Studi Antitumor dari Chondroitin Sulfate-Methotrexate Nanogels
Abstrak
Self-assembly nanogels (NGs) dibentuk oleh bioconjugating methotrexate (MTX) dengan kondroitin sulfat (CS). NG MTX-CS dapat sangat meningkatkan kelarutan dan meningkatkan kemanjuran pengiriman MTX karena sifat pengikatan CD44 dari CS. Eksperimen Vivo mengungkapkan bahwa NG MTX-CS menunjukkan toksisitas yang lebih rendah daripada MTX. MTX-CS NG dapat meningkatkan efek anti tumor sekaligus mengurangi efek samping MTX. Karena sifatnya yang mengikat CD44, konjugat obat konjugat sulfat dapat menjadi platform yang menjanjikan dan efisien untuk meningkatkan kelarutan molekul obat yang sedikit larut serta pengiriman yang ditargetkan ke sel kanker dan jaringan tumor.
Latar Belakang
Methotrexate (4-amino-10-methylfolic acid, MTX) adalah analog folat, milik keluarga antifolat antimetabolit [1]. MTX adalah obat pertama yang digunakan dalam terapi tumor dari tahun 1950-an [2], yang merupakan obat anti-tumor mutagen dan teratogenik, yang bekerja dengan menghalangi aktivitas enzim dan mengganggu sintesis DNA [3]. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa pemberian obat kemoterapi ke sel target saja tidak cukup untuk menginduksi kematian sel, dan MTX dosis tinggi dapat secara signifikan meningkatkan angka kesembuhan dan prognosis pasien [4]. Kelarutan air yang rendah, permeabilitas rendah, dan waktu paruh pendek MTX membatasi aplikasi klinisnya [5, 6]. Efek kemoterapi MTX sebagian besar dipengaruhi oleh serapan sel tumor yang rendah, biodistribusi jaringan, dan efek samping yang serius [7]. Namun, konsentrasi MTX yang lebih tinggi dapat meningkatkan risiko efek samping karena bioavailabilitas MTX yang buruk [8]. Ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan sistem penghantaran obat baru untuk meningkatkan ketersediaan hayati MTX dan mengurangi efek sampingnya.
Nanoteknologi memiliki keunggulan dalam sistem penghantaran obat, antara lain meningkatkan stabilitas obat, memperlancar peredaran darah, mengurangi efek samping, dan mengontrol pelepasan obat [9,10,11,12,13,14,15]. Teknologi self-assembly telah banyak digunakan di bidang penghantaran obat untuk meningkatkan efikasi dan menurunkan efek samping obat [16,17,18,19,20]. Penelitian kami bertujuan untuk merancang sistem penghantaran obat nanogel untuk MTX untuk meningkatkan kelarutan dan biodistribusinya serta mengurangi efek sampingnya. Chondroitin sulfate (CS) adalah glikosaminoglikan asam (GAG), yang merupakan komponen penting dari tulang rawan, dinding pembuluh darah, kulit, tendon, dan jaringan ikat lainnya [21]. Nanogel berdasarkan kondroitin sulfat telah dipelajari sebelumnya [22, 23]. Studi menemukan bahwa CD44 mengikat proteoglikan CS [24,25,26]. CD44 adalah glikoprotein transmembran dengan domain ekstraseluler dan telah terlibat dalam memediasi interaksi sel-sel dan sel-ECM dan berperan dalam migrasi sel [27]. CD44 sangat diekspresikan pada kanker metastatik berbeda dengan level ekspresinya yang rendah pada jaringan normal [28]. Nanopartikel berdasarkan CS telah dilaporkan untuk penargetan tumor dan pengiriman obat anti tumor [29, 30]. Di sini, kami membuat jenis baru nanogel CS-MTX rakitan mandiri dalam upaya meningkatkan pengiriman target molekul obat MTX ke sel kanker melalui interaksi CS-CD44.
Metode
Materi dan Sampel
Chondroitin sulfate dibeli dari Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Liaoning, China). 4-Methylmorpholine, tetrahydrofuran, dan 2-chloro-4, 6-dimethoxy-1, 3, 5-triazine dibeli dari Sun Chemical Technology (Shanghai, China) Co., Ltd., dan serum fetal bovine (FBS) dibeli dari HyClone (Utah, AS). Semua bahan kimia lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Tikus Lewis dibeli dari Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China).
Sintesis DMT-MM
4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) digunakan untuk reaksi kondensasi dehidrasi dengan aktivasi asam karboksilat yang dapat digunakan dalam pelarut berair atau proton sistem. Dua puluh lima gram 2-kloro-4, 6-dimetoksi-1, 3, 5-triazin (CDMT) dilarutkan dalam 200 ml tetrahidrofuran (THF). Kemudian, 18,79 ml 4-metilmorfolina (NMM) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan CDMT sambil diaduk. Untuk memastikan respons yang lengkap, pengadukan harus dipertahankan selama 30 menit. Kemudian, produk yang disaring dicuci tiga kali dengan THF dan dikeringkan di bawah vakum selama 24 jam. DMT-MM diperoleh sebagai bubuk putih (Skema 1).
Jalur sintetis dalam pembentukan DMT-MM
Sintesis MTX-CS
CS terkonjugasi MTX diaktifkan oleh DMT-MM. Untuk aktivasi CS, CS (1,0 g) dilarutkan dalam 20 ml air ultra murni dan diaktifkan dengan menambahkan DMT-MM (0,769 g). Reaksi dilakukan selama 30 menit pada suhu kamar. Kemudian, CS yang diaktifkan direaksikan lebih lanjut dengan MTX selama 24 jam pada suhu kamar. Larutan didialisis selama 48 jam dengan mengganti air setiap 4 jam dan diliofilisasi. MTX-CS diperoleh sebagai bubuk kuning. Bubuk kuning diperiksa dengan spektrometri inframerah transformasi Fourier (ALPHA, BRUKER, USA). Spektrum FTIR direkam dari 400 hingga 4000 cm
−1
.
1
H NMR digunakan untuk menentukan apakah MTX terkonjugasi ke CS (Skema 2).
Jalur sintetis dalam pembentukan MTX-CS
Sitotoksisitas Nanogel MTX-CS
Sitotoksisitas nanogel dianalisis dengan menggunakan sel tumor A549T dan Hela serta kultur Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC). Sel A549T dan Hela diunggulkan dalam pelat 96 sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur pada tahun 1640, dilengkapi dengan 10% FBS dan diinkubasi selama 24 jam di bawah 5% CO2 pada 37 °C. A549T diikuti dengan perlakuan dengan konsentrasi MTX-CS NG yang berbeda (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM), dan Hela diikuti dengan perlakuan dengan konsentrasi MTX- yang berbeda. CS NG (0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 μM) selama 48 jam lagi. Konsentrasi NG MTX-CS didasarkan pada kandungan MTX di setiap sampel. Konsentrasi CS didasarkan pada kandungan NG MTX-CS di setiap sampel. HUVECs diunggulkan di pelat 96 sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur di DMEM, dilengkapi dengan 10% FBS dan diinkubasi selama 24 jam di bawah 5% CO2 pada 37 °C. HUVEC kemudian ditambahkan konsentrasi yang berbeda dari MTX-CS NGs (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM). Konsentrasi NG MTX-CS didasarkan pada kandungan MTX di setiap sampel. Konsentrasi CS didasarkan pada kandungan NG MTX-CS di setiap sampel. Uji MTT adalah pengukuran aktivitas sel. Dua puluh mikroliter buffer CCK-8 ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi pada 37 °C di bawah 5% CO2 selama 4 jam lagi. Media telah dihapus, dan 200 L DMSO ditambahkan ke setiap sumur. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 490 nm (570 nm sebagai referensi) pada pembaca Microplate MULTISKAN GO (Thermo Scientific, USA).
Desain Hewan dan Eksperimental
Untuk menganalisis toksisitas MTX-CS NGs in vivo, tikus Sprague-Dawley jantan kedelapan belas dibeli dari Pusat Hewan Eksperimental dari Akademi Ilmu Kedokteran Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang, Cina). Tikus-tikus itu ditempatkan di bawah siklus 12 jam terang, 12 jam gelap dengan akses gratis ke air dan makanan. Tikus, berusia 8 minggu (200 ± 10 g), secara acak dibagi menjadi tiga kelompok:kelompok kontrol (disuntik dengan saline volume yang sama), kelompok MTX (disuntik dengan 1,25 μmol kg
−1
hari
−1
), dan grup MTX-CS NG (disuntikkan dengan 25 mg kg
−1
hari
−1
MTX-CS NG). Dosis MTX kelompok MTX-CS NG sama dengan dosis bebas kelompok MTX (1,25 μmol kg
−1
hari
−1
). Obat diberikan pada hari lain masing-masing dengan suntikan intraperitoneal. Setelah 2 minggu perawatan (total tujuh suntikan), semua tikus dibunuh dengan cara dipenggal kepalanya untuk penelitian lebih lanjut.
Studi Histologi
Setelah pemenggalan kepala, semua limpa tikus dibedah dengan cepat dan dicuci dua kali dengan fosfat-buffered saline (PBS) dan difiksasi dalam 4% (w /v ) paraformaldehyde (pH = 7.4) (Sigma-Aldrich, MO, USA) selama 24 jam. Kemudian, jaringan disiapkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) menggunakan prosedur standar dan diperoleh di bawah mikroskop cahaya berkualitas tinggi.
Hasil dan Diskusi
Sintesis MTX-CS
Untuk menentukan apakah MTX terkonjugasi ke CS, kami menggunakan FTIR dan
1
H NMR untuk menganalisis sampel biokonjugasi MTX, CS, dan MTX-CS. Gambar 1 menunjukkan spektrum FTIR CS (Gbr. 1a), MTX (Gbr. 1b), dan biokonjugat MTX-CS (Gbr. 1c). Seperti yang ditunjukkan oleh Gbr. 1b, MTX memiliki transmitansi karakteristik pada 3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403, dan 1207 cm
−1
. FTIR memuncak pada 1600 dan 1540 cm
−1
dapat ditugaskan untuk peregangan para-benzena, yang dapat ditemukan dalam spektrum FTIR dari MTX (Gbr. 1b) dan biokonjugat MTX-CS (Gbr. 1c). Hasil FTIR menunjukkan bahwa MTX berhasil terkonjugasi ke CS.
a Spektrum FTIR CS. b Spektrum FTIR dari MTX. c Spektrum FTIR MTX-CS
Gambar 2 menunjukkan
1
Spektrum H NMR dari biokonjugat CS, MTX, dan MTX-CS. Puncaknya pada 6,93 (2H, d, J = 10,1 Hz) dan 7,84 (2H, d, J = 10.1 Hz) dapat ditetapkan ke grup benzoil dari MTX. Puncak pada 4,90 (2H, s) dapat ditetapkan ke metilen di sebelah gugus 2, 4-diamino-6-pteridinil, dan puncak pada 8,69 (1H, s) dapat ditetapkan ke 2, 4-diamino- Kelompok 6-pteridinil MTX seperti yang ditunjukkan Gambar 2b.
1
H NMR dari CS-MTX (Gbr. 2c) menyarankan CS (bagian disakarida δH sinyal antara 3,20 dan 5,40, dengan 5,39 ditetapkan sebagai karbon anomerik) berhasil dilekatkan pada MTX (pergeseran kimia gugus benzoil adalah 8,00 dan 6,88, dan gugus metil pada 3,20). NMR juga membuktikan bahwa MTX terkonjugasi ke CS.
1
Spektrum H NMR CS, MTX, dan CS-MTX. a
1
Spektrum H NMR CS; CS dibubarkan di D2 O. b
1
spektrum H NMR dari MTX; MTX dilarutkan dalam dimetil sulfoksida-d6. c
1
spektrum H NMR CS-MTX; CS-MTX dibubarkan di D2 O
Untuk menghitung jumlah MTX yang terkonjugasi ke CS, sampel dilarutkan dalam air ultra murni dan dikocok selama 48 jam pada suhu kamar. Jumlah MTX ditentukan melalui penggunaan spektrofotometer UV-vis pada 309 nm. Jumlah MTX diukur dengan spektroskopi UV-vis. Akhirnya, jumlah metotreksat yang dihitung pada NG MTX-CS adalah 13,65%. Nanogel yang dibentuk oleh enkapsulasi molekul MTX hidrofobik oleh lapisan luar rantai samping hidrofilik CS (Gbr. 3a). Nanogel dicirikan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS), mikroskop gaya atom (AFM), dan mikroskop elektron transmisi (TEM). Seperti yang ditunjukkan, data DLS mengukur ukuran semua nanogel dalam kisaran 100–400 nm (Gbr. 3b). Ukuran partikel nanopartikel terutama sekitar 200 nm. Gambar AFM dari nanogel menegaskan bahwa nanopartikel terdistribusi dengan baik dengan ukuran yang sama sekitar 200 nm dan morfologi (Gbr. 3c). Gambar TEM juga menunjukkan ukuran nanogel adalah nanosfer dengan ukuran berkisar antara 200–240 nm. Ukuran partikel nanopartikel terutama sekitar 200 nm (Gbr. 3d, e).
Ilustrasi skema NG MTX-CS. Karakterisasi hamburan cahaya dinamis (DLS), mikroskop gaya atom (AFM), dan mikroskop elektron transmisi (TEM) dari MTX-CS NGs. a Ilustrasi skema NG MTX-CS. b Ukuran NG MTX-CS diukur dengan DLS dalam eksperimen representatif. c Gambar AFM dari MTX-CS NG. d , e Gambar TEM dari MTX-CS NG
Untuk menghitung jumlah MTX yang terkonjugasi ke CS, sampel dilarutkan dalam air ultra murni dan dikocok selama 48 jam pada suhu kamar. Jumlah MTX ditentukan melalui penggunaan spektrofotometer UV-vis pada 313 nm.
Jumlah MTX diukur dengan spektroskopi UV-vis. Pertama, kurva standar absorpsi UV metotreksat bebas dibuat (Gbr. 4). Hubungan antara absorbansi dan konsentrasi MTX bebas adalah:
Kemudian, 28,8 mg MTX-CS dilarutkan dalam 1000 ml air ultra murni, dan serapan UV adalah 0,2055. Akhirnya, jumlah metotreksat yang dihitung pada NG MTX-CS adalah 13,65%.
Sitotoksisitas Nanogel MTX-CS
Aktivitas anti-tumor in vitro dari MTX-CS NGs, MTX bebas, dan MTX yang dicampur dengan CS dianalisis dengan menggunakan kultur sel tumor A549T dan Hela. Seperti yang ditunjukkan oleh uji MTT (Gbr. 5), NG MTX-CS dapat secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup kedua sel kanker sementara MTX bebas tidak menunjukkan efek apa pun pada konsentrasi tinggi. MTX dicampur dengan CS pada konsentrasi tinggi bahkan mendorong pertumbuhan sel kanker. Viabilitas Hela menurun dari 73,81% untuk MTX gratis menjadi 60,16% untuk MTX-CS NGs (13,65% penurunan viabilitas sel) pada konsentrasi obat 10 μM (Gbr. 5a). Demikian juga, viabilitas sel A549T menurun dari 80,23% untuk MTX gratis menjadi 46,04% untuk MTX-CS NGs (34,09% penurunan viabilitas sel) pada konsentrasi obat 50 μM (Gbr. 5b). Polisakarida seperti asam hialuronat digunakan sebagai bagian penargetan konjugat obat atau nanopartikel untuk terapi kanker karena secara khusus mengikat reseptor CD44 [31]. Chondroitin sulfate juga dapat bertindak sebagai ligan untuk reseptor CD44 [25, 27] yang berarti bahwa CS dapat meningkatkan penyerapan MTX-CS NGs oleh sel kanker dan meningkatkan kemanjuran obat MTX. Selain itu, nanopartikel dapat meningkatkan stabilitas obat dan mengontrol pelepasan obat [32, 33]. Semua hasil membuktikan bahwa aktivitas anti-tumor MTX-CS NGs lebih baik daripada MTX gratis serta MTX yang dicampur dengan CS. Dengan peningkatan efisiensi pengiriman intraseluler molekul obat MTX, selektivitas penargetan MTX-CS NG juga meningkat jika dibandingkan dengan konsentrasi MTX bebas yang sama. Hasil ini menunjukkan bahwa NG MTX-CS memiliki efek anti-tumor yang lebih baik daripada MTX gratis.
a Viabilitas seluler A549 T dengan adanya MTX gratis, MTX dan CS gratis, serta MTX-CS NG dalam 48 jam. b Viabilitas seluler Hela dengan adanya MTX gratis, MTX dan CS gratis, serta MTX-CS NG dalam 48 jam. c Viabilitas seluler HUVEC dengan adanya MTX, CS, dan MTX-CS NG gratis dalam 48 jam
Efek buruk dari MTX-CS NG, MTX bebas, dan CS dianalisis dengan menggunakan kultur HUVEC. Seperti yang ditunjukkan oleh uji MTT (Gbr. 5c), NG MTX-CS dapat secara signifikan mengurangi efek samping sementara MTX gratis dapat secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup HUVEC. Viabilitas HUVEC meningkat dari 63,6% untuk MTX gratis menjadi 73,5% untuk MTX-CS NG (peningkatan viabilitas sel 9,9%) pada konsentrasi obat 10 μM (Gbr. 5c). Viabilitas sel HUVEC pada 400 μM masih 69,95%. Hasilnya menunjukkan bahwa MTX-CS NGs dapat mengurangi efek samping pada sel normal.
Desain Hewan dan Eksperimental
Salah satu efek samping toksik sekunder utama dari MTX yang digunakan untuk mengobati pasien kanker adalah mukositis usus, yang menyebabkan penurunan berat badan yang cepat [34]. Kami kemudian menguji efek perlindungan dari MTX-CS NGs terhadap penurunan berat badan yang diinduksi kemoterapi pada tikus jantan Sprague-Dawley. Kelangsungan hidup dan bobot dipantau selama 14 hari setelah injeksi saline, MTX gratis, dan MTX-CS NG. Tidak ada kematian yang ditemukan di salah satu dari tiga kelompok. Penurunan mendadak diamati pada berat badan semua kelompok MTX (1,25 μmol kg
−1
hari
−1
selama 14 hari), dengan jelas menunjukkan bahwa tikus mengalami sindrom kemoterapi dan kerusakan akibat kemoterapi, yang mengakibatkan penyakit dan penurunan berat badan, sedangkan berat badan tikus yang diobati dengan MTX-CS NG (4,25 mg kg
−1
hari
−1
selama 14 hari) mengalami sedikit peningkatan (Gbr. 6). Hasil penelitian menunjukkan bahwa MTX-CS NGs tidak menyebabkan efek samping. Temuan ini mendukung pengiriman target MTX ke jaringan tumor melalui interaksi CD44-CS dan mengurangi sitotoksisitas obat MTX.
Pengaruh MTX dan MTX-CS NGs pada berat badan tikus. Hari injeksi pertama dianggap sebagai hari 0. Saline, MTX (1,25 μmol kg
−1
hari
−1
), dan MTX-CS NG (4,25 mg kg
−1
hari
−1
) diberikan hari lain dengan suntikan intraperitoneal, masing-masing, ke kelompok yang sesuai. Hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM dan dianalisis menggunakan t tes. *P < 0,05 dibandingkan dengan tanggal pada hari ke 0
Untuk menyelidiki lebih lanjut toksisitas in vivo dari MTX-CS NGs, analisis histologis limpa tikus dilakukan untuk menentukan apakah MTX-CS NGs menyebabkan kerusakan jaringan (Gbr. 7). Bagian dari kelompok kontrol menunjukkan struktur limpa normal, terdiri dari pulpa putih (bentuk) dan pulpa merah (RP), dengan trabekula fibrosa (T) memanjang ke pulpa limpa. Pulpa putih mengandung selubung limfoid periarterial dan folikel limpa dan dikelilingi oleh zona marginal, sedangkan pulpa merah terdiri dari tali limpa dan dipisahkan oleh sinusoid limpa (Gbr. 7a dan 7b). Kelompok yang diobati dengan MTX menunjukkan penyempitan serius pada pulpa putih (kotak hitam) dan RP. Deposit hemosiderin juga dapat ditemukan pada kelompok yang diobati dengan MTX (Gbr. 7c dan 7d). Kelompok yang diobati dengan MTX-CS NG menunjukkan penyempitan ringan pada pulpa putih (bentuk) dan RP, tanpa ditemukan deposit hemosiderin. Baik pulpa putih maupun pulpa merah menunjukkan penyempitan ringan dibandingkan dengan kelompok MTX (Gbr. 7e dan 7f). Hasil di atas menunjukkan bahwa MTX-CS NG memiliki sedikit efek samping pada jaringan normal [35, 36].
Efek toksisitas MTX dan MTX-CS NGs pada limpa tikus. Limpa bernoda H&E dikeluarkan dari tikus setelah 14 hari perawatan setelah tujuh suntikan intraperitoneal. a , b Bagian dari kelompok kontrol. c , d Kelompok yang diobati dengan MTX. e , f Grup yang diobati dengan MTX-CS NG
Kesimpulan
Singkatnya, kami berhasil membuat nanogel rakitan sendiri untuk pengiriman obat anti-tumor yang sangat efisien. Nanogel terkonjugasi MTX-CS berukuran sekitar 200 nm, menunjukkan stabilitas dan kelarutan yang baik. MTX-CS NGs menunjukkan sitotoksisitas yang lebih kuat dan lebih spesifik daripada MTX. Eksperimen in vivo mengungkapkan bahwa NG MTX-CS menunjukkan toksisitas yang lebih rendah daripada MTX. MTX-CS NG dapat meningkatkan efek anti tumor sekaligus mengurangi efek samping MTX. Karena sifatnya yang mengikat CD44, konjugat obat konjugat sulfat dapat menjadi platform yang menjanjikan dan efisien untuk meningkatkan kelarutan molekul obat yang sedikit larut serta pengiriman yang ditargetkan secara aktif dan selektif ke sel kanker dan jaringan tumor.
