Magnetic Poly(N-isopropylacrylamide) Nanokomposit:Pengaruh Metode Preparasi pada Sifat Antibakteri
Abstrak
Tugas paling menantang dalam preparasi poli magnetik(N-isopropilakrilamida) (Fe3 O4 -PNIPAAm) nanokomposit untuk bio-aplikasi adalah untuk memaksimalkan reaktivitas dan stabilitasnya. Polimerisasi emulsi, pengendapan in situ dan penambahan fisik digunakan untuk menghasilkan Fe3 O4 -PNIPAAm-1, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3, masing-masing. Sifatnya dikarakterisasi menggunakan pemindaian mikroskop elektron (morfologi), zeta-potensial (muatan permukaan), analisis termogravimetri (stabilitas), magnetometri sampel bergetar (magnetisasi) dan hamburan cahaya dinamis. Selain itu, kami menyelidiki efek antibakteri dari setiap nanokomposit terhadap Gram-negatif Escherichia coli dan Gram-positif Staphylococcus aureus . Keduanya Fe3 O4 -PNIPAAm-1 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-2 nanokomposit menunjukkan stabilitas termal yang tinggi, potensi zeta dan nilai magnetisasi, menunjukkan sistem koloid yang stabil. Secara keseluruhan, keberadaan Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit, bahkan pada konsentrasi yang lebih rendah, menyebabkan kerusakan signifikan pada keduanya E. koli dan S. aureus DNA dan menyebabkan penurunan viabilitas sel. Biaya3 O4 -PNIPAAm-1 menunjukkan efek antimikroba yang lebih kuat terhadap kedua strain bakteri daripada Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Staphylococcus aureus lebih sensitif daripada E. koli ke ketiga nanokomposit magnetik PNIPAAm.
Latar Belakang
Nanokomposit polimer termoresponsif magnetik telah digunakan untuk berbagai aplikasi, termasuk pengolahan air dan pengobatan nano [1,2,3,4]. Setiap nanokomposit dirancang khusus untuk mendapatkan manfaat dari kombinasi fitur yang melekat pada kedua komponen, yaitu partikel magnetik dan polimer yang responsif terhadap suhu, sehingga menciptakan nanokomposit yang lebih spesifik dan dapat dikontrol. Magnetit (Fe3 O4 ) nanopartikel memberikan sifat magnetik yang memungkinkan pemisahan yang cepat dan mudah setelah penerapan medan magnet eksternal [5]. Poli(N-isopropilakrilamida) (PNIPAAm) membentuk hidrogel tiga dimensi yang mengalami transisi fase temperatur larutan kritis yang lebih rendah (LCST) reversibel dari koil tunggal dengan keadaan terhidrasi bengkak ke keadaan dehidrasi runtuh dan menyusut [6] ketika dipanaskan dalam air di atas 32 °C. Pembungkusan nanopartikel magnetik dengan lapisan PNIPAAm tidak hanya memberikan stabilitas koloid dalam air tetapi juga memungkinkan fungsionalitas permukaan dengan mengikat molekul lain, seperti obat, protein atau enzim [7]. Konstruksi nanokomposit responsif ganda dicapai dengan menggabungkan dua sifat yang merespon secara bersamaan terhadap kombinasi suhu dan magnet. Metode yang paling umum digunakan untuk sintesis Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit adalah penambahan fisik, presipitasi in situ dan polimerisasi emulsi. Penambahan fisik, metode paling sederhana, membutuhkan pencampuran fisik nanopartikel magnetik yang disintesis sebelumnya dan partikel PNIPAAm. Metode kedua, presipitasi in situ, melibatkan pengendapan nanopartikel magnetik dengan adanya nanopolimer PNIPAAm [8]. Rute ketiga (dan paling umum), polimerisasi emulsi, membutuhkan polimerisasi monomer (N-isopropilakrilamida) dengan adanya nanopartikel magnetik [9,10,11]. Biaya3 O4 -PNIPAAm nanocomposites telah digunakan secara luas dalam aplikasi biomedis dan bioteknologi. Nanopartikel magnetik yang sangat stabil, terkontrol, dan terdispersi dengan baik akan diperlukan untuk meningkatkan kesesuaian nanokomposit tersebut untuk aplikasi masa depan. Salah satu inovasi terbaru melibatkan medan magnet eksternal yang menciptakan sumber panas lokal untuk partikel yang memanas sendiri, menyebabkan PNIPAAm menyusut dan pada gilirannya memungkinkan pelepasan obat yang dienkapsulasi [12]. Fenomena ini, ditambah dengan manik-manik magnetik yang ditargetkan pada tumor, membuka potensi terapi kanker lainnya seperti hipertermia. Hipertermia dapat dimulai dengan berosilasi nanopartikel dalam medan magnet berosilasi pada frekuensi mulai dari kilohertz hingga megahertz. Biaya Lainnya3 O4 -PNIPAAm nanokomposit baru-baru ini disintesis untuk mengontrol pelepasan molekul bioaktif, seperti mioglobin atau vitamin B12, dan untuk penghantaran obat [13]. Studi terbaru menggunakan Fe3 . superparamagnetik berlapis PNIPAAm O4 nanopartikel mampu menunjukkan bahwa agregasi termal dari nanopartikel oksida besi sangat meningkatkan kontras T2 selama pencitraan resonansi magnetik [14]. Jelas, Fe3 O4 -PNIPAAm menunjukkan harapan besar untuk perkembangan masa depan dalam aplikasi biomedis dan bioteknologi. Oleh karena itu, penting untuk dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai biokompatibilitas bahan ini dan efek antibakterinya.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki pengaruh tiga metode preparasi pada sifat fisik-kimia Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit. Dalam melakukannya, kami bertujuan untuk menilai metode persiapan yang paling nyaman untuk memproduksi nanokomposit yang menampilkan sifat yang ditingkatkan untuk aplikasi biologis. Untuk pertama kalinya, kami juga menjelaskan efek antibakteri dari ketiga Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit menggunakan pendekatan multi-titik akhir, laju pertumbuhan bakteri, viabilitas, morfologi sel, dan tingkat kerusakan DNA.
Metode
Bahan kimia
Besi(III) klorida heksahidrat (FeCl3 .6H2 O, 98%), Besi(II) klorida tetrahidrat (FeCl2 .4H2 O, 99%), amonium hidroksida (26% NH3 di H2 O), N-isopropil-akrilamida (NiPAM, 99%), N,N-metilenbis(akrilamida) (BIS, 99%), natrium dodesil sulfat (SDS, 99%) dan amonium persulfat (APS, 98.5 %) semuanya dibeli segar dari Sigma-Aldrich, Jerman.
Persiapan PNIPAAm dengan Polimerisasi Emulsi
NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) dan SDS (0,3 g) dilarutkan dalam 350 ml air deionisasi (DI) pada 70 °C di bawah nitrogen atmosfer. APS (0,0035 g) dilarutkan dalam 1 ml DI dan ditambahkan ke bejana reaksi untuk memulai reaksi. Setelah 4 jam, reaksi dihentikan dan partikel yang disiapkan dicuci dengan air DI. Terakhir, nanopartikel PNIPAAm dipisahkan dengan sentrifugasi (12.000 rpm selama 30 menit) dan digunakan dalam reaksi lebih lanjut.
Preparasi Magnetit (Fe3 O4 ) Nanopartikel
FeCl2 ·4H2 O (1,9 g) dan FeCl3 ·6H2 O (5,4 g) (rasio molar 1:2) dilarutkan dalam DI (100 ml) dan dipanaskan hingga 70 °C. Amonium hidroksida (NH4 OH; 6 ml) dengan cepat ditambahkan ke dalam larutan, yang segera menghasilkan endapan magnetik hitam pekat. Akhirnya, Fe3 O4 suspensi nanopartikel diaduk selama 30 menit pada 70 °C. Produk dicuci beberapa kali dengan DI, diikuti dengan Fe3 O4 nanopartikel dikeringkan dalam rotary evaporator (25 mbar pada 40 ° C) sampai terbentuk bubuk halus. Ini digunakan dalam semua reaksi selanjutnya.
Preparasi Nanokomposit PNIPAAm Magnetik dengan Polimerisasi Emulsi (Fe3 O4 -PNIPAAm-1)
NiPAM (0,4 g), Fe3 . yang baru disiapkan O4 nanopartikel (0,2 g), BIS (0,2 g) dan SDS (0,3 g) dilarutkan dalam 350 ml DI dan dipanaskan hingga 70 °C di bawah atmosfer nitrogen. APS (0,0035 g) kemudian dilarutkan dalam 1 ml DI dan ditambahkan ke bejana reaksi untuk memulai reaksi. Setelah 4 jam, reaksi dihentikan dan nanokomposit yang telah disiapkan dicuci dengan DI. Akhirnya, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 dipisahkan dengan sentrifugasi (12.000 rpm selama 30 menit) dan kemudian dikeringkan menggunakan rotary evaporator (25 mbar pada 40 °C). Bahan bubuk disimpan di tempat gelap pada suhu kamar.
Preparasi Nanokomposit Magnetik PNIPAAm Melalui Pengendapan In Situ (Fe3 O4 -PNIPAAm-2)
FeCl2 (0,148 g), FeCl3 (0,4 g) dan 10 ml DI dicampur dengan baik dan ditambahkan ke 1 g PNIPAAm. NH4 OH (3 ml) kemudian dengan cepat ditambahkan ke dalam larutan, yang segera menghasilkan endapan magnetik hitam pekat. Suspensi kemudian diaduk selama 30 menit pada 70 °C. Nanokomposit yang telah disiapkan dicuci dengan DI, setelah itu Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dipisahkan dengan sentrifugasi (12.000 rpm selama 30 menit) dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator (25 mbar pada 40 °C). Bubuk yang dihasilkan disimpan di tempat gelap pada suhu kamar.
Preparasi Nanokomposit Magnetik PNIPAAm Melalui Adisi Fisik (Fe3 O4 -PNIPAAm-3)
PNIPAAm yang baru disiapkan (1 g), Fe3 . yang baru disiapkan O4 nanopartikel (0,5 g) dan DI (5 ml) dicampur dengan baik, dan suspensi yang dihasilkan diaduk selama 30 menit pada 70 °C. Nanokomposit yang dibuat dicuci dengan DI, diikuti dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 dipisahkan melalui sentrifugasi (12.000 rpm selama 30 menit) dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator (25 mbar pada 40 °C). Bahan bubuk disimpan di tempat gelap pada suhu kamar.
Karakterisasi Nanokomposit
Ukuran dan potensi zeta Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit diukur setelah pembubaran lengkap nanopartikel dalam DI (penyebaran dalam DI diikuti dengan sonifikasi selama 2 menit pada suhu kamar). Pengukuran potensial Zeta dilakukan menggunakan penganalisis Zetasizer Nano (Malvern Instruments, USA) pada pH 7. Unit hamburan cahaya dinamis (DLS) Zetasizer Nano digunakan untuk mengukur diameter hidrodinamik agregat partikel di DI. Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan untuk mengukur jumlah lapisan dan untuk menentukan stabilitas termal nanokomposit. Studi termal dilakukan pada 3-4 mg sampel kering pada suhu berkisar antara 25 hingga 900 °C, menggunakan TGA Q500 (TA Instruments, USA) di bawah atmosfer nitrogen (laju pemanasan 10 °C/menit). Sifat magnetik material diukur menggunakan magnetometer sampel getar MicroMag™ 2900 (Perusahaan pengukuran Princeton, AS). Gambar mikroskop diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM), partikel pertama kali dilarutkan secara menyeluruh dalam DI dan setetes larutan ditempatkan pada kisi tembaga dari SEM emisi medan Zeiss ULTRA Plus yang dilengkapi dengan katoda Schottky. Semua gambar dianalisis menggunakan software Smart SEM v 5.05 (Zeiss, Jerman) untuk pencitraan yang dioperasikan pada 1,5 kV.
Strain Bakteri dan Media
Gram-negatif Escherichia coli CCM3954 dan Gram-positif Staphylococcus aureus CCM 3953 (Brno, Republik Ceko) digunakan untuk semua percobaan. Informasi terperinci tentang galur tersedia di halaman web 'Koleksi Mikroorganisme Ceko' (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Setiap biakan bakteri baru disiapkan dan disimpan semalaman dalam kaldu nutrisi kedelai (Sigma-Aldrich) sebelum melakukan eksperimen biologis.
Kerusakan DNA
Tes komet dilakukan mengikuti metodologi Singh et al. [15] dan Solanky et al. [16]. Semua bahan kimia dibeli dari PENTA (Republik Ceko) kecuali dinyatakan lain. Kultur bakteri segar (disesuaikan dengan 10
7
sel/ml) ditumbuhkan semalaman dan kemudian diinkubasi dengan dua konsentrasi (0,1 dan 1 g/l) PNIPAAm dan masing-masing Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit selama 30 mnt pada 37 °C.
Mikrogel disiapkan dengan meletakkan 100 ml agarosa ke permukaan kaca objek yang buram dan menutupinya dengan kaca penutup 24 × 50 mm (ThermoFisher Scientific, USA). Slide dibiarkan pada suhu kamar selama 5 menit, kemudian kaca penutup dilepas dan slide dibiarkan kering. Lapisan agarosa kering ini (lapisan pertama) memberikan dasar yang kuat untuk lapisan berikutnya. Setelah memaparkan bakteri ke PNIPAAm dan Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit selama 30 menit, 2 l (mengandung sekitar 10.000 sel yang terpapar) diambil dan dicampur dengan 100 l agarosa 0,5% yang baru disiapkan. Campuran ini dipipet pada kaca objek buram dan segera ditutup dengan kaca penutup (lapisan kedua). Slide kemudian didinginkan dalam nampan baja di atas es. Gelas penutup dilepas setelah 1 menit, dan lapisan ketiga 100 l agarosa lisis (termasuk agarosa 0,5% dengan 5 g/ml RNAse A [Ameresco, USA], 0,25% natrium N-lauroilsarcosine dan 0,5 mg/ml lisozim) diproduksi, sekali lagi menggunakan kaca penutup. Slide kemudian dibiarkan di atas es selama 10 menit kemudian ditempatkan ke dalam ruang lembab selama 30 menit pada suhu 37 °C. Setelah kaca penutup dilepas, slide direndam dalam larutan lisis yang mengandung 2,5 M NaCl, 100 mM garam tetrasodium EDTA, 10 mM tris buffer pH 10, 1% sodium lauroyl sarcosine dan 1% triton X-100. Setelah 1 jam lisis pada suhu kamar, slide dipindahkan ke larutan pencernaan enzim yang mengandung 2,5 M NaCl, 10 mM EDTA dan 10 mM tris pH 7. Empat buffer dengan 1 mg/ml proteinase K. diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam, setelah itu ditempatkan pada pelat horizontal unit elektroforesis (Scie-plas, UK) dan diseimbangkan dengan 300 mM natrium asetat dan 100 mM pH 9 buffer tris selama 20 menit kemudian dielektroforesis pada 12 V (0,4 V/cm, sekitar 100 mA) selama 30 mnt. Setelah elektroforesis, slide direndam dalam 1 M amonium asetat dalam etanol (5 ml 10 M amonium asetat dan 45 ml etanol absolut) selama 20 menit, etanol absolut selama 0,5 jam dan etanol 70% selama 10 menit, setelah itu slide dikeringkan dengan udara pada suhu kamar. Untuk mencapai pewarnaan yang seragam, slide diberi perlakuan awal dengan 50 ml larutan buffer TE 5% yang baru disiapkan dan 10 mM NaH2 PO4 . Slide kemudian diwarnai dengan 50 l larutan SYBR 1 mM yang baru disiapkan (Sigma-Aldrich, USA) dalam buffer TE selama 30 menit. Migrasi pemutusan untai DNA (komet) divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi AxioImager pada perbesaran × 400 dan perangkat lunak AxioVision v 4 (Zeiss, Jerman). Biasanya, panjang ekor 50 komet diukur secara individual untuk setiap sampel.
Laju Pertumbuhan Bakteri, Viabilitas Sel, dan Morfologi
Protokol eksperimental mengikuti yang dijelaskan dalam Darwish et al. [17]. Secara singkat, Fe3 O4 -suspensi stok nanokomposit PNIPAAm (10 g/l) ditambahkan ke kultur bakteri segar untuk mendapatkan konsentrasi akhir 0,01, 0,05, 0,5 dan 1 g/l. Setiap konsentrasi diproduksi dalam rangkap tiga di piring 24-sumur. Kontrol negatif, hanya terdiri dari sel bakteri pada media pertumbuhan dan Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit hanya di media tumbuh, dijalankan secara paralel. Pelat kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C, setelah itu kerapatan optik sampel diukur pada 600 nm (OD600) setiap 2 jam selama 6 jam menggunakan pembaca pelat Synergy™ HTX (Biotek, USA). Laju pertumbuhan bakteri didefinisikan sebagai regresi linier R dari pengukuran OD600 (unit absorbansi, AU) versus waktu inkubasi dalam jam. Pengukuran awal sampel nanokomposit tanpa sel (6 jam pada 600 nm) menunjukkan nilai absorbansi konstan yang tidak mengganggu nilai absorbansi nanokomposit yang diukur dengan sel bakteri.
Konsentrasi efektif nanokomposit pada penghambatan 10% (EC10) terhadap laju pertumbuhan bakteri (µ ) dihitung untuk setiap bentuk Fe3 O4 -PNIPAAm berdasarkan persamaan:Saya (%) =(µCµT )/µC ×100, di mana Aku adalah penghambatan, µC adalah nilai rata-rata laju pertumbuhan kontrol dan µT adalah laju pertumbuhan kultur yang dipengaruhi oleh nanokomposit [18].
Setelah inkubasi 24 jam, 100 l alikuot dari setiap sampel diwarnai menggunakan Kit Viabilitas Bakteri L7007 (Molecular Probe, Invitrogen, USA) dalam gelap selama 15 menit. Penentuan proporsi sel hidup (Ex/Em 485/528 nm) dan sel mati (Ex/Em 485/645 nm) dilakukan menggunakan pembaca pelat Synergy™ HTX (Biotek, USA). Persentase sel mati dihitung sebagai rasio sel mati terhadap sel hidup. Pada saat yang sama, gambar E. koli dan S. aureus diperoleh menggunakan mikroskop fluoresensi AxioImager (Zeiss, Jerman) dengan Ex/Em 470/490–700 nm. Panjang E. koli sel dan luas S. aureus kluster sel ditentukan pada perbesaran × 600 menggunakan perangkat lunak AxioVision v 4 (Zeiss, Jerman).
Analisis Statistik
Perbedaan antara strain bakteri yang diinkubasi dalam PNIPAAm, Fe3 . yang berbeda O4 -PNIPAAm nanokomposit dan sampel kontrol tanpa nanokomposit diuji menggunakan ANOVA dan uji Dunnett (GraphPad PRISM, USA).
Hasil
Dalam penelitian ini, kami mensintesis Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit menggunakan tiga protokol berbeda:polimerisasi emulsi (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), presipitasi in situ (Fe3 O4 -PNIPAAm-2) dan penjumlahan fisis (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). Pencitraan SEM menunjukkan bahwa jenis protokol yang digunakan memiliki efek yang jelas pada morfologi sampel dan ukuran partikel, dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-1, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 menunjukkan distribusi ukuran yang luas, aglomerasi karena energi permukaan yang tinggi antara nanopartikel dan adanya interaksi dipolar magnetik ( Gbr. 1 ) .
Memindai gambar mikroskop elektron dan histogram PNIPAAm (a ), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (b ), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (c ) dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (d ). Bilah skala = 200 nm
TGA menunjukkan bahwa Fe3 O4 -Sampel PNIPAAm menjadi relatif stabil pada suhu di atas 400 °C (Gbr. 2). Secara keseluruhan, nanopartikel PNIPAAm menunjukkan kandungan residu yang lebih rendah dibandingkan Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit. Nilai potensial Zeta untuk muatan permukaan adalah 1,58 mV untuk PNIPAAm, 15,6 mV untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-1, 16.4 mV untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan 1,8 mV untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Nilai magnetometer sampel getar untuk saturasi magnetisasi adalah 50,4 emu/g untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-1, 53,7 emu/g untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan 21.0 emu/g untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Hamburan cahaya dinamis di atas (45 °C) dan di bawah (25 °C) LCST menunjukkan ukuran hidrodinamik untuk PNIPAAm sebesar 50 nm pada 25 °C dan 27 nm pada 45 °C; 412 nm pada 25 °C dan 197 nm pada 45 °C untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-1; 212 nm pada 25 °C dan 130 nm pada 45 °C untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan 122 nm pada 25 °C dan 60 nm pada 45 °C untuk Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Gbr. 3).
Hamburan cahaya dinamis di bawah (25 °C) dan di atas (45 °C) transisi fase suhu larutan kritis yang lebih rendah untuk PNIPAAm (a ), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (b ), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (c ) dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (d )
Fe3 O4 -Efek Nanokomposit PNIPAAm pada DNA Bakteri
Setelah pemaparan singkat selama 30 menit, pemutusan untai DNA ditentukan untuk keduanya E. koli dan S. aureus dalam sel yang diberi Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit, 40% EtOH (kontrol positif) dan sel yang tidak diberi perlakuan (kontrol negatif). Semua Biaya3 O4 -PNIPAAm nanokomposit menunjukkan efek signifikan yang serupa (P < 0,001) rata-rata E. koli dan S. aureus panjang ekor komet pada semua konsentrasi (Gbr. 4), dibandingkan dengan sel kontrol yang diinkubasi tanpa nanokomposit.
Contoh Escherichia coli ekor komet, setelah pengobatan dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (a ). Hasil pemutusan untai DNA (panjang ekor komet) untuk Escherichia coli (b ) dan Staphylococcus aureus (c ) diinkubasi selama 30 menit dengan 40% EtOH (kontrol positif), tanpa nanokomposit (kontrol negatif), PNIPAAm (0,1 dan 1 g/l), dan (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (bilah kesalahan mewakili SD untuk panjang komet 50 sel). Tingkat signifikansi ***P < 0.001
Fe3 O4 -PNIPAAm Efek Antibakteri Nanokomposit
Tingkat pertumbuhan menunjukkan bahwa Gram-positif S. aureus kurang tahan dibandingkan Gram-negatif E. koli ke semua nanokomposit setelah paparan 6 jam. Biaya3 O4 -PNIPAAm-1 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-2 sangat menghambat pertumbuhan bakteri, dibandingkan dengan PNIPAAm dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3, dengan E. koli tingkat pertumbuhan berkurang secara signifikan dari 0,08 menjadi 0,028 (P < 0,001) dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan 0,005 (P < 0,001) dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (1 g/l). Tidak ada efek yang diamati pada E. koli tingkat pertumbuhan baik oleh PNIPAAm atau Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Gbr. 5a). Sebagai perbandingan, tingkat pertumbuhan S. aureus dipengaruhi oleh semua Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit dan oleh nanopartikel PNIPAAm. Pada konsentrasi yang lebih rendah (0,01 g/l dan 0,05 g/l), laju pertumbuhan hanya sedikit berkurang dari 0,07 menjadi 0,06 (P < 0,05). Namun, pada konsentrasi yang lebih tinggi (0,5 dan 1 g/l), terjadi penurunan yang signifikan dari 0,07 menjadi 0,001 dengan PNIPAAm, 0,0 dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-1, 0,01 dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan 0,009 dengan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (semua P < 0,001; Gambar 5b). Selain itu, EC10 untuk semua Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit dan kontrol nanopartikel PNIPAAm lebih rendah untuk S. aureus dari itu untuk E. koli (Tabel 1).
Laju pertumbuhan relatif Escherichia coli (a ) dan Staphylococcus aureus (b ) setelah inkubasi 6 jam dalam konsentrasi berbeda (0,01, 0,05, 0,5 dan 1 g/l) PNIPAAm (lingkaran merah), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (berlian oranye [1]), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (segitiga hijau [2]) dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (segitiga biru [3]). Bilah kesalahan menunjukkan SD yang dihitung dari n = 3. Tingkat signifikansi ***P < 0.001
Persentase kematian E. koli sel meningkat dengan meningkatnya konsentrasi Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit setelah 24 jam. PNIPAAm (0,5 dan 1 g/l), misalnya, menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam E. koli sel mati (20%) dibandingkan dengan kultur tanpa Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit (12%). Biaya3 O4 -PNIPAAm-1 (0,5 g/l) menghasilkan hingga 28% kematian E. koli sel dan 32% pada 1 g/l (P < 0,001). Efek Fe3 O4 -PNIPAAm-2 lebih rendah dari Fe3 O4 -PNIPAAm-1 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3, dengan persentase sel mati meningkat dari 13 menjadi 25% saat terpapar pada konsentrasi masing-masing 0,01 dan 1 g/l (P < 0,001). Pada 0,5 dan 1 g/l, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 menghasilkan sekitar 25% sel mati (P < 0,001; Gambar 6a). Persentase kematian S. aureus sel hanya dipengaruhi secara signifikan oleh 1 g/l Fe3 O4 -PNIPAAm-1 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3, dengan sel mati masing-masing mencapai hingga 50 dan 48% (P < 0,001). Kontrol tanpa nanokomposit mengandung sekitar 18% sel mati sedangkan pada konsentrasi PNIPAAm yang lebih rendah, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 dan Fe3 O4 -PNIPAAm-3, proporsi sel mati bahkan lebih rendah. PNIPAAm pada konsentrasi 0,5 dan 1 g/l menghasilkan 25 dan 30% (P < 0,005) sel mati, masing-masing. Biaya3 O4 -PNIPAAm-2 tidak berpengaruh pada S. aureus budaya (Gbr. 6b).
Persentase kematian Escherichia coli (a ) dan Staphylococcus aureus (b ) sel setelah 24 jam terpapar PNIPAAm dan (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Bilah kesalahan menunjukkan SD n = 3. Tingkat signifikansi *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0.001
Tidak ada perbedaan rata-rata E. koli panjang sel (5 μm) dan rata-rata S. aureus area cluster sel (200 μm
2
) untuk setiap nanokomposit atau kontrol PNIPAAm pada konsentrasi terendah (0,1 g/l; Gbr. 7). Pada konsentrasi yang lebih tinggi, E. koli panjang tidak berubah dengan adanya Fe3 O4 -PNIPAAm-2, begitu pula S. aureus area kelompok sel dengan adanya Fe3 O4 -PNIPAAm-1. Namun, E. koli panjangnya meningkat secara signifikan dengan adanya 1 g/l PNIPAAm (5,4 μm, P < 0,005), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (6 μm, P < 0,001) dan Biaya3 O4 -PNIPAAm-3 (10 μm, P < 0.001) (Gbr. 7a), sedangkan S. aureus membentuk kelompok yang lebih besar saat terpapar PNIPAAm (1937 μm
2
, P < 0,001), Biaya3 O4 -PNIPAAm-2 (924 μm
2
, P < 0,001) dan Biaya3 O4 -PNIPAAm-3 (1722 μm
2
, P < 0.001) (Gbr. 7b).
Panjang Escherichia coli sel (a ) dan luas cluster Staphylococcus aureus sel (b ) setelah inkubasi 24 jam dengan PNIPAAm dan (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 dan (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Bilah kesalahan menunjukkan SD ditentukan dari n = 50. Tingkat signifikansi **P < 0,05 dan ***P < 0.001
Diskusi
Baik metode sintesis maupun cara penambahan nanopartikel magnetik ke matriks polimer memiliki efek yang jelas pada sifat fisika-kimia intrinsik Fe3 magnetik. O4 -PNIPAAm nanokomposit. Sintesis bertahap memiliki dampak yang kuat pada sifat nanokomposit, menghasilkan perubahan bentuk partikel, distribusi ukuran, ukuran dan kimia permukaan, bersama dengan perubahan selanjutnya dalam sifat magnetik [19, 20]. Polimerisasi emulsi (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), metode yang mudah dan tepat, menghasilkan nanokomposit yang stabil dengan distribusi ukuran partikel yang sempit dan kecenderungan agregasi yang paling rendah, kualitas yang sangat penting dalam aplikasi biomedis [17]. Diproduksi sebagai akibat dari tolakan sterik dan coulombik, dimensi partikel cukup kecil sehingga pengendapan dapat dihindari [21]. Metode yang paling tidak efektif adalah penambahan fisik (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). Tidak hanya itu diproduksi melalui tiga langkah yang berbeda, dan karenanya membutuhkan waktu lebih lama untuk mempersiapkan, nanokomposit yang dihasilkan menunjukkan agregasi yang lebih tinggi daripada salah satu dari dua metode produksi lainnya. Selain itu, hasil kami menunjukkan bahwa Fe3 O4 -PNIPAAm-3 yang dihasilkan dengan cara ini mungkin mengandung PNIPAAm dan Fe3 yang tidak diinginkan O4 residu nanopartikel.
Polimer dapat menjadi melekat pada nanopartikel magnetik baik oleh ikatan fisik (nonkovalen) atau kovalen, dengan bahan hibrida yang dihasilkan menampilkan sifat tertentu tergantung pada rute sintetis yang diambil. Resuspensi signifikan nanopartikel magnetik terjadi ketika persiapan berlangsung dalam pelarut di mana pembentukan nanopartikel hibrida terjadi, dimana agregasi dan segregasi dapat menjadi masalah. Dalam hal ini, pembentukan in situ nanopartikel magnetik dapat menjadi alternatif yang lebih baik dalam banyak kasus. Selain itu, jika konsentrasi surfaktan terlalu rendah, koalesensi akan mengubah ukuran tetesan, sedangkan misel dapat terbentuk jika konsentrasinya terlalu tinggi, yang menyebabkan nukleasi misel. Dalam hal ini, penting bahwa konsentrasi surfaktan dipilih secara hati-hati berdasarkan karakterisasi yang tepat dari sifat permukaan dan tingkat modifikasi partikel, untuk memastikan permukaan partikel anorganik kompatibel dengan matriks polimer.
Untuk mengevaluasi sifat magnetik Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit, penting untuk mengetahui kandungan MNPs pada nanokomposit. TGA digunakan untuk mengukur jumlah MNP dan untuk menyelidiki stabilitas termal Fe3 O4 -PNIPAAm nanokomposit dibandingkan dengan nanopartikel PNIPAAm saja. Ketiganya Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites menunjukkan stabilitas termal yang lebih tinggi daripada nanopartikel PNIPAAm, mungkin karena adanya Fe3 O4 partikel dalam matriks (Gbr. 2). Residu yang lebih tinggi dalam nanokomposit magnetik dapat dikaitkan dengan keberadaan Fe3 inorganic anorganik O4 senyawa dalam sampel, yang dipertahankan bahkan pada suhu yang lebih tinggi.
Biaya3 O4 -PNIPAAm-1 menunjukkan stabilitas nanokomposit termal tertinggi, bersama dengan kehilangan bobot terendah. Hingga 200 °C, sumber utama penurunan berat badan adalah melalui hilangnya air dan adsorpsi fisik dari lapisan polimer [22]; di atas 200 °C, namun, kerugian terutama disebabkan oleh dekomposisi lapisan kimia yang mengikat PNIPAAm. Residu sampel, yang menjadi stabil di atas 400 °C, mewakili 87% dari berat aslinya, yang sesuai dengan jumlah nanopartikel magnetik dalam nanokomposit. Salah satu tujuan dari proses preparasi ini adalah untuk menghasilkan nanokomposit dengan sifat magnetik yang mencegah agregasi dan memungkinkannya untuk menyebar kembali dengan cepat segera setelah medan magnet dimatikan. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe3 O4 -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe3 O4 nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.
Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe3 O4 -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe3 O4 -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe3 O4 magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe3 O4 -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].
SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe3 O4 nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].
All Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O4 -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].
In comparison with the modified Fe3 O4 nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli and S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe3 O4 (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O4 -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli and S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.
Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe3 O4 -PNIPAAm-2, and Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe3 O4 -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 and Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe3 O4 -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].
S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm
Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli and S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe3 O4 ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.
Conclusions
Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe3 O4 -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). Both Fe3 O4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O4 -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli and S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe3 O4 -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .
