga platfo pada ~2 µM, menunjukkan saturasi permukaan. Oleh karena itu, eksperimen selanjutnya menggunakan konsentrasi aptamer 2 µM.

Karakterisasi fluoresensi immobilisasi aptamer. Bar kesalahan menunjukkan deviasi standar dari 5 analisis independen.

Karakterisasi MB/cDNA

Mikroskop transmisi elektron mengungkapkan bahwa MB berukuran ~7 nm diameter (Gambar 4a,b). Untuk memaksimalkan efisiensi tangkapan, konsentrasi MB 4 mg mL⁻¹ digunakan untuk aktivasi. Efisiensi pasangan dipantau dengan mengukur penurunan intensitas fluoresensi FAM dalam sobrenatan (Gambar 4d). Pengayaan lengkap 10 nM cDNA tercapai, diketahui oleh tingkat fluoresensi sobrenatan yang kembali ke tingkat PBS.

Karakterisasi pasangan MB/cDNA. a TEM MB. b TEM konjugat MB/cDNA. c Distribusi ukuran partikel MB. d Efisiensi pasangan berbasis fluoresensi. Bar kesalahan menunjukkan deviasi standar dari 5 analisis independen.

Analisis Intensitas Medan Magnetik

Setelah inkubasi 10 menit MB/cDNA dengan MGFETs, MB yang tidak terikat dihapus dengan cuci PBS, sehingga hanya MB/cDNA yang tersisa pada sensor (Gambar 1d). Magnetik permanen yang dipasang pada motor berputar menerapkan medan magnetik periodik (Gambar 1e). Impedansi MGFET direkam menggunakan perangkat deteksi khusus.

Hubungan antara kekuatan medan magnetik dan impedansi MGFET diteliti untuk mengidentifikasi parameter medan yang optimal (Gambar 5). Pada MGFET, gaya magnetik melengkungkan kompleks MB/cDNA, mengubah jarak antara kompleks dan permukaan grafena, yang pada gilirannya memodulasi kapasitansi lapisan ganda. Tiga regime diamati: (1) <100 mT, di mana gaya magnetik tidak cukup untuk melengkungkan DNA, menghasilkan perubahan impedansi yang dapat diabaikan; (2) 100–200 mT, di mana lengkungan terjadi dengan cepat, menghasilkan respons impedansi yang jelas; dan (3) >220 mT, di mana batang DNA mencapai batas lengkungan, dan impedansi stabil (Gambar 5b). Model batang elastis ini sesuai dengan laporan sebelumnya tentang mekanika DNA [29,30].

Pengaruh intensitas medan magnetik terhadap impedansi. a Impedansi domain waktu di bawah berbagai kekuatan medan. b Impedansi versus intensitas medan magnetik. Bar kesalahan menunjukkan deviasi standar dari 5 analisis independen.

Deteksi cDNA

Dengan medan magnetik tetap 240 mT, perubahan impedansi direkam di berbagai konsentrasi MB/cDNA (Gambar 6a). Penerapan medan magnetik periodik menginduksi osilasi impedansi yang jelas. Untuk menekan kebisingan, algoritma integrasi sampel (SIA) digunakan: (1) titik data yang dikumpulkan selama periode non-magnetik (T₀) dinormalisasi ke nol; (2) titik selama setiap periode magnetik (T_M) diambil sampel dan dirata-rata; setelah empat siklus, perubahan impedansi periodik diekstraksi (Gambar 6b). Pendekatan ini secara efektif meningkatkan SNR dengan memanfaatkan pengambilan sampel berulang.

a Fluktuasi impedansi domain waktu pada berbagai konsentrasi cDNA. b Perubahan impedansi versus konsentrasi cDNA.

Perubahan impedansi menunjukkan hubungan linier dengan konsentrasi cDNA (Gambar 7). Sensitivitas tinggi berasal dari (1) lengkungan mekanis kompleks MB/cDNA, yang memperkuat modulasi lapisan ganda grafena, dan (2) medan magnetik periodik yang memungkinkan penekanan kebisingan berbasis SIA. Dengan meningkatkan periode magnetik, SNR sistem dapat ditingkatkan lebih lanjut.

Hubungan antara impedansi MGFET dan konsentrasi DNA sasaran. Bar kesalahan menunjukkan deviasi standar dari 5 analisis independen.

Selektivitas MGFETs

Selektivitas dievaluasi menggunakan DNA yang tidak cocok sepenuhnya dan DNA yang tidak cocok satu basis, masing-masing dikaitkan dengan MB. Setelah 10 menit inkubasi dengan MGFETs dan cuci PBS, kompleks MB/DNA yang tidak cocok sepenuhnya sebagian besar dihapus, menghasilkan perubahan impedansi yang dapat diabaikan (Gambar 8a), mengonfirmasi selektivitas yang tinggi. DNA yang tidak cocok satu basis menghasilkan perubahan impedansi sedikit lebih rendah dari benang komplementer sepenuhnya tetapi lebih tinggi dari kontrol non-komplementer, menunjukkan bahwa sensor dapat membedakan ketidakcocokan satu basis (Gambar 8b). Meskipun spesifitas intrinsik aptamer mengatur selektivitas, arsitektur MGFET berkontribusi pada sensitivitas keseluruhan.

Hubungan antara impedansi MGFET dan konsentrasi DNA yang tidak cocok. Bar kesalahan menunjukkan deviasi standar dari 5 analisis independen.

Kesimpulan

Kami telah mengembangkan biosensor transistor efek medan grafena magnetik yang memanfaatkan DNA yang dilabeli magnetik dan medan magnetik periodik untuk mentransduksi peristiwa ikatan menjadi osilasi impedansi. Gaya magnetik secara mekanis melengkungkan kompleks MB/cDNA, memodulasi lapisan ganda grafena, dan menghasilkan batas deteksi 1 pM untuk DNA rangkaian tunggal. Medan magnetik periodik memungkinkan penekanan kebisingan berbasis integrasi sinyal, yang meningkatkan sensitivitas lebih lanjut. Di luar deteksi DNA, platform ini menawarkan kerangka kerja serbaguna untuk mengukur properti mekanis asam nukleik dan untuk mendeteksi biomolekul atau sel lainnya.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel.

Singkatan

cDNA:

DNA rangkaian tunggal komplementer yang dilabeli magnetik

CVD:

Depo uap kimia

DMSO:

Dimetil sulfoksida

FET:

Transistor efek medan

GFET:

Transistor efek medan grafena

MBs:

Nanomanik magnetik

MGFET:

Transistor efek medan grafena magnetik

NHS:

N-Hidroxisuksinimid

PBASE:

1-Pirenbutanoat asam suksinimidil esterna

PBS:

Garam fosfat natrium dodeksil sulfat

SDS:

Natrium dodeklbensen sulfonat

SIA:

Algoritma integrasi sampel

TEM:

Mikroskop transmisi elektron

ITO:

Oksida timbal timah