Potensi Toksisitas Hati, Otak, dan Embrio Nanopartikel Titanium Dioksida pada Mencit
Abstrak
Titanium dioksida skala nano (nano-TiO2 ) telah banyak digunakan dalam industri dan obat-obatan. Namun, keamanan nano-TiO2 paparan masih belum jelas. Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi toksisitas hati, otak, dan embrio serta mekanisme yang mendasari nano-TiO2 menggunakan model tikus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa titanium terdistribusi dan terakumulasi di jantung, otak, limpa, paru-paru, dan ginjal mencit setelah intraperitoneal (i.p.) nano-TiO2 paparan, dengan cara yang bergantung pada dosis. Rasio berat organ/tubuh jantung, limpa, dan ginjal meningkat secara signifikan, dan rasio otak dan paru-paru menurun. Nano-TiO dosis tinggi2 secara signifikan merusak fungsi hati dan ginjal dan metabolisme glukosa dan lipid, seperti yang ditunjukkan dalam tes biokimia darah. Nano-TiO2 menyebabkan kerusakan pada mitokondria dan apoptosis hepatosit, generasi spesies oksigen reaktif, dan gangguan ekspresi gen pelindung di hati tikus. Kami menemukan sel saraf yang pecah dan retak serta infiltrasi sel inflamasi di otak. Kami juga menemukan bahwa aktivitas constitutive nitric oxide synthase (cNOS), inducible NOS (iNOS), dan acetylcholinesterase, dan kadar nitrous oxide dan asam glutamat berubah di otak setelah nano-TiO2 paparan. Model embrio tikus ex vivo menunjukkan toksisitas perkembangan dan genetik setelah dosis tinggi nano-TiO2 . Ukuran nano-TiO2 partikel dapat mempengaruhi toksisitas, partikel yang lebih besar menghasilkan toksisitas yang lebih tinggi. Singkatnya, nano-TiO2 menunjukkan toksisitas pada banyak organ pada tikus setelah terpapar melalui i.p. injeksi dan gavage. Studi kami dapat memberikan data untuk penilaian risiko nano-TiO2 paparan pada kesehatan manusia.
Latar Belakang
Titanium dioksida skala nano (nano-TiO2 ) banyak digunakan dalam industri makanan. Ini telah digunakan untuk produksi permen berlapis, buah-buahan yang diawetkan, permen karet, minuman berkarbonasi, minuman bubuk (dalam bentuk sediaan tanpa pemanis atau terkonsentrasi), susu dan produk susu, dan kategori makanan lainnya [1, 2]. Konsentrasi nano-TiO2 dalam makanan mencapai setinggi 0,5–9 g/kg [1, 3], dan banyak produk makanan yang diklaim bebas nano-TiO2 mengandung nano-TiO2 [2]. Nano-TiO2 juga telah banyak digunakan dalam biomedis, pengobatan polutan organik, teknik material, dan kosmetik [4,5,6]. Namun, keamanan nano-TiO2 paparan masih belum jelas.
Penelitian telah menunjukkan bahwa nano-TiO2 dapat menjadi kaya dan beracun di berbagai organ setelah masuk ke dalam tubuh melalui beberapa metode, seperti pemberian melalui rongga perut atau inhalasi [7, 8]. Nano-TiO2 mungkin menjadi racun bagi beberapa jenis sel, seperti sel limfoblastoid manusia dan sel hepatoma [9, 10]. Ini dapat menginduksi reaksi stres akut pada sel glial otak tikus, yang menyebabkan kerusakan dan disfungsi neuron [11]. Tingkat kelangsungan hidup garis sel neuron yang terpapar nano-TiO2 partikel berkurang secara signifikan dengan cara yang bergantung pada waktu dan dosis [12].
Studi telah mengungkapkan beberapa mekanisme dimana nanopartikel ini menyebabkan toksisitas. Nano-TiO2 partikel dapat menyebabkan toksisitas genetik melalui perubahan struktur kompleks molekul dan permeabilitas membran sel [13,14,15]. Nano-TiO2 dapat menghasilkan stres oksidatif. Selama stres oksidatif, spesies oksigen reaktif (ROS), seperti radikal hidroksil, dihasilkan dan menyebabkan oksidasi DNA, menghasilkan 8-OHG, yang menyebabkan kesalahan dan mutasi pada replikasi DNA [16, 17]. Selain itu, ROS dapat menginduksi peradangan dan interaksi timbal balik antara stres oksidatif dan peradangan, yang mengakibatkan kerusakan DNA dan apoptosis sel [18, 19]. Namun, data sistematis yang komprehensif tentang toksisitas nano-TiO2 tetap terbatas. Tujuan kami adalah untuk mengungkapkan efek dan mekanisme yang mendasari nano-TiO2 paparan pada kesehatan manusia.
Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek dan mekanisme yang mendasari nano-TiO2 paparan menggunakan model tikus. Temuan kami menunjukkan bahwa nano-TiO2 dapat diperkaya dan menyebabkan toksisitas pada beberapa organ seperti hati, ginjal, limpa, jantung, paru-paru, dan otak melalui menghasilkan ketidakseimbangan oksidasi-reduksi dan gangguan ekspresi gen. Ini juga dapat menyebabkan kerusakan pada perkembangan embrio. Studi kami dapat memberikan data untuk menilai potensi risiko nano-TiO pada kesehatan manusia2 paparan.
Metode
Bahan Kimia dan Reagen
TiO skala mikro2 (mikro-TiO2 ) dan 5 nm TiO2 dalam bentuk anatase dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, China), dan 10, 60, dan 90 nm TiO2 (anatase) dibeli dari Run He Ltd. (Shanghai, Cina). Formaldehida, asam nitrat, hidrogen peroksida, dan natrium heparin adalah kelas reagen dan dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina). Buffer fosfat (PBS), penisilin, dan streptomisin dibeli dari Gibco (San Diego, USA). Kit ekstraksi RNA total dibeli dari Takara (Dalian, Cina). Kit uji spesies oksigen reaktif dibeli dari Jianchen Ltd. (Nanjing, Cina). Stok TiO2 suspensi (1%) dalam larutan Hank disterilkan pada 121°C selama 30 menit. Suspensi disonikasi dan diencerkan ke konsentrasi yang diinginkan sesaat sebelum digunakan.
Hewan dan Model
Untuk studi toksisitas hati dan otak, tikus ICR (wilayah kontrol pencetakan) (22 ± 3 g, setengah jantan dan setengah betina) dibeli dari pusat hewan China Medical University. Semua prosedur eksperimental yang melibatkan hewan telah disetujui sebelumnya oleh Komite Etika Institusional Universitas Sains dan Teknologi Tianjin dan dilakukan sesuai dengan pedoman internasional untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium. Untuk studi toksisitas embrio tikus, tikus ICR (45 betina, 20–35 g; 15 jantan, 35–40 g) dibeli dari Beijing Weitong Lihua Ltd. (Beijing, China). Semua tikus sehat dan matang secara seksual. Lima hari sebelum perlakuan, mencit dipelihara dalam kandang terpisah di rumah dengan ventilasi yang baik, siklus terang/gelap 12 jam, 20 ± 2 °C, kelembapan relatif 60 ± 10%, dan akses ad libitum ke makanan dan air.
Regimen dosis 1 dirancang untuk tes toksisitas umum dan toksisitas otak. Tikus secara acak dibagi menjadi enam kelompok dan kelompok kontrol tambahan, dengan 10 ekor tikus/kelompok. TiO skala nano2 (nano-TiO2 ) suspensi disuntikkan (intraperitoneal (ip), 5, 10, 50, 100, 150, dan 200 mg/kg) sekali sehari selama 14 hari. Larutan saline disuntikkan ke tikus dari kelompok kontrol. Tikus diamati setiap hari, dan tidak ada hewan yang mati selama penelitian. Pada hari ke-15, sampel darah diambil dari sinus orbitalis. Semua mencit ditimbang secara individual, dibius dengan Fenobarbital 2% (60 ml/kg, ip), dan kemudian dikorbankan melalui dislokasi serviks. Semua sampel jaringan dikumpulkan (jaringan otak diisolasi dari korteks dan hipokampus) dan disimpan pada suhu -80 °C. Setiap jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dipotong menjadi dua bagian. Satu porsi direndam dalam larutan formalin (10%) pada suhu 4°C untuk pemeriksaan patologis. Bagian lainnya disimpan pada 20 °C untuk penentuan kandungan titanium.
Regimen dosis 2 dirancang untuk uji toksisitas hati. Mencit dibagi menjadi tiga kelompok eksperimen dan satu kelompok kontrol. Nano-TiO2 (5, 10, 50 mg/kg) diberikan sekali sehari melalui gavage selama 60 hari. Tikus dalam kelompok kontrol menerima 0,5% CMC (karboksimetil selulosa). Tikus diamati setiap hari, dan tidak ada hewan yang mati selama penelitian. Pada hari ke-60, mencit dibius dengan Fenobarbital 2% (60 ml/kg, ip), kemudian dikorbankan melalui dislokasi serviks, diambil hati langsungnya dan diproses untuk pemeriksaan menggunakan mikroskop elektron, penentuan ROS dan oksidasi lipid. , dan analisis ekspresi gen.
Penentuan Kandungan Titanium di Jaringan Target
Sepotong 0,1-0,5 g sampel jaringan beku dipotong dan dicairkan pada suhu kamar, dan kemudian dicerna dalam HNO3 (0,5 mL) dan H2 O2 (0,5 mL) pada 160 °C. Setelah diencerkan menjadi 3 mL dengan asam nitrat 3%, konsentrasi titanium dalam larutan ditentukan menggunakan spektrometri massa plasma berpasangan induktif (ICP-MS). Kandungan titanium dalam jaringan target kemudian dihitung.
Tes Biokimia Darah dan Perhitungan Rasio Organ/Berat Badan
Tingkat enzim dalam sampel serum dianalisis dengan penganalisis biokimia otomatis (TBA-2000FR, Toshiba, Tokyo, Jepang). Enzim ini merupakan biomarker yang berhubungan dengan fungsi hati dan ginjal.
Rasio berat organ/tubuh dihitung berdasarkan berat organ dan tubuh. Berat badan diukur sebelum anestesi dan pengorbanan. Organ ditimbang setelah diisolasi dari tikus yang dibius dan dikorbankan.
Pemeriksaan Patologis dan Mikroskop Elektron Transmisi
Pemeriksaan patologi jaringan hati atau otak yang direndam formalin dilakukan di bawah mikroskop cahaya setelah dilakukan pewarnaan hematoxylin. Untuk mikroskop elektron transmisi (TEM), jaringan hati tertanam dalam resin epoksi EPON 812 dan dipotong menjadi beberapa bagian setipis <500 μM setelah fiksasi glutaraldehid dan asam osmik. Bagian diwarnai dengan larutan uranium asam asetat jenuh (pH 3,5) dan timbal sitrat (pH 12) selama 1-2 jam. Bagian yang diwarnai diperiksa menggunakan TEM.
Penentuan Tingkat Spesies Oksigen Reaktif, Aktivitas Enzim Metaboliknya, dan Tingkat Neurotransmitter
Untuk jaringan hati, anion superoksida (O2
–
) tingkat ditentukan menggunakan XTT. Aktivitas katalase (CAT) ditentukan menggunakan nilai OD pada 240 nm, mengikuti prosedur yang dipublikasikan [20]. Tingkat peroksidasi lipid ditentukan oleh kandungan malondialdehid (MDA) mengikuti prosedur yang diterbitkan [21].
Jaringan otak dihomogenisasi dengan larutan polivinilpolipirolidon 1% yang telah didinginkan sebelumnya (50 mM pada pH 7,6 PBS) setelah isolasi. Supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi pada 15.000 rpm selama 20 menit (Eppendorf 5418, Hamburg, Jerman) dan digunakan untuk analisis selanjutnya dari aktivitas enzim superoksida (SOD), CAT, askorbat peroksidase (APX), dan glutathione peroksidase (GSHPx). Aktivitas SOD ditentukan dengan menggunakan NBT (uji nitro-tetrazolium klorida biru). Aktivitas katalase ditentukan menggunakan kit (kit assay CAT, A007-2, Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng, Nanjing, Cina). Aktivitas APX diukur menggunakan kit (APX assay kit, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). Aktivitas GSHPx ditentukan menggunakan kit (kit uji GSHPx, A005, Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng, Nanjing, Cina). Aktivitas konstitutif nitric oxide synthase (cNOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), dan acetylcholinesterase (AChe) ditentukan menggunakan kit komersial (AChe assay kit, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).
Tingkat ROS dalam jaringan otak ditentukan dengan menambahkan 2′, 7′ dichlorofluorescin diacetate ke konsentrasi akhir 10 M dalam homogenat jaringan otak dan dengan menginkubasi pada 37 °C selama 30 menit; jaringan kemudian menjadi sasaran analisis menggunakan flow cytometry.
Penentuan Level mRNA Relatif
Total RNA diekstraksi dari sampel jaringan hati menggunakan kit komersial (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China). DNA komplementer disintesis menggunakan transkripsi balik dengan primer acak. Level mRNA relatif dari SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST, dan TF ditentukan menggunakan kit PCR kuantitatif (qPCR) real-time (One Step SYBR® PrimeScript™ RT-PCR Kit, PR066A, Takara, Dalian, Cina). Semua primer (Tabel 1) disintesis dan dibeli dari Shanghai Sangon Ltd.
Uji Toksisitas Embrio Ex Vivo
Embrio 8,5 hari embrio diisolasi dari tikus betina setelah dislokasi serviks dan kemudian dikultur dalam larutan Hank 50,0 mL yang mengandung 3 mL serum segera disentrifugasi (ICS) dari tikus, mikro-TiO2 , atau nano-TiO2 (0,0, 50,0, 100,0, dan 200,0 μg/mL) dengan 3 embrio di setiap botol selama 48 jam.
Untuk mengetahui pengaruh mikro-TiO2 atau nano-TiO2 waktu pemaparan pada embrio, embrio dikultur dalam larutan Hank 50,0 mL yang mengandung 3 mL ICS dari tikus, mikro-TiO2 , atau nano-TiO2 (200.0 g/mL) dengan 3 embrio di setiap botol selama 16, 26, dan 48 jam, kemudian dicuci selama 48 jam dengan larutan Hank 37 °C yang telah dihangatkan sebelumnya dan dikultur dalam larutan Hank 50,0 mL yang mengandung 3 mL ICS dari tikus.
Perkembangan embrio dievaluasi menggunakan skor Maele-Fabry Van [22]. Diameter kantung kuning telur, panjang mahkota-pantat embrio, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh diperiksa di bawah mikroskop bedah. Tingkat malformasi embrio berkembang dievaluasi berdasarkan skor perubahan morfologi otak depan, otak tengah, otak belakang, tunas kaki depan, tunas kaki belakang, sistem pendengaran dan visual, dan jantung. Lebih dari 10 embrio dari 2 tikus ICR pada hari embrio 10,5 diisolasi untuk kontrol.
Analisis Statistik
Data dianalisis menggunakan SPSS 13 (IBM, Illinois, USA). Perbedaan antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dianalisis menggunakan t . Dunnett tes. Perbedaan antar kelompok dianalisis menggunakan ANOVA. Perbandingan antara dua dari beberapa sampel dianalisis menggunakan uji LSD dan SNK. Data kategoris dianalisis menggunakan uji chi-kuadrat dan uji rank sum. Jika P < 0,05, perbedaannya dianggap signifikan.
Hasil
Distribusi Jaringan Titanium pada Mencit Setelah Paparan Titanium Dioksida Skala Nano
Kami merawat tikus dengan nano-TiO2 (ip, 5, 10, 50, 100, 150, dan 200 mg/kg) selama 14 hari dan menentukan kandungan titanium pada organ tikus. Hasilnya mengungkapkan bahwa titanium terakumulasi dalam organ tikus yang diberi perlakuan nano-TiO dosis berbeda2 (Gbr. 1). Besarnya akumulasi tergantung dosis (Gbr. 1). Hati adalah organ di mana titanium paling diperkaya diikuti oleh ginjal. Besarnya akumulasi titanium kira-kira sama di limpa, paru-paru, otak, dan jantung (Gbr. 1). Hasilnya menunjukkan bahwa nano-TiO2 dapat diserap melalui jalur GI dan didistribusikan ke jaringan melalui sistem peredaran darah dan disimpan di organ hati, ginjal, limpa, paru-paru, otak, dan jantung.
Titanium terakumulasi dalam organ tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05, # dibandingkan dengan kontrol, P < 0,01
Toksisitas Umum Titanium Dioksida Skala Nano pada Tikus
Kami merawat tikus dengan dosis nano-TiO yang berbeda2 selama 14 hari dan menemukan bahwa tidak ada perbedaan peningkatan berat badan di antara kelompok tikus yang diobati dengan dosis berbeda (data tidak ditampilkan). Nano-TiO dosis rendah2 (5 dan 10 mg/kg) tidak mengubah rasio organ/berat badan dari hati, ginjal, limpa, paru-paru, jantung, dan otak pada tikus setelah i.p. paparan selama 14 hari (Gbr. 2). Namun, dosis tinggi nano-TiO2 (50, 100, 150, dan 200 mg/kg) secara signifikan meningkatkan rasio organ/berat badan dari hati, ginjal, limpa, dan jantung dan menurunkan rasio paru-paru dan otak pada tikus dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 2 ).
Rasio berat organ/tubuh pada tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05; # dibandingkan dengan kontrol, P < 0,01
Dosis yang lebih rendah (5, 10, 50, dan 100 mg/kg) nano-TiO2 tidak mengubah indeks biokimia darah (Gbr. 3). Nano-TiO dosis tinggi2 (150 hingga 200 mg/kg) peningkatan fungsi hati biomarker alkaline phosphatase (ALP) dan alanine aminotransferase (ALT), albumin (ALB), leucine aminopeptidase (LAP), butyrylcholinesterase (PChe), bilirubin total (TBIL), dan protein total ( TP) tingkat (Gbr. 3). Dosis tinggi menurunkan kadar serum asam urat (UA) dan nitrogen urea darah (BUN), yang merupakan biomarker untuk fungsi ginjal. Mereka meningkatkan serum aspartat aminotransferase (AST), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), dan tingkat alpha hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH), yang merupakan indeks untuk kerusakan miokard (Gbr. 3).
Indeks biokimia darah pada tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05; # dibandingkan dengan kontrol, P < 0,01. a Indeks biokimia untuk biomarker fungsi hati. b Indeks biokimia untuk biomarker fungsi ginjal. c Indeks biokimia untuk biomarker kerusakan miokard
Hasil ini menunjukkan bahwa dosis tinggi TiO2 dapat menyebabkan kerusakan parah pada hati, ginjal, jantung, dan organ lain dengan cara yang bergantung pada dosis.
Toksisitas Hati dari Nano-TiO2 di Tikus
Kami selanjutnya mengevaluasi toksisitas hati nano-TiO2 . Dengan menggunakan mikroskop cahaya, kami menemukan bahwa tidak ada perubahan signifikan pada hati tikus yang terpapar dosis rendah (ip selama 14 hari, 5 mg/kg) nano-TiO2 (Gbr. 4a, b). Kami mengamati obstruksi dan pelebaran pembuluh darah yang nyata (Gbr. 4c, 50 mg/kg), peningkatan basofil (Gbr. 4d, 100 mg/kg), iskemia parsial di hati (Gbr. 4e, 150 mg/kg), dan obstruksi vena sentral (Gbr. 4f, 200 mg/kg) pada tikus yang terpapar nano-TiO2 (i.p.).
Histologi hati pada tikus yang diobati dengan nano-TiO2 terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. a Kontrol. b TiO2 , 5 mg/kg. c TiO2 , 50 mg/kg. d TiO2 , 100 mg/kg. e TiO2 , 150 mg/kg. f TiO2 , 200 mg/kg
Namun, dengan menggunakan TEM, kami menemukan sedikit pembengkakan mitokondria di hepatosit dan adanya kromatin yang terkondensasi dan sel apoptosis di jaringan hati pada tikus yang terpapar nano-TiO dosis rendah2 (gavage selama 60 hari, 5 mg/kg) (Gbr. 5a, b). Kami mengamati nano-TiO2 di mitokondria hepatosit, mitokondria yang membengkak, dan vakuola di mitokondria sel hati tikus yang diberi 10 mg/kg nano-TiO2 (gavage selama 60 hari, Gbr. 5c). Kami selanjutnya mengamati keruntuhan nukleolus, kromatin yang tersebar, apoptosis yang jelas, dan/atau badan apoptosis dalam sel hati tikus yang diobati dengan 50 mg/kg nano-TiO2 (gavage selama 60 hari, Gambar 5d). Hasilnya menunjukkan bahwa nano-TiO2 dapat menyebabkan kerusakan patologis pada sel hati pada tingkat subseluler dan seluler.
Struktur ultramikroskopik hepatosit pada tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 seperti yang ditunjukkan melalui gavage sekali sehari selama 60 hari. Tikus dalam kelompok kontrol menerima 0,5% CMC (karboksimetil selulosa). a Kontrol (×8000). b TiO2 (5 mg/kg) (×8000). c TiO2 (10 mg/kg) (×10.000). Panah menunjukkan mitokondria dan vakuola di mitokondria. d TiO2 (50 mg/kg) (× 10.000)
Perawatan tikus dengan 5 mg/kg nano-TiO2 selama 60 hari tidak mengubah level ROS seperti O
2−
, H2 O2 , nitric oxide (NO), dan MDA (Gbr. 6), atau tingkat mRNA dari gen SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53, dan TF di jaringan hati (Gbr. 7). Perawatan tikus dengan 10 atau 50 mg/kg nano-TiO2 selama 60 hari menghasilkan peningkatan level O
2−
. yang signifikan , H2 O2 , NO, dan MDA (Gbr. 6), penurunan kadar mRNA gen SOD, CAT, MT, GST, HSP70, P53, TF, dan GSHPx, dan peningkatan kadar mRNA gen CYP1A di hati tikus ( Gambar 7). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis tinggi nano-TiO2 - menginduksi stres oksidatif dan perubahan ekspresi gen pelindung di hati tikus yang terpapar.
Tingkat produksi ROS dan tingkat peroksidasi lipid dalam hati tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 seperti yang ditunjukkan melalui gavage sekali sehari selama 60 hari. Tikus dalam kelompok kontrol menerima 0,5% CMC (karboksimetil selulosa). * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05, dinormalisasi menjadi protein total
Tingkat ekspresi relatif gen dalam hati tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 seperti yang ditunjukkan melalui gavage sekali sehari selama 60 hari. Tikus dalam kelompok kontrol menerima 0,5% CMC (karboksimetil selulosa). * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05; # dibandingkan dengan kontrol, P < 0,01, dinormalisasi menjadi -aktin
Toksisitas Otak dari Titanium Dioksida Nanoscale pada Tikus
Kami mengevaluasi lebih lanjut toksisitas otak dari nano-TiO2 . Kami pertama-tama memeriksa rasio berat otak/tubuh pada tikus yang terpapar nano-TiO2 (i.p. selama 14 hari). Dosis rendah (5, 10, 50 mg/kg) tidak mengubah rasio bobot otak/tubuh, dan dosis yang lebih tinggi (100, 150, 200 mg/kg) secara signifikan menurunkan rasio bobot otak/tubuh dalam dosis tergantung cara (Gbr. 2). Konsentrasi Ti dalam jaringan otak meningkat secara signifikan dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 1).
Kami juga memeriksa perubahan histologis di otak tikus yang terpapar nano-TiO2 (ip selama 14 hari) menggunakan pewarnaan hematoxylin. Kami mengamati bahwa dosis rendah nano-TiO2 (50 mg/kg) tidak mengubah histologi jaringan otak pada tikus setelah i.p. paparan selama 14 hari (Gbr. 8a, b). Perawatan tikus dengan 100 mg/kg nano-TiO2 mengakibatkan sel saraf di jaringan otak pecah dan retak (Gbr. 8c). Perawatan tikus dengan 150 mg/kg nano-TiO2 mengakibatkan invasi sel inflamasi di jaringan otak (Gbr. 8d). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis tinggi nano-TiO2 dapat menyebabkan kerusakan morfologis pada jaringan otak, yang mengakibatkan reaksi inflamasi.
Perubahan patologis pada jaringan otak tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. a Kontrol. b 50 mg/kg. c 150 mg/kg. d 200 mg/kg
Kami menentukan efek nano-TiO2 pada keadaan redoks dan molekul sinyal di jaringan otak tikus yang terpapar nano-TiO2 (i.p. selama 14 hari). Kami mengamati bahwa nano-TiO dosis rendah (5 mg/kg)2 tidak berubah O
2−
, H2 O2 dan kadar MDA, tidak mengubah aktivitas enzim antioksidan APX, CAT, GSHPx, dan SOD, maupun kadar antioksidan non enzimatik ASA/DASA dan GSH/GSSG. Juga tidak mengubah aktivitas nitric oxide synthase (NOS) dan level NO dalam jaringan otak (Gbr. 9 dan 10). Dosis nano-TiO yang lebih tinggi2 peningkatan O
2−
, H2 O2 , dan kadar MDA, menurunkan aktivitas enzim antioksidan APX, CAT, GSHPx, dan SOD, menurunkan kadar antioksidan non-enzimatik ASA/DASA dan GSH/GSSG, meningkatkan kadar NO dan aktivitas NOS, serta menurunkan kadar AchE dan glukosa darah (GLU) di jaringan otak (Gbr. 9 dan 10). Hasil ini menunjukkan bahwa nano-TiO2 dapat menyebabkan kerusakan pada otak pada tikus setelah i.p. paparan.
Rasio ASA/DASA dan GSH/GSSG otak pada tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari
Perubahan ROS, enzim antioksidan, pensinyalan NO, glutamat, dan aktivitas AchE di otak tikus yang terpapar nano-TiO2 . Tikus diobati dengan nano-TiO2 suspensi atau larutan garam seperti yang ditunjukkan melalui injeksi intraperitoneal sekali sehari selama 14 hari. T = 10, * dibandingkan dengan kontrol, P < 0,05; # dibandingkan dengan kontrol, P < 0,01. a Perubahan ROS (O2-, H2O2, dan MDA) pada otak mencit yang terpapar nano-TiO2. b Perubahan enzim antioksidan (SOD, CAT, APX, dan GSHPx) pada otak tikus yang terpapar nano-TiO2. c Perubahan komponen pensinyalan NO (cNOS, iNOS, dan NO) pada otak tikus yang terpapar nano-TiO2. d Perubahan kandungan glutamat dan aktivitas AchE di otak tikus yang terpapar nano-TiO2
Efek Toksik Nano-TiO2 pada Embrio Mouse Ex Vivo
Untuk mengevaluasi toksisitas perkembangan nano-TiO2 , pertama-tama kami membandingkan pertumbuhan dan perkembangan embrio in vivo dan embrio ex vivo. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan dan perkembangan embrio ex vivo mirip dengan embrio in vivo (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, kami menggunakan embrio ex vivo untuk mempelajari efek toksik nano-TiO2 pada embrio.
Kami menyelidiki efek dari dosis yang berbeda (konsentrasi akhir 0,0, 50,0, 100,0, dan 200,0 μg/mL) dan waktu paparan yang berbeda dari mikro-TiO2 /nano-TiO2 pada pertumbuhan dan perkembangan embrio serta morfologi jaringan dan organ melalui pemeriksaan diameter VXY embrio, panjang mahkota-bokong, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mikro-TiO2 tidak mengubah indikator ini pada dosis apapun (Tabel 2).
Untuk berbagai ukuran nano-TiO2 , perlakuan embrio 5-10 nm, 60 nm, 90 nm dengan 50,0 μg/mL TiO2 tidak berpengaruh pada diameter VXY embrio, panjang mahkota-pantat, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh (Tabel 2). Dosis yang lebih tinggi (100,0 dan 200,0 μg/mL) menurunkan diameter VXY, panjang mahkota-bokong, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh, dan meningkatkan tingkat malformasi (Tabel 2). Untuk dosis yang sama, tidak ada perbedaan yang jelas antara kelompok yang diberi perlakuan dengan ukuran nano-TiO yang berbeda2 , 50,0, atau 100 μg/mL. Perawatan embrio dengan 200 μg/mL nano-TiO2 secara signifikan menurunkan diameter VXY, panjang mahkota-bokong, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh embrio mencit dengan meningkatnya ukuran nano-TiO2 partikel (Tabel 2).
Perawatan embrio tikus dengan mikro-TiO2 (200.0 g/mL) selama 16, 24, dan 48 jam tidak mengubah diameter VXY, panjang ubun-ubun-bokong, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh (Tabel 3). Perawatan embrio tikus dengan nano-TiO2 (5–10 nm dan 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/mL) selama 16 jam juga tidak mengubah diameter VXY, panjang ubun-ubun-bokong, panjang kepala, dan jumlah bagian tubuh (Tabel 3). Namun, perlakuan embrio tikus dengan nano-TiO2 (5–10 nm dan 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/mL) selama 24 dan 48 jam menurunkan diameter VXY, panjang ubun-ubun-bokong, panjang kepala, jumlah bagian tubuh, dan meningkatkan laju malformasi (Tabel 3). Untuk waktu pemaparan yang sama, tidak ada perbedaan diameter VXY, panjang mahkota-bokong, panjang kepala, jumlah bagian tubuh, atau tingkat malformasi di antara kelompok ukuran nano-TiO2 yang berbeda particles (Table 3).
In summary, these results indicate that nano-TiO2 had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO2 particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO2 particles.
Discussion
Nano-TiO2 has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO2 exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO2 , using mice models. We find that nano-TiO2 accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO2 significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO2 significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO2 do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO2 may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.
In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO2 . We find that high doses of nano-TiO2 may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO2 , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO2 in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO2 generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO2 can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO2 liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.
In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO2 . We find that high doses of nano-TiO2 can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe2 O3 nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO2 on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO2 may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.
We find that the micro-TiO2 and low doses of nano-TiO2 (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO2 (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO2 in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO2 does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO2 . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO2 , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO2 may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO2 concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO2 is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO2 particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles (Table 2).
In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO2 . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO2 is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO2 in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO2 can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO2 can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO2 . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO2 .
Conclusions
Ingested nano-TiO2 can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO2 causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO2 has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO2 particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO2 exposure on human health.
