Pengembangan dan Evaluasi Sistem untuk Penentuan Semi-Kuantitatif Sifat Fisik Kulit Setelah Paparan Nanopartikel Perak

Metode

Tikus

Slc:ICR tikus (betina, 8 minggu) dibeli dari Jepang SLC (Shizuoka, Jepang). Tikus ditempatkan di sebuah ruangan dengan siklus terang-gelap berikut:lampu menyala pada pukul 8 pagi dan mati pada pukul 8 malam. Makanan dan air disediakan dalam bentuk pelet makanan dan sistem pasokan air yang terletak di atas kandang. Semua protokol eksperimental dilakukan di bawah kondisi yang disetujui oleh komite penelitian hewan Universitas Osaka, Jepang.

nAgs dan Ag ⁺

Suspensi sitrat-ligan-capped nAgs dengan diameter 100 nm (nAg100) dibeli dari nanoComposix (San Diego, CA, USA) dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). Perak nitrat (AgNO₃ ) dibeli dari Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Jepang), juga dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). RM8013, digunakan sebagai standar untuk menghitung efisiensi transportasi, dibeli dari Institut Nasional Standar dan Teknologi (Gaithersburg, MD, USA). Setiap jenis nanopartikel disonikasi selama 10 menit sebelum digunakan. Nanopartikel dan ion juga divortex selama 10 detik sebelum digunakan.

Reagen

Natrium hidroksida (NaOH, 0,1 mol/L) dibeli dari Nacalai Tesque Company (Osaka, Jepang) dan asam nitrat (HNO₃ , 70%) dibeli dari Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Jepang). Fosfat-buffered saline (PBS), pH 7, telah disiapkan.

Optimasi Metode Perawatan Awal

Epidermis dan dermis masing-masing tikus dipisahkan, dicampur dengan PBS (w/v perbandingan 1:10), dan dihomogenkan. Homogenat dicampur dengan larutan 100 ng/mL nAg100. Campuran kemudian diperlakukan dengan salah satu reagen berikut pada v/v rasio 1:1; 0,1 mol/L NaOH, 70% HNO₃ , atau PBS. Sampel diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 °C dan dikenai sp-ICP-MS.

Pemisahan Kulit melalui Iradiasi Microwave

Setiap tikus di-eutanasia dengan isofluran (Wako), setelah itu 2 cm ² (2 cm × 1 cm) sampel kulit punggung dipotong menggunakan gunting bedah dan pinset. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama prosedur eksisi. Oven microwave (RE-SW-20-H, Sharp, Japan) digunakan untuk menyinari kulit pada frekuensi 2450 MHz. Sampel kulit diletakkan di atas piring dan diletakkan di tengah oven microwave. Sesuai dengan persyaratan pengujian, sampel kulit diiradiasi masing-masing selama 10, 30, dan 60 detik pada 200, 600, dan 900 W. Setelah iradiasi, sampel dikeluarkan dengan cepat dan masing-masing epidermis dan dermis dipisahkan dengan cepat dengan pengikisan lembut dengan pinset bedah. Larutan nAg100 100 ng/mL digunakan untuk analisis laju pemulihan dan diameter rata-rata nAg setelah iradiasi (200 W, 30 detik).

Administrasi Transdermal nAg100 dan Ag ⁺

Tikus Slc:ICR betina umur sembilan minggu dibagi menjadi 6 kelompok yang terdiri dari 3 ekor mencit per kelompok, sesuai dengan berat badannya. Tikus dibius menggunakan isofluran. Rambut di punggung mereka dicukur dengan gunting rambut (Panasonic®, Osaka, Jepang) dan pisau cukur tangan (Gillette®, Jerman). Selanjutnya, nAg100 dan Ag ⁺ (20 g/cm ² ) langsung diterapkan pada luas permukaan 2,25 cm ² (1,5 cm × 1,5 cm) dari kulit punggung dan ditutup rapat dengan film plastik non-penyerap. Sepotong kain kasa dengan ukuran yang sama ditempatkan pada film plastik. Perban elastis berperekat digunakan untuk menutupi kasa dengan membungkus kulit dan kulit dibiarkan tertutup selama 5 hari.

Pretreatment Sampel Kulit dan Darah

Lima hari setelah perawatan, darah tepi dari pleksus vena retro-orbital dan kulit punggung dikumpulkan untuk dianalisis. Selanjutnya, 2,25 cm ² (1,5 cm × 1,5 cm) sampel kulit punggung dipotong menggunakan gunting bedah dan pinset. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama eksisi. Lapisan SC dihilangkan secara berurutan menggunakan pita perekat 2 cm (Scotch®, 3M), sebelum memisahkan epidermis dari dermis. Potongan-potongan pita ditekan pada area kulit punggung yang dirawat setelah tekanan konstan diterapkan selama 10 detik. Dua puluh lembar selotip diperlukan untuk menghapus seluruh SC dari setiap tikus. Selanjutnya dermis dan epidermis dipisahkan dengan penyinaran gelombang mikro dan dihomogenkan dengan PBS (w/v rasio 1:10). Darah yang dikumpulkan, serta homogenat dermis dan epidermis, diperlakukan dengan 0,1 mol/L NaOH pada v/v rasio 1:1 dan diinkubasi secara terpisah selama 3 jam pada 37 °C. Setelah inkubasi, massa perak kotor dalam campuran darah, epidermis, dan dermis dianalisis dengan spektrometri massa plasma (ICP-MS) yang digabungkan secara induktif. Kuantifikasi dan penilaian sifat fisik nAgs dan Ag ⁺ dilakukan menggunakan sp-ICP-MS.

Pengukuran Massa Kotor Perak

Untuk mengukur konsentrasi total perak dalam sampel darah, SC, epidermis, dan dermis, digunakan sistem Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Kondisi di mana analisis dilakukan adalah sebagai berikut:daya RF 1550 W; gas pembawa 1,05 L/menit Ar; dan waktu tinggal 100 ms. Pengukuran diulang tiga kali dalam mode MS. Rhodium digunakan sebagai standar internal untuk Ag. Elemen target analisis ICP-MS adalah ¹⁰³ Rh dan ¹⁰⁷ Ag. Larutan standar Ag dan rhodium diperoleh dari Wako.

Analisis dan Perhitungan sp-ICP-MS

Sebuah Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) digunakan untuk analisis sp-ICP-MS. Kondisi analisis adalah sebagai berikut:daya RF 1550 W; gas pembawa 1,05 L/menit Ar; waktu tinggal 10 ms; dan waktu analisis 30 detik. Alat penghitungan partikel tunggal—RIKILT yang diterbitkan oleh Wagenen Food Safety Research (Universitas Wageningen, Wageningen, Belanda)—digunakan untuk menghitung ukuran partikel [20].

Analisis Statistik

Semua analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 5.0 untuk Macintosh (Perangkat Lunak GraphPad, La Jolla, CA, USA). Signifikansi statistik ditetapkan pada P <0,05.

Hasil dan Diskusi

Strategi Pembuatan Metode untuk Menentukan Kuantitas dan Sifat Fisik nAg di Setiap Lapisan Kulit

Untuk menentukan kuantitas dan sifat fisik nAg di setiap lapisan kulit, sampel kulit perlu dilarutkan sepenuhnya dan disiapkan sampel yang sesuai untuk analisis sp-ICP-MS. Hal ini juga penting untuk memisahkan epidermis dan dermis, tanpa kehilangan selama pemulihan, atau perubahan sifat fisik nAg, karena nAg yang diserap secara non-transdermal kadang-kadang dapat dihilangkan selama penghapusan SC melalui pita stripping [21].

Berkenaan dengan pelarutan sampel kulit, kami sebelumnya telah melaporkan bahwa pretreatment NaOH adalah teknik yang optimal untuk kuantifikasi serta analisis sifat fisik nAg dalam jaringan hewan, seperti hati, jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa [16]. Oleh karena itu, pretreatment NaOH diterapkan pada sampel kulit yang digunakan dalam penelitian ini.

Perawatan hidrotermal, yang mengarah pada pelunakan serat kolagen dan peningkatan pencernaan enzim, yang mendorong pemisahan di persimpangan epidermal-dermal (EDJ), secara luas digunakan untuk memisahkan kulit menjadi lapisan epidermis dan dermal [22]. Meskipun perawatan ini secara efisien memisahkan lapisan kulit, nAg di lapisan dapat terionisasi dalam larutan berair yang mengakibatkan perubahan sifat fisiknya. Dilaporkan bahwa gelombang pendek iradiasi gelombang mikro memungkinkan kulit dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermal melalui pembentukan panas yang mengganggu EDJ [23, 24]. Oleh karena itu, kami menerapkan iradiasi gelombang mikro tanpa inkubasi ke dalam larutan untuk waktu yang singkat.

Secara kolektif, kami mengusulkan strategi (diilustrasikan pada Gambar. 1), yang divalidasi dengan menganalisis tingkat pemulihan dan perubahan sifat fisik nAg di setiap lapisan kulit.

Strategi penentuan kuantitas dan sifat fisik nAg100 pada setiap lapisan jaringan kulit. Untuk menentukan kuantitas dan sifat fisik nAg100 pada setiap lapisan jaringan kulit perlu dilakukan (1) melarutkan jaringan kulit secara sempurna dan (2) memisahkan kulit menjadi jaringan epidermis dan dermal, tanpa kehilangan jaringan selama pemulihan atau perubahan sifat fisik nAg100. Dalam hal ini, kami fokus pada (1) perlakuan awal NaOH dan (2) penyinaran gelombang mikro

Optimasi Metode Perawatan Awal untuk Mendeteksi nAg100 di Epidermis dan Dermis

Kami mengacu pada penelitian kami sebelumnya untuk mengoptimalkan metode pra-perawatan untuk melarutkan sampel kulit. Ishizaka dkk. [15] melaporkan bahwa, di antara berbagai jenis reagen pelarut, seperti NaOH dan HNO_3, Pretreatment NaOH sudah optimal. Jadi, kami menguji HNO₃ dan NaOH sebagai reagen pelarutan asam dan basa, masing-masing. Homogenat epidermis dan dermis yang dipisahkan dari sampel kulit tikus dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL diikuti dengan perlakuan dengan masing-masing reagen pelarutan pada suhu 37 °C. Pertama, kami mengevaluasi tingkat pemulihan Ag setelah pengobatan dengan reagen ini. Analisis ICP-MS menunjukkan bahwa tingkat pemulihan hampir 100% dicapai oleh NaOH dan HNO₃ pengobatan saja (Gbr. 2a). Selanjutnya, untuk mengevaluasi perubahan sifat fisik akibat setiap perlakuan, kami menganalisis konsentrasi pemulihan setiap partikel dan ion. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa nAg100 hampir sepenuhnya terionisasi oleh HNO₃ . Hal ini menunjukkan bahwa HNO_3, sebagai reagen asam, melarutkan partikel dan mengubahnya menjadi ion, seperti yang juga dilaporkan dalam penelitian sebelumnya [15]. Sebaliknya, mayoritas nAg100 diperlakukan dengan NaOH tetap sebagai partikel, dan bukan sebagai ion (Gbr. 2b). Dengan demikian, NaOH memungkinkan sebagian besar nAg100 tetap dalam bentuk partikel. Akhirnya, distribusi diameter partikel dievaluasi untuk menganalisis sifat fisik secara rinci. HNO₃ perlakuan mengubah diameter partikel rata-rata dari 100 nm menjadi 40 nm, yang sesuai dengan ionisasi nAg100. Sebaliknya, diameter partikel rata-rata setelah perlakuan NaOH adalah sekitar 100 nm, sesuai dengan ukuran partikel awal (Gbr. 2c). Hal ini menunjukkan bahwa pretreatment NaOH optimal untuk mendeteksi nAg100 pada kulit tikus.

Pretreatment NaOH adalah metode yang optimal untuk mendeteksi nAg100 di dermis dan epidermis. Dua reagen pelarut (HNO₃ dan NaOH) disaring sebagai pelarut pretreatment untuk melisiskan jaringan. Homogenat epidermis (E) dan dermis (D) dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL dan diperlakukan dengan masing-masing reagen pelarut pada 37 °C. Setelah 3 jam, semua sampel dianalisis melalui ICP-MS dan sp-ICP-MS. a tingkat pemulihan Ag, b nAg (bilah hitam) dan Ag ⁺ tingkat pemulihan (batang berbayang), dan c diameter partikel rata-rata disajikan. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Data telah dinyatakan sebagai mean ± S.D. (n =3)

Pemisahan Sampel Kulit menjadi Epidermis dan Dermis melalui Iradiasi Microwave dan Evaluasi Tingkat Pemulihan dan Perubahan Sifat Fisik nAgs

Untuk memisahkan sampel kulit menjadi lapisan epidermis dan dermal, kami menerapkan kondisi berbeda dari iradiasi gelombang mikro yang relevan dengan penelitian kami dan sebelumnya dilaporkan berhasil [24] dan membandingkan kinerjanya sehubungan dengan keterpisahan kulit dan perubahan properti fisik. Diamati bahwa pada kondisi 200 W selama 10 detik, 600 W selama 30 detik, 600 W selama 60 detik, 950 W selama 30 detik, dan 950 W selama 60 detik, kulit gagal memisahkan diri menjadi lapisan epidermis dan dermal ( Gambar 3a). Selain itu, kulit hanya dipisahkan sebagian menjadi lapisan epidermis dan dermal pada kondisi 200 W selama 60 detik, 600 W selama 10 detik, dan 950 W selama 10 detik. Sebaliknya, kulit hanya terpisah sempurna menjadi lapisan epidermis dan dermal setelah iradiasi pada 200 W selama 30 detik. Hasil ini menunjukkan bahwa penyinaran pada 200 W selama 30 detik adalah optimal untuk pemisahan lapisan kulit.

Skrining dan evaluasi kondisi untuk memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis dengan iradiasi gelombang mikro. a Jaringan kulit diiradiasi dengan gelombang mikro dalam sembilan kondisi dan dipisahkan menjadi jaringan epidermis dan dermal. Panel kiri dan kanan menunjukkan sampel kulit sebelum dan sesudah iradiasi. Di panel kanan, lingkaran putih tunggal, ganda, dan tiga menunjukkan masing-masing kondisi yang tidak dapat dipisahkan, dapat dipisahkan sebagian, dan sepenuhnya dapat dipisahkan. Bilah skala:1 cm. Homogenat kulit dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL, dan diiradiasi pada 200 W selama 30 detik, dan dianalisis melalui sp-ICP-MS. b nAg (bilah hitam) dan Ag ⁺ (bar berbayang) tingkat pemulihan dan c diameter partikel rata-rata disajikan. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Data telah dinyatakan sebagai mean ± S.D. (n =3)

Untuk memverifikasi apakah iradiasi gelombang mikro ini pada 200 W selama 30 detik mempengaruhi sifat fisik nAg100, kami menentukan sifat fisik Ag di lapisan epidermis dan dermal. Homogenat epidermis dan dermis, masing-masing dicampur dengan 100 ng/mL nAg100, dilisiskan menggunakan NaOH dan diiradiasi pada 200 W selama 30 detik. Analisis Sp-ICP-MS mengungkapkan bahwa sebagian besar nAg100 yang diberi perlakuan dengan iradiasi gelombang mikro tetap sebagai partikel, dan begitu juga dengan kelompok yang tidak diberi perlakuan (Gbr. 3b). Untuk menganalisis sifat fisik secara rinci, distribusi diameter partikel juga dievaluasi. Partikel rata-rata berdiameter hampir 100 nm, yang sesuai dengan ukuran partikel awal (Gbr. 3c). Temuan ini menunjukkan bahwa iradiasi gelombang mikro sampel kulit pada 200 W selama 30 detik adalah pendekatan yang menjanjikan untuk memisahkan kulit secara efisien menjadi lapisan epidermis dan dermal tanpa mengubah sifat fisik nAg100.

Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa kami telah berhasil mengembangkan sistem untuk menentukan sifat fisik nAg100 secara semi-kuantitatif di setiap lapisan kulit. Secara khusus, metode ini memerlukan yang berikut:(i) penghilangan nAg100 yang diserap secara non-transdermal dengan menghilangkan SC dengan metode stripping tape [21]; (ii) pemisahan kulit menjadi lapisan epidermis dan dermal melalui penyinaran gelombang mikro; (iii) pelarutan epidermis dan dermis dengan perlakuan NaOH; dan (iv) penentuan sifat fisik Ag secara semi-kuantitatif pada setiap lapisan kulit menggunakan sp-ICP-MS.

Evaluasi Praktis dengan Menentukan Kuantitas dan Sifat Fisik nAg100 dan Ag ⁺ di Lapisan Kulit Mouse Di Vivo

Untuk mengevaluasi penerapan praktis dari pendekatan ini, kami menganalisis kuantitas dan sifat fisik Ag di epidermis dan dermis serta dalam darah tepi, setelah kulit tikus terpapar nAg100 dan Ag ⁺ dalam hidup. Lima hari setelah paparan, kami memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis di bawah kondisi yang dioptimalkan untuk iradiasi gelombang mikro dan melarutkannya menggunakan NaOH, seperti yang dijelaskan pada bagian sebelumnya. Analisis ICP-MS menunjukkan bahwa Ag hadir di semua jaringan (seperti epidermis, dermis, dan darah) dari semua kelompok. Di dermis dan darah, Ag di Ag ⁺ kelompok yang terpapar nAg100 cenderung meningkat, dibandingkan dengan kelompok yang terpapar nAg100 (Gbr. 4a). Data menunjukkan bahwa meskipun bentuk ion dan partikel diserap dan didistribusikan secara perkutan seperti yang dilaporkan sebelumnya [8, 9], lebih mudah bagi bentuk ionik untuk menyusup ke lapisan jaringan dalam daripada bentuk partikel.

Analisis sifat fisis semi-kuantitatif nAg100 dan Ag ⁺ diterapkan pada kulit tikus in vivo. Pertama, kulit tikus terkena nAg100 dan Ag ⁺ (20 g Ag/cm ² ). Lima hari setelah pemaparan, kuantifikasi, dan evaluasi sifat fisik Ag di epidermis, dermis, dan darah dilakukan masing-masing melalui ICP-MS dan sp-ICP-MS. a Konsentrasi Ag dan b tingkat partikel terdeteksi di epidermis, dermis, dan darah. c Diameter rata-rata partikel terdeteksi di epidermis dan dermis. Garis putus-putus mewakili ukuran partikel awal. Semua data telah dinyatakan sebagai mean ± S.E. (n =3). *p <0,05 (Siswa tes)

Selanjutnya, kami mengevaluasi rasio nAg dan Ag ⁺ di setiap sampel. Di Ag ⁺ kelompok terpajan, hampir semua Ag terdeteksi dalam bentuk ionik di epidermis, dermis, dan darah, menunjukkan bahwa Ag ⁺ diserap dan didistribusikan secara perkutan tanpa perubahan sifat fisik. Sebaliknya, pada kelompok yang terpapar nAg100, sekitar 70% Ag di epidermis dan dermis hadir dalam bentuk partikel, sedangkan Ag yang tersisa terionisasi. Selanjutnya, Ag yang terdeteksi dalam darah tepi hampir seluruhnya terionisasi dan bentuk partikelnya hampir tidak terdeteksi (Gbr. 4b). Akhirnya, kami mengevaluasi ukuran partikel di lapisan epidermis dan dermal, di mana sebagian besar bentuk partikel terdeteksi. analisis sp-ICP-MS mengungkapkan bahwa ukuran partikel terdeteksi di kedua lapisan sekitar 70-80 nm, sesuai dengan tingkat di mana nAg100 terionisasi (Gbr. 4c). Data ini menunjukkan bahwa ketika kulit terpapar nAg100, kulit dapat diserap dan didistribusikan saat terionisasi.

Seperti yang dilaporkan sebelumnya, ligan permukaan nanopartikel mempengaruhi penyerapannya ke dalam kulit [25, 26]. Misalnya, nanopartikel emas yang dimodifikasi dengan gugus amino diserap ke dalam kulit tikus dan manusia lebih banyak daripada nanopartikel emas yang dimodifikasi dengan gugus karboksil dalam eksperimen ex vivo [25]. Selain itu, analisis dinamika molekuler menunjukkan bahwa kemampuan penetrasi kulit menurun dari hidrofobik netral ke kationik menjadi nanopartikel emas anionik dalam urutan itu [26]. Dalam hal ini, disimpulkan dalam penelitian ini bahwa nAg100 lebih kecil kemungkinannya untuk menembus SC di epidermis, penghalang kulit awal, karena nAg100 dimodifikasi dengan sitrat dan bermuatan negatif. Oleh karena itu, alasan partikel-partikel yang diamati di dermis dan darah mungkin karena partikel-partikel tersebut menembus melalui pori-pori dan juga melalui epidermis.

Juga telah dilaporkan bahwa penetrasi nanopartikel emas ditingkatkan dengan modifikasi dengan peptida penembus sel, seperti Tat dan R7 [25]. Oleh karena itu, di masa depan, modifikasi serupa dapat dipertimbangkan untuk nAgs agar dapat menghantarkannya lebih dalam ke kulit. Selanjutnya, mungkin perlu untuk mengurangi ukuran nAgs, karena efek modifikasi permukaan lebih besar dengan luas permukaan spesifik yang lebih besar.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami mengembangkan pendekatan pretreatment untuk menentukan sifat fisik nAg100 secara semi-kuantitatif di setiap lapisan kulit dengan sp-ICP-MS. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami menunjukkan bahwa paparan kulit terhadap nAg100 dapat mengakibatkan nAg100 terionisasi, diserap, dan didistribusikan ke lapisan yang lebih dalam. Oleh karena itu, untuk memahami respons biologis atau toksisitas yang terkait dengan paparan nAg100 pada kulit, mungkin perlu mempertimbangkan tidak hanya distribusi nAg100, dan ukuran partikelnya, tetapi juga distribusi Ag ⁺ dari nAg100, yang meleleh ke dalam jaringan kulit. Oleh karena itu, pendekatan ini menjanjikan sebagai teknik fundamental yang dapat digunakan untuk analisis risiko.

Ketersediaan Data dan Materi

Berbagi data tidak berlaku untuk artikel ini karena tidak ada kumpulan data yang dibuat atau dianalisis selama studi saat ini.

Singkatan

ENP:

Nanopartikel yang direkayasa

nAg::

Nanopartikel perak

Ag ⁺ :

Ion perak

sp-ICP-MS:

Partikel tunggal yang digabungkan secara induktif spektrometri massa plasma

SC:

Stratum korneum

nAg100:

Nanopartikel perak dengan diameter 100 nm

AgNO₃ :

Perak nitrat

NaOH:

Natrium hidroksida

HNO₃ :

Asam nitrat

PBS:

Garam dengan buffer fosfat

ICP-MS:

Spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif

EDJ:

Sambungan epidermis-dermal

Meningkatkan Efisiensi Konversi Daya Sel Surya Quantum Dot-Sensitized dengan Mengintegrasikan Konsep Fotovoltaik Konsentrasi dengan Fotoanoda Ganda Adsorpsi Produk Terurai SF6 pada C3N Modifikasi ZnO:Studi Teori