Sifat Preparasi dan Antibiofilm dari Zinc Oxide/Porous Anodic Alumina Composite Film
Abstrak
Film PAA (porous anodic alumina) dibuat dengan oksidasi anodik dua langkah setelah waktu yang berbeda, dan kemudian film komposit ZnO/PAA dibuat dengan metode sol-gel pada permukaannya. Sedangkan film komposit ZnO/PAA dikarakterisasi dengan X-ray diffraction (XRD), thermogravimetric/differential thermal analyzer (TG/DTA), Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), scanning electron microscopy (SEM), transmisi electron microscopy. (TEM), difraksi elektron area terpilih (SAED), dan sudut kontak air (CA). Sifat antibiofilm film komposit ZnO/PAA pada Shewanella putrefaciens diukur secara bersamaan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mikromorfologi film komposit PAA dan ZnO/PAA dipengaruhi oleh waktu anodisasi kedua. ZnO adalah struktur wurtzite heksagonal, dan partikel ZnO dengan diameter 10–30 nm menempel pada permukaan dalam atau luar PAA. Setelah dimodifikasi oleh Si69, film ZnO diterjemahkan dari hidrofilia menjadi hidrofobisitas. Film ZnO/PAA dengan sifat antibiofilm yang optimal disiapkan pada permukaan PAA dengan anodisasi dua langkah selama 40 menit. Ketaatan Shewanella putrefaciens dibatasi oleh super-hidrofobisitasnya, dan pertumbuhan bakteri biofilm dihambat oleh partikel ZnO yang melimpah.
Latar Belakang
Seperti yang kita ketahui, bakteri dapat menempel pada permukaan padat dan membentuk biofilm yang licin pada lingkungan yang sesuai [1]. Biasanya, biofilm bakteri menempel kuat pada permukaan bahan, seperti stainless steel [2], karet [3], kaca [4], dan polistirena [5]. Biofilm akan mengakibatkan korosi peralatan [6] dan kontaminasi makanan [7], yang menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa adhesi biofilm dipengaruhi oleh sifat-sifat permukaan material, seperti kekasaran [8,9,10,11], struktur mikro [12, 13], hidrofilia [14,15,16,17], dan konstituen antibiotik. [18,19,20]. Bohinc dkk. [10] menunjukkan bahwa kepatuhan bakteri akan meningkat dengan kekasaran permukaan kaca. Singh dkk. [12] menunjukkan bahwa kekasaran permukaan yang tinggi dapat meningkatkan adsorpsi protein dan mempercepat adhesi bakteri dan pembentukan biofilm. Bonsaglia dkk. menemukan bahwa Listeria monocytogenes melekat pada permukaan hidrofilik (misalnya, stainless steel dan kaca) lebih baik daripada yang hidrofobik (misalnya, polistirena) [14]. Penelitian lain juga membuktikan bahwa permukaan hidrofobik tidak baik untuk adhesi biofilm [16, 17]. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa konstituen antibiotik dapat menghambat pembentukan biofilm [18,19,20]. Tiga ratus empat permukaan baja tahan karat yang mengandung Cu memiliki sifat antibakteri dan antibiofilm yang hebat, memanfaatkan aktivitas antimikroba elemen Cu [18]. Singkatnya, sifat permukaan sangat penting untuk sifat antibiofilm bahan.
Bahan aluminium telah banyak digunakan, dan alumina anodik berpori (PAA) telah menarik lebih banyak perhatian di bidang fungsi listrik ringan, fungsi katalitik, dan fungsi penginderaan dalam beberapa tahun terakhir [21,22,23,24], dan aktivitas antimikrobanya dilaporkan. Ferraz dkk. [24] melaporkan bahwa PAA dapat menginduksi aktivasi monosit/makrofag yang melekat karena fase matriks dan nanoporositasnya.
Selain itu, lapisan tipis seng oksida (ZnO) telah dipelajari sebagai bahan yang sangat baik untuk antibakteri dan antijamur. Kepatuhan Pseudomonas aeruginosa untuk film ZnO dengan struktur permukaan nanorod lebih lemah dari kaca dan ZnO tergagap, dan lebih banyak P. aeruginosa terbunuh dalam film ZnO [25]. Sementara itu, satu penelitian menunjukkan bahwa permukaan berlapis ZnO secara dramatis membatasi pembentukan biofilm, dan generasi radikal hidroksil memainkan peran kunci dalam aktivitas antibiofilm tetapi tidak pada keberadaan ion seng [26]. Selanjutnya, film komposit ZnO dapat digunakan di banyak bidang untuk membatasi pembentukan biofilm dan akan memiliki prospek aplikasi yang baik dalam pengawetan produk akuatik [27]. ZnO bersifat hidrofilik, sedangkan film hidrofobik baik dalam menahan adhesi biofilm. Oleh karena itu, perlu dilakukan perbaikan sifat hidrofobik film ZnO.
Produk perairan sangat mudah rusak karena pembusukan mikroba mereka [28]. Di bawah kondisi penyimpanan aerobik, Pseudomonas sp. dan Shewanella putrefaciens dikenal sebagai organisme pembusuk dominan [29]. Shewanella putrefaciens memiliki sifat psychrotrophic dan dapat mereduksi trimetilamina-N -oksida menjadi trimetilamina [30]. Jadi, Shewanella putrefaciens akan digunakan sebagai bakteri indikator dalam makalah ini.
Struktur mikro film ZnO akan berbeda karena basis PAA mereka, dan kemudian sifat antibiofilm akan terpengaruh. Dalam karya ini, film ZnO disiapkan pada PAA dengan morfologi yang berbeda dan dimodifikasi untuk meningkatkan hidrofobisitas. Sifat antibiofilm Shewanella putrefaciens dari film komposit ZnO/PAA dipelajari. Hasilnya memberikan nilai potensial untuk aplikasi dalam kemasan makanan, peralatan pengolahan makanan, dan bidang bahan fungsional antibakteri lainnya.
Bahan dan Metode
Materi
Semua reagen yang digunakan dalam penelitian ini murni analitik. Air de-ionisasi dan steril digunakan untuk menyiapkan larutan dengan konduktivitas lebih rendah dari 0,5 mS/cm. Shewanella putrefaciens ATCC8071 dibeli dari American Type Culture Collection. Aluminium foil dengan ketebalan 0,3 mm dengan kemurnian aluminium lebih dari 99,99% dibeli dari Shengshida Metal materials Co., Ltd. (China).
Persiapan Film Komposit ZnO/PAA
Persiapan Film Anodik Alumina (PAA) Berpori
Aluminium foil dengan kemurnian tinggi dipotong menjadi ukuran kecil 10 × 30 mm
2
dan dipoles dengan pasta pemoles silika 50 nm oleh pemoles (WV80, Positec Machinery Co., Ltd., China) dan dihilangkan lemaknya secara ultrasonik dalam aseton pada 53 kHz, 280 W selama 15 mnt (SK8210HP, Kudos Ultrasonic Instruments Co. Ltd ., Shanghai). Kemudian, foil dicuci dua kali masing-masing dengan etanol dan air. Aluminium foil yang telah diberi perlakuan sebelumnya digunakan sebagai anoda, lembaran grafit dengan luas yang sama sebagai katoda, dan larutan asam oksalat 0,3 mol/L sebagai elektrolit. Anodisasi pertama dilakukan pada kondisi 30 °C dan 40 V selama 90 menit. Setelah itu, lembaran aluminium direndam dalam larutan campuran 6.0 wt% H3 PO4 dan 1,8 berat H2 CrO4 pada 60 °C selama 4 jam untuk menghilangkan lapisan alumina. Anodisasi kedua kemudian dilakukan dalam kondisi yang sama tetapi masing-masing selama 0, 40, 60, dan 80 menit. Film anodik alumina (PAA) berpori dengan model port yang berbeda diperoleh.
Persiapan Film Komposit ZnO/PAA
Pertama, volume yang sama dari larutan etanol seng asetat 0,02 mol/L dan larutan etanol NaOH 0,04 mol/L dicampur dengan pengadukan cepat pada suhu 70 °C selama 5 menit, kemudian film PAA (aluminium foil) direndam dalam larutan campuran tersebut. di bawah tingkat vakum 0,085 MPa. Setelah itu larutan dipanaskan hingga mendidih. Setelah menjadi sol biru tipis, aluminium foil dikeluarkan dan dibilas dengan air deionisasi. Kemudian, sampel dikeringkan dengan vakum pada -0,085 MPa, 80 °C selama 6 jam, dan film komposit ZnO/PAA disiapkan setelah dikalsinasi pada 480 °C selama 2 jam di atmosfer udara. Serbuk seng oksida disiapkan secara bersamaan. Terakhir, film komposit ZnO/PAA dan bubuknya dimodifikasi dengan larutan etanol Si69 1,0%berat pada 65 °C selama 2 jam dan kemudian dikeringkan dengan vakum pada 0,085 MPa, 40 °C selama 12 jam.
Karakterisasi Film Komposit ZnO/PAA
Difraksi sinar-X dari serbuk seng oksida dilakukan dengan menggunakan difraktometer serbuk sinar-X (Rigaku Ultima IV, Rigaku, Jepang) pada langkah 0,02°dan 2θ kisaran 10°–80° dengan radiasi CuKa 40 kV, 50 mA. Perubahan termal dan kehilangan berat sampel dianalisis dengan penganalisis termal termogravimetri/diferensial (TG/DTA, Perkin Elmer Diamond). Spektra inframerah transformasi Fourier (FT-IR) direkam dengan Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer (Agilent, American) dalam kisaran 4000–400 cm
−1
. Mikrograf permukaan film PAA dan film komposit ZnO/PAA dicitrakan dengan mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FESEM, S-4800, Hitachi, Jepang). Morfologi nanopartikel yang dicukur dari film komposit ZnO/PAA diukur dengan mikroskop elektron transmisi emisi lapangan (FETEM, Jem-2100F, JEOL, Jepang), dan area difraksi elektron terpilih (SAED, Jem-2100F, EOL, Jepang) dari sampel diperiksa. Sudut kontak air (CA) dari film komposit (sebelum/sesudah dimodifikasi) diukur dengan metode penurunan sessile pada beberapa posisi berbeda pada setiap permukaan sampel menggunakan tetesan air deionisasi 3,0 L (SL200B, USA).
Sifat Antibiofilm Film Komposit ZnO/PAA
Budidaya Shewanella putrefaciens Biofilm
Suspensi bakteri dari aktivasi sekunder Shewanella putrefaciens (OD595 0.5) dan alkaline peptone water (APW) 3% (m/v) NaCl dicampur dengan keseragaman rasio 1:200 (v /v ). Film komposit ZnO/PAA (0,5 × 0,5 cm) direndam dalam inokulum encer 3 mL dan diinkubasi pada suhu 28 °C selama waktu tertentu. Dalam kondisi ini, Shewanella putrefaciens tumbuh dengan baik dan menunjukkan kemampuan proliferasi yang kuat.
Uji Adhesi Shewanella putrefaciens Biofilm pada Film Komposit ZnO/PAA
Setelah budidaya dalam suspensi bakteri Shewanella putrefaciens selama waktu tertentu, film komposit ZnO/PAA dengan biofilm dipindahkan ke tabung sentrifus steril lain dan dicuci tiga kali dengan 1 mL larutan NaCl steril 0,85% (m/v) untuk menghilangkan bakteri bebas. Biofilm diwarnai dengan 1 mL 0,2%b/b kristal violet selama 15 menit pada suhu kamar dan dicuci tiga kali dengan 1 mL larutan NaCl steril 0,85% (m/v) untuk menghilangkan kristal violet yang berlebihan. Kemudian, biofilm yang diwarnai dilucuti secara ultrasonik dalam 33% (v /v ) asam asetat 200 μL pada 53 kHz, 280 W selama 10 mnt. OD595 (densitas optik pada 595 nm) dari larutan di atas dicatat oleh pembaca pelat mikro VICTOR™ X3 (Perkin Elmer, Amerika) di pelat mikrotiter 96 sumur. Hasilnya ditampilkan sebagai “rata-rata ± standar deviasi” dari tiga kali percobaan paralel.
Pengujian Jumlah Bakteri Total Shewanella putrefaciens Biofilm pada Film Komposit ZnO/PAA
Film komposit ZnO/PAA dengan biofilm dicuci tiga kali dengan saline buffer fosfat steril (PBS, pH 7,4; 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2 HPO4 , dan 1,8 mmol/L KH2 PO4 ) untuk mengusir bakteri yang mengambang, dan biofilm yang diwarnai dilucuti secara ultrasonik dalam 10-mL PBS steril pada 53 KHz, 280 W selama 10 mnt. Selanjutnya, jumlah bakteri total dalam biofilm diukur dengan metode plate count. Dengan percobaan paralel tiga kali, hasilnya ditampilkan sebagai “rata-rata ± standar deviasi”, dan kurva pertumbuhan koloni bakteri biofilm digambar.
Setelah menghilangkan bakteri yang mengambang, film komposit ZnO/PAA dengan biofilm direndam dalam 2,5% (w /v ) glutaraldehid pada 4 °C selama 4 jam. Selanjutnya, sampel didehidrasi setiap 30 menit dengan 50, 70, 80, dan 90% (v /v ) etanol, masing-masing. Setelah dicelupkan ke dalam etil alkohol absolut selama 1 jam, sampel dikeringkan secara alami di atas meja yang bersih. Mikrograf permukaan sampel dicitrakan oleh FESEM (S-4800, Hitachi, Jepang) setelah sputter emas dilapisi pada 3 kV selama 40 d.
Pengukuran CLSM dari Shewanella putrefaciens Biofilm
Film komposit ZnO/PAA dengan biofilm dicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS, pH = 7.4) tiga kali untuk menghilangkan bakteri yang mengambang, dan sampel diwarnai dalam gelap selama 15 menit dalam larutan campuran 0,01wt% acridine orange (AO, Sigma, America) dan 0,1wt% propidium iodide (PI, Sigma, America). Setelah itu, sampel dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan larutan pencelupan yang berlebihan, dan kelembaban yang berlebihan dikeluarkan. Sepuluh mikroliter agen penyegel anti-fluoresensi pendinginan (Biosharp BL701A, Cina) dijatuhkan pada biofilm, dan sampel disimpan pada 4 °C tanpa cahaya. Proporsi sel hidup dan mati dari biofilm diamati menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM, TCS-SP5 II, Germany Leica Instrument Co., Ltd.) [31, 32].
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Film ZnO
Karakterisasi XRD Serbuk ZnO yang Dibuat dengan Proses Sol-gel
Sifat antibakteri dan antibiofilm dari seng oksida dipengaruhi oleh struktur kristalnya [33, 34]. Gambar 1 menunjukkan bahwa struktur kristal sampel berubah setelah dikalsinasi. Sebelum kalsinasi, sampel ditampung dalam struktur wurtzite heksagonal ZnO. Puncak difraksi pada 31.70°, 34.52°, 36.31°, 47.68°, 56.82°, 62.92°, dan 67.92° dari 2θ sesuai dengan (100), (002), (101), (102), (110), (103), dan (112) bidang kristal seng oksida (PDF # 36-1451, a = b = 3.250 dan c = 5.207), masing-masing. Puncak difraksi yang lebar menunjukkan kristalinitas yang rendah dan partikel ZnO yang kecil. Sementara itu, puncak yang kurang murni mengungkapkan zat antara dalam sampel. Setelah dikalsinasi pada 230 °C, puncak tidak murni menghilang dan kebisingan yang diukur berkurang, tetapi lebar puncak difraksi tidak berubah. Ini berarti bahwa perantara menghilang, dan tingkat kristal meningkat. Dengan meningkatnya suhu kalsinasi, puncak difraksi ZnO menjadi lebih tajam, menunjukkan bahwa kristalinitas meningkat dan partikel kristal tumbuh.
Pola XRD dari bubuk seng oksida yang dikalsinasi pada suhu yang berbeda
Hanya air terikat dari Zn(CH3 COO)2 ·2H2 O diproduksi dalam larutan etanol Zn(CH3 COO)2 , dan hidrolisis CH3 COO
−
terhambat. Pertama, Zn(CH3 COO)2 dihidrolisis dan menghasilkan produk antara.
Pada proses pemanasan, kolosol difasilitasi oleh larutan etanol NaOH, dan efek ruang sterik CH3 COO
−
sangat penting untuk stabilitas ZnO collosol. Sedangkan reaksi netral CH3 COOH dengan NaOH terjadi.
5Zn4 O(CH3 COO)6 + 22NaOH + 13H2 O → 4Zn5 (OH)8 (CH3 COO)2 ·2H2 O + 22CH3 COONa(2)
CH3 COOH + NaOH→CH3 COONa + H2 O(3)
Spanhel dan Anderson [35] menunjukkan bahwa alkogel seng oksida terbentuk dari butiran ZnO melalui agregasi dan Pertumbuhan Ostwald (penuaan). Kemudian, perantara dari Zn5 (OH)8 (CH3 COO)2 ·2H2 O dipanaskan dan didekomposisi menjadi fase ZnO [36, 37]. Dengan demikian, struktur wurtzite heksagonal dari ZnO adalah dasar dari gelatin kering sebelum kalsinasi.
Hosono dkk. [37] telah mengkonfirmasi mekanisme reaksi ini. Larutan etanol Zn(CH3 COO)2 ·2H2 O berubah menjadi produk koloid selama pemanasan pada suhu 60 °C, dan hasil XRD menunjukkan bahwa produk kering gelatin adalah campuran kristal ZnO dan Zn5(OH)8 (CH3 COO)2 ·2H2 O. Setelah direfluks selama 48 jam, partikel berubah menjadi wurtzite ZnO.
Analisis TG/DTA
Hasil TG/DTA gelatin seng oksida ditunjukkan pada Gambar 2, dan kurva TG dapat dibagi menjadi tiga tahap. Pada tahap pertama, kehilangan massa adalah 68,6% dari suhu kamar hingga 100 °C, dan puncak endotermik terjadi pada 62 °C. Hal ini sesuai dengan pelarut etanol yang hilang dan air dalam gelatin seng oksida. Pada tahap kedua, kehilangan massa hanya 3,8% dari 100 hingga 400 °C. Hasil XRD menunjukkan pengotor menghilang, kristalinitas meningkat, dan pertumbuhan partikel kristal masing-masing setelah dikalsinasi pada 230, 280, dan 360°C. Sejumlah kecil kehilangan massa mungkin merupakan hilangnya air pori dan transisi pengotor. Dari 400 hingga 850 °C, tidak ada kehilangan massa dan puncak endotermik, yang menunjukkan tidak ada transformasi kristal pada tahap ini. Sedangkan hasil XRD menunjukkan kristal tumbuh setelah kalsinasi pada suhu 480 °C. Hasil TG/DTA konsisten dengan hasil XRD.
Grafik TG/DTA untuk gelatin seng oksida
Karakterisasi FT-IR dari Film Seng Oksida yang Tidak Dimodifikasi/Dimodifikasi
Gambar 3 menunjukkan spektrum FT-IR dari film ZnO termodifikasi dan hidrofobik yang tidak dimodifikasi. Puncak lebar pada 3600–3300 cm
−1
dikaitkan dengan vibrasi regangan OH, dan puncaknya pada 1651 cm
−1
dikaitkan dengan getaran lentur –OH, masing-masing, menunjukkan air yang diserap dan air kapiler dalam sampel [38]. Puncaknya pada 2360 dan 2328 cm
−1
dikaitkan dengan karbon dioksida di udara. Puncaknya pada 2943 dan 2864 cm
−1
disebabkan oleh vibrasi regangan asimetris dan simetris dari CH2 , masing-masing. Puncak yang lebih kuat pada 1475 cm
−1
dianggap berasal dari getaran lentur dalam bidang atau getaran gunting dari CH2 kelompok [39], dan puncaknya pada 895 cm
−1
dianggap berasal dari vibrasi ulur kelompok Si-O [40]. Puncaknya sekitar 440 dan 414 cm
−1
dianggap berasal dari getaran kerangka gugus Zn-O dari ZnO yang tidak dimodifikasi/dimodifikasi [41]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa modifikasi membuat ikatan –S–S– pada Si69 pecah, dan triethoxysilylpropyl dicangkokkan pada sampel, sehingga sifat hidrofobik film ZnO meningkat. Wang [42] melaporkan bahwa dispersi nano-ZnO dapat ditingkatkan dengan modifikasi in situ dari Si69 dan Si69 yang dicangkokkan pada permukaan partikel nano-ZnO melalui reaksi kimia. Ini konsisten dengan hasil analisis kami.
Spektrum FT-IR dari film seng oksida yang tidak dimodifikasi/dimodifikasi
Analisis Mikromorfologi Film PAA
Morfologi film PAA dipengaruhi oleh waktu oksidasi teranodisasi kedua. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, setelah menghilangkan lapisan alumina dari anodisasi pertama, film PAA adalah bingkai sarang lebah heksagonal bersambung dengan pori-pori nano sebesar 5-10 nm (Gbr. 4a). Setelah anodisasi dua langkah selama 40 menit, pori-pori nano diubah menjadi bingkai cangkang multilayer (Gbr. 4b). Setelah anodisasi dua langkah selama 60 menit, bingkai cangkang multilayer memudar, dan diameter nanopori diperbesar menjadi 20–40 nm, sementara itu ada tonjolan di permukaan (Gbr. 4c). Memperpanjang waktu anodisasi dua langkah hingga 80 menit, pori nano diperbesar hingga 60–70 nm, dan tonjolan menghilang (Gbr. 4d).
Gambar SEM dari porous anodic alumina (PAA) dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi kedua a 0 mnt, b 40 mnt, c 60 mnt, dan h 80 mnt
Menurut teori acid field-assisted dissolution (AFAD) [43], dalam proses anodisasi, lapisan oksida lapisan penghalang menjadi tidak seragam, dan terbentuk ridge. Pada titik-titik ini, pembentukan dan pengembangan mikropori dipromosikan oleh AFAD yang diperparah. Dengan perpanjangan waktu anodisasi kedua, lubang berurutan dan tembus terbentuk secara bertahap di permukaan, dan kemudian bingkai cangkang multilayer dan punggungan menghilang (Gbr. 4b–d). Hasilnya mirip dengan Reddy, yang membuat PAA melalui proses anodisasi dua langkah dalam asam oksalat 0,3 mol/L [44].
Analisis Mikromorfologi Film ZnO
Sifat antobiofilm dari permukaan material dipengaruhi oleh morfologi dan substansinya [12]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, morfologi film ZnO berbeda secara signifikan yang dibuat pada film PAA dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi kedua. Pada permukaan film PAA dengan nanopori 5-10 nm, partikel besar yang diaglomerasi berukuran 20-30 nm melekat erat dan membentuk film ZnO tebal (Gbr. 5a). Pada permukaan film PAA yang dibuat dengan durasi anodisasi dua langkah selama 40 menit, bingkai cangkang multilayer tetap berada di film ZnO (Gbr. 5b). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5c, partikel ZnO telah melekat pada kerangka film PAA dan membentuk lubang yang lebih besar. Pada sampel dengan pori nano 60–70 nm, partikel ZnO berukuran 10–20 nm menempel di tepi lubang PAA, dan sebagian partikel masuk ke pori nano (Gbr. 5d). Ini mungkin collosol memasuki lubang yang lebih besar dalam kondisi vakum dan kemudian membentuk partikel ZnO. Hasil di atas menunjukkan bahwa semakin kecil diameter nanopori PAA maka semakin tinggi daya lekat ZnO. Wu dkk. [45] menganggap bahwa partikel kolosol mudah terbentuk pada dinding lubang karena partikel sol negatif dan dinding pori PAA positif. Temuan ini juga sesuai dengan penelitian Bousslama et al. [46]. Kolosol hanya menempel pada dinding lubang saat film PAA direndam dalam sol seng selama 24 jam, kemudian lubang terisi penuh selama 48 jam, yang menunjukkan bahwa partikel kolosol lebih disukai menempel pada dinding lubang.
Gambar SEM dari film ZnO disiapkan pada PAA dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi dua langkah a 0 mnt, b 40 mnt, c 60 mnt, dan h 80 mnt
Hasil di atas menunjukkan bahwa partikel collosol mudah masuk ke lubang besar dan menempel pada permukaan bagian dalam dalam kondisi vakum; namun, partikel kolosol hanya menempel pada kerangka permukaan luar PAA dengan lubang-lubang kecil.
Gambar TEM dari film ZnO yang dicukur dari film komposit ZnO/PAA ditunjukkan pada Gambar 6. Pada permukaan PAA yang dibuat hanya dengan anodisasi satu langkah, partikel ZnO terdelaminasi berukuran sekitar 10 nm, tetapi partikel berukuran 20-30 nm ditunjukkan pada gambar SEM (Gbr. 5a), menunjukkan bahwa partikel ZnO diaglomerasi. Pada permukaan PAA yang dibuat dengan anodisasi dua langkah, partikel ZnO terdelaminasi berukuran kira-kira 20 nm, dan sebagian partikel diaglomerasi di masing-masing lokasi. Dimanifestasikan bahwa partikel ZnO menempel di tepi lubang PAA terlebih dahulu (Gbr. 6c, e, f).
Gambar TEM (a , c , e , f ) dan pola SAED (b , d ) dari film ZnO yang dibuat pada PAA dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi dua langkah a , b 0 mnt c , d 40 mnt; e 60 mnt; dan f 80 mnt
Bidang kisi (100), (101), (102), (110), dan (103) dari struktur wurtzit heksagonal ZnO ditunjukkan dalam pola SAED (Gbr. 6b, d), yang menunjukkan bahwa ZnO adalah wurtzit heksagonal. Hasilnya bertepatan dengan analisis XRD.
Karakterisasi Hidrofobisitas-Hidrofilisitas Permukaan Film ZnO
Untuk mengurangi adhesi bakteri dari bahan, film ZnO yang disiapkan dengan mikromorfologi yang berbeda diperlakukan untuk meningkatkan hidrofobisitas, dan sudut kontak air dari permukaan film tipis sebelum dan sesudah modifikasi ditunjukkan pada Tabel 1.
Sebelum dimodifikasi, film ZnO bersifat hidrofilik karena adanya gugus hidroksil permukaan pada partikel ZnO. Hidrofilisitas adalah yang terbaik karena struktur berpori yang disiapkan pada permukaan PAA dengan durasi anodisasi dua langkah 40 menit. Untuk sampel lain dengan durasi anodisasi dua langkah 60 dan 80 menit, hidrofilik menurun secara bertahap karena jumlah perekat ZnO yang rendah. Untuk sampel dengan durasi anodisasi satu langkah, hidrofilik yang rendah disebabkan oleh strukturnya yang tidak berpori.
Setelah modifikasi, film ZnO diterjemahkan menjadi hidrofobik. Menurut analisis FT-IR, triethoxysilylpropyl dicangkokkan pada sampel setelah ikatan –S–S– dari pemutusan Si69. Sementara itu, bisa jadi karena strukturnya yang berpori dan partikel ZnO yang lebih banyak; film ini memiliki hidrofobisitas tertinggi dengan durasi anodisasi dua langkah 40 mnt.
Karakterisasi Shewanella putrefaciens Biofilm
Chi dkk. [47] melaporkan bahwa aluminium anodized tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram-negatif (Escherichia coli dan P. aeruginosa ) dan bakteri Gram-positif (Streptococcus faecalis dan Staphylococcus aureus ). Namun, ZnO memiliki aktivitas antibakteri dan antibiofilm yang sangat baik [25,26,27], dan ada korelasi positif antara aktivitas antibakteri dan antibiofilm [48,49]. Selanjutnya, sifat antibakteri ZnO dipengaruhi oleh struktur mikronya [50, 51]. Untuk mendapatkan permukaan aktivitas antibiofilm yang sangat baik, film ZnO dengan struktur mikro yang berbeda disiapkan pada film PAA dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi kedua, dan sifat antibiofilm diukur.
Adhesi Biofilm dan Kurva Pertumbuhan Bakteri Biofilm
Pembentukan dan perkembangan biofilm bakteri dapat disimpulkan dalam lima tahap:adhesi bakteri yang reversibel ke permukaan pada awalnya; konversi dari adhesi reversibel ke adhesi ireversibel; pembentukan awal biofilm; perkembangan biofilm yang matang; dan degenerasi biofilm dan bakteri kembali ke keadaan planktonik [52].
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7(1), dalam 2 jam, perlekatan Shewanella putrefaciens biofilm pada film ZnO meningkat dengan cepat, menggambarkan konversi dari adhesi reversibel bakteri menjadi adhesi ireversibel. Dari 2 hingga 12 jam, perlekatan biofilm secara bertahap meningkat, yang merupakan tahap pertumbuhan biofilm. Dari 12 hingga 24 jam, perlekatan biofilm sedikit meningkat atau menurun, yang menunjukkan tahap pematangan biofilm. Setelah 24 jam, perlekatan biofilm menurun, dan biofilm memasuki tahap degenerasi. Gambar 7(2) menunjukkan bahwa kecenderungan variasi bakteri biofilm sesuai dengan perlekatan biofilm, menunjukkan bahwa perkembangan biofilm bergantung pada bakteri biofilm.
Daya rekat Shewanella putrefaciens biofilm (1 ) dan kurva pertumbuhan koloni bakteri biofilm (2 ) pada film ZnO yang disiapkan pada PAA dengan waktu yang berbeda dari durasi anodisasi dua langkah (a) 0 mnt, (b) 40 mnt, (c) 60 mnt, dan (d) 80 mnt
Selain itu, untuk film ZnO yang dibuat pada permukaan PAA dengan durasi anodisasi dua langkah selama 80 menit, perlekatan biofilm dan jumlah total bakteri biofilm adalah yang tertinggi di antara keempat sampel. Namun, untuk film ZnO yang disiapkan pada permukaan PAA dengan durasi anodisasi dua langkah selama 40 menit, sifat antibiofilmnya optimal. Hal ini mungkin karena perlekatan biofilm yang dihambat oleh hidrofobisitas tertinggi, dan kemudian lebih sedikit eksopolisakarida (EPS) dan nutrisi lainnya terhadap pertumbuhan bakteri biofilm. Untuk film ZnO yang dibuat pada permukaan PAA dengan durasi anodisasi dua langkah selama 80 menit, hidrofiliknya baik untuk perlekatan awal biofilm, dan partikel ZnO yang lebih sedikit tidak menghambat pertumbuhan bakteri biofilm. Sementara itu, lebih banyak bahan perekat biofilm memberi nutrisi pada bakteri biofilm, dan bakteri biofilm berkembang biak dengan cepat. Konsisten dengan penelitian kami, perlekatan biofilm dihambat oleh hidrofobisitas film ZnO yang lebih tinggi pada tahap awal pembentukan biofilm [49]. Perlekatan biofilm dipengaruhi oleh sifat hidrofobik dan hidrofilik bahan [14, 53, 54]. Bonsaglia dkk. [14] melaporkan bahwa L. monocytogenes melekat pada permukaan hidrofilik lebih mudah daripada ke permukaan hidrofobik. Banyak penelitian menemukan bahwa adhesi bakteri berkurang atau dihambat oleh permukaan hidrofobik [47, 54]. Shaer dkk. [54] indicated that the biofilm colonization on the functionalizing orthopedic hardware could be prevented by hydrophobic polycations. Chen dkk. [55] also suggested that the biofilm could be inhibited by low surface free energy. The results matched those from us.
The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm
The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.
SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min
After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.
According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Feng et al. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.
The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms
As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.
CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min
Conclusions
In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.
