Nanopartikel Magnetik Dual-Target Mengaktifkan Isolasi Sel Endotel Limfatik Tinggi Kualitas dan Citra Dual-Modal pada Kanker Kolorektal
Abstrak
Tumor ganas tetap menjadi penyebab utama kematian di seluruh dunia. Kepadatan salur limfatik berkaitan erat dengan metastase, namun penanda saat ini kurang spesifik dan terjangkau. Di sini kami melaporkan nanopartikel core-shell Fe₃O₄@KCTS yang difungsikan dengan antibodi LYVE-1 dan podoplanin. Sonda dual-target yang dihasilkan secara efisien menangkap sel endotel limfatik (LEC) dari tumor kolorektal manusia, memungkinkan isolasi tingkat kemurnian tinggi dan citra MRI T₂-berbobot plus fluorescensi in vivo. Temuan ini membangun landasan untuk diagnosis klinis dini dan penargetan terapeutik terhadap metastase yang dikaitkan LEC.
Pendahuluan
Sementara mikroenvironment tumor menggerakkan metastase, kontribusi tepat sel endotel limfatik (LEC) masih tidak terdefinisi dengan baik. Penanda spesifik LEC—LYVE-1, podoplanin, VEGFR-3, Prox-1—telah mempercepat penelitian, namun tidak ada yang sepenuhnya eksklusif untuk LEC. LYVE-1 tidak ada pada endotel vaskular, dan podoplanin tidak diekspresi oleh pembuluh darah, membuat pasangan ini sangat spesifik. Nanopartikel oksida besi magnetik (Fe₃O₄) biokompatibel, sangat paramagnetik, dan dapat difungsikan permukaannya. Turunan kitosan, seperti karboksi metil kitosan α-ketoglutarat (KCTS), menyediakan banyak grup karboksil untuk kopling kovalent, meningkatkan dispersi dan mengurangi agregasi.
Menggabungkan atribut ini, kami merakit nanopartikel Fe₃O₄@KCTS yang membawa antibodi LYVE-1 dan podoplanin. Desain dual-target meningkatkan fidelitas tangkapan LEC, mengurangi sel vaskular yang mencemari, dan mendukung citra dual-mode, memajukan aplikasi diagnostik dan penelitian.
Bahan dan Metode
Budidaya Sel
Sel karsinoma kolorektal manusia HT29 (ATCC) dipertahankan pada 37 °C dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 % FBS, 100 U mL⁻¹ penicilin, dan 100 µg mL⁻¹ streptomycin, di bawah 5 % CO₂.
Model Hewan
Empat tikus NOD/SCID wanita menerima suntikan subkutan HT29 (2 × 10⁷ sel mL⁻¹, 200 µL per tikus). Protokol disetujui oleh Komite Etika Universitas Guangxi Medical.
Sintesis Nanopartikel
Inti Fe₃O₄ diaktifkan dengan EDC/NHS, kemudian dikonjugasi dengan KCTS melalui kopling COOH–OH. Antibodi LYVE-1 (APC) dan podoplanin (FITC) dikoplehkan secara kovalent, menghasilkan Fe₃O₄@KCTS-LECs-Double-Ab (0,1 mg mL⁻¹). Nanopartikel disimpan pada 4 °C dalam kegelapan.
Karakterisasi
Mikroskopi elektron transmisi (TEM) mengungkapkan inti bola seragam (≈ 90 nm). Pencaran cahaya dinamis (DLS) menunjukkan diameter rata-rata 91,3 ± 2,3 nm dan potensial zeta –32,8 ± 1,5 mV, yang mengindikasikan stabilitas koloid yang luar biasa. Spektroskopi fluorescensi mengonfirmasi puncak FITC (488 nm) dan APC (545 nm) yang berbeda, mengonfirmasi pemasangan antibodi yang berhasil.
Imunohistokimia dan Imunofluoresensi
Bias tumor beku diwarnai dengan antibodi LYVE-1 (APC) dan podoplanin (FITC), diwarnai kembali dengan DAPI, dan diperiksa dengan mikroskopi konfokal.
Isolasi LEC
Jaringan tumor diurai secara enzimatis, difilter, dan diekspose kepada (1) MicroBeads LYVE-1 komersial atau (2) pemisahan magnetik Fe₃O₄@KCTS-LECs-Double-Ab. Sel yang diurutkan dibudidayakan dalam plate enam-sumur.
Uji Fungsional
Pembentukan tabung dinilai dalam Matrigel, dan penyerapan LDL diukur dengan DiI-Ac-LDL. Kehidupan sel diukur melalui CCK-8 setelah paparan konsentrasi nanopartikel dari 0,1 hingga 2 mg mL⁻¹. Toksisitas in vivo dievaluasi melalui histopatologi organ utama setelah satu suntikan 2 mg mL⁻¹.
Studi Citra
Tikus NOD/SCID yang membawa xenograft HT29 subkutan menerima 0,5 mmol kg⁻¹ nanopartikel dual-target secara intravenus. Citra MRI T₂-berbobot (3,0 T, 80 × 80 mm FOV, 69 ms TE) dan citra fluorescensi dilakukan sebelum suntikan dan pada 0,5, 12, dan 24 jam setelah suntikan. Grup pemblokir menerima antibodi anti-LYVE-1 dan anti-podoplanin sebelum suntikan nanopartikel.
Hasil
Desain Nanopartikel
Skema 1 mengilustrasikan konstruksi core-shell dan difungsian dual-antibodi. Data TEM dan DLS mengonfirmasi monodispersi (91 nm) dan muatan permukaan negatif (–32,8 mV). Spektroskopi fluorescensi memvalidasi ko-konjugasi FITC dan APC.
Kemurnian LEC
Situs aliran menunjukkan 71,2 % sel LYVE-1⁺/podoplanin⁻ dengan MicroBeads, versus 88,9 % sel double-positif dengan nanopartikel dual-target (P < 0,05). Imunofluoresensi mengonfirmasi ko-ekspresi kedua penanda dalam populasi yang diurutkan nanopartikel.
Kompetensi Fungsional
LEC yang diurutkan nanopartikel menunjukkan kemampuan pembentukan tabung yang lebih baik dan penyerapan LDL yang ditingkatkan relatif terhadap sel yang diurutkan MicroBead, yang mengindikasikan kemurnian dan fungsionalitas yang lebih tinggi.
Citra In Vivo
Fluorescensi mencapai puncak pada 12 jam setelah suntikan dan menurun pada 24 jam, sedangkan intensitas sinyal MRI menurun pada 12 jam sebelum secara bertahap pulih. Grup pemblokir menunjukkan penyerapan tumor yang dapat diabaikan, mengonfirmasi spesifisitas target.
Toksisitas
Uji CCK-8 mengungkapkan > 90 % kehidupan di semua konsentrasi nanopartikel pada 24 dan 48 jam. Histologi jantung, paru-paru, hati, limpa, dan ginjal tidak menunjukkan nekrosis atau inflamasi setelah dosis 2 mg mL⁻¹.
Pembahasan
Difungsian dual-antibodi secara signifikan meningkatkan isolasi LEC, mengatasi keterbatasan sistem satu penanda yang sering kali menangkap sel endotel vaskular sekaligus. Potensial zeta negatif yang kuat dan morfologi seragam dari Fe₃O₄@KCTS-LECs-Double-Ab memberikan stabilitas dan mencegah agregasi. Kemampuan citra dual-mode menawarkan platform yang kuat untuk deteksi dini kanker kolorektal dan untuk mempelajari metastase yang dikaitkan LEC.
Kesimpulan
Kami telah merakit nanopartikel magnetik dual-target yang biokompatibel yang secara efisien mengisolasi LEC tingkat kemurnian tinggi dan memungkinkan citra MRI dan fluorescensi secara simultan in vivo. Platform ini menawarkan alternatif yang hemat biaya dan menghemat waktu dibandingkan metode isolasi konvensional dan menjanjikan penerjemahan klinis dalam diagnosis kanker kolorektal dan penelitian mekanisme metastase limfatik.
