Pengembangan dan Evaluasi Sistem untuk Penentuan Semi-Kuantitatif Sifat Fisik Kulit Setelah Paparan Nanopartikel Perak
Abstrak
Untuk memastikan penggunaan yang aman dari nanopartikel perak (nAgs) dalam kosmetik, perlu untuk mengungkapkan sifat fisik nAgs di dalam kulit, karena sifat ini dapat berubah selama proses penyerapan perkutan. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk membangun sistem analitik berdasarkan partikel tunggal yang digabungkan secara induktif spektrometri massa plasma (sp-ICP-MS) untuk menentukan sifat fisik nAgs di kulit. Pertama, kami mengoptimalkan metode praperlakuan untuk melarutkan sampel kulit dan kemudian menunjukkan bahwa sebagian besar nAg diperoleh kembali dengan perlakuan natrium hidroksida sambil tetap dalam bentuk partikel. Untuk memisahkan kulit menjadi epidermis dan dermis, kami menyaring beberapa kondisi iradiasi gelombang mikro. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa penerapan 200 W selama 30 detik adalah optimal, karena kondisi ini memastikan pemisahan lapisan kulit secara sempurna tanpa mengubah sifat fisik sebagian besar nAgs. Terakhir, kami mengevaluasi aplikasi in vivo dengan menganalisis kuantitas serta sifat fisik Ag di epidermis, dermis, dan darah tepi mencit setelah kulit dipapar nAgs atau Ag
+
. Analisis sp-ICP-MS selanjutnya menunjukkan bahwa nAgs dapat diserap dan didistribusikan ke lapisan yang lebih dalam dalam bentuk terionisasi, sedangkan Ag
+
diserap dan didistribusikan tanpa perubahan sifat fisik. Studi ini menunjukkan bahwa untuk mendapatkan pemahaman yang komprehensif tentang respons kulit setelah terpapar nAgs, penting untuk mempertimbangkan distribusi dan ukuran partikel tidak hanya nAgs tetapi juga Ag
+
dilepaskan dari nAgs ke dalam kulit.
Pengantar
Kemajuan teknologi terbaru dalam nanoteknologi telah mempercepat pengembangan nanopartikel rekayasa (ENPs) yang partikel lebih kecil dari 100 nm. Karena sifatnya yang menguntungkan, seperti penetrasi jaringan yang ditingkatkan dan reaksi permukaan, dibandingkan dengan bahan berukuran mikro atau lebih besar, ENP banyak digunakan dalam berbagai produk, termasuk kosmetik, makanan, dan obat-obatan [1,2,3]. Misalnya, nanopartikel perak (nAgs), salah satu jenis ENP yang paling umum, dimasukkan ke dalam kosmetik karena sifat antibakterinya yang dihasilkan dari pelepasan ion perak yang stabil (Ag
+
) [4, 5]. Namun, sifat fisikokimia unik yang terkait dengan ukuran partikel kecil nAgs bisa berbahaya. Diketahui bahwa partikel-partikel ini dapat mengganggu penghalang yang tidak dapat ditembus, seperti penghalang darah-otak, dan menyebabkan peradangan [6]. Selain itu, beberapa penelitian telah melaporkan bahwa ENPs dapat menembus penghalang kulit [7,8,9]. Oleh karena itu, untuk menentukan keamanan penggunaan partikel-partikel ini secara terus-menerus, penting untuk memahami efek toksik yang terkait dengan ENP yang mengandung nAgs dengan menyelidiki dinamika partikel-partikel ini di dalam jaringan, seperti kulit.
Untuk memastikan keamanan, sangat penting untuk memahami kemungkinan risiko yang terkait dengan penggunaan ENP, yang melibatkan konsep integratif "bahaya" (potensi toksisitas) dan "kondisi paparan." Sementara bahaya ENP telah dianalisis di seluruh dunia, hanya beberapa penelitian yang meneliti kondisi yang berkaitan dengan paparan ENP [10]. Secara khusus, telah dilaporkan bahwa nAgs dan Ag
+
dapat mengubah sifat fisiknya di dalam tubuh. Misalnya, ionisasi nAgs menghasilkan pembentukan nAgs dengan ukuran partikel yang lebih kecil dan pelepasan Ag
+
[11]. Sebaliknya, nAgs yang memiliki ukuran partikel kecil dapat dideteksi pada epitel usus tikus setelah pemberian perak asetat secara oral [12]. Selanjutnya, kami baru-baru ini melaporkan bahwa dibandingkan dengan nAgs dan Ag yang lebih kecil
+
, nAg yang lebih besar lebih mudah ditemukan dalam ASI tikus menyusui yang terpapar nAgs tersebut [13]. Oleh karena itu, nAgs dapat mengubah sifat fisiknya di dalam tubuh, yang pada gilirannya menyebabkan perubahan kinetika. Jadi, untuk memahami risiko yang terlibat, perlu untuk mengevaluasi sifat fisik, seperti ukuran partikel, partikel ini, dan untuk membedakan antara partikel ini dan ion dalam tubuh.
Dalam hal ini, kami menerapkan partikel tunggal yang digabungkan secara induktif spektrometri massa plasma (sp-ICP-MS), yang memasukkan maksimum satu partikel ke dalam penganalisis per waktu tinggal. Ini adalah metode efektif yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran partikel dengan menganalisis intensitas puncak dan konsentrasi partikel melalui laju puncak. Partikel dan ion dapat dibedakan dengan menganalisis sinyal puncak dan sinyal latar [14]. Kami sebelumnya telah mengoptimalkan metode pretreatment untuk sp-ICP-MS dalam sampel biologis untuk secara semi-kuantitatif menentukan sifat fisik ENP di berbagai organ, seperti hati, jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa [15].
Kulit terdiri dari epidermis, termasuk stratum korneum (SC), dan dermis, yang mengandung pembuluh darah, pembuluh limfatik, dan saraf [16]. Oleh karena itu, masuknya ENP ke dalam setiap lapisan kulit dapat menyebabkan toksisitas dalam berbagai tingkat. Sebagai contoh, distribusi nanopartikel titanium dioksida dalam sel-sel keratinosit kulit manusia dari epidermis dapat merangsang produksi spesies oksigen reaktif [17]. Selain itu, pada tikus yang tidak berbulu, paparan dermal terhadap nanopartikel titanium dioksida selama 60 hari tidak hanya menyebabkan perubahan patologis, seperti dermis yang lebih tipis karena toksisitas lokal, tetapi juga perubahan patologis di hati, seperti nekrosis likuifaksi akibat toksisitas sistemik yang menyebar melalui pembuluh darah di dermis [18]. Selain itu, respon biologis pada setiap lapisan juga dapat bervariasi tergantung pada sifat fisik, seperti ukuran partikel, dan perbedaan antara partikel dan ion [19]. Untuk memahami keamanan penggunaan nAgs, perlu dipahami sifat fisik dan biodistribusi nAgs setelah terpapar ke kulit.
Untuk mengatasi masalah khusus ini, diperlukan pendekatan yang dapat melakukan pra-perawatan kulit dan memisahkan lapisannya tanpa menyebabkan kerugian selama pemulihan atau perubahan sifat fisik ENP. Namun, pendekatan optimal untuk kulit tersebut belum ditemukan.
Dalam penelitian ini, kami mengoptimalkan pendekatan pra-perawatan yang secara semi-kuantitatif menentukan sifat fisik nAgs, model ENP, di setiap lapisan kulit melalui sp-ICP-MS, dan selanjutnya mengevaluasi efektivitasnya secara in vivo.
Metode
Tikus
Slc:ICR tikus (betina, 8 minggu) dibeli dari Jepang SLC (Shizuoka, Jepang). Tikus ditempatkan di sebuah ruangan dengan siklus terang-gelap berikut:lampu menyala pada pukul 8 pagi dan mati pada pukul 8 malam. Makanan dan air disediakan dalam bentuk pelet makanan dan sistem pasokan air yang terletak di atas kandang. Semua protokol eksperimental dilakukan di bawah kondisi yang disetujui oleh komite penelitian hewan Universitas Osaka, Jepang.
nAgs dan Ag
+
Suspensi sitrat-ligan-capped nAgs dengan diameter 100 nm (nAg100) dibeli dari nanoComposix (San Diego, CA, USA) dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). Perak nitrat (AgNO3 ) dibeli dari Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Jepang), juga dalam bentuk dispersi stok (1 mg/mL). RM8013, digunakan sebagai standar untuk menghitung efisiensi transportasi, dibeli dari Institut Nasional Standar dan Teknologi (Gaithersburg, MD, USA). Setiap jenis nanopartikel disonikasi selama 10 menit sebelum digunakan. Nanopartikel dan ion juga divortex selama 10 detik sebelum digunakan.
Reagen
Natrium hidroksida (NaOH, 0,1 mol/L) dibeli dari Nacalai Tesque Company (Osaka, Jepang) dan asam nitrat (HNO3 , 70%) dibeli dari Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Jepang). Fosfat-buffered saline (PBS), pH 7, telah disiapkan.
Optimasi Metode Perawatan Awal
Epidermis dan dermis masing-masing tikus dipisahkan, dicampur dengan PBS (w/v perbandingan 1:10), dan dihomogenkan. Homogenat dicampur dengan larutan 100 ng/mL nAg100. Campuran kemudian diperlakukan dengan salah satu reagen berikut pada v/v rasio 1:1; 0,1 mol/L NaOH, 70% HNO3 , atau PBS. Sampel diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 °C dan dikenai sp-ICP-MS.
Pemisahan Kulit melalui Iradiasi Microwave
Setiap tikus di-eutanasia dengan isofluran (Wako), setelah itu 2 cm
2
(2 cm × 1 cm) sampel kulit punggung dipotong menggunakan gunting bedah dan pinset. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama prosedur eksisi. Oven microwave (RE-SW-20-H, Sharp, Japan) digunakan untuk menyinari kulit pada frekuensi 2450 MHz. Sampel kulit diletakkan di atas piring dan diletakkan di tengah oven microwave. Sesuai dengan persyaratan pengujian, sampel kulit diiradiasi masing-masing selama 10, 30, dan 60 detik pada 200, 600, dan 900 W. Setelah iradiasi, sampel dikeluarkan dengan cepat dan masing-masing epidermis dan dermis dipisahkan dengan cepat dengan pengikisan lembut dengan pinset bedah. Larutan nAg100 100 ng/mL digunakan untuk analisis laju pemulihan dan diameter rata-rata nAg setelah iradiasi (200 W, 30 detik).
Administrasi Transdermal nAg100 dan Ag
+
Tikus Slc:ICR betina umur sembilan minggu dibagi menjadi 6 kelompok yang terdiri dari 3 ekor mencit per kelompok, sesuai dengan berat badannya. Tikus dibius menggunakan isofluran. Rambut di punggung mereka dicukur dengan gunting rambut (Panasonic®, Osaka, Jepang) dan pisau cukur tangan (Gillette®, Jerman). Selanjutnya, nAg100 dan Ag
+
(20 g/cm
2
) langsung diterapkan pada luas permukaan 2,25 cm
2
(1,5 cm × 1,5 cm) dari kulit punggung dan ditutup rapat dengan film plastik non-penyerap. Sepotong kain kasa dengan ukuran yang sama ditempatkan pada film plastik. Perban elastis berperekat digunakan untuk menutupi kasa dengan membungkus kulit dan kulit dibiarkan tertutup selama 5 hari.
Pretreatment Sampel Kulit dan Darah
Lima hari setelah perawatan, darah tepi dari pleksus vena retro-orbital dan kulit punggung dikumpulkan untuk dianalisis. Selanjutnya, 2,25 cm
2
(1,5 cm × 1,5 cm) sampel kulit punggung dipotong menggunakan gunting bedah dan pinset. Perhatian khusus diberikan untuk mencegah kerusakan jaringan selama eksisi. Lapisan SC dihilangkan secara berurutan menggunakan pita perekat 2 cm (Scotch®, 3M), sebelum memisahkan epidermis dari dermis. Potongan-potongan pita ditekan pada area kulit punggung yang dirawat setelah tekanan konstan diterapkan selama 10 detik. Dua puluh lembar selotip diperlukan untuk menghapus seluruh SC dari setiap tikus. Selanjutnya dermis dan epidermis dipisahkan dengan penyinaran gelombang mikro dan dihomogenkan dengan PBS (w/v rasio 1:10). Darah yang dikumpulkan, serta homogenat dermis dan epidermis, diperlakukan dengan 0,1 mol/L NaOH pada v/v rasio 1:1 dan diinkubasi secara terpisah selama 3 jam pada 37 °C. Setelah inkubasi, massa perak kotor dalam campuran darah, epidermis, dan dermis dianalisis dengan spektrometri massa plasma (ICP-MS) yang digabungkan secara induktif. Kuantifikasi dan penilaian sifat fisik nAgs dan Ag
+
dilakukan menggunakan sp-ICP-MS.
Pengukuran Massa Kotor Perak
Untuk mengukur konsentrasi total perak dalam sampel darah, SC, epidermis, dan dermis, digunakan sistem Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Kondisi di mana analisis dilakukan adalah sebagai berikut:daya RF 1550 W; gas pembawa 1,05 L/menit Ar; dan waktu tinggal 100 ms. Pengukuran diulang tiga kali dalam mode MS. Rhodium digunakan sebagai standar internal untuk Ag. Elemen target analisis ICP-MS adalah
103
Rh dan
107
Ag. Larutan standar Ag dan rhodium diperoleh dari Wako.
Analisis dan Perhitungan sp-ICP-MS
Sebuah Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) digunakan untuk analisis sp-ICP-MS. Kondisi analisis adalah sebagai berikut:daya RF 1550 W; gas pembawa 1,05 L/menit Ar; waktu tinggal 10 ms; dan waktu analisis 30 detik. Alat penghitungan partikel tunggal—RIKILT yang diterbitkan oleh Wagenen Food Safety Research (Universitas Wageningen, Wageningen, Belanda)—digunakan untuk menghitung ukuran partikel [20].
Analisis Statistik
Semua analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 5.0 untuk Macintosh (Perangkat Lunak GraphPad, La Jolla, CA, USA). Signifikansi statistik ditetapkan pada P <0,05.
Hasil dan Diskusi
Strategi Pembuatan Metode untuk Menentukan Kuantitas dan Sifat Fisik nAg di Setiap Lapisan Kulit
Untuk menentukan kuantitas dan sifat fisik nAg di setiap lapisan kulit, sampel kulit perlu dilarutkan sepenuhnya dan disiapkan sampel yang sesuai untuk analisis sp-ICP-MS. Hal ini juga penting untuk memisahkan epidermis dan dermis, tanpa kehilangan selama pemulihan, atau perubahan sifat fisik nAg, karena nAg yang diserap secara non-transdermal kadang-kadang dapat dihilangkan selama penghapusan SC melalui pita stripping [21].
Berkenaan dengan pelarutan sampel kulit, kami sebelumnya telah melaporkan bahwa pretreatment NaOH adalah teknik yang optimal untuk kuantifikasi serta analisis sifat fisik nAg dalam jaringan hewan, seperti hati, jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa [16]. Oleh karena itu, pretreatment NaOH diterapkan pada sampel kulit yang digunakan dalam penelitian ini.
Perawatan hidrotermal, yang mengarah pada pelunakan serat kolagen dan peningkatan pencernaan enzim, yang mendorong pemisahan di persimpangan epidermal-dermal (EDJ), secara luas digunakan untuk memisahkan kulit menjadi lapisan epidermis dan dermal [22]. Meskipun perawatan ini secara efisien memisahkan lapisan kulit, nAg di lapisan dapat terionisasi dalam larutan berair yang mengakibatkan perubahan sifat fisiknya. Dilaporkan bahwa gelombang pendek iradiasi gelombang mikro memungkinkan kulit dipisahkan menjadi lapisan epidermis dan dermal melalui pembentukan panas yang mengganggu EDJ [23, 24]. Oleh karena itu, kami menerapkan iradiasi gelombang mikro tanpa inkubasi ke dalam larutan untuk waktu yang singkat.
Secara kolektif, kami mengusulkan strategi (diilustrasikan pada Gambar. 1), yang divalidasi dengan menganalisis tingkat pemulihan dan perubahan sifat fisik nAg di setiap lapisan kulit.