Nanopartikel Silika Hias Membran Sel Kanker Sarat dengan miR495 dan Doxorubicin untuk Mengatasi Resistensi Obat untuk Terapi Kanker Paru-Paru yang Efektif
Abstrak
Terapi kanker saat ini biasanya menyerah pada banyak hambatan ekstraseluler dan intraseluler, di antaranya distribusi yang tidak ditargetkan dan resistensi multidrug (MDR) adalah dua kesulitan penting yang bertanggung jawab atas hasil yang buruk dari banyak sistem penghantaran obat (DDS). Di sini, dalam penelitian kami, dilema tersebut diatasi dengan mengembangkan nanopartikel silika berlapis (SLI) membran sel kanker (CCM) untuk memberikan bersama miR495 dengan doxorubicin (DOX) untuk terapi kanker paru yang efektif (CCM/SLI/R-D). CCM homolog dari sel kanker paru-paru MDR (A549/DOX) seharusnya meningkatkan properti homing tumor dari DDS untuk melewati penghalang ekstraseluler. Selain itu, MDR sel kanker ditaklukkan melalui penurunan regulasi ekspresi P-glikoprotein (P-gp) menggunakan miR495. Terbukti bahwa miR495 secara signifikan dapat menurunkan ekspresi P-gp yang meningkatkan akumulasi obat intraseluler di A549/DOX. Hasil in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa CCM/SLI/R-D menunjukkan efek terapeutik yang sangat ditingkatkan pada A549/DOX, yang lebih unggul daripada menerapkan miR495 atau DOX saja. Efek CCM/SLI/R-D yang lebih disukai dalam menaklukkan MDR pada kanker paru-paru memberikan alternatif baru untuk kemoterapi kanker MDR yang efektif.
Pengantar
Studi terbaru menawarkan akumulasi bukti untuk korelasi positif antara resistensi multidrug (MDR) dan kegagalan kemoterapi [1, 2]. Salah satu mekanisme yang paling dikenal luas untuk MDR adalah transporter kaset pengikat ATP (ABC), di antaranya P-glikoprotein (P-gp) adalah yang paling banyak dipelajari [1, 3]. Ditemukan bahwa P-gp dapat secara efektif memompa kemoterapi intraseluler keluar dari sel, menyebabkan akumulasi obat intraseluler berkurang, akibatnya diikuti oleh penurunan efikasi [4, 5]. Penghambatan P-gp telah menunjukkan efek menguntungkan dalam mengatasi MDR, yang mungkin menjadi target potensial untuk memerangi MDR.
MicroRNAs (miRNA) adalah jenis RNA non-coding yang terjadi secara alami. Namun, miRNA menunjukkan peran penting dalam regulasi transfeksi seluler dan ekspresi protein [6]. Akibatnya, dilaporkan bahwa ekspresi P-gp dipengaruhi oleh berbagai miRNA yang bergantung pada jenis tumor [7]. Studi sebelumnya telah mengungkapkan bahwa miR495 dapat secara efektif menurunkan regulasi ekspresi P-gp pada sel kanker ovarium dan lambung MDR [8]. Di sini, dalam penelitian ini, miR495 digunakan untuk mengeksplorasi lebih jauh perannya dalam regulasi P-gp dalam sel kanker paru-paru MDR.
Karena keuntungan yang tak tertandingi, seperti efek samping yang sangat berkurang seiring dengan peningkatan bioavailabilitas, sistem penghantaran obat (DDS) telah berkembang selama beberapa dekade terakhir dan telah diakui sebagai alternatif obat bebas dalam penghantaran obat, terutama dalam terapi kanker [9,10] ,11,12]. Akibatnya, pengembangan DDS multifungsi yang mampu menaklukkan hambatan ekstraseluler dan intraseluler terapi kanker yang rumit sementara pada saat yang sama cocok untuk memuat berbagai jenis obat menjadi fokus penelitian [13,14,15,16]. Nanopartikel silika (SLI), sebagai salah satu kandidat yang paling banyak diadopsi, memiliki keunggulan serbaguna seperti persiapan yang mudah, kapasitas pemuatan obat yang tinggi, dan biokompatibilitas yang baik dan merupakan pembawa nano yang lebih disukai. Secara alami, SLI telah digunakan oleh banyak DDS sebagai nanocarrier untuk mencapai kemanjuran yang memuaskan [17, 18].
Namun, studi praklinis telah mengungkapkan bahwa pengiriman DDS yang ditargetkan juga penting untuk keberhasilan terapi kanker. Untuk mencapai efek penargetan yang lebih baik, pendekatan yang paling umum diadopsi adalah memodifikasi ligan penargetan pada permukaan DDS, yang dapat mengikat reseptor yang sesuai pada permukaan sel kanker [16, 19, 20]. Dari molekul kecil (berat molekul di bawah 1000 Da) hingga antibodi monoklonal (berat molekul di atas 10 kDa), ligan penargetan ini telah dilaporkan berhasil diterapkan pada DDS [21,22,23]. Namun, karena sifat ektogenik dari beberapa ligan atau alasan lain, efek samping seperti reaksi imun dan sitotoksisitas terjadi. Dalam beberapa tahun terakhir, membran plasma seluler menjadi bahan lain yang menjanjikan tidak hanya untuk memodifikasi permukaan nanopartikel tetapi juga berfungsi sebagai komponen penargetan biokompatibel. Atas dasar interaksi antara membran sel kanker homolog (CCM) dengan sel kanker, CCM telah terbukti sangat meningkatkan kemampuan tumor-homing DDS [24, 25].
Untuk menggabungkan properti tumor-homing CCM dan P-gp yang menargetkan miR495 dalam satu DDS untuk terapi koktail kanker paru-paru (dipilih sebagai model kanker dalam penelitian kami), SLI amina bermuatan positif pertama kali dibuat dan dimuat sebelumnya dengan doxorubicin (DOX ). SLI amina yang dimuat DOX kemudian dimuat dengan miR495 untuk membentuk inti pengiriman bersama (SLI/R-D). Akhirnya, SLI/R-D didekorasi dengan CCM bermuatan negatif (diperoleh dari sel A549/DOX) untuk menyiapkan pengiriman bersama dan DDS penargetan tumor (CCM/SLI/R-D). Diharapkan CCM dapat secara khusus memandu CCM/SLI/R-D ke sel A549/DOX yang homogen untuk meningkatkan efek penargetan tumornya dan meningkatkan serapan intraseluler. Sementara itu, miR495 yang dirilis dapat mengatasi MDR A549/DOX dan mencapai efek antikanker sinergis dengan DOX.
Bahan dan Metode
Materi
Metil tiazolil tetrazolium (MTT), N -(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoksisilane (AEAPS), tetraetil ortosilikat (TEOS), doksorubisin (DOX), dan Triton X-100 diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). miR495 disediakan oleh Cell Biolabs Inc. (San Diego, CA, USA). Bahan kimia dan reagen lainnya diperoleh dari Aladdin Co., Ltd (Shanghai, Cina) dan murni analitik.
Kultur Sel dan Model Hewan
A549 (karsinoma paru-paru manusia), A549/DOX (garis sel tahan-DOX), dan garis sel NIH3T3 (fibroblas embrionik tikus) dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% (v/v) serum janin sapi (FBS), penisilin (100 U/mL), dan streptomisin (100 U/mL) dalam inkubator suhu konstan 37 °C yang mengandung 5% CO2 . A549/DOX (garis sel tahan DOX) dibuat dengan menginkubasi sel A549 dengan peningkatan konsentrasi DOX secara bertahap seperti yang dilaporkan [26]. Semua garis sel dikultur dalam protokol standar seperti yang dilaporkan sebelumnya [27]. Tikus telanjang Balb/c jantan (∼ 20 g) diperoleh dari Institut Model Hewan, Universitas Wuhan (Wuhan, Cina), dan dibesarkan dengan protokol standar. Model xenograft tumor A549/DOX dibuat berdasarkan artikel sebelumnya [28]. Semua eksperimen yang berhubungan dengan hewan telah disetujui oleh Komite Etika institusional Rumah Sakit Afiliasi Ketiga Universitas Sun Yet-sen.
Model Spheroid Tumor Multiseluler
Tumor spheroid multiseluler (MCTS) didirikan berdasarkan laporan sebelumnya [29]. Singkatnya, piring 96-sumur (Corning, USA) ditutupi dengan larutan agarosa yang diautoklaf untuk membuat bantalan gel. Setelah itu, campuran sel A549/DOX dan NIH3T3 (1:1) diunggulkan ke dalam cawan dan diinkubasi untuk membentuk MCTS. Pembentukan MCTS dipantau dengan mikroskop optik (CX 23, Olympus, Jepang).
Persiapan CCM/SLI/R-D
Pembuatan SLI amina dilakukan dalam mikroemulsi air dalam minyak berdasarkan laporan sebelumnya [30]. Secara singkat, mikroemulsi air dalam minyak yang mengandung DOX dibuat pada suhu kamar. Setelah itu, AEAPS, TEOS, dan NH4 OH berturut-turut ditambahkan untuk memicu reaksi. Setelah bereaksi selama 24 jam, SLI amina yang mengandung DOX diendapkan menggunakan etanol dalam jumlah berlebih dan dikumpulkan menggunakan sentrifugasi (3000 rpm, 10 min).
MiR495 dilarutkan dalam buffer HEPES dan tetes demi tetes ditambahkan ke dalam larutan berair DOX-loaded amine SLI pada berbagai rasio berat/berat (b/b) dengan vortex untuk mendapatkan kompleks biner SLI/R-D [31].
Isolasi CCM dari sel A549/DOX dilakukan berdasarkan laporan sebelumnya [32]. Singkatnya, sel A549/DOX dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan sentrifugasi. Setelah itu, sel-sel didispersikan dalam buffer ekstraksi dan selanjutnya disentrifugasi (10.000g , 10 min), diikuti oleh ultrasentrifugasi kedua (100.000g , 60 min) untuk akhirnya mendapatkan CCM. Semua prosedur dilakukan pada suhu 4 °C. Konsentrasi protein CCM diukur menggunakan kit BCA (Beyotime, Shanghai, China).
Pelapisan CCM ke SLI/R-D menggunakan protokol yang sama seperti pengikatan miR495. Singkatnya, volume yang berbeda dari larutan CCM ditambahkan ke SLI/R-D (1 mg/mL) di bawah pusaran. Akhirnya, campuran diperlakukan dengan sonikasi probetype (100 W, 5 min) dan kemudian disentrifugasi (10.000g , 10 min) untuk mendapatkan CCM/SLI/R-D.
Karakterisasi
Distribusi ukuran dan potensi zeta CCM/SLI/R-D dinilai oleh Zetasizer (ZS90, Malvern, UK). Selain itu, mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM1230, JEOL, Jepang) diterapkan untuk mengamati morfologi nanocarrier.
Kemampuan mengikat SLI ke miR495 dipelajari dengan uji retardasi gel dengan miR495 telanjang sebagai kontrol. SLI/RD yang diformulasikan pada berbagai rasio berat badan (0,2–25, SLI hingga miR495) dimuat pada gel agarosa 2% yang mengandung Goldview (Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Beijing) dan dielektroforesis dalam 0,5× Tris-Borate -EDTA buffer (90 V, 60 min). Visualisasi miR495 dilakukan menggunakan penganalisis Gel-Pro (Genegenius, Syngene, UK).
Buffer lisis (Beyotime, Shanghai) digunakan untuk menentukan total protein dari CCM, setelah itu BCA kit digunakan untuk kuantifikasi konsentrasi. Kemudian, sampel dipindahkan ke membran poli(vinilidena fluorida) (PVDF). Akhirnya, membran diwarnai dengan antibodi pertama yang sesuai (Abcam, USA) dan antibodi kedua (Abcam, USA). Densitometer (E-Gel Imager, Thermo-Fisher, USA) digunakan untuk visualisasi.
Konten pemuatan obat (DLC) CCM/SLI/R-D ditentukan dengan memunculkan pembawa nano yang disiapkan dalam metanol selama 48 jam. Sampel disentrifugasi (10.000 rpm, 30 min), dan supernatan dikumpulkan untuk penentuan DOX dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) [33]. Pemuatan miR495 ditentukan dengan absorbansi UV pada 260 nm (UV5Nano, METTLER TOLEDO, Swiss).
Perubahan ukuran partikel CCM/SLI/R-D dalam PBS dan plasma tikus dicatat pada setiap titik waktu dalam 48 h. Profil pelepasan DOX dari CCM/SLI/R-D diselidiki menurut laporan sebelumnya [34].
Transfeksi Intraseluler
Sel A549/DOX diunggulkan dalam pelat 6-sumur selama 24 jam dan kemudian dikultur dengan CCM/SLI/miR495 (konsentrasi miR495, 1–25 ng/mL) selama 48 jam. Setelah itu, sel-sel dipisahkan, dipanen, dan dilakukan analisis western blot dari ekspresi P-gp.
Konsentrasi obat intraseluler ditentukan menurut laporan sebelumnya [23]. Singkatnya, setelah diobati dengan CCM/SLI/miR495 untuk interval waktu yang berbeda, sel A549/DOX diinkubasi dengan DOX. Pada interval waktu yang telah ditentukan (4 dan 8 h), sel-sel dipisahkan, dikumpulkan, dan didispersikan dalam 5 mL larutan ekstraksi DOX (etanol 0,6 M HCl, 1:1, v/v), diikuti dengan ultrasonikasi pada 400 W dalam penangas es selama 40 kali. Campuran dibiarkan pada 4 °C selama 24 jam dan disentrifugasi pada 12.000 rpm (4 °C) selama 10 min. Supernatan dikumpulkan dan dilakukan pengukuran kandungan DOX seperti yang dijelaskan di atas.
Viabilitas Sel
Efek sitotoksisitas nanocarrier bebas obat (10–200 μg/mL) dan CCM/SLI/RD (konsentrasi DOX, 2-50 μM; konsentrasi miR495, 10–250 nM; rasio molar antara DOX dan miR495 ditetapkan pada 200) pada sel A549/DOX selama 48 jam ditentukan dengan uji 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Variasi tingkat protein terkait apoptosis juga ditentukan menggunakan uji western blot.
MCTS dengan diameter 300-400 μm diinkubasi dengan medium yang mengandung formulasi berbeda (konsentrasi DOX, 25 μM) pada suhu 37 °C selama 5 hari. Mikroskop optik digunakan untuk merekam perubahan diameter MCTS.
In Vitro dan In Vivo Penargetan CCM/SLI/R-D
SiRNA berlabel FAM diadopsi untuk membangun DDS. Sel A549 / DOX diunggulkan dalam pelat 6-sumur selama 24 jam. Kemudian, sel-sel diinkubasi dengan CCM berlebihan selama 2 jam, dan SLC/siRNA dan CCM/SLC/siRNA ditambahkan. Pada interval waktu yang ditentukan, sel dikumpulkan dan ditentukan oleh flow cytometer (FCM, FC500MCL, Beckman Coulter) untuk kuantifikasi.
Cy5 berlabel miR495 diadopsi untuk membangun DDS. Tikus yang mengandung tumor A549/DOX diberi i.v. disuntikkan dengan SLI/miR495 dan CCM/SLI/miR495, dan distribusi miR495 dipantau pada interval waktu yang telah ditentukan menggunakan sistem pencitraan waktu nyata (ZEWTON 7.0, Vilber, Prancis). Setelah pemberian selama 12 jam, tumor dan organ utama diperoleh dari tikus yang dikorbankan dan dicitrakan menggunakan sistem yang sama untuk analisis analitik.
In Vivo Anticancer Assay
Uji antikanker in vivo CCM/SLI/R-D dinilai menggunakan tikus pembawa tumor A549/DOX. Secara rinci, tikus secara acak dibagi menjadi 5 kelompok (n = 6):(1) salin (sebagai kontrol), (2) DOX bebas, (3) CCM/SLI/DOX, (4) CCM/SLI/miR495, dan (5) CCM/SLI/R-D. Selanjutnya mencit diberikan intratumoral dengan formulasi dosis 5 mg/kg DOX dan 0,25 mg/kg miR495 sebanyak 7 kali dalam 14 hari. Volume tumor dan berat badan tikus di setiap kelompok ditentukan setiap 2 hari.
Hasil dan Diskusi
Persiapan CCM/SLI/R-D
Untuk mencapai kapasitas pemuatan obat yang baik dan biokompatibilitas dalam satu DDS, hidrolisis sinkron TEOS dan AEAPS dalam mikroemulsi air dalam minyak digunakan untuk pembuatan SLI. DOX telah dijebak sebelumnya ke dalam matriks SLI selama fabrikasi. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1a, hasil hamburan cahaya dinamis (DLS) menunjukkan bahwa SLI amina bermuatan DOX memiliki diameter ~ 100 nm. Gambar TEM lebih lanjut mengungkapkan bahwa nanopartikel berbentuk bola dengan distribusi sempit, yang sejalan dengan hasil yang diperoleh oleh DLS.
a Ukuran dan potensi perubahan zeta SLI/R-D pada rasio w/w yang berbeda. b Uji pengikatan miRNA dari kompleks biner SLI/R-D pada berbagai rasio w/w. Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3)
SLI amina yang dimuat DOX memiliki potensi permukaan 26,83 mV, yang bermanfaat sebagai pembawa miR495. Menurut laporan sebelumnya [31], perakitan miR495 dan SLI untuk membentuk kompleks biner didorong oleh interaksi elektrostatik. SLI w/w hingga miR495 dalam kompleks biner memberikan dampak signifikan pada efisiensi transfeksi akhir. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 1a, karena fakta bahwa miR495 adalah makromolekul bermuatan negatif, pada rasio berat/berat SLI yang rendah terhadap miR495, kompleks biner telah menunjukkan muatan permukaan negatif dengan ukuran partikel yang meningkat secara signifikan, yang mungkin disebabkan oleh adhesi nanopartikel tetangga. Namun, dengan peningkatan rasio w/w, muatan permukaan kompleks biner secara bertahap menjadi positif dengan ukuran partikel yang stabil diamati pada sekitar 100 nm. Ditunjukkan bahwa ketika rasio w/w mencapai 20, baik ukuran partikel dan potensial permukaan kompleks biner tetap stabil tanpa perubahan signifikan dengan peningkatan rasio w/w.
Kapasitas pengikatan dan perlindungan nanocarrier ke miR495 sangat penting untuk pengiriman gen. Kemampuan pengikatan miR495 dari SLI dinilai dengan uji keterbelakangan gel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1b, miR495 telanjang tidak menunjukkan keterbelakangan sementara penambahan SLI secara signifikan mengubah perilaku miR495. Diamati bahwa SLI menunjukkan peningkatan kapasitas pengikatan miR495 dengan peningkatan rasio berat, yang mencapai keterbelakangan total miR495 pada rasio berat 5.
Ringkasnya, disimpulkan bahwa kompleks biner pada rasio w/w 20 dengan ukuran partikel yang tepat dan muatan permukaan yang diinginkan, serta sifat pengikatan dan perlindungan miR495 yang efektif, adalah formulasi optimal yang dipilih sebagai model untuk dilakukan. percobaan berikut.
Kemudian, kami menjelajahi rasio protein CCM yang optimal terhadap kompleks biner dengan mencampurkan CCM dengan kompleks biner pada rasio massa yang berbeda (SLI terhadap protein CCM, b/b). Rasio optimal ditentukan oleh ukuran partikel yang dihasilkan dan muatan permukaan dalam kondisi yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, penambahan CCM (muatan negatif) menghasilkan fluktuasi yang signifikan pada ukuran produk tetapi penurunan terus menerus pada muatan permukaan. Hasilnya menunjukkan bahwa CCM berhasil berlabuh di permukaan kompleks biner. Yang paling penting, diamati bahwa ukuran partikel dan muatan permukaan CCM/SLI/R-D mencapai dataran tinggi pada rasio massa 7,5 dan bahwa CCM tambahan menunjukkan dampak yang tidak signifikan pada muatan permukaan dan hanya sedikit peningkatan ukuran. Untuk lebih spesifik, diameter nanopartikel mencapai 121,28 ± 3,36 nm dan potensi zeta berubah menjadi 28,04 ± 2,64 mV, yang mirip dengan muatan permukaan CCM bebas (− 27,95 ± 3,06 mV), menunjukkan bahwa dekorasi CCM mencapai kejenuhan dalam kondisi ini. Hasilnya, CCM/SLI/R-D pada rasio massa 7,5 dipilih sebagai formulasi model untuk melakukan eksperimen berikut.
a Ukuran dan potensi perubahan zeta CCM SLC/R-D pada rasio berat yang berbeda. Gambar yang disisipkan adalah analisis baut barat dari tiga protein representatif dalam CCM dan CCM/SLI/R-D. b Distribusi ukuran dan TEM CCM/SLI/R-D. Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3). Bilah skala 100 nm
Karakterisasi CCM/SLI/R-D
Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa protein dalam CCM mampu menampung sel tumor homolog ketika diadopsi untuk memodifikasi nanopartikel [35, 36]. Oleh karena itu, tiga protein membran (Na-K ATPase, AT1R, dan CXCR4) dipilih dan tingkat ekspresinya dalam CCM dibandingkan dengan CCM/SLI/R-D. Seperti yang ditunjukkan pada gambar yang disisipkan pada Gambar 2a, jumlah ketiga protein dalam CCM menunjukkan intensitas yang sama dengan CCM/SLI/RD, yang menunjukkan bahwa protein terintegrasi dalam CCM diturunkan ke CCM/SLI/RD setelah pelapisan dan hilang atau degradasi dapat diabaikan selama proses ini. Hasil ini juga memberikan bukti kuat untuk mengkonfirmasi keberhasilan konstruksi CCM/SLI/R-D, yang bermanfaat untuk meningkatkan lokasi tumor CCM/SLI/R-D.
Distribusi ukuran dan morfologi CCM/SLI/R-D juga dipelajari menggunakan DLS dan TEM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, DLS mengungkapkan bahwa CCM/SLI/RD didistribusikan secara sempit di sekitar 120 nm sementara TEM menunjukkan bahwa CCM/SLI/RD dicirikan sebagai struktur cangkang inti bulat dan lapisan ganda lipid dapat diamati dengan jelas pada permukaan superfisial. lapisan.
DLC DOX dalam CM/SLI/R-D (ditentukan dengan HPLC) bisa setinggi 17,96%, dan pemuatan miR495 (ditentukan dengan spektrofotometer UV) bisa setinggi 1,64%.
Studi sebelumnya telah menyimpulkan beberapa persyaratan awal untuk pengiriman molekul obat yang aman. Pertama-tama, DDS yang diadopsi harus dipertahankan stabil tanpa variasi ukuran yang dramatis di bawah lingkungan fisiologis, karena ukuran partikel memberikan kontribusi penting yang penting bagi nasib sistem in vivo [10, 37]. Akibatnya, stabilitas CCM/SLI/R-D yang bergantung waktu diselidiki. Untuk menentukan stabilitas koloid CCM/SLI/R-D dalam lingkungan fisiologis, perubahan ukuran DDS dalam PBS (pH 7.4) dan plasma tikus dicatat hingga 48 h. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 3a, CM/SLN/Ce6 dapat secara efektif mempertahankan ukurannya selama seluruh rentang pengujian tanpa variasi yang signifikan. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa CCM/SLI/R-D mampu mempertahankan kestabilan dalam kondisi fisiologis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, CCM/SLI/RD dapat menjaga stabilitas pada kondisi ekstraseluler (32,76% obat dilepaskan setelah 120 h inkubasi), menunjukkan bahwa selama proses pengiriman, CCM/SLI/RD dapat dengan aman merangkum molekul obat yang dimuat tanpa menginduksi efek samping yang potensial. Yang paling penting, setelah memasuki sel dan menjadi sasaran lingkungan asam sel kanker, obat-obatan itu mudah dilepaskan (75,93%), yang mungkin dianggap berasal dari konsentrasi hidrogen tinggi yang melemahkan kombinasi obat dan pembawa [6, 38].
a Stabilitas koloid LCC/RA di PBS (pH 7.4) dan plasma tikus pada 37 °C hingga 48 h. b Profil pelepasan obat DOX dari LCC/R-A dalam media pelepasan di bawah kondisi pH ekstraseluler dan intraseluler (7,4 dan 5,5). Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3)
Transfeksi Intraseluler
Untuk mengungkapkan hubungan antara transfeksi miR495 dan ekspresi P-gp, sel A549/DOX ditransfeksi dengan konsentrasi miR495 yang berbeda. Setelah itu, tingkat ekspresi P-gp dalam sel-sel ini ditentukan menggunakan uji western blot. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, ekspresi P-gp menunjukkan hubungan negatif dengan konsentrasi miR495, menunjukkan bahwa CCM/SLI dapat diterapkan sebagai alat yang berguna untuk pengiriman miR495, yang bermanfaat bagi CCM/SLI/RD untuk membalikkan MDR dalam sel A549/DOX. Sebagai bukti konsep, efek transfeksi miR495 pada variasi akumulasi DOX intraseluler dipelajari lebih lanjut. Setelah dirawat dengan CCM/SLC/siRNA selama 48 atau 72 h (Gbr. 4b), sel A549/DOX diperlakukan dengan DOX untuk interval waktu yang bervariasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5d, dengan perlakuan awal CCM/SLC/siRNA selama 48 jam, fluoresensi seluler DOX dalam sel A549/DOX meningkat 1,49 kali lipat (4 jam pasca inkubasi) dan 1,47 kali lipat (8 jam pasca inkubasi) , masing-masing. Dengan pretreatment CCM/SLC/siRNA selama 72 jam, fluoresensi DOX intraseluler dalam sel A549/DOX meningkat 1,63 kali lipat (4 jam pasca inkubasi) dan 1,85 kali lipat (8 jam pasca inkubasi). Hasilnya, disimpulkan bahwa CCM/SLC/siRNA dapat mengatasi MDR pada A549/DOX dengan meningkatkan akumulasi DOX intraseluler dibandingkan dengan sel yang tidak diberi perlakuan.
a Hubungan antara konsentrasi miR495 dan ekspresi protein P-gp dalam sel A549/DOX setelah diberi perlakuan CCM/SLI/miR495 selama 48 h. b Akumulasi DOX intraseluler dalam sel A549/DOX setelah diberi perlakuan LCC/miR495 untuk interval waktu yang berbeda. Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3)
Viabilitas sel A549/DOX yang diobati dengan pembawa bebas obat (a ) atau obat yang mengandung (b ) formulasi berbeda pada konsentrasi nanopartikel/obat yang berbeda selama 48 h. c Uji Western blot dari ekspresi protein caspase-3, sitokrom C, dan bcl-2 setelah perlakuan yang berbeda. Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3).
**P < 0.01
Pengujian Antikanker In Vitro
Sitotoksisitas pembawa bebas obat (CCM/SLI) dipelajari untuk mengungkapkan lebih lanjut biokompatibilitas DDS. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a, setelah diinkubasi dengan CCM/SLI selama 48 h pada konsentrasi tertinggi 200 μg/mL, A549/DOX masih menunjukkan viabilitas lebih dari 90%, yang menunjukkan bahwa CCM/SLI biokompatibel dengan toksin yang tidak signifikan. ke sel.
Setelah itu, uji antikanker in vitro dievaluasi. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5b, efek antikanker dari semua formulasi berhubungan positif dengan konsentrasi obat. Secara rinci, viabilitas sel A549/DOX masih 72,6% pada konsentrasi DOX tertinggi (50 μM). CCM/SLI/DOX dan CCM/SLI/miR495 pada kondisi yang sama mencapai viabilitas sel yang sama, masing-masing 59,4% dan 63,3%, lebih tinggi dari DOX. Namun, tercatat bahwa viabilitas sel untuk pengobatan CCM/SLI/R-D menurun secara signifikan menjadi 38,5%. Selain itu, indeks CI dalam CCM/SLI/R-D ditentukan sebagai 0,84, menunjukkan efek sinergis yang kuat dari miR495 dan DOX pada pembunuhan sel A549/DOX.
Untuk memverifikasi kesimpulan lagi, protein regulasi apoptosis yang umum diadopsi (caspase-3, bcl-2, dan cytochrome-3) dinilai dalam formulasi yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5c, jumlah caspase-3 yang dibelah adalah yang tertinggi dalam sel yang diobati dengan CCM/SLI/RD dan tingkat bcl-2 (penekan apoptosis) adalah yang terendah di antara semua kelompok pengujian, yang selanjutnya mengkonfirmasi antikanker yang lebih disukai. kemanjuran CCM/SLI/RD. Selain itu, CCM/SLI/R-D menunjukkan banyak peningkatan ekspresi sitokrom-3, yang menunjukkan bahwa apoptosis pada kelompok ini terkait dengan kerusakan mitokondria.
MCTS diadopsi untuk meniru tumor padat dan untuk menilai efek antikanker dari formulasi yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, volume MCTS dalam kelompok DOX bebas terus meningkat selama periode percobaan secara keseluruhan, menunjukkan bahwa MDR dalam A549/DOX dapat secara signifikan mengurangi sitotoksisitas DOX. Sistem pengiriman tunggal (SLI/DOX dan SLI/miR495) menunjukkan efek penekanan tertentu dengan sedikit penurunan pertumbuhan. Yang paling penting, kombinasi miR495 dan DOX dalam CCM/SLI/R-D menunjukkan kemanjuran yang sangat tinggi dengan pertumbuhan volume negatif yang diamati pada akhir pengujian. Gambar optik pada Gambar 6b juga mencapai kesimpulan yang sama.
Volume berubah (a ) dan gambar optik yang sesuai (b ) dari MCTS setelah perlakuan yang berbeda. Data ditampilkan sebagai mean ± SD (n = 3).
**P < 0.01
Penargetan In Vitro dan In Vivo
Untuk mengungkapkan kemungkinan alasan untuk efek antitumor diskriminatif dari berbagai formulasi, serapan seluler dinilai untuk menyelidiki apakah modifikasi CCM dapat secara positif meningkatkan kapasitas internalisasi nanopartikel dalam sel A549/DOX karena banyak penelitian telah menunjukkan bahwa modifikasi permukaan CCM dapat meningkatkan tumor -kapasitas penargetan nanocarriers [39, 40]. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 7a, intensitas fluoresensi intraseluler meningkat pada kelompok CCM/SLI/miR49 dan SLI/miR495 sebagai fungsi waktu, menunjukkan hubungan positif antara waktu dan serapan seluler di kedua nanopartikel. Selain itu, dicatat bahwa sinyal fluoresensi yang lebih tinggi diamati pada kelompok CCM/SLI/miR495, yaitu 1,58 kali lipat dari pada kelompok SLI/miR495 pada titik waktu 6 h. Untuk memverifikasi apakah penyerapan CCM / SLI / miR495 melalui endositosis yang dimediasi CCM, sel-sel diinkubasi dengan CCM berlebih sebelum penambahan nanocarrier. Terlihat bahwa intensitas fluoresensi pada kelompok CCM/SLI/miR495 terus menurun, sedangkan intensitas fluoresensi pada kelompok SLI/miR495 tetap hampir sama. Hasil ini menunjukkan bahwa CCM/SLI/miR495 diambil oleh sel melalui endositosis terkait CCM.
a Analisis kuantitatif serapan bergantung waktu intraseluler dari formulasi berbeda dalam sel A549/DOX (dilakukan sebelumnya dengan/tanpa CCM). b Intensitas fluoresensi rata-rata dari tumor yang dibedah dan organ utama tikus yang diobati dengan SLI / R-A dan CCM / SLI / R-A pada 48 jam pasca injeksi. Data dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3).
**P < 0.01
CCM dari A549/DOX diharapkan dapat meningkatkan kapasitas penargetan tumor CCM/SLI/R-D ke sel A549/DOX isogen untuk meningkatkan akumulasi nanocarrier dalam tumor. Untuk memverifikasi konsep kami, distribusi SLI/R-D dan CCM/SLI/R-D dipantau oleh sistem pencitraan waktu nyata. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7b, seperti yang diharapkan, CCM/SLI/R-D menunjukkan lebih banyak akumulasi dalam tumor dibandingkan dengan SLI/R-D. Selain itu, disimpulkan bahwa SLI/R-D didistribusikan di hampir semua organ (kecuali jantung) dengan fokus di hati dan limpa, yang mungkin disebabkan oleh kemampuan tumor-homing yang buruk. Sebaliknya, modifikasi CCM dapat secara signifikan mengurangi penangkapan hati untuk membantu peningkatan penempatan muatan yang dimuat ke jaringan tumor.
Kemanjuran Antitumor Pada Vivo
Kemanjuran antitumor in vivo CCM/SLI/R-D dilakukan. Setelah pengobatan dengan DOX atau SLI/DOX, pertumbuhan tumor mencit melambat. Namun, CCM/SLI/R-D memiliki efikasi antitumor terbaik dan menghasilkan pengurangan volume tumor sebesar 303 ± 25 mm
3
. Selain itu, hasil variasi bobot badan mencit pada kelompok yang berbeda juga menunjukkan hasil yang menarik (Gbr. 8). Ini menunjukkan tidak ada penurunan berat badan yang jelas pada tikus yang diobati dengan CCM/SLI/R-D, menunjukkan bahwa kemampuan penargetan tumor CCM/SLI/R-D dapat meningkatkan kemanjuran antitumor dengan pengurangan efek samping. Sebaliknya, distribusi DOX bebas yang tidak ditargetkan menyebabkan toksisitas sistematis pada tikus, yang tercermin dari penurunan berat badan secara bertahap sebagai fungsi waktu. Singkatnya, CCM/SLI/R-D adalah DDS pembawa tumor yang unggul untuk terapi tumor paru.
The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n = 6).
**P < 0.01
Kesimpulan
In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.
Ketersediaan Data dan Materi
The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.
