Sintesis Hijau Nanopartikel Logam dan Oksida Logam dan Pengaruhnya pada Alga Uniseluler Chlamydomonas reinhardtii

Metode

Materi

GK komersial, perak nitrat (AgNO₃ ), hidrogen tetrakloroaurat (HAuCl₄ ·3H₂ O), tembaga klorida (CuCl₂ ·2H₂ O), asam kloroplatinat (H₂ PtCl₆ ), kalium tetrakloropaladat(II) (K₂ PdCl₄ ), hidrogen klorida (HCl), natrium hidroksida (NaOH) dan amonium hidroksida (NH₄ OH) semuanya dibeli dari Sigma-Aldrich, USA. Air deionisasi (DI) digunakan untuk semua percobaan. Semua bahan kimia dan reagen yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas analitis.

C. reinhardtii kultur alga (strain CPCC11) diperoleh dari Canadian Phycological Culture Center (CPCC, Department of Biology, University of Waterloo, Canada).

Pemrosesan GK

Bubuk GK (1 g) dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi 1 L air DI dan diaduk perlahan semalaman di atas pengaduk magnet. Larutan gum selanjutnya dibiarkan pada suhu kamar (20 °C) selama 18 jam untuk memisahkan bahan yang tidak larut. Larutan gum kemudian disaring melalui corong kaca sinter (ukuran pori 10–16 m) dan larutan bening diliofilisasi dan disimpan sampai diperlukan.

Sintesis NP Logam dan Oksida Logam Menggunakan GK

Secara singkat, 100 μL alikuot 10 mM AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ dan K₂ PdCl₄ larutan ditambahkan ke 10 mL larutan GK berair dalam labu berbentuk kerucut 50 mL yang terpisah. Penyesuaian pH dispersi koloid dilakukan dengan menambahkan HCl 0,1 N atau NaOH 0,1 N untuk mencapai hasil maksimum pembentukan NP. Untuk mensintesis NP Ag, Au, Pt dan Pd, AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ , dan K₂ PdCl₄ dan campuran GK diaduk dalam pengocok orbital Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) pada 250 rpm pada suhu berkisar antara 45 hingga 95 °C selama 1 jam. Solusinya masing-masing berubah menjadi kuning muda, merah anggur, hitam pekat dan hitam teredam, menunjukkan pembentukan NP Ag, Au, Pt dan Pd. Pada kasus Pt, reduksi dan pembentukan NP terjadi pada pH 8,0 dan suhu 90 °C, sedangkan NP Pd terbentuk pada pH 8,5 dan 95 °C. Lihat selengkapnya di Padil dkk. [66, 67].

NP CuO disintesis menggunakan proses sintesis termal koloid [13]. Secara singkat, 100 L alikuot dari 10 mM larutan tembaga klorida dihidrat (CuCl₂ ·2H₂ O) dicampur dengan 10 mL larutan GK (100 mg didispersikan dalam 10 mL air DI) dan NaOH dalam labu berbentuk kerucut 50 mL yang terpisah, dengan CuCl₂ ·2H₂ O dan NaOH dipertahankan pada rasio molar 2:5. Campuran yang mengandung CuCl₂ ·2H₂ O dan GK diaduk pada 250 rpm pada suhu 75 °C selama 1 jam dalam pengocok orbital. Warna campuran berangsur-angsur berubah dari kebiruan menjadi hitam, menunjukkan pembentukan NP CuO. Endapan yang dihasilkan diperoleh dengan cara sentrifugasi dan dicuci terlebih dahulu dengan etanol kemudian air DI.

Karakterisasi NP Sintesis Hijau

Konsentrasi logam dalam NP yang baru disintesis diukur menggunakan spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer).

Pembentukan dan stabilitas NP logam dinilai menggunakan spektrofotometer UV–Vis Cintra 202 (GBC, Australia), stabilitas NP ditentukan setelah 6 bulan.

Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari NP Ag, Au, Pt, Pd, dan CuO diperoleh menggunakan mikroskop Tecnai F 12 (FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA) yang beroperasi pada tegangan percepatan 15 kV. Sampel disiapkan untuk analisis TEM dengan menjatuhkan 10–20 μL dispersi NP-anorganik GK ke dalam kisi tembaga dan dikeringkan pada suhu kamar, setelah menghilangkan kelebihan larutan.

Kondisi Kultur Alga

Klamidomonas reinhardtii dikultur dalam media TAPx4 (File tambahan 1:Tabel S1, informasi pendukung) pada 20 °C dalam inkubator (Infors, Swiss) yang dilengkapi dengan pengocok yang terus berputar pada 100 rpm dan pengaturan pencahayaan 114,2 μmol foto m ^{− 2} s ⁻¹ . Sel alga ditumbuhkan pada tingkat eksponensial untuk mendapatkan sekitar 10 ⁶ sel/mL.

Karakterisasi NP dalam Media Paparan Alga

Distribusi ukuran NP di C. reinhardtii Media TAPx4 diukur menggunakan teknik sedimentasi sentrifugal diferensial (DCS) pada sentrifugal cakram DC24000UHR (CPS Instruments Inc., USA). Pengukuran dilakukan pada kecepatan putaran cakram 24.000 rpm, dan sedimentasi partikel dilakukan menggunakan 8–24% (w /dengan ) gradien kerapatan sukrosa. Sebelum setiap pengukuran sampel, instrumen dikalibrasi menggunakan standar nanosfer PVC (470 nm). NP juga dicirikan oleh mobilitas elektroforesis, dan pendekatan Smoluchowski digunakan untuk menentukan zeta-potensial (ZP) pada Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., UK). Setiap pengukuran dilakukan lebih dari 10 kali dengan fungsi autokorelasi selama 10 detik, setiap hasil diperoleh dari pengukuran rangkap tiga dari sampel yang sama.

Metode ultra-filtrasi digunakan untuk menentukan jumlah ion logam dalam media alga (Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). Aliquot yang diambil pada interval waktu yang berbeda (2 dan 24 jam) disentrifugasi selama 30 menit pada 7500 rpm untuk memisahkan partikel dan agregat. Supernatan kemudian disaring melalui filter ultra-filtrasi Amicon Ultracel 3K dengan pemotongan berat molekul 3-kDa (Millipore, USA) untuk memisahkan ion dari partikel. NP dan agregat dengan diameter lebih besar dari 1,3 nm tertahan pada filter, dan filtrat dianalisis dengan ICP-MS untuk ion terlarut [68].

Generasi ROS abiotik dengan meningkatnya konsentrasi NP dalam media alga ditentukan menggunakan fluorescent dichlorodihydroflourescein diacetate (H₂ DCF-DA, Sigma-Aldrich, Swiss), seperti yang dijelaskan dalam studi sebelumnya [47, 69].

Pengaruh NP pada Pertumbuhan Alga, Integritas Membran, dan Generasi Stres Oksidatif

Pengaruh NP logam dan oksida logam pada pertumbuhan alga, integritas membran dan generasi stres oksidatif diuji menggunakan flow cytometry (FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, USA). Percobaan dilakukan dalam botol transparan (PS, 50 mL, Semadeni, Swiss) yang mengandung 5 mL suspensi alga dan NP pada konsentrasi 1, 5, 10 dan 20 mg/L. Sampel kontrol tanpa NP dijalankan secara paralel. Sel alga dipanaskan dalam air mendidih (100 °C) selama 15 menit untuk memberikan kontrol positif untuk membran sel yang rusak. Sel alga juga diperlakukan dengan jinten (Sigma-Aldrich, USA), agen spesies oksidatif, selama 30 menit dalam gelap sebagai kontrol positif stres oksidatif (ROS). Semua sampel yang tidak diobati dan sampel yang dirawat dengan NP diinkubasi dalam kondisi yang sama dengan yang diadopsi untuk memelihara kultur. Sub-sampel diambil setelah 1, 3, 5 dan 24 jam untuk menilai efek NP pada integritas membran seluler dan stres oksidatif menggunakan FCM. Sebuah alikuot 250-μL dari setiap sampel dipindahkan ke pelat dasar datar Microtiter® 96-sumur. Untuk menilai integritas membran seluler, probe fluoresen propidium iodida (PI) (P4170, Sigma-Aldrich, USA) ditambahkan ke sampel pada konsentrasi akhir 7 μM. Untuk deteksi stres oksidatif, CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, USA) ditambahkan ke sampel sesuai instruksi produk. Singkatnya, PI mengikat DNA dan menempel pada RNA setelah penetrasi intraseluler melalui membran sel yang rusak, tetapi dikeluarkan dari sel sehat. CellROX® Green Reagent adalah probe untuk mengukur stres oksidatif dalam sel hidup. Pewarna permeant sel berfluoresensi lemah saat dalam keadaan tereduksi tetapi menunjukkan fluoresensi fototabel hijau terang pada oksidasi oleh ROS dan selanjutnya mengikat DNA. Dengan demikian, sinyalnya terutama terlokalisasi pada nukleus dan mitokondria. Pelat diinkubasi dalam gelap selama 20 menit (PI) dan 30 menit (ROS) sebelum pengukuran FCM. Suspensi alga kemudian dilewatkan melalui FCM dengan laser eksitasi 488-nm biru. CellROX Green diukur dalam saluran FL1 533/30 nm, fluoresensi merah PI di saluran FL2 585/40 nm dan autofluoresensi merah klorofil a (Chla ) di saluran FL3> 670 nm. Eksperimen dilakukan dalam rangkap dua dan berulang.

Data FCM dianalisis menggunakan perangkat lunak CFlow Plus (BD Biosciences, USA). Sampel diberi gerbang, berdasarkan sifat hamburan maju dan autofluoresensi merah Chla , untuk menghilangkan sinyal dari NP, serpihan, dan kontaminan lainnya. Jumlah sel, persentase membran sel yang rusak atau sel yang mengalami stres oksidatif, dan data autofluoresensi diambil berdasarkan autofluoresensi Chla (670 nm), sel berlabel PI (585 nm) dan ROS Green (533 nm) (File tambahan 1:Gambar S1).

Efisiensi Fotosistem Alga II

Suspensi NP oksida logam dan logam ditambahkan ke kultur alga yang sama (sekitar 10 ⁶ sel/mL) dalam labu kaca 15-mL untuk mencapai konsentrasi akhir 1, 5, 10 dan 20 mg/L. Kultur alga tanpa NP disiapkan sebagai kontrol negatif. Semua sampel kemudian dipindahkan ke inkubator di bawah kondisi yang sama yang digunakan untuk kultur alga asli. Aliquot (2,2 mL) dari setiap sampel diambil segera dan setelah inkubasi 1, 3, 5 dan 24 jam untuk mendeteksi hasil kuantum fotosistem II (QY) menggunakan fluorometer AquaPen-C AP-C 100 (PSI Ltd., Ceko Republik). Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga. QY mewakili rasio fluoresensi variabel (F _v = B _m B ₀ ) hingga fluoresensi maksimum (F _m ), dengan QY = F _v :B _m digunakan sebagai proksi efisiensi pendinginan fotokimia [70]. B _m diperoleh dengan menerapkan iluminasi pada 680 nm selama beberapa detik sebelum dan di akhir iluminasi, dengan fluoresensi minimal (F ₀ ) menjadi pengukuran awal pada tingkat fluoresensi minimum tanpa adanya cahaya fotosintesis.

Analisis Statistik

Pengaruh NP logam dan oksida logam pada C. reinhardtii diuji menggunakan analisis varians ANOVA dan uji Dunnett (GraphPad PRISM, USA). Tingkat signifikansi ditetapkan pada *P < 0,05, **P < 0.01 dan ***P < 0.001.

Hasil

Pembentukan dan Karakterisasi Utama NP

Gambar TEM dari NP Ag, Au, Pt, Pd, dan CuO yang disintesis menggunakan GK menunjukkan NP bulat yang terpisah dengan baik dengan diameter mulai dari 2 hingga 100 nm (Gbr. 1a–e). Larutan NP koloid berair yang diperiksa di bawah spektroskopi UV-Vis (Gbr. 1f) menunjukkan resonansi plasmon permukaan yang berbeda pada 412 dan 525 nm, konsisten dengan pembentukan NP Au dan Ag dalam jaringan GK. Tidak ada resonansi plasmon permukaan yang berbeda yang diamati untuk NP Pt, Pd atau CuO. Pengukuran UV–Vis setelah 6 bulan mengonfirmasi stabilitas semua NP, spektrum yang menampilkan puncak tunggal dengan ukuran rata-rata yang sama dengan NP yang baru disintesis (File tambahan 1:Gambar S2).

Gambar mikroskop elektron transmisi a Au, b Pt, c Ag, d Pd dan e Nanopartikel CuO disintesis menggunakan gum karaya dan garam logam yang sesuai. a , b , c , d dan e sisipan grafik menunjukkan distribusi ukuran partikel puncak dengan berat partikel nano dalam media alga, sebagaimana ditentukan oleh sedimentasi sentrifugal diferensial. (F) Spektrum UV–Vis untuk nanopartikel Au, Ag, Pt, Pd dan CuO

Karakterisasi NP dalam Media Paparan Alga

Ukuran NP, berdasarkan distribusi bobot, berkisar antara 180 hingga 5 nm sebagai berikut:CuO> Au> Pt> Ag> Pd. Semua NP bermuatan negatif pada pH 7 (Tabel 1 dan File tambahan 1:Gambar S3). NP Pt, Ag, dan CuO memiliki konsentrasi logam ionik tertinggi (33–36 μg/L), dan NP Au dan Pt terendah (6–7 g/L) (Tabel 1). Bentuk ionik logam dideteksi dalam media alga (Tabel 1).

Pengaruh terhadap Pertumbuhan Alga

C. reinhardtii budaya memiliki tingkat pertumbuhan 1 × 10 ⁶ sel/jam. Dengan adanya 1 mg/L NP Ag, Pd, dan CuO, laju pertumbuhan menurun tajam menjadi 2,2 × 10 ⁴ , 1,7 × 10 ⁴ dan 0.2 × 10 ⁴ sel/jam, masing-masing (P < 0,001). Sebagai konsentrasi NP meningkat lebih lanjut, pertumbuhan alga benar-benar terhambat (Gbr. 2). Ketika ganggang terkena Au dan Pt NP, tingkat pertumbuhan juga berkurang secara signifikan dibandingkan dengan kontrol (P < 0.001), tetapi peningkatan konsentrasi tidak meningkatkan efeknya.

Tingkat pertumbuhan Chlamydomonas reinhardtii terkena logam Au, Pt, Pd, Ag dan CuO logam dan nanopartikel oksida logam (1, 5, 10 dan 20 mg/L). Tingkat pertumbuhan untuk kontrol yang tidak terpapar (kultur alga) adalah 1 × 10 ⁶ sel/jam setelah 24 jam. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari eksperimen berulang menggunakan sampel duplikat

Generasi Stres Oksidatif dalam Sel

Stres oksidatif bervariasi tergantung pada jenis NP (Gbr. 3). Efek tertinggi, dengan hampir 100% sel terpengaruh, disebabkan oleh 5–20 mg/L NP Ag dan CuO (Gbr. 3d, e dan File tambahan 1:Tabel S2). Ketika sel alga terpapar Au NP, stres oksidatif jauh lebih rendah, dengan sebagian besar < 10% sel terpengaruh. Konsentrasi tertinggi Au NP (20 mg/L) hanya memengaruhi 15% sel (P < 0,001). Persentase sel yang stres menurun secara bertahap dari waktu ke waktu, tanpa stres oksidatif yang terdeteksi setelah 24 jam untuk semua konsentrasi Au yang diuji (Gbr. 3a). Pt NP menyebabkan stres oksidatif pada kurang dari 8% sel alga selama 5 jam pertama paparan (Gbr. 3b). Hanya pada konsentrasi 10 dan 20 mg/L stres dihasilkan pada 10 dan 19% sel, masing-masing, setelah 24 jam (P < 0,001; File tambahan 1:Tabel S2), tanpa stres yang terdeteksi pada konsentrasi yang lebih rendah (P> 0.1) setelah paparan 24 jam (Gbr. 3b). Paparan 1 mg/L Ag NP gagal menginduksi stres oksidatif pada sel alga selama periode 24 jam (P> 0.9). Namun, paparan 5 mg/L mengakibatkan stres oksidatif setelah 5 jam, dan paparan 10 dan 20 mg/L mengakibatkan stres oksidatif setelah 3 jam. Setelah 24 jam terpapar Ag NP, 100% sel mengalami stres (P < 0,001; Gbr. 3c dan File tambahan 1:Tabel S2). NP CuO menginduksi signifikan (P < 0,001) stres oksidatif dalam sel alga lebih cepat (3 jam) daripada NP logam lain yang diuji pada 10 dan 20 mg/L (File tambahan 1:Tabel S2), kecuali untuk NP Ag. Stres oksidatif sudah signifikan pada 5 mg/L setelah 5 jam. Semua konsentrasi (> 5 mg/L) memiliki pengaruh yang signifikan terhadap stres oksidatif sel (Gbr. 3d, e). Sebagai parameter pelengkap, kami juga menentukan ROS abiotik yang dihasilkan oleh NP. Berbeda dengan C. reinhardtii tingkat pertumbuhan dan persentase C. reinhardtii sel menunjukkan stres oksidatif, Au NP hanya menghasilkan sedikit peningkatan ROS abiotik (P> 0,05; File tambahan 1:Gambar S4).

Persentase Chlamydomonas reinhardtii sel yang menunjukkan stres oksidatif setelah terpapar dengan peningkatan konsentrasi (1, 5, 10, dan 20 mg/L) a Au, b Pt, c Pd, d Ag dan e nanopartikel CuO setelah 1, 3, 5 dan 24 jam. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari eksperimen berulang menggunakan sampel duplikat. Catatan berbeda y -skala sumbu untuk Au dan Pt

Pengaruh terhadap Integritas Membran Alga

NP Au dan Pt menyebabkan signifikan (P < 0.001) kerusakan membran sel pada semua konsentrasi dari 1 hingga 5 jam (File tambahan 1:Tabel S3); namun, tidak ada efek yang signifikan (P> 0,05) diamati setelah 24 jam (Gbr. 4a, b). Dalam kasus NP Ag, 100% sel rusak (P < 0.001) setelah 1 jam paparan 1–20 mg/L (Gbr. 4c, File tambahan 1:Tabel S3, Ag). Persentase membran sel yang rusak setelah terpapar 1 dan 5 mg/L Pd NP (File tambahan 1:Tabel S3, Pd) sebanding dengan persentase kontrol selama 24 jam (P> 0.4). Di sisi lain, kerusakan yang signifikan (P < 0,001) diamati setelah 24 jam paparan 20 mg/L Pd NP (Gbr. 4d). Efek CuO meningkat dengan meningkatnya konsentrasi dan waktu, mencapai dampak tertinggi setelah 24 jam (Gbr. 4e dan File tambahan 1:Tabel S3).

Persentase Chlamydomonas reinhardtii sel dengan membran yang rusak setelah terpapar dengan peningkatan konsentrasi (1, 5, 10 dan 20 mg/L) a Au, b Pt, c Pd, d Ag dan e nanopartikel CuO setelah 1, 3, 5 dan 24 jam. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari eksperimen berulang menggunakan sampel duplikat. Catatan berbeda y -skala sumbu untuk Au dan Pt

Efek pada Klorofil (Chl ) Fluoresensi

Chl fluoresensi tidak terpengaruh secara signifikan (P> 0.1) oleh Au NP pada konsentrasi apa pun selama periode 24 jam dan oleh Pt selama periode 5 jam (Gbr. 5a, b dan File tambahan 1:Tabel S4). Di sisi lain, NP Ag, Pd dan CuO sangat dihambat (P < 0.001) Chl fluoresensi dengan meningkatnya konsentrasi dan waktu pemaparan, mis. Chl fluoresensi berkurang dari 98% (1 jam) menjadi 22% (24 jam) (P < 0.001) saat sel alga ditumbuhkan dengan adanya 5 mg/L Ag (File tambahan 1:Tabel S4). Penurunan fluoresensi serupa juga diamati untuk 10 dan 20 mg/L Ag, dengan kadar turun menjadi 20 dan 9% (P < 0,001), masing-masing (Gbr. 5c). CuO dan Pd NP (keduanya 20 mg/L) menyebabkan penurunan tajam pada Chl fluoresensi setelah 24 jam (P < 0,001). Tidak ada efek yang dapat diamati (P> 0.1), namun, untuk 1 atau 5 mg/L Pd dan untuk 1 mg/L NP Ag dan CuO (Gbr. 5c–e).

Persentase Chlamydomonas reinhardtii sel dengan klorofil (Chl ) fluoresensi setelah paparan terhadap peningkatan konsentrasi (1, 5, 10 dan 20 mg/L) a Au, b Pt, c Pd, d Ag dan e nanopartikel CuO setelah 1, 3, 5 dan 24 jam. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari eksperimen berulang menggunakan sampel duplikat

Pengaruh NP pada Fotosistem Alga II

Au, Pt dan CuO NP memiliki efek yang sedikit signifikan (P < 0,05) pada fotosistem II QY pada beberapa titik waktu selama periode 24 jam pada konsentrasi mulai dari 1 hingga 20 mg/L (Gbr. 6 dan File tambahan 1:Tabel S5). Di sisi lain, QY berkurang secara signifikan (P < 0.001) setelah hanya 1 jam setelah kontak dengan NP Ag pada semua konsentrasi (Gbr. 6c dan File tambahan 1:Tabel S5). NP Pd dan CuO menghasilkan penurunan QY yang signifikan pada konsentrasi tertinggi 20 mg/L (Gbr. 6d, e dan File tambahan 1:Tabel S5).

Pengaruh a Au, b Pt, c Pd, d Ag dan e nanopartikel CuO (1, 5, 10 dan 20 mg/L) pada efisiensi fotosistem II (QY %) setelah 1, 3, 5 dan 24 jam. Seratus persen pada y -sumbu mewakili QY dari kultur alga kontrol tanpa partikel nano. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari eksperimen berulang dari sampel yang digandakan

Diskusi

Dalam karya ini, kami bertujuan untuk mengeksplorasi penghapusan produksi limbah beracun selama sintesis bahan nano logam dan oksida logam dalam menerapkan pendekatan kimia hijau [16, 57, 58], penekanan utama adalah pada penggunaan dispersan ramah lingkungan dan bahan terbarukan dan biodegradable. Kami berhasil menggunakan GK, bahan alami, terbarukan, dan dapat terurai secara hayati untuk sintesis dan stabilisasi berbagai NP. Menggunakan air DI sebagai pelarut, gugus fungsi yang ada di GK (yaitu –OH dan –COO–) bertindak sebagai zat pereduksi dan polimer GK itu sendiri bertindak sebagai zat penutup untuk NP yang terbentuk, sehingga memungkinkan sintesis hijau NP [59, 68]. NP yang disintesis dalam penelitian kami (Au, Pt, Pd, Ag dan CuO) sebanding dalam hal ukuran, stabilitas, dan efektivitas biaya dengan NP hijau lainnya yang disintesis dari penelitian sebelumnya [13, 69].

Kami kemudian menggunakan rentang konsentrasi skala nano (1–20 mg/L) terkait dengan konsentrasi lingkungan yang diharapkan atau tercatat [39, 71,72,73] untuk menilai efek biologis NP pada C. reinhardtii menggunakan titik akhir seperti pertumbuhan alga, integritas membran, Chl efisiensi fotosistem II fluoresensi dan stres oksidatif. Hasil kami mengungkapkan dua pengelompokan yang berbeda:NP Au dan Pt yang memiliki sedikit atau tidak berpengaruh pada alga, dan NP Ag, Pd dan CuO yang menunjukkan efek kuat pada hampir semua titik akhir (File tambahan 1:Tabel S6). Studi toksisitas NP logam atau oksida logam telah mengidentifikasi beberapa karakteristik fisiko-kimia utama NP yang dapat dikaitkan dengan toksisitasnya, termasuk komposisi, pelapisan, ukuran, bentuk dan homo- atau heteroagregasi [69, 74,75,76,77, 78]. Selain itu, toksisitas logam terlarut (bentuk ionik) sebelumnya telah ditunjukkan pada alga menggunakan berbagai kriteria, termasuk pembentukan ROS intraseluler, Chl penipisan dan penghambatan fotosintesis [79,80,81]. Kami dengan jelas mendeteksi generasi ROS dan efeknya pada pertumbuhan, Chl produksi dan fotosistem II setelah paparan NP Ag, Pd dan CuO.

Sementara NP Pd biasanya dianggap sebagai kelompok toksik, mereka belum dipelajari secara luas dan baru-baru ini diakui sebagai NP antibakteri yang penting [41]. Secara umum diyakini bahwa ukuran kecil (1,5–3 nm) NP Pd berkontribusi terhadap atribut antibakterinya, mungkin memfasilitasi transportasi ke sel melalui pori-pori dinding sel bakteri atau alga, yang memiliki diameter berkisar antara 5 hingga 20 nm [82, 83] . In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO₃ on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .

Pengaruh Parameter Penyesuaian pH untuk Modifikasi Sol–Gel Terhadap Struktur, Mikro, dan Sifat Magnetik Strontium Ferit Nanokristalin Studi Teori pada InGaAs/InAlAs SAGCM Avalanche Photodiode