Sistem Analitik Baru untuk Menilai Properti Fisikokimia Nanopartikel Perak di Kulit Manusia
Abstrak
Untuk memastikan penggunaan aman nanopartikel perak (nAgs) dalam kosmetika, perlu untuk mengungkapkan properti fisik nAgs di dalam kulit, karena properti ini dapat berubah selama proses penyerapan perkusutan. Dalam studi ini, kami bertujuan untuk mendirikan sistem analitik berdasarkan spektrometri massa plasma terintegrasi partikel tunggal (sp-ICP-MS) untuk menentukan properti fisik nAgs di kulit. Pertama, kami mengoptimalkan metode pretreatment untuk melarutkan sampel kulit dan kemudian menunjukkan bahwa sebagian besar nAgs dapat dipulihkan dengan perlakuan natrium hidroksida sementara tetap dalam bentuk partikel. Untuk memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis, kami menyaring beberapa kondisi iradiasi mikrogelombang. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa penerapan 200 W selama 30 detik adalah optimal, karena kondisi ini memastikan pemisahan yang sempurna lapisan kulit tanpa mengubah properti fisik mayoritas nAgs. Terakhir, kami mengevaluasi aplikasi in vivo dengan menganalisis jumlah serta properti fisik Ag di epidermis, dermis, dan darah perifer tikus setelah mengekspos kulit pada nAgs atau Ag⁺. Analisis sp-ICP-MS selanjutnya menunjukkan bahwa nAgs dapat diserap dan tersebar ke lapisan yang lebih dalam dalam bentuk ionisasi, sedangkan Ag⁺ diserap dan tersebar tanpa perubahan properti fisik. Studi ini mengindikasikan bahwa untuk mendapatkan pemahaman yang menyeluruh tentang respons kulit setelah eksposur pada nAgs, penting untuk mempertimbangkan distribusi dan ukuran partikel tidak hanya nAgs tetapi juga Ag⁺ yang dilepaskan dari nAgs ke dalam kulit.
Pendahuluan
Kemajuan teknologi terbaru dalam nanoteknologi telah mempercepat perkembangan nanopartikel terdirian (ENPs) yang merupakan partikel lebih kecil dari 100 nm. Dengan manfaatnya, seperti penetrasi jaringan yang ditingkatkan dan reaksi permukaan, dibandingkan materi mikro- atau ukuran yang lebih besar, ENPs banyak digunakan dalam berbagai produk, termasuk kosmetika, makanan, dan obat-obatan [1,2,3]. Misalnya, nanopartikel perak (nAgs), salah satu jenis ENP yang paling umum, dimasukkan ke dalam kosmetika karena properti antibakteri mereka yang berasal dari pelepasan stabil ion perak (Ag⁺) [4, 5]. Namun, properti fisikokimia unik yang terkait dengan ukuran partikel kecil nAgs dapat berbahaya. Diketahui bahwa partikel ini dapat mengganggu halangan yang tidak dapat ditembus, seperti halangan darah-otak, dan menyebabkan inflamasi [6]. Selain itu, beberapa studi telah melaporkan bahwa ENPs dapat menembus halangan kulit [7,8,9]. Oleh karena itu, untuk menentukan keamanan penggunaan berkelanjutan partikel ini, penting untuk memahami efek toksik yang terkait dengan ENPs yang mengandung nAgs dengan menyelidiki dinamika partikel ini dalam jaringan, seperti kulit.
Untuk memastikan keamanan, sangat penting untuk memahami risiko yang terkait dengan penggunaan ENPs, yang melibatkan konsep integratif “bahaya” (toksisitas potensial) dan “kondisi paparan.” Sementara bahaya ENPs telah dianalisis di seluruh dunia, hanya beberapa studi yang telah memeriksa kondisi yang terkait dengan paparan ENPs [10]. Secara khusus, telah dilaporkan bahwa nAgs dan Ag⁺ dapat mengubah properti fisik mereka dalam tubuh. Misalnya, ionisasi nAgs menghasilkan terbentuknya nAgs dengan ukuran partikel yang lebih kecil dan pelepasan Ag⁺ [11]. Sebaliknya, nAgs dengan ukuran partikel kecil dapat terdeteksi pada epitel usus tikus setelah pengapalan asam perak asetat [12]. Selain itu, kami baru-baru ini melaporkan bahwa dibandingkan dengan nAgs dan Ag⁺ yang lebih kecil, nAgs yang lebih besar lebih mudah ditemukan dalam ASI tikus menyusui yang diekspose pada nAgs tersebut [13]. Oleh karena itu, nAgs dapat mengubah properti fisiknya dalam tubuh, yang pada gilirannya mengakibatkan perubahan kinematika. Oleh karena itu, untuk memahami risiko yang terlibat, perlu mengevaluasi properti fisik, seperti ukuran partikel, partikel ini, dan membedakan antara partikel ini dan ion dalam tubuh.
Dengan demikian, kami menerapkan spektrometri massa plasma terintegrasi partikel tunggal (sp-ICP-MS), yang memperkenalkan maksimum satu partikel ke dalam analisis per waktu tinggal. Ini adalah metode efektis yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran partikel dengan menganalisis intensitas puncak dan konsentrasi partikel melalui laju puncak. Partikel dan ion dapat dibedakan dengan menganalisis sinyal puncak dan latar belakang [14]. Kami sebelumnya telah mengoptimalkan metode pretreatment untuk sp-ICP-MS dalam sampel biologis untuk menentukan secara semi-kuantitatif properti fisik ENPs dalam berbagai organ, seperti hati, jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa [15].
Kulit terdiri dari epidermis, termasuk lapisan korneum (SC), dan dermis, yang mengandung pembuluh darah, pembuluh limfatik, dan saraf [16]. Oleh karena itu, masuknya ENPs ke dalam setiap lapisan kulit dapat menginduksi toksisitas dengan tingkat yang bervariasi. Misalnya, distribusi nanopartikel dioksida titan dalam sel keratosit kulit manusia epidermis dapat merangsang produksi spesies reaktif oksigen [17]. Selain itu, pada tikus tanpa bulat, paparan dermis terhadap nanopartikel dioksida titan selama 60 hari tidak hanya mengakibatkan perubahan patologis, seperti dermis yang lebih tipis karena toksisitas lokal, tetapi juga perubahan patologis di hati, seperti nekrosis likuefaksi karena toksisitas sistemik yang menyebar melalui pembuluh darah di dermis [18]. Selain itu, respons biologis dalam setiap lapisan juga dapat bervariasi tergantung pada properti fisik, seperti ukuran partikel, dan perbedaan antara partikel dan ion [19]. Untuk memahami keamanan penggunaan nAgs, perlu memahami properti fisik dan distribusi nAgs setelah diekspose pada kulit.
Untuk menyelesaikan masalah khusus ini, diperlukan pendekatan yang dapat melakukan pretreatment kulit dan memisahkan lapisannya tanpa menyebabkan kerugian selama pemulihan atau perubahan properti fisik ENPs. Namun, pendekatan optimal untuk kulit belum pernah dirancang.
Dalam studi ini, kami mengoptimalkan pendekatan pretreatment yang menentukan secara semi-kuantitatif properti fisik nAgs, model ENP, di setiap lapisan kulit melalui sp-ICP-MS, dan kemudian mengevaluasi efektivitasnya in vivo.
Metode
Tikus
Tikus Slc:ICR (betina, 8 minggu) dibeli dari Japan SLC (Shizuoka, Jepang). Tikus ditempatkan dalam ruangan dengan siklus cahaya-gelap berikut: lampu menyala pukul 08.00 dan mati pukul 20.00. Makanan dan air disediakan dalam bentuk pelet makanan dan sistem pasokan air yang terletak di atas kandang. Semua protokol eksperimen dilakukan di bawah kondisi yang disetujui oleh komite penelitian hewan Universitas Osaka, Jepang.
nAgs dan Ag⁺
Suspensi nAgs capped ligan sitrat dengan diameter 100 nm (nAg100) dibeli dari nanoComposix (San Diego, CA, USA) dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). Nitrat perak (AgNO₃) dibeli dari Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Jepang), juga dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). RM8013, digunakan sebagai standar untuk menghitung efisiensi transportasi, dibeli dari National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA). Setiap jenis nanopartikel di sonikasi selama 10 menit sebelum digunakan. Nanopartikel dan ion juga di-vorteks selama 10 detik sebelum digunakan.
Reagen
Natrium hidroksida (NaOH, 0,1 mol/L) dibeli dari Nacalai Tesque Company (Osaka, Jepang) dan asam nitrat (HNO₃, 70%) dibeli dari Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Jepang). Larutan garam fosfat (PBS), pH 7, disiapkan.
Optimisasi Metode Pretreatment
Epidermis dan dermis dari setiap tikus dipisahkan, dicampur dengan PBS (rasio w/v 1:10), dan dihomogenkan. Homogenat kemudian dicampur dengan larutan nAg100 100 ng/mL. Larutan kemudian diperlakukan dengan salah satu reagen berikut pada rasio v/v 1:1; 0,1 mol/L NaOH, 70% HNO₃, atau PBS. Sampel diinkubasi selama 3 jam pada 37 °C dan dilakukan sp-ICP-MS.
Pemisahan Kulit melalui Iradiasi Mikrogelombang
Setiap tikus diutamakan dengan isoflurane (Wako), setelahnya sampel kulit punggung 2 cm² (2 cm × 1 cm) dieksksi menggunakan gunting bedah dan pensil. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama prosedur eksksi. Oven mikrogelombang (RE-SW-20-H, Sharp, Jepang) digunakan untuk mengiradiasi kulit pada frekuensi 2450 MHz. Sampel kulit ditempatkan pada piring dan diletakkan di tengah oven mikrogelombang. Sesuai dengan persyaratan pengujian, sampel kulit diiradiasi selama 10, 30, dan 60 detik pada 200, 600, dan 900 W, masing-masing. Setelah iradiasi, sampel segera dikeluarkan dan setiap epidermis dan dermis dengan cepat dipisahkan dengan menggosok halus menggunakan pensil bedah. Larutan nAg100 100 ng/mL digunakan untuk analisis tingkat pemulihan dan diameter rata-rata nAg setelah iradiasi (200 W, 30 detik).
Administrasi Transdermal nAg100 dan Ag⁺
Tikus betina Slc:ICR berusia 9 minggu dibagi menjadi 6 kelompok dengan 3 tikus per kelompok, menurut berat badan mereka. Tikus dianestesikan menggunakan isoflurane. Bulat di punggung mereka dicukuk dengan alat cakram (Panasonic®, Osaka, Jepang) dan cuit tangan (Gillette®, Jerman). Selanjutnya, nAg100 dan Ag⁺ (20 μg/cm²) langsung diterapkan pada area permukaan 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) dari kulit punggung dan ditutup rapat dengan film plastik non-absorben. Selembar gauze dengan ukuran yang sama ditempatkan pada film plastik. Pita elastis self-adhesive digunakan untuk menutup gauze dengan melilit di sekitar kulit dan kulit dibiarkan tertutup selama 5 hari.
Pretreatment Sampel Kulit dan Darah
Lima hari setelah perawatan, darah perifer dari plexus vena retro-orbitale dan kulit punggung dikumpulkan untuk analisis. Selanjutnya, sampel kulit punggung 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) dieksksi menggunakan gunting bedah dan pensil. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama eksksi. Lapisan SC secara berurutan dihilangkan menggunakan sepotong pita perekat 2 cm (Scotch®, 3M), sebelum memisahkan epidermis dari dermis. Sepotong pita ditekan pada area yang dirawat dari kulit punggung setelah itu tekanan konstan diberikan selama 10 detik. Dua puluh sepotong pita diperlukan untuk menghilangkan seluruh SC dari setiap tikus. Selanjutnya, dermis dan epidermis dipisahkan dengan iradiasi mikrogelombang dan dihomogenkan dengan PBS (rasio w/v 1:10). Darah yang dikumpulkan, serta homogenat dermis dan epidermis, diperlakukan dengan 0,1 mol/L NaOH pada rasio v/v 1:1 dan diinkubasi secara terpisah selama 3 jam pada 37 °C. Setelah inkubasi, massa perak kasar dalam campuran darah, epidermis, dan dermis dianalisis dengan spektrometri massa plasma terintegrasi (ICP-MS). Kuantifikasi dan penilaian properti fisik nAgs dan Ag⁺ dilakukan menggunakan sp-ICP-MS.
Pengukuran Massa Kasar Perak
Untuk mengukur konsentrasi perak total dalam sampel darah, SC, epidermis, dan dermis, sistem ICP-MS Agilent 7700x (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) digunakan. Kondisi di mana analisis dilakukan adalah sebagai berikut: daya RF 1550 W; gas pengawal 1,05 L/min Ar; dan waktu tinggal 100 ms. Pengukuran diulang tiga kali dalam mode MS. Rodium digunakan sebagai standar internal untuk Ag. Elemen target analisis ICP-MS adalah ¹⁰³Rh dan ¹⁰⁷Ag. Larutan standar Ag dan rodium diperoleh dari Wako.
Analisis dan Perhitungan sp-ICP-MS
Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) digunakan untuk analisis sp-ICP-MS. Kondisi analisis adalah sebagai berikut: daya RF 1550 W; gas pengawal 1,05 L/min Ar; waktu tinggal 10 ms; dan waktu analisis 30 s. Alat perhitungan partikel tunggal—RIKILT yang diterbitkan oleh Wagenen Food Safety Research (Wageningen University, Wageningen, Belanda)—digunakan untuk menghitung ukuran partikel [20].
Analisis Statistik
Semua analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 5.0 untuk Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05.
Hasil dan Pembahasan
Strategi untuk Membangun Metode untuk Menentukan Jumlah dan Properti Fisik nAgs di Setiap Lapisan Kulit
Untuk menentukan jumlah dan properti fisik nAg di setiap lapisan kulit, perlu untuk melarutkan sampel kulit sepenuhnya dan menyiapkan sampel yang dapat dianalisis dengan sp-ICP-MS. Juga penting untuk memisahkan epidermis dan dermis, tanpa kerugian selama pemulihan, atau perubahan properti fisik nAg, karena nAg yang tidak terserap melalui kulit kadang-kadang dapat dihilangkan selama penghapusan SC melalui stripping pita [21].
Terhadap pelarutan sampel kulit, kami sebelumnya telah melaporkan bahwa pretreatment NaOH adalah teknik yang optimal untuk kuantifikasi serta analisis properti fisik nAg dalam jaringan hewan, seperti hati, jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa [16]. Oleh karena itu, pretreatment NaOH diterapkan pada sampel kulit yang digunakan dalam studi ini.
Perawatan hidrotermal, yang mengakibatkan pelunakkan serat kolagen dan pencernaan enzim yang ditingkatkan, yang mempromosikan pemisahan pada juncak epidermis-dermis (EDJ), banyak digunakan untuk memisahkan kulit menjadi lapisan epidermis dan dermis [22]. Meskipun perawatan ini secara efisien memisahkan lapisan kulit, nAg pada lapisan dapat diionikan dalam larutan air yang mengakibatkan perubahan properti fisiknya. Dilaporkan bahwa pulsa singkat iradiasi mikrogelombang memungkinkan kulit untuk dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermis melalui generasi panas yang mengganggu EDJ [23, 24]. Oleh karena itu, kami menerapkan iradiasi mikrogelombang tanpa inkubasi pada larutan untuk waktu singkat.
Secara keseluruhan, kami mengusulkan strategi (diilustrasikan pada Gambar 1), yang divalidasi dengan menganalisis tingkat pemulihan dan perubahan properti fisik nAg di setiap lapisan kulit.
Strategi untuk menentukan jumlah dan properti fisik nAg100 di setiap lapisan jaringan kulit. Untuk menentukan jumlah dan properti fisik nAg100 di setiap lapisan jaringan kulit perlu untuk (1) melarutkan jaringan kulit sepenuhnya dan (2) memisahkan kulit menjadi jaringan epidermis dan dermis, tanpa kerusakan jaringan selama pemulihan atau perubahan properti fisik nAg100. Dalam hal ini, kami fokus pada (1) pretreatment NaOH dan (2) iradiasi mikrogelombang
Optimisasi Metode Pretreatment untuk Mendeteksi nAg100 di Epidermis dan Dermis
Kami merujuk pada studi kami sebelumnya untuk mengoptimalkan metode pretreatment untuk melarutkan sampel kulit. Ishizaka et al. [15] melaporkan bahwa, di antara berbagai reagen pelarut, seperti NaOH dan HNO₃, pretreatment NaOH adalah optimal. Jadi, kami menguji HNO₃ dan NaOH sebagai reagen pelarut asam dan alkali, masing-masing. Homogenat epidermis dan dermis yang dipisahkan dari sampel kulit tikus dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL diikuti dengan perlakuan dengan setiap reagen pelarut pada 37 °C. Pertama, kami mengevaluasi tingkat pemulihan Ag setelah perlakuan dengan reagen ini. Analisis ICP-MS menunjukkan bahwa tingkat pemulihan hampir 100% dicapai oleh perlakuan NaOH dan HNO₃ hanya (Gambar 2a). Selanjutnya, untuk mengevaluasi perubahan properti fisik karena setiap perlakuan, kami menganalisis konsentrasi pemulihan setiap partikel dan ion. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa nAg100 hampir sepenuhnya diionikan oleh HNO₃. Ini menunjukkan bahwa HNO₃, sebagai reagen asam, melarutkan partikel dan mengonversinya menjadi ion, seperti juga dilaporkan dalam studi sebelumnya [15]. Sebaliknya, mayoritas nAg100 yang diperlakukan dengan NaOH tetap sebagai partikel, dan bukan sebagai ion (Gambar 2b). Jadi, NaOH memungkinkan mayoritas nAg100 tetap dalam bentuk partikel. Terakhir, distribusi diameter partikel dievaluasi untuk menganalisis properti fisik secara rinci. Perlakuan HNO₃ mengubah diameter partikel rata-rata dari 100 nm menjadi 40 nm, yang sesuai dengan ionisasi nAg100. Sebaliknya, diameter partikel rata-rata setelah perlakuan NaOH sekitar 100 nm, sesuai dengan ukuran partikel awal (Gambar 2c). Ini menunjukkan bahwa pretreatment NaOH adalah optimal untuk mendeteksi nAg100 di kulit tikus.
Pretreatment NaOH adalah metode optimal untuk mendeteksi nAg100 dalam dermis dan epidermis. Dua reagen pelarut (HNO₃ dan NaOH) disaring sebagai pelarut pretreatment untuk meluluhkan jaringan. Homogenat epidermis (E) dan dermis (D) dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL dan diperlakukan dengan setiap reagen pelarut pada 37 °C. Setelah 3 jam, semua sampel dianalisis melalui ICP-MS dan sp-ICP-MS. a Tingkat pemulihan Ag, b tingkat pemulihan nAg (bar hitam) dan Ag⁺ (bar bayangan), dan c diameter partikel rata-rata ditampilkan. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Data dinyatakan sebagai mean ± S.D. (n = 3)
Pemisahan Sampel Kulit menjadi Epidermis dan Dermis melalui Iradiasi Mikrogelombang dan Evaluasi Tingkat Pemulihan serta Perubahan Properti Fisik nAgs
Untuk memisahkan sampel kulit menjadi lapisan epidermis dan dermis, kami menerapkan berbagai kondisi iradiasi mikrogelombang yang relevan dengan studi kami dan sebelumnya dilaporkan berhasil [24] dan membandingkan performa mereka dengan avaibalitas pemisahan kulit dan perubahan properti fisik. Terjadi bahwa dalam kondisi 200 W selama 10 detik, 600 W selama 30 detik, 600 W selama 60 detik, 950 W selama 30 detik, dan 950 W selama 60 detik, kulit gagal dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermis (Gambar 3a). Selain itu, kulit hanya sebagian dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermis dalam kondisi 200 W selama 60 detik, 600 W selama 10 detik, dan 950 W selama 10 detik. Sebaliknya, kulit hanya sepenuhnya dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermis setelah iradiasi pada 200 W selama 30 detik. Hasil ini menunjukkan bahwa iradiasi pada 200 W selama 30 detik adalah optimal untuk pemisahan lapisan kulit.
Saringan dan evaluasi kondisi untuk memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis oleh iradiasi mikrogelombang. a Jaringan kulit diiradiasi oleh mikrogelombang di bawah sembilan kondisi dan dipisahkan menjadi jaringan epidermis dan dermis. Panel kiri dan kanan menunjukkan sampel kulit sebelum dan setelah iradiasi, masing-masing. Di panel kanan, lingkaran putih tunggal, ganda, dan tiga menunjukkan kondisi tidak dapat dipisahkan, sebagian dapat dipisahkan, dan sepenuhnya dapat dipisahkan, masing-masing. Skala bar: 1 cm. Homogenat kulit dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL, dan diiradiasi pada 200 W selama 30 detik, dan dianalisis melalui sp-ICP-MS. b Tingkat pemulihan nAg (bar hitam) dan Ag⁺ (bar bayangan) dan c diameter partikel rata-rata ditampilkan. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Data dinyatakan sebagai mean ± S.D. (n = 3)
Untuk memverifikasi apakah iradiasi mikrogelombang ini pada 200 W selama 30 detik mempengaruhi properti fisik nAg100, kami menentukan properti fisik Ag di lapisan epidermis dan dermis. Homogenat epidermis dan dermis, masing-masing dicampur dengan 100 ng/mL nAg100, diluluhkan menggunakan NaOH dan diiradiasi pada 200 W selama 30 detik. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa mayoritas nAg100 yang diperlakukan dengan iradiasi mikrogelombang tetap sebagai partikel, dan juga demikian pada kelompok yang tidak diperlakukan (Gambar 3b). Untuk menganalisis properti fisik secara rinci, distribusi diameter partikel juga dievaluasi. Diameter partikel rata-rata hampir 100 nm, yang sesuai dengan ukuran partikel awal (Gambar 3c). Temuan ini menunjukkan bahwa iradiasi mikrogelombang sampel kulit pada 200 W selama 30 detik adalah pendekatan yang menjanjikan untuk memisahkan kulit secara efisien menjadi lapisan epidermis dan dermis tanpa mengubah properti fisik nAg100.
Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa kami telah berhasil mengembangkan sistem untuk menentukan secara semi-kuantitatif properti fisik nAg100 di setiap lapisan kulit. Secara spesifik, metode ini mencakup hal berikut: (i) penghapusan nAg100 yang tidak terserap secara transdermal dengan menghapus SC dengan metode stripping pita [21]; (ii) pemisahan kulit menjadi lapisan epidermis dan dermis melalui iradiasi mikrogelombang; (iii) pelarutan epidermis dan dermis dengan perlakuan NaOH; dan (iv) penentuan secara semi-kuantitatif properti fisik Ag di setiap lapisan kulit menggunakan sp-ICP-MS.
Evaluasi Praktis dengan Menentukan Jumlah dan Properti Fisik nAg100 dan Ag⁺ di Lapisan Kulit Tikus In Vivo
Untuk mengevaluasi aplikasi praktis pendekatan ini, kami menganalisis jumlah dan properti fisik Ag di epidermis dan dermis serta darah perifer, setelah kulit tikus diekspose pada nAg100 dan Ag⁺ in vivo. Lima hari setelah eksposur, kami memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis dalam kondisi iradiasi mikrogelombang yang dioptimalkan dan melarutkannya menggunakan NaOH, seperti yang dijelaskan di bagian sebelumnya. Analisis ICP-MS menunjukkan bahwa Ag hadir di semua jaringan (seperti epidermis, dermis, dan darah) dari semua kelompok. Di dermis dan darah, Ag dalam kelompok diekspose Ag⁺ cenderung meningkat, dibandingkan dengan kelompok diekspose nAg100 (Gambar 4a). Data menunjukkan bahwa meskipun baik bentuk ion maupun partikel diserap secara perkusutan dan tersebar seperti yang telah dilaporkan sebelumnya [8, 9], bentuk ion lebih mudah menembus ke dalam lapisan jaringan yang lebih dalam dibandingkan bentuk partikel.
Analisis properti fisik semi-kuantitatif nAg100 dan Ag⁺ yang diterapkan pada kulit tikus in vivo. Pertama, kulit tikus diekspose pada nAg100 dan Ag⁺ (20 μg Ag/cm²). Lima hari setelah eksposur, kuantifikasi dan evaluasi properti fisik Ag di epidermis, dermis, dan darah dilakukan melalui ICP-MS dan sp-ICP-MS, masing-masing. a Konsentrasi Ag dan b laju partikel yang terdeteksi di epidermis, dermis, dan darah. c Diameter rata-rata partikel yang terdeteksi di epidermis dan dermis. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Semua data dinyatakan sebagai mean ± S.E. (n = 3). *p < 0,05 (uji t Student)
Selanjutnya, kami mengevaluasi rasio nAg dan Ag⁺ dalam setiap sampel. Dalam kelompok diekspose Ag⁺, hampir semua Ag terdeteksi dalam bentuk ion di epidermis, dermis, dan darah, yang menunjukkan bahwa Ag⁺ diserap secara perkusutan dan tersebar tanpa perubahan properti fisik. Sebaliknya, dalam kelompok diekspose nAg100, sekitar 70% Ag di epidermis dan dermis hadir dalam bentuk partikel, sementara sisanya diionikan. Selain itu, Ag yang terdeteksi dalam darah perifer hampir total diionikan dan bentuk partikel hampir tidak terdeteksi (Gambar 4b). Terakhir, kami mengevaluasi ukuran partikel di lapisan epidermis dan dermis, di mana sebagian besar bentuk partikel terdeteksi. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa ukuran partikel yang terdeteksi di kedua lapisan sekitar 70–80 nm, sesuai dengan tingkat di mana nAg100 diionikan (Gambar 4c). Data ini menunjukkan bahwa ketika kulit diekspose pada nAg100, ia dapat diserap dan tersebar sambil diionikan.
Seperti telah dilaporkan sebelumnya, ligan permukaan nanopartikel mempengaruhi penyerapannya ke dalam kulit [25, 26]. Misalnya, nanopartikel emas yang dimodifikasi dengan grup amino terserap ke dalam kulit tikus dan manusia dalam skala yang lebih besar daripada nanopartikel emas yang dimodifikasi dengan grup karboksil dalam eksperimen ex vivo [25]. Selain itu, analisis dinamika molekuler menunjukkan bahwa kemampuan menembus kulit menurun dari emas netral hidrofobik ke kationik ke anionik dalam urutan tersebut [26]. Dengan demikian, dalam studi ini, disimpulkan bahwa nAg100 kurang mungkin menembus SC di epidermis, halangan kulit awal, karena nAg100 dimodifikasi dengan sitrat dan bermuatan negatif. Oleh karena itu, alasan partikel terlihat di dermis dan darah mungkin karena partikel menembus melalui pori serta melalui epidermis.
Telah juga dilaporkan bahwa kemenjuran nanopartikel emas ditingkatkan oleh modifikasi dengan peptid menembus sel, seperti Tat dan R7 [25]. Oleh karena itu, di masa depan, modifikasi serupa dapat dipertimbangkan untuk nAgs untuk mengirannya lebih dalam ke dalam kulit. Selain itu, mungkin perlu untuk mengurangi ukuran nAgs, karena efek modifikasi permukaan semakin besar dengan luas permukaan spesifik yang lebih besar.
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami mengembangkan pendekatan pretreatment untuk menentukan secara semi-kuantitatif properti fisik nAg100 di setiap lapisan kulit dengan sp-ICP-MS. Dengan pendekatan ini, kami menunjukkan bahwa eksposur kulit pada nAg100 dapat mengakibatkan nAg100 diionikan, diserap, dan tersebar ke dalam lapisan yang lebih dalam. Oleh karena itu, untuk memahami respons biologis atau toksisitas yang terkait dengan eksposur kulit pada nAg100, mungkin perlu untuk mempertimbangkan tidak hanya distribusi nAg100 dan ukuran partikelnya, tetapi juga Ag⁺ dari nAg100, yang mencair ke dalam jaringan kulit. Oleh karena itu, pendekatan ini menunjukkan janji sebagai teknik dasar yang dapat digunakan untuk analisis risiko.
Ketersediaan Data dan Bahan
Berbagi data tidak berlaku untuk artikel ini karena tidak ada dataset yang dihasilkan atau dianalisis selama studi saat ini.
Singkatan
ENPs:
Nanopartikel Terdirian
nAg:
Nanopartikel Perak
Ag⁺:
Ion Perak
sp-ICP-MS:
Spektrometri Massa Plasma Terintegrasi Partikel Tunggal
