Sebuah Nanopartikel Magnetik Penargetan Ganda untuk Deteksi Kanker Manusia
Abstrak
Tumor ganas merupakan ancaman utama bagi kehidupan manusia dan kepadatan pembuluh limfatik yang tinggi sering dikaitkan dengan tumor metastatik. Dengan penemuan molekul yang ditargetkan pada sistem limfatik seperti reseptor hyaluronan endotel pembuluh limfatik 1 (LYVE-1) dan Podoplanin, banyak penelitian telah dilakukan untuk menentukan peran sel endotel limfatik (LEC) dalam metastasis tumor. Namun, kelemahan seperti non-spesifisitas dan biaya tinggi membatasi penelitian dan aplikasi diagnostik mereka. Dalam penelitian ini, Fe3 O4 @KCTS, jenis nanopartikel magnetik dengan cangkang inti, dibuat dengan mengaktifkan Fe3 O4 dengan karbodiimida dan berikatan silang dengan kitosan -ketoglutarat (KCTS). Antibodi LYVE-1 dan Podoplanin kemudian dimasukkan ke permukaan nanopartikel magnetik ini dan sebagai hasilnya, nanoprobe magnetik penargetan ganda dikembangkan. Tes eksperimental dari penelitian ini menunjukkan bahwa nanoprobe magnetik penargetan ganda dengan LEC kemurnian tinggi dari jaringan tumor berhasil dikembangkan, memberikan dasar untuk aplikasi klinis LEC dalam pengobatan kanker kolorektal serta diagnosis klinis awal menggunakan pencitraan bimodal.
Pengantar
Tumor ganas menimbulkan ancaman besar bagi kesehatan manusia [1]. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa lingkungan mikro tumor mempengaruhi karakteristik biologis tumor, seperti metastasis terkait tumor [2, 3]. Namun, mekanisme potensial, terutama proses dimana sel endotel limfatik (LEC) mempromosikan metastasis tumor, masih belum jelas [4]. Oleh karena itu perlu untuk merancang strategi diagnostik untuk tumor berdasarkan penargetan pembuluh limfatik. Kurangnya penanda spesifik limfatik, terutama yang membedakan LEC dari endotel vaskular, membatasi penelitian tentang fungsi LEC. Dalam beberapa tahun terakhir, penanda spesifik LEC, seperti reseptor hyaluronan endotel pembuluh limfatik 1 (LYVE-1) [5, 6], Podoplanin [7], reseptor faktor pertumbuhan endotel vaskular 3 (VEGFR-3) [8], dan Prox -1 telah diidentifikasi [9]. Hal ini mempercepat penelitian pembuluh limfatik tumor, terutama dengan menargetkan pembuluh endolimfatik tumor untuk mendiagnosis tumor. Ini juga memungkinkan penelitian tentang mekanisme metastasis tumor dengan menyortir sel endotel endolimfatik tumor menggunakan manik-manik imunomagnetik [10]. Namun, mirip dengan banyak penanda lain yang digunakan dalam patologi molekuler, tidak ada penanda molekuler terkait LEC yang sepenuhnya spesifik untuk LEC. Karena ekspresi sementara Prox-1 dalam nukleus [11], itu tidak cocok untuk aplikasi klinis. Meskipun VEGFR-3 diekspresikan dalam LEC, ia tidak memiliki spesifisitas limfatik pada kanker karena juga diekspresikan dalam epitel vaskular [8]. LYVE-1 secara khusus diekspresikan dalam LEC serta pada sinusoid hepatik normal, endotel limpa, venula endotel tinggi, serta makrofag jaringan yang diaktifkan tetapi tidak diekspresikan dalam epitel vaskular [7]. Podoplanin tidak diekspresikan dalam sel epitel vaskular tetapi merupakan penanda spesifik untuk LEC [7, 12].
Magnetik ferroferric oxide, nano gold, quantum dots, liposom, dan titanium oksida banyak digunakan dalam diagnosis dan pengobatan kanker karena biokompatibilitasnya yang tinggi, luas permukaan spesifik yang besar, dan mudah dimodifikasi dengan molekul fungsional biologis lainnya [13, 14]. Selain karakteristik di atas, oksida besi magnetik (Fe3 O4 ) memiliki distribusi ukuran yang sempit, dispersibilitas yang baik, paramagnetisme yang tinggi, dan ukuran yang dapat dikontrol sehingga cocok untuk pencitraan resonansi magnetik [15]. Diantaranya, oksida besi superparamagnetik yang dilapisi dengan antibodi telah banyak digunakan dalam pemisahan sel, pengenalan, dan diagnosis dini tumor [16, 17]. Sebagai bahan alam bermolekul tinggi, permukaan kitosan kaya akan gugus hidroksil dan amino, dan telah banyak digunakan karena sifat-sifatnya yang sangat baik seperti biokompatibilitas, kompatibilitas darah, keamanan, dan degradabilitas mikroba [18]. Oleh karena itu, kombinasi kitosan atau turunan kitosan dan Fe3 magnetic magnetik O4 lebih kondusif untuk aplikasi biologis, karena dapat mencegah manik-manik magnetik menggumpal satu sama lain untuk membentuk cairan magnetik. Untuk alasan ini, ini menghasilkan kinerja dispersi yang lebih baik.
Dalam penelitian tumor, deteksi pembuluh limfatik pada tumor didasarkan pada pelabelan langsung dengan antibodi, atau melalui antibodi yang dikombinasikan dengan manik-manik magnetik untuk menyortir sel endotel limfatik. Di sini, untuk menargetkan pembuluh limfatik intratumoral secara lebih akurat, kami merancang nanoprobe multi-target, yaitu, dua antibodi yang sangat spesifik terhadap sel endotel limfatik, antibodi anti-Lyve-1, dan antibodi anti-podplanin. Antibodi ini terikat pada nanopartikel tetroksida besi berlapis kitosan. Dibandingkan dengan nanoprobe lainnya, nanoprobe yang dirancang dalam penelitian ini yang mengandung dua antibodi lebih akurat untuk deteksi pembuluh limfatik dan sel endotel limfatik yang diisolasi lebih murni.
Dalam penelitian ini, untuk pengayaan cepat dan isolasi LEC dari sel kanker manusia, ligan dengan spesifisitas yang relatif tinggi untuk antibodi anti-LYVE-1 dan antibodi anti-podplanin digunakan untuk memfasilitasi pengikatan pada nanopartikel superparamagnetik berlapis kitosan untuk menyiapkan magnet. manik-manik untuk memilih LEC. Itu juga diverifikasi bahwa probe mampu diagnosis bimodal tumor padat.
Bahan dan Metode
Kondisi Garis Sel dan Kultur Sel
Garis sel kanker usus besar (HT29), yang dibeli dari bank sel ATCC, dibiakkan pada suhu 37 °C dalam medium Eagle (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY, USA) yang mengandung 10% serum janin sapi ( Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin, di bawah 5% CO2 .
Model Hewan Eksperimental
Empat puluh tikus betina NOD/SCID (berusia 4–6 minggu) dibeli dari Perusahaan Teknologi Hewan Laboratorium Vital River Beijing (Beijing, Cina). Sel HT29 yang ditumbuhkan dalam fase log dicuci tiga kali dengan phosphate-buffered saline (PBS). Setelah mencernanya dengan tripsin, sel disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit. Sel-sel tersebut kemudian disuspensikan kembali dalam PBS dan konsentrasi sel disesuaikan menjadi 2 × 10
7
/mL. Setiap tikus disuntik dengan 200 L suspensi sel. Semua protokol eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Universitas Kedokteran Guangxi (Guangxi, Cina).
Preparasi dan Karakterisasi Fe3 O4 @KCTS-LECs-Double Antibody Magnetic Nanoprobes
Kitosan (Bioteknologi Xi’an Ruixi) dikarboksilasi dengan asam -ketoglutarat untuk memperoleh -ketoglutarat karboksimetil Kitosan (KCTS) yang kaya akan gugus CO pada permukaannya [19]. Biaya3 O4 (Bioteknologi Xi'an Ruixi) digunakan sebagai inti dan KCTS ditetapkan sebagai struktur kerangka dasar. Setelah mengaktifkan Fe3 O4 nanopartikel dengan karbodiimida, Fe3 O4 @KCTS dibentuk dengan menggabungkan ikatan kovalen KCTS-COOH dan permukaan-OH. Antibodi LEC yang dipilih secara khusus untuk antibodi terkonjugasi LYVE-1 APC manusia (R&D Systems®, Cat. No. FAB20892A) dan antibodi anti-podoplanin (FITC) (Abcam, Cat. No. ab205333). Antibodi ini berikatan silang secara kovalen dengan Fe yang terkarboksilasi3 O4 @KCTS menggunakan EDC/NHS yang diaktifkan. Akibatnya, nanoprobe magnetik yang dimodifikasi dengan antibodi ganda LEC, mengacu pada Fe3 O4 @KCTS-LECs-Double antibodi magnetic nanoprobe (0,1 mg/mL) diperoleh. Nanopartikel terkonjugasi antibodi ganda diawetkan dalam kegelapan pada suhu 4 °C.
Morfologi dan distribusi ukuran Fe3 O4 @KCTS-LECs- Nanopartikel magnetik antibodi ganda dievaluasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; H-7650, Jepang). Ukuran partikel (Size), Zeta potensial, dan Indeks Dispersi Partikel (PDI) Fe3 O4 @KCTS-Antibodi ganda diukur menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS; PRO3000, Jepang), dan fotoluminesensinya diukur dengan spektrofotometer fluoresensi (FL-7000, Perkin Elmer, USA).
Imunohistokimia dan Imunofluoresensi
Potongan jaringan beku disiapkan dan dimasukkan ke dalam es aseton selama 10 menit kemudian direndam dalam larutan PBS selama 10 menit. Setelah diblokir dalam 1% BSA dan dicuci tiga kali dengan PBS, bagian diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi LYVE-1 APC manusia dan antibodi anti-podoplanin (FITC) pada 4 °C selama 30 menit. Setelah inkubasi, bagian direndam tiga kali dalam larutan PBS setelah itu larutan pewarnaan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ditambahkan ke jaringan tumor untuk menutupi jaringan sepenuhnya. Bagian diinkubasi lagi selama 5 menit pada suhu kamar. Setelah itu, mereka dicuci tiga kali dengan PBS, diikuti dengan penambahan agen pendinginan anti-fluoresensi ketika bagian benar-benar kering. Terakhir, bagian-bagian tersebut dipasang pada kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop confocal (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokyo, Jepang).
Jaringan kanker usus besar yang diawetkan dalam formalin ditanamkan parafin untuk penelitian ini. Bagian dewax dari xenograft kanker HT29 diblokir dengan hidrogen peroksida 3%, diblokir dalam serum normal 5%, dan diinkubasi dengan antibodi anti-LYVE-1 (Abcam, ab10278, UK) semalaman pada suhu 4 °C. Selanjutnya, antibodi sekunder kambing anti-kelinci berlabel biotin IgG H&L (HRP) (ab205718) dalam reagen pelabelan superstreptavidin terkonjugasi peroksidase lobak diinkubasi selama 30 menit. Warna diukur menggunakan larutan 3,3′-diaminobenzidine (DAB).
Pemurnian Sel
Volume rata-rata tumor adalah sekitar 1,5 × 1 × 1 cm
3
. Sebelum mengangkat tumor, tikus didesinfeksi dengan merendamnya dalam etanol 75% selama 3-5 menit. Kulit mencit yang telah didesinfeksi dipotong dengan gunting steril dan forsep steril pada bangku yang bersih. Jaringan tumor dieksisi dengan hati-hati dan ditempatkan dalam cawan petri yang berisi PBS. Jaringan tumor yang direndam kemudian dipotong dengan gunting mata dan ditempatkan di piring steril. Jaringan parut dipipet ke dalam tabung centrifuge 50 mL menggunakan tabung pasteurisasi. Kemudian ditambahkan kolagenase I sebanyak tiga kali volume, dan divorteks selama 10 menit untuk mendapatkan campuran jaringan tumor kolagenase I. Campuran tersebut kemudian ditempatkan dalam penangas air 37 °C selama 20 menit dan ini diulangi lima kali. Di akhir pencernaan, kolagenase I dihentikan dengan menambahkan media lengkap dan campuran didiamkan selama 2 menit. Setelah sentrifugasi pada 300 g selama 10 menit, tumor dicuci dua kali dengan PBS, kemudian disuspensikan kembali dalam 10 mL PBS, dan disaring perlahan melalui saringan dengan ukuran pori 75 m (200 mesh). Sel-sel yang disaring dihitung, dirata-ratakan ke dalam dua tabung sentrifugasi 15 mL, disuspensikan kembali dalam PBS, kemudian disentrifugasi pada 300 g selama 10 menit dan kemudian dicuci tiga kali. (1) Metode penyortiran manik-manik magnetik MACS:sel-sel yang dicuci disuspensikan kembali dalam buffer 100 μL. Suatu larutan yang mengandung PBS pH 7,2, 0,5% BSA, dan 2 mM EDTA dibuat dengan mengencerkan larutan stok MACS BSA (Kat. No. 130-091-376) menjadi 1:20 dengan larutan pembilas otomatis MACS™ (Kat. No. 130 -091-222). Selanjutnya, 10 L antibodi terkonjugasi LYVE-1 APC manusia ditambahkan dan kemudian diinkubasi pada 4 °C selama 15 menit dalam gelap. Terakhir, dicuci tiga kali dengan larutan buffer 2 mL. Setelah sentrifugasi, 80 L larutan buffer ditambahkan untuk menangguhkan kembali sel, dan 20 L larutan manik-manik magnetik anti-APC fluorescein ditambahkan. Campuran diinkubasi selama 15 menit, dicuci tiga kali, kemudian disentrifugasi, dan dicampur rata dengan 300 L larutan buffer. Akhirnya, sel-sel positif dalam kolom dengan cepat dirobohkan dengan larutan buffer 3 mL. Sel-sel yang dihasilkan dikultur dalam piring enam-sumur. (2) Biaya3 O4 @KCTS-LECs-metode penyortiran nanopartikel magnetik antibodi ganda:sel yang dicuci disuspensikan kembali dalam 200 μL buffer, dicampur dengan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik, diinkubasi pada 4 °C selama 20 menit dalam gelap, kemudian dicuci tiga kali dengan buffer 4 mL, disentrifugasi, dan disuspensikan kembali dalam buffer 160 μL. Akhirnya, sel dielusi menggunakan magnet dan dibiakkan di piring 6-sumur.
Imunofluoresensi Sel Diurutkan dengan Metode Berbeda
Sel-sel yang diurutkan menurut metode penyortiran yang berbeda disesuaikan dengan konsentrasi sel 5 × 10
4
/mL dengan PBS, dan merata di piring 12-sumur. Satu mililiter suspensi sel ditambahkan ke setiap sumur dan kemudian dikultur pada 37 °C selama 24 jam dalam 5% CO2 sekitarnya. Media lama kemudian dibuang, dan sel dicuci tiga kali dengan larutan PBS. Kemudian, 200 L paraformaldehyde 4% ditambahkan ke setiap sumur, dan sel disimpan pada suhu kamar selama 10 menit. Sel-sel kemudian dicuci tiga kali dengan larutan PBS, antibodi terkonjugasi LYVE-1 APC manusia, dan antibodi anti-podoplanin (FITC) ditambahkan. Setelah inkubasi di tempat gelap pada suhu 4°C selama 2 jam, sel dicuci tiga kali. Selanjutnya, 50 L DAPI ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk menodai inti biru diikuti dengan pencucian tiga kali dengan PBS. Terakhir, quencher anti-fluoresensi dijatuhkan di tengah slide, dan sisi yang tertutup sel ditempatkan pada slide kaca dan diamati menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser.
Alur Sitometri Sel Diurutkan Berdasarkan Metode Berbeda
Sel-sel yang diurutkan menurut metode yang berbeda disuspensi ulang dengan antibodi terkonjugasi LYVE-1 APC manusia dan antibodi anti-podoplanin antibodi (FITC) dalam buffer pengikat 200 μL (10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl) , dan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 1 jam di tempat gelap, kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Sel dideteksi dan dianalisis dengan flow cytometry (BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) kemudian dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).
Deteksi Aktivitas LEC
Sel fase pertumbuhan logaritmik yang diurutkan dengan metode yang berbeda dikumpulkan, dicerna, dan dihitung. Konsentrasi sel disesuaikan menjadi 2 × 10
5
sel/mL dan 50 μL sel-sel ini ditambahkan ke dalam setiap lubang pelat -slide berlapis Matrigel dan diinkubasi dalam 5% CO2 inkubator pada suhu 37 °C selama 6 jam. Media dipisahkan dan dibuang dengan pipet pasteurisasi diikuti dengan penambahan larutan PBS yang mengandung 1 g/mL calcein AM (Invitrogen, Cat. No. c3099). Sel-sel kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dalam gelap, dicuci dengan PBS, dan difoto di bawah mikroskop (Nikon, Jepang). Setelah itu, 1 × 10
5
sel dicampur dengan 500 μL medium lengkap yang mengandung 20 μg/mL DiI-ac-LDL (Molecular Probe, Invitrogen), dan kemudian diinokulasi dalam pelat 24-sumur 37 °C selama 4 jam. Solusi kultur lama telah dihapus dan sel-sel dicuci tiga kali dalam PBS. Kemudian, 50 L larutan DAPI ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar untuk menodai inti biru. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, mereka akhirnya dicitrakan di bawah mikroskop.
MR dan Pencitraan Fluoresensi Di Vivo
Langkah-langkah berikut diikuti untuk menentukan apakah tumor ditargetkan oleh Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik pada hewan. Model xenograft subkutan tikus NOD/SCID dari kanker usus besar digunakan untuk pemindaian resonansi magnetik atau fluoresensi. Pencitraan pembobotan T2 dilakukan dalam kondisi tertentu yang mencakup bidang pandang (80 × 80 mm), waktu gema (69 md), dan ketebalan lapisan (2,0 mm) menggunakan pemindai MRI 3.0T (Discovery 750, gE, jerman) , memiliki kumparan volume mouse berdiameter 40 mm. Tikus NOD/SCID dibagi menjadi dua kelompok (n = 3); kelompok eksperimen dan kelompok penghambat reseptor. Semua tikus disuntik dengan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda (0,5 mmol/kg) nanopartikel magnetik melalui vena ekor. Setiap tikus dipindai pada empat titik waktu tertentu:sebelum injeksi, 0,5 jam, 12 jam, dan 24 jam setelah injeksi. Pada kelompok pemblokiran reseptor, setiap tikus disuntik dengan antibodi Anti-LYVE-1 (Abeam, ab10278, UK) dan antibodi anti-podoplanin (Abcam, ab10288, UK) sebelum disuntik dengan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda. Pemindaian MRI dilakukan pada empat titik waktu yang sama. Gambar fluoresensi diambil menggunakan hewan kecil sistem pencitraan in vivo (Bruker, USA). Titik waktu untuk pengelompokan, injeksi obat, dan pemindaian adalah seperti yang disebutkan di atas.
Toksisitas Fe3 O4 @KCTS-LECs-Double Antibody Magnetic Nanoprobe
Toksisitas Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanoprobe magnetik terhadap LEC dievaluasi dengan uji CCK-8. Sel (100 μL medium, 2 × 10
5
/mL) dibiakkan semalaman di pelat 96-sumur pada suhu 37 °C di atmosfer manusiawi yang mengandung 5% CO2 , kemudian diberi Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibodi magnetic nanoprobe (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL) selama 24, atau 48 jam dalam kondisi yang sama. Setelah inkubasi, 10 L CCK-8 solusi ditambahkan ke setiap sumur diikuti untuk inkubasi lain selama 2 jam. Densitas optik (OD) diukur pada 450 nm oleh pembaca pelat mikro ELISA (Thermo Scientific, USA).
Untuk menilai toksisitas Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibodi magnetic nanoprobe in vivo, tikus betina NOD/SCID menerima injeksi vena ekor tunggal 200 μL PBS (kelompok kontrol) atau Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibodi magnetic nanoprobe (2 mg/mL) (n = 3 hewan per kelompok). Setelah 1 minggu, mencit dikorbankan, diambil bagian jaringan utama (jantung, paru-paru, hati, limpa, ginjal) dan direndam dalam larutan formaldehida 10%, didehidrasi, dan dibenamkan parafin. Bagian parafin (tebal 4 m) dipotong dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin.
Analisis Tanggal
Software statistik SPSS 16.0 digunakan untuk analisis data. Data pengukuran dinyatakan dalam x ± s, perbandingan antar kelompok dilakukan dengan analisis varians, dan perbandingan data hitung dilakukan dengan uji chi-square. P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Prinsip Nanopartikel Magnetik Penargetan Ganda untuk Deteksi Kanker Manusia
Dalam penelitian ini, seperti yang ditunjukkan pada Skema 1, Fe3 O4 @KCTS, jenis nanopartikel magnetik dengan cangkang inti, dibuat dengan mengaktifkan Fe3 O4 dengan karbodiimida dan berikatan silang dengan kitosan -ketoglutarat (KCTS). Antibodi LYVE-1 dan podoplanin kemudian ditambahkan ke permukaan nanopartikel magnetik ini sehingga membentuk probe nano magnetik penargetan ganda. Probe ini disuntikkan ke model tikus melalui vena ekor untuk mendiagnosis tumor dengan pencitraan MR berbobot T2 dan pencitraan fluoresensi. Setelah eksisi, tumor dihaluskan menjadi satu sel, dan kemudian diinkubasi dengan probe untuk mengidentifikasi sel endotel limfosit dengan kemurnian lebih tinggi dengan magnet untuk mengeksplorasi mekanisme metastasis tumor. Hasilnya menunjukkan bahwa nanoprobe magnetik penargetan ganda yang menyediakan LEC kemurnian tinggi dari jaringan tumor berhasil dikembangkan, memberikan dasar untuk aplikasi klinis LEC pada kanker kolorektal serta diagnosis klinis awal dengan pencitraan mode ganda kanker kolorektal.
Karakterisasi Fe3 O4 @KCTS-LECs-Double Antibody Magnetic Nanopartikel
Gambar TEM (Gbr. 1a) menunjukkan bahwa Fe3 . telanjang O4 tidak beraturan dengan bola dan memiliki gumpalan di antara partikel. Saat Fe3 O4 dimodifikasi oleh KCTS (Gbr. 1b), partikelnya berbentuk bulat atau oval biasa, dan partikelnya tersebar secara merata. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c, Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik dimodifikasi dengan antibodi bermuatan negatif pada permukaan Fe3 O4 @KCTS yang memberikan muatan negatif, sehingga meningkatkan tolakan elektrostatik antara partikel nano. Biaya3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik berbentuk bulat, seragam, bebas dari agregasi partikel, dan tidak rusak. Diameter rata-rata adalah 91,28 ± 2,31 nm dan PDI adalah 0,207 ± 0,015 (Gbr. 1d). Gambar tersebut menunjukkan bahwa distribusi ukuran nanopartikel sempit dan menunjukkan dispersi yang baik dalam air. Permukaan bermuatan negatif memiliki potensi zeta 32.8 ± 1.51 mV, dengan nilai absolut lebih dari 30, menunjukkan bahwa material memiliki stabilitas yang baik (Gbr. 1e).
Karakterisasi nanoprobe magnetik. a Gambar mikrograf elektron transmisi Fe3 O4 nanoprobe (bilah skala, 100 nm). b Gambar mikrograf elektron transmisi Fe3 O4 @KCTS nanoprobe (bilah skala, 100 nm). c Gambar mikrograf elektron transmisi Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanoprobe magnetik (bilah skala, 100 nm). d Ukuran partikel dideteksi dengan analisis ukuran, dan ukuran rata-rata probe adalah 91,28 nm. e Potensi zeta sekitar 32,8 mv. f Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibodi nanoprobe memiliki puncak emisi di bawah cahaya eksitasi 488 dan 545
Hasil spektrometer fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 1f. Puncak emisi yang berbeda diamati pada antibodi anti-podoplanin (FITC) di bawah lampu eksitasi 488, dan pada antibodi anti-LYVE-1 (APC) di bawah lampu eksitasi 545. Kehadiran puncak emisi di Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibodi kompleks di bawah 488 dan 545 eksitasi menunjukkan bahwa materi berhasil digabungkan.
Imunohistokimia dan Imunofluoresensi
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, b, ekspresi LYVE-1 dalam jaringan kanker usus besar dan antibodi LYVE-1 dan podoplanin dalam jaringan tumor beku diamati. Ini menunjukkan bahwa sejumlah kecil sel endotel limfatik hadir dalam jaringan kanker usus besar.
Ekspresi pembuluh limfatik dalam jaringan kanker kolorektal. a Pembuluh darah yang melebar di bagian jaringan positif untuk LYVE-1 pada membran sel endotel dengan imunohistokimia (bilah skala, 100 μm). Di sebelah kanan adalah gambar yang diperbesar. b Pembuluh darah yang melebar di bagian jaringan positif untuk LYVE-1 dan podoplanin pada membran sel endotel seperti yang diungkapkan oleh imunofluoresensi (bilah skala, 50 μm)
Isolasi dan Pengayaan LEC
Pewarnaan imunofluoresensi dilakukan pada sel yang diperoleh dengan dua metode penyortiran yang berbeda. Ditemukan bahwa sel-sel yang diurutkan dengan manik-manik magnetik LYVE-1 MicroBeads mengekspresikan protein LYVE-1, tetapi tidak podoplanin, sedangkan sel-sel yang diperoleh dengan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik mengekspresikan protein LYVE-1 dan protein podoplanin (Gbr. 3a). Selain itu, hasil flow cytometry dari sel-sel yang diurutkan dengan metode yang berbeda dianalisis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, tingkat koekspresi protein LYVE-1 dan protein podoplanin oleh manik-manik magnetik LYVE-1 MicroBeads adalah 71,2%, sedangkan tingkat koekspresi kedua penanda diperoleh dengan menyortir dengan Fe3 O4 @ KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik adalah 88,9%. Dua sampel independen t tes menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan secara statistik antara kedua kelompok (P < 0,05) (Gbr. 3c).
Analisis kemurnian sel endotel limfatik. a Mikrograf fluoresensi pencitraan warna ganda LYVE-1 (merah) dan podoplanin (hijau)/inti [4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, biru) dalam LEC kanker kolorektal manusia yang diisolasi diurutkan menggunakan LYVE-1 Microbeads dan Fe 3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda (bilah skala, 100 μm). b Ko-ekspresi LYVE-1 (APC) dan podoplanin (FITC) seperti yang diungkapkan oleh deteksi aliran sitometrik. c Hasil flow cytometry, *P < 0,05
Perbandingan Fungsi Biologis LEC yang Diperoleh dengan Dua Metode Penyortiran Berbeda
Kami selanjutnya membandingkan karakteristik biologis sel endotel limfatik yang diperoleh dengan dua metode penyortiran yang berbeda. Hasil uji tabung lem matrigel ditunjukkan pada Gambar 4a. Sel diperoleh dengan menyortir dengan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik memiliki kemampuan membentuk tabung yang lebih kuat. Hasil uji serapan sel endotel Dil-ac-LDL yang ditunjukkan pada Gambar. 4b mengungkapkan bahwa fluoresensi merah diamati dalam sel yang diurutkan oleh manik-manik magnetik LYVE-1 MicroBeads, tetapi fluoresensi merah yang lebih kuat diamati pada sel yang diurutkan berdasarkan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik. Hasil ini menunjukkan bahwa sel yang diperoleh Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik memiliki kemurnian lebih tinggi, kemampuan pembentukan tabung yang lebih baik, dan fagositosis sel endotel, menunjukkan bahwa mereka lebih cocok untuk penelitian sel endotel limfatik pada tumor.
Perbandingan fungsi biologis LEC. a Penentuan kemampuan pembentukan tabung LECs in vitro oleh Calcein AM (hijau) in vitro (bilah skala, 50 μm). b Uji fagositosis sel endotel (berlabel DiI, merah; DAPI, biru) fungsi sel endotel menggunakan LEC terisolasi oleh LYVE-1 Microbeads dan Fe3 O4 @KCTS-LECs-Antibodi ganda (bilah skala, 100 μm)
Analisis Pencitraan Bimodal Di Vivo
Hasil pencitraan in vivo ditunjukkan pada Gambar 5a. Ditemukan bahwa tidak ada fluoresensi dari tumor sebelum injeksi Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik. Setelah injeksi, fluoresensi dari tumor meningkat, mencapai puncaknya pada 12 jam. Setelah itu, fluoresensi secara bertahap menurun seiring waktu. Pada kelompok tertutup kontrol, hampir tidak ada fluoresensi dari tumor selama percobaan. Setelah 24 jam, diamati bahwa bahan telah sepenuhnya dimetabolisme dari tubuh tikus dari kedua kelompok. Demikian pula, pencitraan resonansi magnetik yang ditunjukkan pada Gambar 5b mengungkapkan bahwa pencitraan tumor secara bertahap melemah, mencapai tingkat terlemahnya setelah 12 jam, diikuti oleh pemulihan bertahap seiring waktu. Namun, kekuatan pencitraan tumor pada kelompok tertutup kontrol hampir tidak berubah. Dapat disimpulkan bahwa Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik memiliki sifat penargetan tumor yang tinggi in vivo.
Pencitraan fluoresensi dan MRI model tumor xenografting subkutan kanker kolorektal tikus NOD / SCID. a Tikus NOD/SCID dibius dan dicitrakan dengan sistem pencitraan fluoresensi pada saat pra-injeksi dan pasca-injeksi 0,5 jam, 12 jam, dan 24 jam. b Tikus NOD/SCID dibius dan dicitrakan dengan pemindai MRI 3.0T pada pra injeksi dan pasca injeksi 0,5 jam, 12 jam, dan 24 jam
In Vitro dan di Vivo Toksisitas Nanopartikel Magnetik
Sitotoksisitas in vitro dari nanoprobe magnetik dievaluasi dalam LEC yang diurutkan berdasarkan Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik. Hasil uji CCK-8 menunjukkan bahwa viabilitas sel tinggi setelah inkubasi dengan berbagai konsentrasi nanoprobe magnetik (Gbr. 6a). Hal ini menunjukkan bahwa Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanopartikel magnetik memiliki sitotoksisitas minimal. Kami selanjutnya mengevaluasi toksisitas nanopartikel magnetik in vivo. Tikus NOD/SCID betina diperlakukan dengan nanoprobe magnetik dan kemudian bagian jaringan dari organ utama setelah pewarnaan dengan hematoxylin-eosin diperiksa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, tidak ada tanda-tanda nekrosis atau peradangan yang terlihat. Hasil ini menunjukkan bahwa nanoprobe magnetik tidak menghasilkan efek toksik in vivo. Temuan ini menunjukkan bahwa nanoprobe magnetik yang dirancang dalam penelitian ini cocok untuk aplikasi sebagai probe deteksi dalam penyelidikan hewan dan manusia.
Toksisitas Fe3 O4 @KCTS-LECs-antibodi ganda nanoprobe magnetik. a LEC diinkubasi dengan berbagai konsentrasi nanoprobe magnetik, dan viabilitas sel diukur pada 24 jam dan 48 jam. b Tikus NOD/SCID diperlakukan dengan PBS atau nanoprobe magnetik, dan bagian dari organ utama diwarnai dengan hematoxylin-eosin dan diperiksa dengan mikroskop cahaya (bilah skala, 100 μm)
Discussion
It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.
Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.
In this study, the Fe3 O4 @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.
Biaya3 O4 is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Biaya3 O4 nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe3 O4 NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Biaya3 O4 provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe3 O4 . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.
Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.
Conclusions
In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe3 O4 @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.
