Deteksi Imunosensing-Fluoresensi Baru dari Penanda Tumor Fragmen Cytokeratin-19 (CYFRA 21-1) Melalui Carbon Quantum Dots/Zinc Oxide Nanocomposite
Abstrak
Deteksi cepat kanker paru stadium awal menggunakan fragmen antigen cytokeratin-19 (CYFRA 21-1) sebagai penanda tumor dalam serum manusia berperan penting dalam kelangsungan hidup pasien dan mengambil reaksi pembedahan yang cepat. Penelitian ini bertujuan untuk menggunakan titik-titik kuantum karbon hijau terkonjugasi nanokomposit seng oksida terkonjugasi sebagai solusi imunosensing fluoresensi yang sangat sensitif untuk penentuan cepat antigen CYFRA 21-1 dalam serum manusia. Metode yang disarankan dilakukan dengan menerapkan metode hidrotermal untuk menyiapkan titik-titik kuantum karbon menggunakan Citrus lemon perikarp. Titik kuantum karbon yang terbentuk digunakan dalam reduksi dan stabilisasi seng asetat untuk mensintesis titik kuantum karbon-seng oksida nanokomposit. Untuk membentuk sistem immunosensing antibodi-antigen-antibodi sandwich capping, antigen CYFRA 21-1 dijebak dengan melumpuhkan antibodi monoklonal non-konjugasi BM 19.21 pada permukaan karbon quantum dots-seng oksida nanokomposit dan antibodi monoklonal lain KS 19.1, yang dilapisi pada permukaan sumur mikrotiter. Sistem ini memiliki fitur fluoresensi yang dapat disetel yang direkam pada eksitasi dan emisi ex = 470 dan em = 520 nm, masing-masing. Sistem imunosensing fluoresensi nanokomposit yang disarankan menunjukkan hubungan linier 0,01–100 ng mL
−1
dengan batas deteksi 0,008 ng mL
−1
. Sistem immunosensing yang disarankan berdasarkan karbon quantum dots-seng oksida nanokomposit memberikan pendekatan yang menjanjikan untuk diagnosis cepat kanker paru-paru dengan mendeteksi CYFRA 21-1 dalam serum manusia.
Pengantar
Kanker paru-paru adalah jenis kanker yang paling umum dan agresif dengan tantangan besar dalam perawatan medis. Kekambuhan tumor dan metastasis dianggap sebagai penyebab utama kematian pasien kanker paru-paru [1]. Fragmen tumor marker cytokeratin 19 (CYFRA 21-1) merupakan fragmen yang terdapat pada banyak sel epitel normal maupun ganas [2]. Hal ini dapat diperkirakan dengan menggunakan uji sandwich immunoradiometric. Studi awal mengklarifikasi bahwa pada stadium ganas kanker paru-paru, CYFRA 21-1 dilepaskan ke dalam sirkulasi darah pasien dan meningkat dalam serum mereka [3]. Oleh karena itu, adalah mungkin untuk meningkatkan kelangsungan hidup pasien kanker paru-paru dengan deteksi dini dan reaksi pembedahan yang cepat [4].
Beberapa teknik sebelumnya dilaporkan untuk mendeteksi CYFRA 21-1, termasuk enzyme immunoassay [5], electrochemiluminescence immunoassay [6], dan immunoradiometric assay [7]. Strategi yang menguntungkan untuk meningkatkan dan meningkatkan sensitivitas CYFRA 21-1 dalam serum manusia masih menjadi perhatian.
Dalam beberapa tahun terakhir, kemajuan besar dan pertumbuhan eksplosif nanoteknologi telah dicapai di hampir semua bidang kehidupan [8]. Di antara bidang-bidang tersebut adalah sistem penghantaran obat [9], analisis farmasi [10], reaksi aktivitas katalitik [11], aplikasi obat [12], penanda tumor kanker [13], dan pencitraan jaringan [14].
Saat ini, teknik penginderaan berbasis fluoresensi (FL) telah menarik banyak peneliti karena desainnya yang sederhana dan sensitivitasnya yang sangat baik. Berbagai bahan sensorik FL telah dirancang dan disintesis untuk pemantauan biologis. Sistem FL untuk penentuan biologis sangat bercahaya, dapat terdispersi dalam air, stabil secara kimia, dan tidak beracun [15]. Ada berbagai probe berbasis fluoresensi immunosensing untuk deteksi biomarker. Uji kompetitif heterogen dilakukan dengan melumpuhkan molekul penangkap di permukaan dan kemudian diinkubasi dengan biomarker terkonjugasi fluorofor. Kompetisi antara biomarker bebas dan terkonjugasi untuk mengikat molekul penangkap menurunkan intensitas fluoresensi dengan konsentrasi biomarker [16]. Uji sandwich heterogen didasarkan pada inkubasi molekul penangkap dan larutan yang diinginkan membentuk kompleks dengan biomarker. Akibatnya, intensitas fluoresensi meningkat dengan konsentrasi biomarker [17].
Dalam uji kompetitif homogen, dua molekul penangkap terkonjugasi fluorofor A yang berbeda terkonjugasi dengan biomarker terkonjugasi fluorofor B dan larutan meningkatkan fluoresensi dengan konsentrasi biomarker [18]. Namun, teknik tersebut menunjukkan kelemahan tertentu, termasuk waktu eksperimen yang lama, kurangnya deteksi multipleks, kompleksitas, dan terkadang hasil yang relatif salah. Kemajuan dalam nanoteknologi memungkinkan peneliti untuk mengembangkan probe imunosensing fluoresensi baru dengan karakteristik optik yang unik [19]. Sejak penggunaan pertama titik-titik kuantum dalam deteksi biomolekul, mereka telah mendapatkan banyak minat karena fitur optiknya memberikan fleksibilitas tinggi dalam pemilihan panjang gelombang yang sesuai, label yang sangat baik untuk deteksi multipleks, biokompatibilitas, dan kapasitas penargetan [20].
Titik kuantum karbon (CQDs) telah menunjukkan sifat kimia, fisik, optik, magnetik, dan listrik yang sangat baik. CQD dapat disintesis menggunakan teknik yang berbeda, termasuk hidrotermal, elektro-oksidasi, ablasi laser, dan metode gelombang mikro [21,22,23,24]. Karena fitur toksisitasnya yang rendah, peneliti ilmiah menganggap CQD sebagai kandidat kuat di banyak probe fluoresen. Selain itu, mereka memiliki kemampuan yang kuat untuk memanipulasi melalui reaksi kimia yang dapat dikontrol berbeda dalam berbagai tuntutan seperti biokimia, fotokimia, biosensing, bioimaging, dan sistem pengiriman obat [25,26,27], serta dalam deteksi immunoassay [28]. Studi sebelumnya tentang sintesis CQDs mengungkapkan kelemahan tertentu dengan menggunakan sumber karbon mahal, bahan kimia beracun dan reagen, atau menggunakan proses non-selektif [29]. Untuk membatasi kerugian tersebut, peneliti mulai menggunakan jus buah sebagai sumber karbon baru dan murah [30]. Karena penggunaan jus buah tidak memberikan tujuan optimal dalam memanfaatkan sumber daya, CQD fluoresen baru-baru ini diperoleh dari kulit buah [31]. Penggunaan kulit buah memberikan cara yang menjanjikan untuk sintesis CQD yang ramah lingkungan dan hijau.
Seng oksida (ZnO) adalah salah satu oksida logam yang paling penting, berpotensi aktif, stabil dan rendah toksik yang banyak digunakan dalam perangkat laser ultraviolet, bidang biomedis, berbagai jenis sensor, dan fotokatalisis [32,33,34,35]. Nanopartikel ZnO (ZnONPs) menampilkan sifat fotoluminesen di dekat rentang spektrum UV dan Vis. Hal ini dapat dikaitkan dengan emisi eksitonik yang didasarkan pada rekombinasi langsung pasangan elektron-lubang [36] atau karena emisi hijau-kuning pada 520 nm sebagai akibat dari transisi elektronik dari tepi pita konduksi ke tingkat perangkap. [37].
Umumnya, titik karbon adalah nanopartikel kuasi-spherical amorf atau nanokristalin yang mengandung sp
2
dan sp
3
karbon, kelompok berbasis O/N, dan kelompok kimia pasca modifikasi. Selanjutnya, CQDs memiliki kemampuan untuk menggairahkan dengan panjang gelombang yang lebih tinggi dan dapat mengubah kemanjuran permukaan gabungan dari pasangan elektron-lubang dan memperlakukan pendinginan dalam sistem yang dianalisis, yang dapat memfasilitasi penentuan kuantitatif biomolekul [38]. Mereka memiliki kemampuan untuk didekorasi oleh oksida logam seperti TiO2 dan ZnO untuk membentuk nanokomposit optik aktif yang dapat dimanfaatkan dalam pendeteksian biomarker dalam serum manusia. ZnO adalah bahan celah pita lebar (3,37 eV), yang dapat berpendar di daerah UV dan biru dari cahaya tampak karena adanya kepadatan tingkat cacat yang besar di celah pita [39]. Pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO meningkatkan penyerapan cahaya tampak karena hibridisasi ZnO dengan CQD, dan pergeseran biru dalam penyerapan pendaran menjadi 520 nm dapat dikaitkan dengan rekombinasi radiasi dari lowongan O terionisasi. Selain peningkatan penyerapan cahaya tampak, pemisahan lubang elektron yang lebih baik dan pengurangan waktu transfer elektron antarmuka dapat dipertimbangkan untuk kinerja optik yang lebih tinggi dari CQD hibridisasi dengan nanopartikel ZnO [40]. Selain itu, peningkatan radikal –OH* yang berarti, yang dihasilkan dari nanokomposit CQDs/ZnO di antarmuka air, dapat menyebabkan peningkatan sinyal fluoresensi yang signifikan dari sistem analisis. Dengan demikian, nanokomposit CQDs/ZnO gabungan meningkatkan modifikasi sifat optoelektronik dan fotoluminesensi permukaan ZnO dan menghasilkan cacat permukaan yang kuat dengan fotoluminesensi yang dapat disetel [41]. Selain itu, CQD yang diimobilisasi dengan antibodi bio-rekognisi yang membentuk sistem penginderaan FL antibodi-antigen-antibodi memberikan probe yang layak dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi terhadap analit target [42].
Studi yang disarankan mengusulkan sistem penginderaan fluoresensi imunoassay sederhana dan ultrasensitif baru berdasarkan CQD yang didekorasi dengan nanokomposit ZnO untuk menentukan penanda tumor CYFRA 21-1 dalam serum manusia. Jeruk lemon pericarp digunakan sebagai prekursor karbon untuk menurunkan CQD menggunakan kondisi hidrotermal. Selain itu, digunakan sebagai agen pereduksi dan penstabil untuk sintesis nanokomposit ZnO terkonjugasi CQD. Nanokomposit CQDs/ZnO yang telah disiapkan diimobilisasi oleh antibodi monoklonal BM 19.21 (mAb) non-konjugasi dan sumur mikrotiter dilapisi dengan antibodi monoklonal KS 19.1 lainnya untuk membentuk sistem imunosensing sandwich capping.
Metode
Instrumen
Spektrofotometri spektrofotometri dari kedua CQD serta nanokomposit CQDs/ZnO direkam menggunakan spektrofotometer Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, UK). Morfologi permukaan dan distribusi ukuran partikel dari CQD yang disintesis hijau dan nanokomposit CQDS/Zn dievaluasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) instrumen model JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Jerman) dan mikroskop elektron pemindaian (SEM) model JSM-7610F (JEOL, AS). Fluoresensi dan spektrum inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dari sistem imunosensing yang disarankan diperiksa menggunakan pembaca multi-mode Biotek Synergy H1 (Biotek, Tokyo, Jepang) dan spektrofotometer FT-IR Perkin Elmer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Jepang) , masing-masing. Spektrum Raman, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dan pola difraksi serbuk sinar-X (XRD) diukur menggunakan spektrometer mikro-Raman (CRAIC Technologies, CA, USA), sistem spektroskopi sinar-X Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd. , Manchester, Inggris) dan difraktometer Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Jerman).
Bahan Kimia dan Reagen
Instrumen SG-2000-10090 (Barsbuttel, Jerman) digunakan untuk memperoleh air deionisasi yang digunakan di seluruh eksperimen. CYFRA 21-1-non-conjugated monoclonal antibodi (mAb) BM 19.21 dan KS 19.1 untuk membentuk sistem immunosensing sandwich capping diperoleh dari Abcam (Cambridge, UK). Lemon jeruk buah-buahan dipasok oleh pasar lokal. Phosphate-buffered saline (PBS) pH = 7.4 dibuat menggunakan natrium klorida, kalium klorida, natrium hidroksida, monopotassium fosfat, dan dinatrium fosfat (BHD Ltd. Co. Poole, UK). Randox Laboratories (Irlandia Utara-Inggris) dengan ramah menyediakan serum normal komersial. Sampel darah acak dikumpulkan dari sukarelawan sehat, dan sebelum memulai penelitian ini, persetujuan telah diperoleh. Lebih lanjut, Sigma-Aldrich (Hamburg, Jerman) memasok kadar murni karbodiimida hidroklorida (EDC) dan N-hidroksisuksinimida (NHS). Komite etik penelitian di King Saud University, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) menyetujui penelitian tersebut.
Preparasi Hidrotermal Hijau dari Carbon Quantum Dots (CQD)
Lemon jeruk pericarp digunakan untuk mensintesis CQD dalam kondisi hidrotermal. Sekitar 20 g jeruk nipis pericarp dan 200 mL air deionisasi dipindahkan ke labu bulat dan direfluks pada 100 ° C di bawah pengadukan magnet terus menerus selama 6 jam. Setelah pendinginan hingga suhu kamar, ekstrak yang dihasilkan disentrifugasi pada 3500 rpm dan 20 mL larutan yang diekstraksi atas diautoklaf dan dipanaskan dalam kondisi hidrotermal dalam kisaran suhu dari 100 hingga 200 °C untuk interval 6-120 h yang berbeda. Setelah didinginkan hingga suhu kamar, cairan atas mewakili CQD (Skema 1).
Sintesis hijau CQD menggunakan Citrus lemon pericarp ke larutan CQD fluoresen dan bola karbon
Untuk menyiapkan nanokomposit CQDs/ZnO, reaksi reduksi kimia sederhana dilakukan dengan menggunakan CQD sebagai zat pereduksi dan penstabil. CQDs/ZnO nanokomposit diperoleh dengan menambahkan 20 mL CQD ke 50 mL 5.0 × 10
−2
mol L
−1
seng asetat pada 60 °C di bawah pengadukan terus menerus selama 10 min. Ketika warna campuran berubah dari kekuningan menjadi krem, campuran didiamkan selama 30 menit untuk menyelesaikan proses reduksi dan disimpan pada suhu 4 °C. Untuk memastikan stabilitas dan memeriksa aglomerasi nanokomposit CQDs/ZnO yang telah disiapkan, spektrometri UV-Vis digunakan untuk merekam absorbansi dalam 20 hari pada 390 nm. Hasil hasil menunjukkan stabilitas tinggi dan tidak ada perubahan signifikan dalam absorbansi nanokomposit CQDs/ZnO.
Untuk memastikan pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO, teknik mikroskopis dan spektroskopi yang berbeda digunakan. Keseragaman dan morfologi permukaan nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari menggunakan mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HRTEM) dan SEM. Spektrum optik dipelajari menggunakan spektroskopi UV-Vis, FT-IR, XPS, dan Raman. Struktur kristal CQD yang disiapkan dievaluasi menggunakan pola XRD.
Proses Imobilisasi
Antibodi BM 19.21 monoklonal non-konjugasi diimobilisasi pada permukaan nanokomposit CQDs/ZnO yang disintesis oleh ikatan amida peptida sederhana antara amina dan gugus karboksilat aktif. Proses imobilisasi dilakukan dengan menambahkan 5.0 mL masing-masing equimolar 3.0 × 10
−3
mol L
−1
NHS dan EDC hingga 5.0 mL larutan nanokomposit CQDs/ZnO di bawah pengadukan terus menerus selama 1 h. Sekitar 5 mg antibodi BM 19.21 monoklonal non-konjugasi dilarutkan dalam 1,0 mL 0,01 mol L
−1
fosfat-buffered saline (pH = 7.4) dan ditambahkan ke larutan penginderaan di atas. Antibodi BM 19.21 monoklonal non-konjugasi diimobilisasi pada permukaan larutan nanokomposit CQDs/ZnO setelah inkubasi pada 37 °C selama 12 jam (Skema 2). Spektrofotometri digunakan untuk mengkonfirmasi keberhasilan proses imobilisasi.
Imobilisasi antibodi monoklonal BM 19.21 pada permukaan nanokomposit CQDs/ZnO
Prinsip Umum Metode Immunoassay
Reaksi sandwich capping antibodi-antigen-antibodi diperoleh dengan menggunakan antibodi monoklonal KS 19.1 lain yang melapisi permukaan sumur mikrotiter (Skema 3). Dalam kondisi immunoassay yang optimal, konsentrasi antigen CYFRA 21-1 ditentukan sebagai fungsi dari peningkatan intensitas sinyal fluoresensi.
Skema yang diilustrasikan merepresentasikan sandwich capping immunosensing antibodi-antigen-antibodi reaksi
Prosedur Imunosensing
Koleksi spesimen serum manusia disediakan oleh sukarelawan acak. Pembekuan lengkap dipastikan sebelum sentrifugasi pada suhu kamar dan disimpan pada suhu 4 °C. Teknik spiking digunakan untuk menyiapkan sampel standar yang mengandung antigen CYFRA 21-1 dalam kisaran konsentrasi 0,01–500 ng mL
−1
. Kira-kira 50 μL sampel berduri ditempatkan dalam sumur mikrotiter dan dicampur dengan 50 μL antibodi monoklonal KS 19.1 yang baru diencerkan menggunakan saline buffer fosfat pH = 7,4 selama 30 menit dan kemudian diinkubasi tanpa menutupi pelat selama 1 jam pada suhu 37 °C. Isi sumur dikocok dengan cepat, dan sumur dibilas tiga kali menggunakan air deionisasi (300 μL) untuk setiap sumur. Kira-kira 50 μL larutan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19,21 amobil ditambahkan ke setiap sumur, dicampur dengan lembut, dan diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C. Sampel yang disiapkan menjadi sasaran analisis fluoresensi menggunakan pembaca mikrotiter untuk merekam intensitasnya.
Hasil dan Diskusi
Evaluasi Morfologi Titik Kuantum Karbon dan Nanokompositnya
Mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi permukaan dan distribusi CQD dalam sampel. Untuk menyelesaikan pemeriksaan di bawah TEM, sekitar 4 μL suspensi CQD yang disiapkan dijatuhkan pada permukaan kisi karbon TEM. Pada gambar HRTEM (Gbr. 1a), bintik hitam seragam yang diamati dengan jarak kisi (0,36 nm) menunjukkan pembentukan CQD. Grafik distribusi ukuran partikel diplot dan ukuran partikel rata-rata berkisar dari 1,5 ± 0,5 hingga 5,0 ± 0,5 nm (Gbr. 1b). Ukuran partikel yang diperoleh membuktikan bahwa CQD yang terbentuk memang merupakan nanomaterial berukuran kuantum. Selain itu, hamburan cahaya dinamis (DLS) dilakukan, dan ukuran partikel rata-rata ditemukan ~ 20 ± 0.2 nm. Perbedaan antara dua pengukuran sebelumnya diamati. Penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa HRTEM tidak menunjukkan struktur kisi kristal dari CQD yang terbentuk pada perbesaran yang lebih tinggi karena sifatnya yang amorf [43]. Demikian pula, dalam penelitian ini, prekursor alami karbon adalah Citrus lemon pericarp dan CQD turunan juga menunjukkan sifat amorf. Oleh karena itu, perbedaan pengukuran ukuran partikel dapat dikaitkan dengan aglomerasi CQD yang terbentuk, sifat amorf dari titik karbon yang terbentuk, mekanisme yang terlibat dalam setiap percobaan, dan dinamika hidrasi partikel.
a Gambar mikroskop elektron transmisi (HRTEM) resolusi tinggi dari CQD dengan diameter 5 nm dan b grafik distribusi ukuran CQD berdasarkan TEM
Nanokomposit CQDs/ZnO yang telah disiapkan diselidiki menggunakan TEM dan SEM. Pada gambar TEM (Gbr. 2a), keberadaan partikel heksagonal yang menempel pada CQD menunjukkan pembentukan nanokomposit CQD/ZnO. Dalam SEM, sampel nanokomposit dilapisi dengan emas untuk mencegah penyerapan elektron oleh sampel dan penumpukan muatan. Tegangan dipercepat yang diterapkan adalah 15 kV pada perbesaran × 30.000 (Gbr. 2b).
a dan b mewakili gambar mikroskop elektron transmisi dan pemindaian mikroskop elektron dari nanokomposit CQDs/ZnO
UV-Vis dan spektrum fluoresensi CQD dipelajari, dan spektrum yang direkam menunjukkan dua puncak signifikan pada 224 dan 280 nm yang dapat dikaitkan dengan p ~~p* dan n ~~P* transisi C=C dan C=O, masing-masing. Selain itu, spektrum fluoresensi CQD menampilkan dua sinyal maksimum λmis = 360 dan em = 453 nm (Gbr. 3a, b). Selanjutnya, spektrum UV-Vis nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari. Sebuah puncak penyerapan yang signifikan diamati pada 370 nm menampilkan pergeseran hijau biru (Gbr. 4a). Sifat photoluminescence (PL) dari nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari. Ukuran dan cacat permukaan CQD sangat mempengaruhi sifat pendaran mereka. Sebagai fungsi dari panjang gelombang eksitasi, emisi (PL) CQDs bervariasi [38]. Juga, partikel berukuran nano ZnO menunjukkan emisi terkait cacat di wilayah serapan biru ke hijau yang terlihat [41]. Oleh karena itu, ZnONP yang didekorasi dengan CQD menghasilkan nanokomposit yang sangat baik untuk emisi PL. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, spektrum PL dari CQDs/ZnO menunjukkan pergeseran biru dengan puncak yang signifikan pada 520 nm setelah panjang gelombang eksitasi 470 nm. Pergeseran yang diamati dapat dikaitkan dengan tumpang tindih antara pita energi CQD dan ZnONP. Pergeseran biru yang ditampilkan berada di tingkat emisi cacat 2.1 eV.
Spektroskopi spektroskopi CQD (a ) Spektrum UV-Vis pada 224 dan 280 nm dan (b ) spektrum fluoresensi CQD di ex = 360 dan em = 452 nm
Spektroskopi spektroskopi CQD/ZnONPs a Spektrum UV-Vis pada puncak serapan pada 370 nm dan b spektrum fotoluminesensi CQD/ZnONP di ex = 470 dan em = 520 nm
Untuk mengkonfirmasi pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO dan nanokomposit CQDs/ZnO amobil dengan antibodi monoklonal BM 19.21 non-konjugasi, studi FT-IR komparatif dilakukan. Spektrum FT-IR CQD yang direkam mengungkapkan adanya puncak berbeda yang berbeda sesuai dengan gugus fungsi tertentu, termasuk puncak vibrasi regangan pada 3462 cm
−1
dan 2932 cm
−1
masing-masing untuk gugus C-OH dan C-H. Selanjutnya, tiga pita penyerapan getaran diamati pada 1749 cm
−1
, 1375 cm
−1
, dan 1246 cm
−1
sesuai dengan keberadaan gugus fungsi C=O, C–N, dan C–O–C, masing-masing (Gbr. 5a). Puncak baru pada 436 cm
−1
sesuai dengan pita getaran regangan Zn-O diamati. Sifat pereduksi dan penstabil CQD diperoleh dari adanya gugus –OH dan COOH pada permukaannya. Gugus fungsi ini bertindak sebagai donor elektron dan memiliki afinitas yang kuat terhadap pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO. Oleh karena itu, CQD mengurangi dan menstabilkan nanokomposit yang terbentuk (Gbr. 5b). Seperti yang digambarkan pada Gambar. 5c, terlihat bahwa dua puncak baru terbentuk pada 3254 cm
−1
dan 1675 cm
−1
. Puncak ini dikaitkan dengan vibrasi regangan N–H dan C=O, masing-masing, dan mengkonfirmasi imobilisasi CQDs/ZnO-BM 19,21 melalui ikatan peptida.
Spektrum FT-IR a CQD, b nanokomposit CQDs/ZnO, dan c nanokomposit CQD/ZnO-BM 19.21 amobil
Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dari CQD hijau yang disintesis diperiksa. Spektrum CQD yang diperoleh (Gbr. 6a) menunjukkan gugus fungsi yang berbeda pada masing-masing 288 dan 286 eV untuk C=O dan COOH. Juga, dua puncak energi ikat yang signifikan diamati pada 1044.4 dan 1021.5 eV untuk Zn 2p1/2 dan Zn 2p3/2 , masing-masing (Gbr. 6b). Selain itu, spektrum XPS resolusi tinggi dari nanokomposit CQDs/ZnO mengkonfirmasi adanya puncak energi ikat yang berbeda pada 560, 385, 350, 246, dan 200 eV untuk O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p, dan Zn 3d, masing-masing (Gbr. 6c). Semua data yang disebutkan sebelumnya membuktikan keberadaan ZnO pada permukaan CQD yang membentuk nanokomposit CQDs/ZnO.
Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dari a CQD, b ZnO, dan c nanokomposit CQD/ZnO
Sebuah studi perbandingan antara pola XRD CQDs dan CQDs/ZnO nanokomposit dilakukan. Puncak lebar pada 20° (2Ɵ) untuk titik karbon terlihat pada pola XRD CQD (Gbr. 7a). Namun, puncak tajam yang berbeda dikenali pada 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78°, dan 80° (2Ɵ) untuk Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004), dan (202), masing-masing. Puncak yang diamati mencerminkan distribusi ZnO pada permukaan CQD yang membentuk nanokomposit CQD/ZnO (Gbr. 7b).
Pola difraksi sinar-X a CQD dan b nanokomposit CQD/ZnO
Spektrum Raman dari CQDs, CQDs/ZnO, dan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19,21 yang diimobilisasi dipelajari. Sinyal Raman biasanya digunakan untuk mempelajari struktur kristal dan cacatnya. Gambar 8a, menunjukkan dua pita D dan G khas pada 1300 dan 1520 cm
−1
untuk nanopartikel karbon, masing-masing. Seperti yang dilaporkan sebelumnya, D-band biasanya mewakili sp
3
cacat, dan G-band adalah fitur getaran bidang sp
2
-ikatan karbon [44]. AkuD /AkuG rasio dihitung untuk CQD yang disiapkan, dan ternyata 1,02 ± 0,03. Puncak tajam baru diamati pada 440 dan 520 cm
−1
untuk nanopartikel ZnO dan puncak khas CQD diamati pada 1364 dan 1595 cm
−1
. Rasio ID /AkuG ditemukan 1,2 ± 0,01 menunjukkan pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO (Gbr. 8b). Spektrum Raman dari nanokomposit CQD/ZnO-BM 19,21 imobilisasi menampilkan banyak puncak yang dapat dengan mudah dikenali sebagai tanda konfirmasi struktur sekunder dan tersier. Puncak yang diamati di wilayah 1007–1128 cm
−1
ditugaskan untuk mewakili struktur sekunder utama dari antibodi monoklonal. Puncak Raman pada 550–682 cm
−1
wilayah ditugaskan untuk mewakili konformasi disulfida, sedangkan 867-797 cm
−1
yang ditugaskan untuk mewakili keadaan ikatan hidrogen residu tirosin. Juga, perubahan signifikan pada puncak spektrum Raman menjadi 1630 cm
−1
dapat dikaitkan dengan adanya struktur tersier dari antibodi amobil [45] (Gbr. 8c). Rasio ID /AkuG ditingkatkan menjadi 1,4 ± 0,04 mengungkapkan struktur kristal yang lebih baik karena pembentukan nanokomposit CQD/ZnO-BM 19,21 amobil.
Pergeseran spektrum Raman a CQD, b nanokomposit CQDs/ZnO, dan c nanokomposit CQD/ZnO-BM 19.21 amobil
Optimasi Kondisi Imunosensing Fluoresensi
Pemilihan dan optimalisasi kondisi imunosensing fluoresensi yang disarankan dilakukan dengan mempelajari berbagai parameter. Umumnya, jumlah nanokomposit amobil, pH dan konsentrasi buffer yang digunakan, waktu inkubasi antara analit target dalam sampel serum, dan reagen immunosensing harus diselidiki dan dioptimalkan. Untuk memilih jumlah yang sesuai dari nanokomposit CQD/ZnO-BM 19,21 amobil, jumlah yang berbeda dalam kisaran 10–100 μL diuji. Intensitas fluoresensi maksimum diamati dengan menambahkan 50 μL nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19,21 amobil (Gbr. 9a). Empat larutan garam buffer fosfat dengan nilai pH 7,2-7,5 disiapkan dan diuji sebagai fungsi dari intensitas fluoresensi. Sedikit perubahan dalam intensitas sinyal fluoresensi diamati dengan mengubah nilai pH. Pada pH 7.2 dan 7.3, sinyal fluoresensi menurun karena ketidakstabilan kimia dari nanokomposit CQDs/ZnO yang diimobilisasi. Sinyal fluoresensi meningkat pada pH-7,4 menjadi 7,5 karena interaksi yang sangat baik antara molekul monoklonal pada permukaan nanokomposit (Gbr. 9b). Ditemukan bahwa 7,4 adalah nilai pH yang paling cocok untuk mempertahankan aktivitas antigen target yang dapat terurai dengan meningkatkan pH lebih dari 7,5. Oleh karena itu, pH 7.4 dipilih untuk studi lebih lanjut.
Optimalisasi penentuan fluoresensi antigen CYFRA 21-1 pada ex = 470 dan em =520 nm. a Pengaruh penambahan nanokomposit CQD/ZnO-BM 19.21 amobil, b pengaruh larutan garam penyangga fosfat kisaran pH 7,3–7,5, c pengaruh konsentrasi buffer menggunakan PBS pada rentang konsentrasi 0,01–0,05 mol L
−1
, dan d efek waktu reaksi imun menggunakan 10–60 min
Pengaruh konsentrasi saline buffer fosfat pada intensitas fluoresensi diperkirakan menggunakan kisaran konsentrasi 0,01–0,05 mol L
−1
. The maximum fluorescence intensity signal was obtained using the buffer concentration of 0.01 mol L
−1
. At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).
Analytical Quantification
Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL
1
. The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL
−1
with a detection limit of 0.008 ng mL
−1
. The calculated equation was found to be IB = 7.933C + 181.24 (r
2
= 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.
System Suitability
System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL
1
and lower detection limit of 0.008 ng mL
1
(Table 1).
Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System
To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL
− 1
of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K
+
, Na
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, and Zn
2+
) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL
−1
CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL
−1
coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F
0
/F
0
) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.
Analysis of Real Specimens
In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL
−1
) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.
Conclusion
The present study concerned with the preparation of green synthesis CQDs conjugated with ZnO nanocomposite using Citrus lemon as a precursor. The CQDs/ZnO nanocomposite was employed to form a new fluorescence immunosensing system by immobilizing a monoclonal BM 19.21 antibody through simple peptide bonds. The highly sensitive fluorescence system was used to determine the tumor marker of lung cancer (CYFRA 21-1) in human serum. CYFRA 21-1 antigen was determined via sandwich capping antibody-antigen-antibody reaction using another monoclonal antibody KS 19.1 coating the microtiter wells. The unique features and high sensitivity of the suggested system facilitate the determination of the target tumor marker with high stability and reproducibility. A comparative study was carried out and the outcome results confirmed the suitability and high sensitivity of the suggested immunosensing system, and the results were in agreement with a previously reported conventional technique.
Ketersediaan Data dan Materi
The only outcome data from this study was presented in the manuscript.
