Pengiriman Terpadu Sasaran 5-Fluorouracil dan LY294002 melalui Nanopartikel Lipid PEG Meningkatkan Efisiensi Antitumor pada Karsinoma Sel Selang Eksplam
Abstrak
Kami merancang nanoliposom ter-PEG yang mengenkapsulasi ganda agen kimiaoterapeutik 5-fluorouracil (5-FU) dan inhibitor otophagi LY294002 (LY) untuk mengobati karsinoma sel selang eksplam (ESCC). Karakterisasi fisikokimia dan biologi yang komprehensif mendemonstrasikan pengmuatan ganda obat yang berhasil dan profil peluncuran terkontrol, dengan LY dirilis sedikit lebih cepat daripada 5-FU. Nanoliposom menunjukkan penyerapan yang dimediasi reseptor, dikonfirmasi oleh mikroskop konfokal dan FACS, dan mengirimkan konsentrasi seluler yang lebih tinggi dari kedua agen. In vitro, nanoliposom (FLNP) menginduksi sitotoksisitas dan apoptosis yang lebih besar (~48%) daripada obat tunggal atau kombinasi bebas, seperti yang dibuktikan oleh MTT, annexin V/PI, dan pewarnaan Hoechst. Western blot mengungkapkan regulasi naik kaspas-3 dan PARP serta regulasi turun Bcl-2, mengonfirmasi induksi apoptosis. Dalam model xenograft, FLNP mencapai inhibisi pertumbuhan tumor yang unggul, mengurangi volume tumor menjadi ~500 mm³ versus ~1.400 mm³ pada kontrol (p < 0,0001). Temuan ini mendukung janji pengiriman terpadu terprogram dari inhibisi otophagi dan kimiaoterapi melalui satu nanokarier untuk mengatasi resistensi multidroga dalam ESCC.
Latar Belakang
Karsinoma sel selang eksplam (ESCC) tetap menjadi beban kesehatan besar di Asia Timur, dengan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun hanya ~25 % (1,2). Sementara bedah adalah sumbu pengobatan, kimiaoterapi tambahan dapat secara signifikan meningkatkan hasil (3,4). Namun, monoterapi sering gagal karena heterogenitas tumor dan resistensi intrinsik (5). Regimen kombinasi yang menargetkan jalur seluler yang berbeda sangat penting untuk efisiensi sinergi (6,7).
Otophagi, proses degradasi lisosom, seringkali diupregulasi dalam sel kanker di bawah stres dan dapat melindungi mereka dari agen kimiaoterapeutik (8). Inhibisi otophagi telah ditunjukkan dapat menyusutkan sel tumor terhadap obat sitotoksik, sehingga mengatasi resistensi multidroga (MDR) (9). LY294002 (LY) adalah inhibitor PI3K yang telah dipelajari secara luas yang secara efektif memblokir otophagi (9). 5-Fluorouracil (5-FU), analog pirimidin fluorinasi, banyak digunakan dalam kanker sel selang; sitotoksisitasnya timbul dari pengintegrasian ke dalam RNA dan inhibi sintesil timidilat (10–12). Keduanya 5-FU dan LY menderita larut air yang buruk dan klarifikasi sistemik yang cepat, yang membatasi jendela terapeutiknya (6,7).
Nanokarier, khususnya liposom ter-PEG, telah muncul sebagai kendaraan pengiriman obat yang divalidasi klinis, menawarkan kelarutan yang ditingkatkan, sirkulasi yang panjang, dan akumulasi tumor pasif melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR) (13–18). Dengan mengenkapsulasi keduanya 5-FU dan LY dalam satu liposom PEG-lipid, kami berhipotesis bahwa peluncuran awal LY akan mengganggu jalur kelangsungan otophagi, membuat sel tumor lebih rentan terhadap 5-FU dan menghasilkan respons antitumor sinergi.
Metode
Bahan
5-FU (Sigma-Aldrich, China) dan LY294002 (Beijing Huafeng United Technology Corporation, China) digunakan seperti yang diterima. Lipid—fosfatidilkolin telur (EPC), DSPE-PEG2000, dan kolesterol—diperoleh dari Avanti Polar Lipids, China.
Prodiksi Nanoliposom dengan Muatan Ganda Obat
Fosfolipid dan kolesterol dilarutkan dalam campuran metanol–kloroform (rasio molar 10:4:1, 10 mg total). 5-FU dan LY (1,5 mg masing-masing) ditambahkan, dan pelarut diavapor pada 60 °C di bawah tekanan rendah untuk membentuk tipis tipis. Hidrasi dengan larutan fosfat (PBS) selama 1 diikuti oleh ekstrusi melalui membran policarbonat 200 nm menghasilkan FLNP. Obat yang tidak terkapsulasi dikuantifikasi oleh HPLC. Muatan obat (DL) dan efisiensi kapsulasi (EE) dihitung sebagai berikut: DL (%) = (Bobot obat terkapsulasi / Bobot liposom) × 100; EE (%) = (Bobot obat terkapsulasi / Bobot obat awal) × 100.
Analisis Ukuran Partikel
Pencaran cahaya dinamis (DLS) menggunakan Malvern Zetasizer Nano ZS mengukur ukuran partikel dan indeks polidispersi (PDI) pada 25 °C.
Analisis Morfologi
Mikroskop transmisi elektron (TEM, Hitachi H-7600) dan mikroskop gaya atom (AFM) memeriksa morfologi.
Studi Peluncuran In Vitro
Peluncuran obat dari FLNP dievaluasi dalam PBS (pH 7,4) pada 37 °C menggunakan membran dialisis (MW ≈ 3.500). Sampel diambil pada interval yang ditentukan dan dianalisis oleh HPLC (Hitachi L-2200 autosampler, L-2420 detektor UV–Vis; kolom Inertsil C18, 150 × 4,6 mm, 5 µm). Kalibrasi linier berkisar dari 0,025–2 µg/mL (r² ≈ 0,9995).
Kultur Sel
Gariskan sel ESCC manusia EC 9706 dipertahankan dalam RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10 % FBS, 100 U/mL penitsilin, dan 100 µg/mL streptomycin dalam inkubator lembap 5 % CO₂.
Analisis Penyerapan Seluler
Nanoliposom berlabel rhodamine B diinkubasi dengan sel EC 9706 (10 µg/mL) selama 2 jam. Mikroskop skaning konfokal laser (CLSM, Nikon TE2000-E) memvisualisasikan distribusi selul. Sitometria aliran (BD FACSCALibur) mengukur penyerapan pada titik waktu 1 jam dan 2 jam.
Uji Sitotoksisitas
Uji viabilitas MTT dilakukan pada 1 × 10⁴ sel/well (plate 96-well). Sel diobati dengan 5-FU bebas, LY, 5-FU + LY, atau FLNP selama 24 jam. Absorbansi pada 570 nm diukur menggunakan pembaca Synergy HTX.
Uji Apoptosis
Pewarnaan annexin-V/PI (BD Biosciences) diikuti oleh sitometria aliran mengukur apoptosis awal dan akhir setelah 24 jam perawatan (1 µg obat setara).
Uji Hoechst 33342
Pewarnaan Hoechst 33342 (1 µg/mL) dari sel yang diubah memvisualisasikan kondensi inti di bawah mikroskop fluoresensi.
Western Blotting
Ekstrak protein dipisahkan oleh SDS-PAGE dan ditransfer ke membran PVDF. Blot diurai untuk kaspas-3 terbelah, PARP, Bcl-2, dan p53 (AbClon). Deteksi menggunakan ECL dan pemrosesan Kodak M35-A.
Analisis Inhibisi Pertumbuhan Tumor In Vivo
Tikus nude athymic betina (6 minggu) menerima suntikan subkutan 1 × 10⁶ sel OE-19 (100 µL). Khi tumor mencapai ~80 mm³ (hari 10), tikus (n = 6 per grup) menerima 5 mg/kg FLNP, kombinasi obat bebas, atau kontrol melalui injeksi intraperitoneal tiga kali selama 10 hari. Volume tumor (V = ½ × panjang × lebar²) diukur dengan kaliper selama 20 hari.
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD. Signifikansi dievaluasi oleh uji t atau ANOVA (p < 0,05).
Hasil dan Pembahasan
Pengiriman terpadu 5-FU dan LY dalam liposom PEG mencapai efek antitumor sinergi yang melebihi efisiensi masing-masing agen atau kombinasi bebas mereka. Sinergi ini disebabkan oleh peluncuran berurutan LY, yang mengganggu otophagi dan menyusutkan sel terhadap kerusakan DNA yang diinduksi 5-FU.
Ilustrasi skematis persiapan nanoliposom PEG yang dimuat 5-fluorouracil dan LY.
Persiapan dan Karakterisasi Nanoliposom yang Dimuat 5-FU dan LY
Liposom polos memiliki diameter rata-rata ~110 nm (PDI ≈ 0,15). Muatan ganda obat meningkatkan ukuran menjadi ~150 nm (PDI ≈ 0,18), dimensi yang mendukung akumulasi tumor melalui EPR (17,18). Muatan permukaan adalah +25 mV, yang memberikan stabilitas koloid dan meminimalkan adsorpsi protein non-spesifik.
Karakterisasi fisikokimia FLNP. a Distribusi ukuran DLS; b citra TEM; c citra AFM.
Muatan Obat dan Peluncuran In Vitro
Efisiensi kapsulasi adalah 92,5 % untuk 5-FU dan 86 % untuk LY, dengan kapasitas muatan ~16 % w/w. Profil peluncuran dalam PBS (pH 7,4) menunjukkan pola bifasik: ~30 % 5-FU dan ~40 % LY dirilis dalam 24 jam, diikuti oleh peluncuran bertahap hingga ~60 % 5-FU dan ~75 % LY pada 90 jam (Gambar 3). Peluncuran LY yang lebih cepat mempromosikan inhibisi otophagi awal, mempersiapkan sel untuk sitotoksisitas 5-FU selanjutnya.
Profil peluncuran 5-FU dan LY dari FLNP dalam PBS (pH 7,4). Jumlah obat dikuantifikasi oleh HPLC.
Studi Internalisasi Seluler
CLSM mengungkapkan fluoresensi merah intens dalam sitoroplasma perinukleus setelah 2 jam, yang menunjukkan endositosis yang dimediasi reseptor. Sitometria aliran mengonfirmasi penyerapan yang bergantung pada waktu, dengan peningkatan yang mencolok antara 1 jam dan 2 jam (Gambar 4).
a Citra CLSM sel EC 9706 setelah inkubasi FLNP 2 jam. b Analisis sitometria aliran pada 1 jam dan 2 jam.
Efek Antikanker In Vitro
Uji MTT menunjukkan sitotoksisitas yang bergantung pada dosis untuk semua formulasi. FLNP mencapai IC₅₀ 0,58 µg/mL, jauh lebih rendah daripada 5-FU bebas (2,68 µg/mL), LY (5,98 µg/mL), dan kombinasi bebas (1,54 µg/mL). Efektivitas yang ditingkatkan disebabkan oleh pengiriman obat yang ditingkatkan dan peluncuran berurutan (Gambar 5).
Viabilitas sel EC 9706 setelah paparan 24 jam 5-FU bebas, LY, 5-FU + LY, dan FLNP (uji MTT).
Evaluasi Apoptosis
Pewarnaan annexin-V/PI mengungkapkan 48 % apoptosis dalam sel yang diobati FLNP, dibandingkan 20 % untuk 5-FU sendirian dan 30 % untuk kombinasi bebas (Gambar 6). Pewarnaan Hoechst mengesahkan kondensi inti dalam sel yang diobati FLNP.
Sitometria aliran apoptosis dalam sel EC 9706 setelah 24 jam perawatan FLNP.
Analisis Western Blot
FLNP secara signifikan meningkatkan kaspas-3 dan PARP yang terbelah sambil mengurangi ekspresi Bcl-2 dan p53, mengonfirmasi aktivasi jalur apoptosis intrinsik (Gambar 7).
Western blot protein terkait apoptosis setelah perawatan FLNP.
Efektivitas antitumor in vivo: FLNP mengurangi volume tumor menjadi ~500 mm³ versus ~1.400 mm³ pada kontrol (p < 0,0001).
Analisis Inhibisi Pertumbuhan Tumor In Vivo
FLNP secara konsisten menekan progresi tumor selama 20 hari, mencapai reduksi >60 % volume tumor akhir relatif terhadap grup obat bebas. Hasil terapeutik yang ditingkatkan disebabkan oleh akumulasi selektif tumor (EPR) dan peluncuran obat yang berkelanjutan.
Kesimpulan
Platform liposom PEG kami berhasil mengirimkan 5-FU dan LY, mencapai peluncuran terkontrol dan berurutan yang memperkuat sitotoksisitas dan apoptosis dalam ESCC. FLNP unggul dibandingkan kombinasi obat bebas in vitro dan in vivo, menekankan potensi inhibisi otophagi untuk mengatasi resistensi kimiaoterapi. Studi mendatang akan memperluas strategi ini ke karsinoma sel selang lainnya dan mengevaluasi model xenograft ortotopik dan hasil pasien.
