Imunoassay Fluoresens Cepat dan Sensitif untuk CYFRA 21-1 Menggunakan Nanokomposit Titik Kuantum Karbon/Oksida Seng

Abstrak

Deteksi cepat kanker paru-paru di tahap awal menggunakan antigen fragmen sitokeratin-19 (CYFRA 21-1) sebagai penanda tumor dalam serum manusia memainkan peran penting dalam kelangsungan hidup pasien dan tindakan bedah yang cepat. Studi ini bertujuan untuk menggunakan nanokomposit oksida seng yang dikonjugasi titik kuantum karbon sintesis hijau sebagai solusi imunosen sensing fluoresensi yang sangat sensitif untuk penentuan cepat antigen CYFRA 21-1 dalam serum manusia. Metode yang diusulkan dilakukan dengan menerapkan metode hidrotermal untuk menyiapkan titik kuantum karbon menggunakan kulit jeruk nipis (Citrus lemon). Titik kuantum karbon yang terbentuk digunakan dalam pengurangan dan stabilisasi asetat seng untuk menyintesis nanokomposit titik kuantum karbon-oksida seng. Untuk membentuk sistem imunosen sensing imunisasi sandwich antigen-antibodi-antigen, antigen CYFRA 21-1 ditangkap dengan mengimobilkan antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi pada permukaan nanokomposit titik kuantum karbon-oksida seng dan antibodi monoklonal lain KS 19.1, yang dilapisi pada permukaan lubang mikroplates. Sistem ini memiliki fitur fluoresensi yang dapat disesuaikan yang direkam pada eksitasi dan emisi λ_ex = 470 dan λ_em = 520 nm, masing-masing. Sistem imunosen sensing fluoresensi nanokomposit yang diusulkan menunjukkan hubungan linier 0,01–100 ng mL⁻¹ dengan batas deteksi 0,008 ng mL⁻¹. Sistem imunosen sensing berbasis nanokomposit titik kuantum karbon-oksida seng yang diusulkan memberikan pendekatan yang menjanjikan untuk diagnosis cepat kanker paru-paru dengan mendeteksi CYFRA 21-1 dalam serum manusia.

Pendahuluan

Kanker paru-paru adalah jenis kanker yang paling umum dan agresif dengan tantangan besar dalam pengobatan medis. Kembali terjadi tumor dan metastase dianggap sebagai penyebab utama kematian bagi pasien kanker paru-paru [1]. Penanda tumor fragmen sitokeratin 19 (CYFRA 21-1) adalah fragmen yang ada di banyak sel epitelial normal maupun maligan [2]. Ini dapat diestimasi menggunakan imunoradiometri assay sandwich. Studi awal menjelaskan bahwa pada tahap maligan kanker paru-paru, CYFRA 21-1 dilepaskan ke dalam sirkulasi darah pasien dan meningkat dalam serum mereka [3]. Oleh karena itu, mungkin untuk meningkatkan kelangsungan hidup pasien kanker paru-paru dengan deteksi awal dan consequently tindakan bedah yang cepat [4].

Beberapa teknik sebelumnya telah dilaporkan untuk deteksi CYFRA 21-1, termasuk imunoenzim assay [5], imunoelektrokemiluminesens assay [6], dan imunoradiometri assay [7]. Strategi yang menguntungkan untuk meningkatkan dan meningkatkan sensitivitas CYFRA 21-1 dalam serum manusia masih menjadi perhatian.

Dalam beberapa tahun terakhir, kemajuan besar dan pertumbuhan meledak nanoteknologi telah dicapai dalam hampir semua bidang kehidupan [8]. Di antaranya adalah sistem pengiriman obat [9], analisis farmasi [10], reaksi aktivitas katalitik [11], aplikasi medis [12], penanda tumor kanker [13], dan citra jaringan [14].

Saat ini, teknik sensing berbasis fluoresensi (FL) telah menarik banyak peneliti karena desain yang sederhana dan sensitivitas yang luar biasa. Berbagai bahan sensori FL telah dirancang dan disintesis untuk pemantauan biologis. Sistem FL untuk penentuan biologis sangat luminesens, dapat dispersi dalam air, stabil kimiawi, dan tidak beracun [15]. Ada berbagai sonda imunosen fluoresensi berbasis untuk deteksi penanda biologis. Assay kompetitif heterogen dilakukan dengan mengimobilkan molekul tangkap pada permukaan kemudian diinkubasi dengan penanda biologis yang dikonjugasi fluorofor. Persaingan antara penanda biologis bebas dan yang dikonjugasi untuk ikatan ke molekul tangkap menurunkan intensitas fluoresensi dengan konsentrasi penanda biologis [16]. Assay sandwich heterogen didasarkan pada inkubasi molekul tangkap dan larutan yang diminati yang membentuk kompleks dengan penanda biologis. Akibatnya, intensitas fluoresensi meningkat dengan konsentrasi penanda biologis [17].

Dalam assay kompetitif homogen, dua molekul tangkap yang dikonjugasi fluorofor A yang berbeda dikonjugasi dengan penanda biologis yang dikonjugasi fluorofor B dan larutan meningkatkan fluoresensi dengan konsentrasi penanda biologis [18]. Namun, teknik-teknik tersebut menunjukkan beberapa kekurangan, termasuk waktu eksperimen yang lama, kurangnya deteksi multiplex, kompleksitas, dan kadang-kadang hasil yang palsu. Kemajuan dalam nanoteknologi memungkinkan peneliti untuk mengembangkan sonda imunosen fluoresensi baru dengan karakteristik optik unik [19]. sejak penggunaan pertama titik kuantum dalam deteksi biomolekul, mereka telah mendapat minat besar karena fitur optik mereka memberikan fleksibilitas tinggi dalam pemilihan panjang gelombang yang sesuai, label yang baik untuk deteksi multiplex, kompatibilitas biologis, dan kemampuan targeting [20].

Titik kuantum karbon (CQDs) telah menunjukkan sifat kimiawi, fisik, optik, magnetik, dan listrik yang unggul. CQDs dapat disintesis menggunakan berbagai teknik, termasuk hidrotermal, elektrokidoksiasi, ablasi laser, dan metode mikrogelombang [21,22,23,24]. Karena fitur ketoksikan rendah, peneliti ilmiah mempertimbangkan CQDs sebagai kandidat kuat dalam banyak sonda fluoresen. Selain itu, mereka memiliki kemampuan kuat untuk dimanipulasi melalui berbagai reaksi kimia yang dapat dikontrol dalam berbagai kebutuhan seperti sistem biokimia, fotokimia, biosensing, bioimaging, dan pengiriman obat [25,26,27], serta dalam deteksi imunoassay [28]. Studi awal tentang sintesis CQDs mengungkapkan beberapa kekurangan dengan menggunakan sumber karbon yang mahal, bahan kimia dan reagen yang beracun, atau menggunakan proses yang tidak selektif [29]. Untuk membatasi kekurangan ini, peneliti mulai menggunakan jus buah sebagai sumber karbon baru dan murah [30]. Karena penggunaan jus buah tidak memberikan tujuan optimal dalam pemanfaatan sumber daya, CQDs fluoresen baru-baru ini diperoleh dari kulit buah [31]. Penggunaan kulit buah memberikan jalur yang menjanjikan untuk sintesis CQD yang ramah lingkungan dan hijau.

Oksida seng (ZnO) adalah salah satu oksida logam yang paling penting, potensial aktif, stabil, dan beracun rendah yang banyak digunakan dalam perangkat laser ultraviolet, bidang medis, berbagai jenis sensor, dan fotokatalisis [32,33,34,35]. Nanopartikel oksida seng (ZnONPs) menunjukkan properti fotoluminesens di dekat spektrum UV dan Vis. Ini dapat dikaitkan dengan emisi eksiton yang didasarkan pada rekombinasi langsung pasangan elektron-lubang [36] atau karena emisi kuning-hijau pada 520 nm sebagai hasil transisi elektron dari tepi daur konduksi ke tingkat jebakan [37].

Secara umum, titik karbon adalah nanopartikel quasi-sferalik amorf atau nanokristal yang mengandung karbon sp² dan sp³, grup O/N-basis, dan grup kimia yang dimodifikasi pasca. Selain itu, CQDs memiliki kemampuan untuk dieksitasi dengan panjang gelombang yang lebih tinggi dan dapat mengubah efikasi permukaan gabungan pasangan elektron-lubang dan menangani peningkatan dalam sistem yang dianalisis, yang dapat memudahkan penentuan kuantitatif biomolekul [38]. Mereka memiliki kemampuan untuk dihiasi oleh oksida logam seperti TiO₂ dan ZnO untuk membentuk nanokomposit yang aktif optik yang dapat dimanfaatkan dalam deteksi penanda biologis dalam serum manusia. ZnO adalah bahan dengan jarak energi lebar (3,37 eV), yang dapat luminesens di wilayah UV dan biru cahaya terlihat karena kehadiran kepadatan besar tingkat cakera dalam jarak energi [39]. Pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO meningkatkan penyerapan cahaya terlihat karena hibrida ZnO dengan CQDs, dan geser biru dalam penyerapan luminesensi ke 520 nm dapat dikaitkan dengan rekombinasi radiatif O vakansi terionisasi. Selain peningkatan penyerapan cahaya terlihat, pemisahan pasangan elektron-lubang yang lebih baik dan pengurangan waktu transfer elektron antarmuka dapat dipertimbangkan untuk performa optik yang lebih tinggi dari hibrida CQDs dengan nanopartikel ZnO [40]. Selain itu, kenaikan yang signifikan dari radikal –OH*, yang dihasilkan dari nanokomposit CQDs/ZnO di antarmuka air, dapat menyebabkan elevasi yang signifikan dalam sinyal fluoresensi sistem analisis. Jadi, nanokomposit gabungan CQDs/ZnO meningkatkan modifikasi properti optoelektronik dan fotoluminesensi permukaan ZnO dan menghasilkan cakera permukaan yang kuat dengan fotoluminesensi yang dapat disesuaikan [41]. Selain itu, CQDs yang diimobilkan dengan antibodi pengenalan biologis membentuk sistem sensing FL antibodi-antigen-antibodi memberikan sonda yang berkelanjutan dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi terhadap analita target [42].

Studi yang diusulkan mengusulkan sistem sensing fluoresensi imunoassay baru yang sederhana dan ultra sensitif berbasis nanokomposit CQDs yang dihiasi dengan ZnO untuk menentukan penanda tumor CYFRA 21-1 dalam serum manusia. Kulit jeruk nipis (Citrus lemon) digunakan sebagai prekursor karbon untuk mendapatkan CQDs dalam kondisi hidrotermal. Selain itu, digunakan sebagai agen pengurang dan stabilisasi untuk sintesis nanokomposit CQDs yang dikonjugasi dengan ZnO. Nanokomposit CQDs/ZnO yang disiapkan diimobilkan oleh antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi (mAb) dan lubang mikroplates dilapisi dengan antibodi monoklonal KS 19.1 lainnya untuk membentuk sistem sensing imunosen sandwich.

Metode

Instrumen

Spektra spektrofotometri baik CQDs maupun nanokomposit CQDs/ZnO direkam menggunakan spektrofotometer Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, Inggris). Morfologi permukaan dan distribusi ukuran partikel CQDs dan nanokomposit CQDs/Zn yang dihasilkan secara hijau dievaluasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) model JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Jerman) dan mikroskop elektron pemindai (SEM) model JSM-7610F (JEOL, AS). Spektra fluoresensi dan inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dari sistem sensing imunosen yang diusulkan diperiksa menggunakan pembaca multi-mode Biotek Synergy H1 (Biotek, Tokyo, Jepang) dan spektrofotometer FT-IR Perkin Elmer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Jepang), masing-masing. Spektra Raman, spektroskopi fotoelektron X (XPS) dan pola difraksi bubuk X (XRD) diukur menggunakan mikro-Raman spektrometer (CRAIC Technologies, CA, AS), sistem spektroskopi X-ray Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd., Manchester, Inggris) dan diffractometer Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Jerman), masing-masing.

Bahan Kimia dan Reagen

Instrumen SG-2000-10090 (Barsbuttel, Jerman) digunakan untuk memperoleh air deionis yang digunakan selama semua eksperimen. Antibodi monoklonal (mAb) non-konjugasi CYFRA 21-1 BM 19.21 dan KS 19.1 untuk membentuk sistem sensing imunosen sandwich diperoleh dari Abcam (Cambridge, Inggris). Buah Citrus lemon disediakan oleh pasar lokal. Larutan penyangga fosfat (PBS) pH = 7,4 disiapkan menggunakan klorida natrium, klorida kalium, hidroksida natrium, fosfat kalium monobasik, dan fosfat natrium dibasik (BHD Ltd. Co. Poole, Inggris). Randox Laboratories (Irlanda Utara-Inggris) dengan baik menyediakan serum normal komersial. Sampel darah acak dikumpulkan dari sukarelawan sehat, dan sebelum memulai studi ini, persetujuan tertulis telah diperoleh. Selain itu, Sigma-Aldrich (Hamburg, Jerman) menyediakan kelas murni baik hidroklorida karbodiimida (EDC) dan N-hidroksisuksinimida (NHS). Komite etika penelitian di King Saud University, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) menyetujui studi ini.

Persiapan Hijau Hidrotermal Titik Kuantum Karbon (CQDs)

Kulit jeruk nipis (Citrus lemon) digunakan untuk menyintesis CQDs dalam kondisi hidrotermal. Sekitar 20 g kulit jeruk nipis dan 200 mL air deionis dipindahkan ke dalam kolong bulat dan direfluks pada 100 °C di bawah pengadukan magnet yang berkelanjutan selama 6 jam. Setelah pendingin ke suhu ruangan, ekstrak yang dihasilkan difugasi pada 3500 rpm dan 20 mL larutan ekstrak atas diotoklaves dan dipanaskan dalam kondisi hidrotermal dalam rentang suhu 100 hingga 200 °C untuk interval yang berbeda 6–120 jam. Setelah pendingin ke suhu ruangan, liquur atas mewakili CQDs (Skema 1).

Sintesis hijau CQDs menggunakan kulit jeruk nipis (Citrus lemon) untuk larutan CQD fluoresen dan bola karbon

Persiapan Nanokomposit Titik Kuantum Karbon-Oksida Seng

Untuk menyiapkan nanokomposit CQDs/ZnO, reaksi reduksi kimia sederhana dilakukan menggunakan CQDs sebagai agen pengurang dan stabilisasi. Nanokomposit CQDs/ZnO diperoleh dengan menambahkan 20 mL CQDs ke 50 mL asetat seng 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ pada 60 °C di bawah pengadukan berkelanjutan selama 10 menit. Ketika warna campuran berubah dari kekuningan menjadi krim, campuran ditinggalkan selama 30 menit untuk menyelesaikan proses pengurangan dan disimpan pada 4 °C. Untuk memastikan stabilitas dan memeriksa agregasi nanokomposit CQDs/ZnO yang disiapkan, spektrometri UV-Vis digunakan untuk merekam absorbansi selama 20 hari pada 390 nm. Hasil yang diperoleh menunjukkan stabilitas tinggi dan tidak ada perubahan signifikan dalam absorbansi nanokomposit CQDs/ZnO.

Karakterisasi Nanokomposit Titik Kuantum Karbon-Oksida Seng

Untuk memastikan pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO, berbagai teknik mikroskopi dan spektroskopi digunakan. Keseragaman dan morfologi permukaan CQDs dan nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari menggunakan mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HRTEM) dan SEM. Spektra optik dipelajari menggunakan UV-Vis, FT-IR, XPS, dan spektroskopi Raman. Struktur kristal CQDs yang baru disiapkan dievaluasi menggunakan pola XRD.

Proses Imobilisasi

Antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi diimobilkan pada permukaan nanokomposit CQDs/ZnO yang disintesis melalui ikat peptida amida sederhana antara amina dan grup karboksil aktif. Proses imobilisasi dilakukan dengan menambahkan 5,0 mL NHS dan EDC masing-masing 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ setara molar ke 5,0 mL larutan nanokomposit CQDs/ZnO di bawah pengadukan berkelanjutan selama 1 jam. Sekitar 5 mg antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi dilarutkan dalam 1,0 mL larutan penyangga fosfat 0,01 mol L⁻¹ (pH = 7,4) dan ditambahkan ke larutan sensing di atas. Antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi diimobilkan pada permukaan larutan nanokomposit CQDs/ZnO setelah inkubasi pada 37 °C selama 12 jam (Skema 2). Spektrofotometri digunakan untuk mengonfirmasi keberhasilan proses imobilisasi.

Imobilisasi antibodi monoklonal BM 19.21 pada permukaan nanokomposit CQDs/ZnO

Prinsip Umum Metode Imunoassay

Reaksi imunisasi sandwich antibodi-antigen-antibodi diperoleh menggunakan antibodi monoklonal KS 19.1 lainnya yang melapisi permukaan lubang mikroplates (Skema 3). Dalam kondisi imunoassay optimal, konsentrasi antigen CYFRA 21-1 ditentukan sebagai fungsi dari peningkatan intensitas sinyal fluoresensi.

Skema yang diilustrasikan mewakili reaksi sensing imunosen sandwich antibodi-antigen-antibodi

Prosedur Sensing Imunosen

Koleksi spesimen serum manusia disediakan oleh sukarelawan acak. Pembekuan lengkap dipastikan sebelum sentrifugasi pada suhu ruangan dan disimpan pada 4 °C. Teknik spiking digunakan untuk menyiapkan sampel standar yang mengandung antigen CYFRA 21-1 dalam rentang konsentrasi 0,01–500 ng mL⁻¹. Sekitar 50 μL sampel yang di-spike dispensed dalam lubang mikroplates dan dicampur dengan 50 μL antibodi monoklonal KS 19.1 yang baru dicairkan menggunakan penyangga fosfat pH = 7,4 selama 30 menit dan kemudian diinkubasi tanpa menutup plate selama 1 jam pada 37 °C. Isi lubang digosok dengan cepat, dan lubang dicuci tiga kali menggunakan air deionis (300 μL) untuk setiap lubang. Sekitar 50 μL larutan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan ditambahkan ke setiap lubang, dicampur dengan lembut, dan diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C. Sampel yang disiapkan dianalisis menggunakan pembaca mikroplates untuk merekam intensitas.

Hasil dan Pembahasan

Evaluasi Morfologi Titik Kuantum Karbon dan Nanokompositnya

Mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi permukaan dan distribusi CQDs dalam sampel. Untuk melakukan pemeriksaan di bawah TEM, sekitar 4 μL larutan CQDs yang disiapkan ditetapkan pada permukaan grid karbon TEM. Dalam gambar HRTEM (Gambar 1a), titik hitam seragam yang teramati dengan spasi latis (0,36 nm) menunjukkan pembentukan CQDs. Grafik distribusi ukuran partikel dibuat dan ukuran partikel rata-rata berkisar dari 1,5 ± 0,5 hingga 5,0 ± 0,5 nm (Gambar 1b). Ukuran partikel yang diperoleh membuktikan bahwa CQD yang terbentuk memang nanomaterial berukuran kuantum. Selain itu, pencaran cahaya dinamis (DLS) dilakukan, dan ukuran partikel rata-rata ditemukan sekitar 20 ± 0,2 nm. Perbedaan antara dua pengukuran sebelumnya teramati. Studi sebelumnya mengungkapkan bahwa HRTEM tidak menunjukkan struktur latis kristal dari CQD yang terbentuk pada pengesaran tinggi karena sifat amorfnya [43]. Serupa dalam studi ini, prekursor karbon alami adalah kulit jeruk nipis (Citrus lemon) dan CQD yang dihasilkan juga menunjukkan sifat amorf. Oleh karena itu, perbedaan dalam pengukuran ukuran partikel dapat dikaitkan dengan agregasi CQD yang terbentuk, sifat amorf dari titik karbon yang terbentuk, mekanisme yang terlibat dalam setiap eksperimen, dan dinamika hidrasi partikel.

a Gambar mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HRTEM) CQD dengan diameter 5 nm dan b grafik distribusi ukuran CQD berdasarkan TEM

Nanokomposit CQDs/ZnO yang disiapkan diselidiki menggunakan TEM dan SEM. Dalam gambar TEM (Gambar 2a), kehadiran partikel hexagonal yang menempel pada CQD menunjukkan pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO. Dalam SEM, sampel nanokomposit dilapisi emas untuk mencegah penyerapan elektron oleh sampel dan penumpukan muatan. Tegangan percepatan yang digunakan adalah 15 kV pada pengesaran × 30.000 (Gambar 2b).

a dan b mewakili gambar mikroskop elektron transmisi dan mikroskop elektron pemindai nanokomposit CQDs/ZnO

Spektra UV-Vis dan fluoresensi CQDs dipelajari, dan spektral yang direkam menunjukkan dua puncak signifikan pada 224 dan 280 nm yang dapat dikaitkan dengan transisi p~p* dan n~P* dari C=C dan C=O, masing-masing. Selain itu, spektrum fluoresensi CQD menampilkan dua sinyal pada λ_ex = 360 dan λ_em = 453 nm (Gambar 3a, b). Selanjutnya, spektrum UV-Vis nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari. Puncak penyerapan signifikan teramati pada 370 nm yang menunjukkan geser biru hijau (Gambar 4a). Properti fotoluminesensi (PL) nanokomposit CQDs/ZnO dipelajari. Ukuran dan cakera permukaan CQD sangat mempengaruhi properti luminesensinya. Sebagai fungsi panjang gelombang eksitasi, emisi PL CQD bervariasi [38]. Selain itu, partikel nanos Ukuran ZnO menunjukkan emisi terkait cakera di wilayah biru ke hijau absorpsi terlihat [41]. Oleh karena itu, ZnONP yang dihiasi dengan CQD menghasilkan nanokomposit yang sangat baik untuk emisi PL. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4b, spektrum PL CQDs/ZnO menunjukkan geser biru dengan puncak signifikan pada 520 nm setelah panjang gelombang eksitasi 470 nm. Geser yang teramati dapat dikaitkan dengan tumpang tindih antara daur energi CQD dan ZnONP. Geser biru yang ditampilkan berada pada tingkat emisi cakera 2,1 eV.

Spektral spektroskopi CQD (a) spektrum UV-Vis pada 224 dan 280 nm dan (b) spektrum fluoresensi CQD pada λ_ex = 360 dan λ_em = 452 nm

Spektral spektroskopi CQDs/ZnONP a spektrum UV-Vis pada puncak penyerapan pada 370 nm dan b spektrum fotoluminesensi CQDs/ZnONP pada λ_ex = 470 dan λ_em = 520 nm

Untuk mengonfirmasi pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO dan nanokomposit CQDs/ZnO yang diimobilkan dengan antibodi monoklonal BM 19.21 yang tidak dikonjugasi, studi komparatif FT-IR dilakukan. Spektrum FTIR yang direkam CQD menunjukkan kehadiran puncak-puncak yang berbeda yang sesuai dengan grup fungsi tertentu, termasuk puncak gerangan gerangan pada 3462 cm⁻¹ dan 2932 cm⁻¹ untuk grup C–OH dan C–H, masing-masing. Selain itu, tiga pita absorpsi gerangan teramati pada 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹, dan 1246 cm⁻¹ yang sesuai dengan kehadiran grup fungsi C=O, C–N, dan C–O–C, masing-masing (Gambar 5a). Puncak baru pada 436 cm⁻¹ yang sesuai dengan pita gerangan gerangan Zn–O teramati. Properti pengurang dan stabilisasi CQD diperoleh dari kehadiran grup –OH dan COOH pada permukaannya. Grup fungsi ini bertindak sebagai donor elektron dan memiliki afinitas yang kuat terhadap pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO. Oleh karena itu, CQD mengurangi dan stabilisasi nanokomposit yang terbentuk (Gambar 5b). Seperti digambarkan dalam Gambar 5c, diperhatikan bahwa dua puncak baru terbentuk pada 3254 cm⁻¹ dan 1675 cm⁻¹. Puncak-puncak ini dikaitkan dengan gerangan gerangan N–H dan C=O, masing-masing, dan mengonfirmasi imobilisasi CQDs/ZnO-BM 19.21 melalui ikat peptida.

Spektra FT-IR a CQD, b nanokomposit CQDs/ZnO, dan c nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan

Spektra spektroskopi fotoelektron X (XPS) CQD yang dihasilkan secara hijau diperiksa. Spektrum CQD yang diperoleh (Gambar 6a) menunjukkan berbagai grup fungsi pada 288 dan 286 eV untuk C=O dan COOH, masing-masing. Selain itu, dua puncak energi ikatan signifikan teramati pada 1044,4 dan 1021,5 eV untuk Zn 2p_1/2 dan Zn 2p_3/2, masing-masing (Gambar 6b). Selain itu, spektrum XPS resolusi tinggi nanokomposit CQDs/ZnO mengonfirmasi kehadiran berbagai puncak energi ikatan pada 560, 385, 350, 246, dan 200 eV untuk O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p, dan Zn 3d, masing-masing (Gambar 6c). Semua data yang disebutkan sebelumnya membuktikan kehadiran ZnO pada permukaan CQD yang membentuk nanokomposit CQDs/ZnO.

Spektra spektroskopi fotoelektron X (XPS) a CQD, b ZnO, dan c nanokomposit CQDs/ZnO

Studi komparatif antara pola XRD CQD dan nanokomposit CQDs/ZnO dilakukan. Puncak lebar pada 20° (2θ) untuk titik karbon diperhatikan dalam pola XRD CQD (Gambar 7a). Namun, puncak tajam yang berbeda dikenali pada 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78°, dan 80° (2θ) untuk Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004), dan (202), masing-masing. Puncak yang teramati mencerminkan distribusi ZnO pada permukaan CQD yang membentuk nanokomposit CQDs/ZnO (Gambar 7b).

Pola difraksi X-ray a CQD dan b nanokomposit CQDs/ZnO

Spektra Raman CQD yang disiapkan, CQDs/ZnO, dan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan dipelajari. Sinyal Raman biasanya digunakan untuk mempelajari struktur kristal dan cakaranya. Gambar 8a menunjukkan dua pita D dan G tipikal pada 1300 dan 1520 cm⁻¹ untuk nanopartikel karbon, masing-masing. Seperti telah dilaporkan sebelumnya, pita D biasanya mewakili cakera sp³, dan pita G adalah ciri getaran bidang karbon sp²-terikat [44]. Rasio I_D/I_G dihitung untuk CQD yang disiapkan, dan ditemukan sebesar 1,02 ± 0,03. Puncak tajam baru teramati pada 440 dan 520 cm⁻¹ untuk nanopartikel ZnO dan puncak tipikal CQD teramati pada 1364 dan 1595 cm⁻¹. Rasio I_D/I_G ditemukan sebesar 1,2 ± 0,01 yang menunjukkan pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO (Gambar 8b). Spektrum Raman nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan menampilkan banyak puncak yang dapat dengan mudah dikenali sebagai tanda konfirmasi struktur sekunder dan tersier. Puncak yang teramati pada wilayah 1007–1128 cm⁻¹ dikaitkan untuk mewakili struktur sekunder utama antibodi monoklonal. Puncak Raman pada wilayah 550–682 cm⁻¹ dikaitkan untuk mewakili konformasi disulfida, sedangkan puncak 867–797 cm⁻¹ dikaitkan untuk mewakili keadaan ikatan hidrogen sisa tirosin. Selain itu, geser signifikan puncak spektrum Raman ke 1630 cm⁻¹ dapat dikaitkan dengan kehadiran struktur tersier antibodi yang diimobilkan [45] (Gambar 8c). Rasio I_D/I_G meningkat menjadi 1,4 ± 0,04 yang menunjukkan struktur kristal yang lebih baik karena pembentukan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan.

Pergeseran spektrum Raman a CQD, b nanokomposit CQDs/ZnO, dan c nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan

Optimisasi Kondisi Sensing Imunosen Fluoresensi

Pemilihan dan optimisasi kondisi sensing imunosen fluoresensi yang diusulkan dilakukan dengan mempelajari berbagai parameter. Secara umum, jumlah nanokomposit yang diimobilkan, pH dan konsentrasi penyangga yang digunakan, waktu inkubasi antara analita target dalam sampel serum, dan reagen sensing imunosen harus diselidiki dan dioptimasi. Untuk memilih jumlah nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan yang sesuai, berbagai jumlah dalam rentang 10–100 μL diuji. Intensitas fluoresensi maksimum teramati dengan menambahkan 50 μL nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan (Gambar 9a). Empat larutan penyangga fosfat pH 7,2–7,5 disiapkan dan diuji sebagai fungsi intensitas fluoresensi. Perubahan ringan dalam intensitas sinyal fluoresensi teramati dengan mengubah nilai pH. Pada pH 7,2 dan 7,3, sinyal fluoresensi menurun karena ketidakstabilan kimiawi nanokomposit CQDs/ZnO yang diimobilkan. Sinyal fluoresensi meningkat pada pH 7,4 hingga 7,5 karena interaksi yang baik antara molekul monoklonal pada permukaan nanokomposit (Gambar 9b). Terjumpa bahwa 7,4 adalah nilai pH paling cocok untuk mempertahankan aktivitas antigen target yang mungkin terdekomposisi dengan meningkatkan pH di atas 7,5. Oleh karena itu, pH 7,4 dipilih untuk studi lebih lanjut.

Optimisasi penentuan fluoresensi antigen CYFRA 21-1 pada λ_ex = 470 dan λ_em = 520 nm. a Efek penambahan nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan, b efek penyangga fosfat rentang pH 7,3–7,5, c efek konsentrasi penyangga menggunakan PBS dalam rentang konsentrasi 0,01–0,05 mol L⁻¹, dan d efek waktu imunoreaksi menggunakan 10–60 menit

Pengaruh konsentrasi penyangga fosfat terhadap intensitas fluoresensi diestimasi menggunakan rentang konsentrasi 0,01–0,05 mol L⁻¹. Sinyal intensitas fluoresensi maksimum diperoleh menggunakan konsentrasi penyangga 0,01 mol L⁻¹. Pada konsentrasi penyangga yang lebih tinggi, nanokomposit CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan teragregasi, dan ketidakstabilan solusi sensing imunosen dapat menyebabkan penurunan intensitas fluoresensi (Gambar 9c). Untuk menghitung waktu imunoreaksi, prosedur analitik diulang menggunakan waktu reaksi yang bervariasi dari 10 hingga 60 menit. Sinyal intensitas fluoresensi maksimum teramati dengan mempertahankan reaksi antara antigen yang diuji dan solusi sensing imunosen selama setidaknya 30 menit (Gambar 9d).

Kuantifikasi Analitik

Dalam kondisi optimal, metode imunoassay yang diusulkan dilakukan menggunakan 12 sampel serum yang mengandung antigen CYFRA 21-1 dalam rentang konsentrasi 0,01–500 ng mL¹. Hasil yang diperoleh diplot untuk membentuk grafik kalibrasi yang linier pada rentang konsentrasi 0,01–100 ng mL⁻¹ dengan batas deteksi 0,008 ng mL⁻¹. Persamaan yang dihitung ditemukan adalah I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Setelah enam pengulangan, persentase deviasi standar relatif (%RSD) adalah 1,3%. Hasil yang dapat diterima menunjukkan sensitivitas tinggi dari metode imunosen fluoresensi untuk kuantifikasi antigen CYFRA 21-1 dalam sampel serum.

Kesesuaian Sistem

Kesesuaian sistem diselidiki dengan melakukan studi komparatif antara metode sensing imunosen CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan yang diusulkan dan metode yang telah diuraikan sebelumnya. Sistem fluoresensi yang diusulkan memberikan keuntungan signifikan seperti kesederhanaan, ramah lingkungan, dan mudah untuk mendeteksi analita target dalam sampel serum. Hasil yang direkam mengungkapkan sensitivitas tinggi dengan rentang deteksi linier yang luas 0,01–100 ng mL¹ dan batas deteksi lebih rendah 0,008 ng mL¹ (Tabel 1).

Akurasi, Presisi, dan Selektivitas Sistem Sensing Imunosen yang Diimobilkan

Untuk memastikan akurasi sistem sensing imunosen fluoresensi CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan yang diusulkan untuk penentuan antigen CYFRA 21-1 dalam sampel serum, 12 sampel serum diuji. Hasil data dibandingkan dengan teknik yang telah dilaporkan sebelumnya [6], yang didasarkan pada assay elektrokimiluminesens menggunakan kompleks tris 2,2′-bipyridil ruthenium (II) untuk dieksitasi oleh tripropilamina. Hasil yang dapat diterima diperoleh seperti yang ditunjukkan dalam Tabel 2. Uji intra-hari dan inter-hari digunakan untuk menyelidiki presisi metode yang diusulkan. Uji dilakukan menggunakan sampel serum yang mengandung 10 ng mL^{− 1} antigen CYFRA 21-1. Deviasi standar relatif rata-rata adalah 1,1% dan 1,3% untuk uji intra-hari dan inter-hari, masing-masing, yang mengungkapkan presisi tinggi. Selain itu, selektivitas metode yang diusulkan terhadap penentuan antigen CYFRA 21-1 dievaluasi menggunakan beberapa spesies yang mungkin mengganggu seperti asam amino (sistein, lisin, serin, tirosin, dan glisin), beberapa kation (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, dan Zn²⁺) dan beberapa penanda biologis lainnya seperti CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, dan CA 125. Uji dilakukan dalam kondisi optimal menggunakan serum manusia yang mengandung 10 ng mL⁻¹ antigen CYFRA 21-1 dalam kehadiran 10 ng mL⁻¹ spesies yang coexist. Hasil data dihitung sebagai persentase kesalahan relatif (Er%) dan hasil yang sesuai tidak melebihi ± 5% untuk setiap spesies yang mengganggu (Tabel 3). Nilai toleransi yang dihitung (F-F⁰/F⁰) ditemukan berada dalam batas toleransi (< 5%). Oleh karena itu, sistem sensing imunosen fluoresensi CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan yang diusulkan menunjukkan selektivitas tinggi terhadap penentuan antigen CYFRA 21-1 dalam serum manusia.

Analisis Spesimen Nyata

Dalam spesimen manusia nyata, sistem sensing imunosen fluoresensi berbasis larutan CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan yang diusulkan dieksploitasi untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi persentase (%) pemulihan penanda tumor antigen CYFRA 21-1. Seperti telah disebutkan sebelumnya dalam prosedur sensing imunosen, sistem yang diusulkan digunakan untuk menentukan antigen CYFRA 21-1 dengan menemukan hubungan antara intensitas fluoresensi dan konsentrasi antigen CYFRA 21-1 dalam sampel serum. Jumlah tertentu antigen target (0,5, 1,0, dan 2,0 ng mL⁻¹) ditambahkan ke sampel yang diperkirakan, dan peningkatan intensitas sinyal dievaluasi. Setelah enam penentuan, deviasi standar relatif persentase (%RSD) dihitung. Hasil pemulihan persentase yang diperoleh ditemukan bervariasi dari 96,7 ± 0,7 hingga 100,0 ± 1,3%. %RSD yang dihitung berada dalam rentang 0,2–1,4%. Sampel serum yang diuji dianalisis menggunakan metode yang telah dilaporkan sebelumnya [6] dan pemulihan persentase ditemukan bervariasi dari 96,1 ± 1,6 hingga 100,0 ± 0,4% dengan %RSD 0,3–1,7%. Untuk memastikan kesesuaian teknik sensing imunosen fluoresensi yang diusulkan menggunakan larutan CQDs/ZnO-BM 19.21 yang diimobilkan, studi statistik komparatif menggunakan uji Student’s t dan uji F [46] dilakukan antara hasil saat ini dan yang diperoleh oleh orang lain dari metode yang sebelumnya dilakukan (Tabel 4). Nilai uji t dan uji F yang diperoleh ditemukan bervariasi dari 0,354 hingga 2,181 (2,228)* dan 1,16 hingga 4,0 (5,05)* dengan betreffing nilai tabel P = 0,05, masing-masing. Hasil ini mengungkapkan kesepakatan yang baik antara metode yang diusulkan dan prosedur konvensional yang telah diterbitkan sebelumnya. Selain itu, semua jumlah terdeteksi antigen CYFRA 21-1 dalam sampel serum berada dalam batas normal yang menunjukkan tidak ada kanker paru-paru yang didiagnosis dalam sampel serum yang diselidiki.