Pengaruh Karbon Nanotube dan Turunannya Terhadap Sel Tumor In Vitro dan Parameter Biokimia, Komposisi Darah Seluler Di Vivo
Abstrak
Tujuan dari pekerjaan yang diusulkan adalah untuk menganalisis toksisitas nanotube karbon teroksidasi (CNTox), difungsikan oleh doxorubicin (CNT-Dox) dan fluorescein (CNT-FITC) pada tingkat sel dan organisme. Efek sitotoksik CNTox, CNT-Dox, dan CNT-FITC dianalisis pada sel tumor in vitro (kultur 2-D, 3-D) dan pada model tikus Balb2/c in vivo. Akibatnya, ditunjukkan kemungkinan imobilisasi doksorubisin pada permukaan CNT dan pelepasan terkontrol doksorubisin (Dox) dari permukaan CNT. Imobilisasi Dox bertepatan dengan penurunan efek sitotoksik CNT-Dox dibandingkan dengan Dox gratis. Pemecahan ikatan peptida dengan permukaan CNT menyebabkan pelepasan doksorubisin dan peningkatan tergantung dosis dari efek sitotoksik CNT dan Dox. Efek sitotoksik gabungan dari CNT, Dox, dan tripsin pada kelangsungan hidup sel tumor ditunjukkan. Pada tingkat organisme diteliti pengaruh struktur nano yang diperoleh terhadap keadaan sistem enzim hati, metabolisme protein, dan komposisi darah sel hewan coba. Pengaruh CNTox model in vivo secara statistik sama dengan kontrol. CNT-Dox menunjukkan efek toksik total organisme yang lebih rendah dibandingkan dengan doksorubisin murni. Penyimpangan dalam komposisi darah sel menunjukkan efek toksik umum dari CNT-Dox, tetapi lebih moderat dibandingkan dengan doksorubisin murni. Dari data yang diperoleh, kami menyimpulkan bahwa pengikatan CNT dengan doksorubisin memungkinkan pengurangan toksisitas doksorubisin pada indikator biokimia umum darah dan pelanggaran dalam komposisi sel darah in vivo. Pada saat yang sama, efek gabungan dari CNT dan doksorubisin setelah pelepasan obat memungkinkan kami mencapai kemanjuran yang lebih besar dalam menekan pertumbuhan tumor secara in vitro.
Latar Belakang
Salah satu aplikasi yang paling mencolok dan menjanjikan dari karbon nanotube adalah obat-obatan. Karbon nanotube (CNTs) dicirikan oleh sifat kimia dan biologi yang unik [1,2,3,4,5]. CNT memiliki luas permukaan yang besar yang memungkinkan mereka untuk menempelkan berbagai macam zat biologis [6]. Selain itu, CNT mampu menembus membran sel, kapiler, dan terakumulasi dalam sel dan jaringan [7,8,9]. CNT diserap oleh sel dengan mudah dan meningkatkan kemampuan CNT untuk mencapai inti sel dan menyiratkan kemungkinan terapi gen [10]. Itulah mengapa CNT merupakan kendaraan yang menarik untuk pengangkutan protein, antigen, vektor RNA/DNA [11], vaksin, dan obat-obatan ke dalam sel [12]. Perhatian khusus adalah pada prospek penggunaan CNT sebagai pembawa yang dipersonalisasi dengan pelepasan obat terkontrol untuk antikanker [13], antibakteri [14], dan terapi imunologis [15]. Pengiriman yang ditargetkan dan pelepasan terkontrol adalah masalah aktual dari penggunaan obat modern, terutama dengan sifat sitotoksik. Mekanisme pelepasan obat yang tepat memastikan konsentrasi efektif zat aktif di jaringan target dengan konsentrasi minimal di jaringan lain. Ini akan mengurangi dosis obat dengan mempertahankan efektivitas dan pengurangan bahaya dari efek samping. Saat ini, ada berbagai cara pengiriman obat yang bertujuan, seperti pengiriman menggunakan liposom [16], misel dan dendrimer polimer [17], partikel biodegradable [18], dan nanopartikel lainnya [19]. Tapi percobaan terbaru telah menunjukkan banyak manfaat dari menggunakan CNT dalam memberikan obat dibandingkan dengan nanopartikel lainnya [20, 21]. Salah satunya adalah CNT dengan permukaan yang cukup besar dan aktif yang dapat diisi dengan zat kimia yang diinginkan, mulai dari molekul kecil hingga protein, antibodi, dan RNA/DNA. Ujung terbuka CNT membuat volume bagian dalam dan permukaan dapat diakses untuk fungsionalitas. Jadi, area permukaan CNT yang besar menyediakan banyak situs pengikatan untuk berbagai jenis fungsionalisasi. Pada saat yang sama dengan prospek CNT, ada beberapa masalah dengan kelarutan CNT yang rendah, kemampuan untuk agregasi, kualitas hidrofilik, waktu paruh yang panjang, dan pengaruh pada seluruh organisme [22]. Menurut literatur, masuknya CNT ke dalam tubuh hewan percobaan disertai dengan akumulasi CNT dan turunannya di organ saluran pencernaan, limpa, ginjal [23], otot [24], dan jaringan paru-paru [25] . Pada langkah berikutnya, pengaruh CNT pada aktivitas metabolisme dan proses inflamasi [25, 26], keadaan sistem kekebalan [27], dan kelangsungan hidup hewan percobaan [28]. Namun demikian, masalah ini adalah subjek penelitian aktif untuk kemajuan lebih lanjut dalam penggunaan nanotube karbon. Keuntungan CNT sebagai nano-vektor untuk penghantaran obat telah dibuktikan secara meyakinkan dalam sejumlah penelitian. Penulis [29, 30] melaporkan bahwa nanotube tertentu mungkin kurang berbahaya daripada pembawa nano untuk obat. Juga telah ditunjukkan bahwa fungsionalisasi sederhana (-OH, -COOH, -NH, PEG) [31] atau enkapsulasi CNT [22], meningkatkan kelarutan dalam air, meningkatkan bioavailabilitas, dan mengurangi toksisitas CNT. Dan pengenalan CNT ke tikus dengan tumor yang ditransplantasikan mungkin efektif terhadap jaringan yang diubah menjadi target dan menyebabkan penurunan volume tumor dan meningkatkan kelangsungan hidup hewan [32].
Berdasarkan penelitian sebelumnya [33], kami berasumsi bahwa zat antitumor aktif (doxorubicin) dapat diimobilisasi pada permukaan ikatan peptida karbon nanotube. Senyawa yang dihasilkan berupa carbon nanotube yang difungsikan oleh doxorubicin (CNT-Dox), dapat menurunkan sifat sitotoksik CNT sebagai doxorubicin (Dox). Pada saat yang sama, disintegrasi konstruksi yang dirawat memungkinkan untuk mewujudkan sifat sitotoksik CNT dan Dox. Dengan demikian, adalah mungkin untuk mencapai peningkatan aktivitas antitumor dari kedua zat tersebut. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan efek sitotoksik konstruk CNTs-Dox dengan adanya protease (tripsin) in vitro. Kami menganalisis dampak CNT dan turunannya pada sel tumor dalam model sel 2D dan 3D, in vitro. Tujuan lainnya adalah untuk mengetahui pengaruh senyawa yang diperoleh (CNTs, CNTox, dan CNT-Dox) pada aktivitas sistem enzim hati, pergantian protein, dan komposisi darah seluler in vivo. Jadi, penulis menyadari estimasi kompleks toksisitas, bioavailabilitas, dan efektivitas penggunaan CNT dan turunannya terhadap tumor saluran pencernaan.
Metode
Garis sel karsinoma kolon adenokarsinoma grade II Kaukasia (HT29) digunakan sebagai model sel eksperimental dalam sistem 2D (monolayer) dan 3D (spheroid) in vitro. Garis itu dibeli dari Bank garis sel dan jaringan hewan Institut patologi eksperimental, onkologi, dan radiobiologi Kavetsky NAS Ukraina. Sel ditangani dalam kondisi kultur sel standar (kelembaban 95%, CO 5%2 di udara; 37 °C) dalam media penuh DMEM dengan 10% FBS di bawah tingkat penyimpanan laboratorium 2.
Sintesis, Oksidasi, dan Fungsionalisasi CNT
Karbon nanotube multi-dinding awal (MWCNTs) diperoleh dengan deposisi uap kimia (propilena dan hidrogen dengan Mo/Fe/Al2 O3 sebagai katalis). MWCNT yang disintesis memiliki 10–30 lapisan, diameter dalam 5–15 nm, diameter luar 10–60 nm, panjang 20–500 μm, luas permukaan spesifik 120 m
2
/g dan kerapatan curah 5–50 g/l [33].
Pemurnian MWCNT dari logam/katalis dilakukan dengan perlakuan HF. Penghapusan karbon amorf dari nanomaterial karbon diwujudkan dengan oksidasi di udara pada 450–500 °C. Sampel mentah yang mengandung MWCNT bereaksi dengan oksigen dari udara dan menghasilkan karbon dioksida atau karbon monoksida. Sejumlah deposit karbon telah diperoleh setelah pelarutan HF (aqua) pendukung katalis dioksidasi di udara pada 450–500 °C. Reaktor tabung kuarsa aliran udara digunakan untuk prosedur ini selama 130–150 menit. Kami menganalisis dan menggambarkan karakteristik fisik dan kimia dari MWCNT yang diperoleh dalam pekerjaan sebelumnya [33].
Pemindaian spektroskopi elektron (SEM) MWCNTs (JEOL SL6060LA, Jepang) digunakan untuk menentukan karakteristik struktural MWCNTs. Setelah imobilisasi ligan, morfologi tidak berubah.
Oksidasi MWCNT
Tahap selanjutnya, karbon nanotube murni (CNT) dioksidasi dalam 70% HNO3 pada 99 °C selama 4 jam lalu dicuci dengan air suling dan NH 10%4 larutan OH selama 12 jam. Akibatnya, karbon nanomaterial oksida MWCNTox (CNTox) disintesis. Setelah itu, CNT dicuci tiga kali dengan dH2 O sampai pH netral. Situs asam pada permukaan CNT diregenerasi dengan larutan HCl 0,1 M. CNTs-ox teroksidasi yang dihasilkan dipisahkan dengan sentrifugasi, dibilas secara ekstensif, dan disuspensikan kembali dalam dH2 Wahai air.
Persiapan Partikel CNT-Dox
Tugas langkah selanjutnya adalah melumpuhkan Dox hidroklorida (Dox, Teva Nederland B.V, Belanda) pada permukaan partikel MWCNTs. Untuk memfungsikan permukaan CNT teroksidasi (200 mg) oleh amino yang mengandung Dox-laktosa monohidrat, mereka diinkubasi dengan zat penghubung bifungsional—N-cyclohexyl-N′-(2 morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (C 1011, Sigma Aldrich , USA) selama 15 menit pada suhu kamar (Gbr. 1a). Setelah itu, 100 mg DOX-laktosa monohidrat ditambahkan ke dalam 10 ml buffer fosfat 0,15 M pH 6,5 ke masing-masing bahan nanokarbon. Campuran dibiarkan bereaksi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Dalam kondisi seperti itu, ikatan kovalen antara Dox dan CNT terbentuk (Gbr. 1b). Komposisi dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm 15 menit dan dicuci dengan dH2 Oh tiga kali. Supernatan digunakan untuk mendeteksi konsentrasi DOX bebas dengan spektrofotometer. Imobilisasi FITS pada permukaan CNT disediakan oleh skema yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, b.
a Skema reaksi CNT dengan karbodiimida. b Skema fungsionalisasi CNT oleh doksorubisin
a Skema reaksi CNT dengan urea. b Skema fungsionalisasi CNT oleh FITC
Persiapan Suspensi Stabil MWCNT
Suspensi koloid MWCNTs dilakukan dalam dua tahap. Pada tahap pertama, bahan nano karbon telah mengalami perlakuan ultrasonik dalam buffer salin fosfat (PBS) menggunakan penyebar ultrasonik UZDN—2 T. Mode pemrosesannya adalah I = 10 mA, R = 22 kHz, durasi—30 mnt. Pada tahap kedua, hidrosol yang dihasilkan didispersikan dengan sentrifugasi pada suhu kamar. Proses ini mencakup beberapa siklus sentrifugasi. Jadi, fraksi SWCNT yang larut secara hidrofilik dipilih dengan cara ini. Sebelum ditambahkan ke sel kultur suspensi, larutan MWCNT disterilkan dengan cara direbus selama 30 menit. Turunan CNT (CNT-Dox dan CNT-FITC) disterilkan dengan PSGA konsentrasi 100 kali lipat (Penisilin:Streptomisin:Gentamysin:Amfoterisin).
Zeta Potensi Suspensi Nanotube
Potensi zeta sampel diukur dengan hamburan cahaya elektroforesis (M3-PALS). Untuk pengukuran, penganalisis Zetasizer Nano ZS, yang diproduksi oleh Malvern Instruments (Malvern, UK), digunakan. Eksperimen dilakukan pada suhu 25 °C dengan tujuh kali pengulangan. Untuk mengukur sampel, digunakan elektroda submersible universal (Universal Dip Cell) ZEN1002 dan kuvet polistirena (DTS001), sumber cahaya—laser H-Ne 633 nm.
Spektroskopi FTIR
Komposisi kimia dari nanomaterial yang diperoleh diselidiki dengan spektroskopi Fourier-transform infrared (FTIR). Spektrum IR ditentukan dengan spektrometer FTIR Varian FTS 7000e. Sampel untuk analisis disiapkan dengan menggiling di penggilingan campuran ~ 1 mg CNT dan 150 mg KBr murni spektral. Sampel disiapkan dengan menggunakan alat pres dengan gaya tekanan 3,0–3,5 × 10
3
kg/cm
2
. Sampel didehidrasi dengan pemanasan pada suhu 600 °C selama 60 menit. Spektrum awal KBr diperoleh, setelah itu dikurangkan dari spektrum sampel. Semua spektrum dianalisis menurut katalog Identifikasi Spektrometri Senyawa Organik [34]. Sebagai perbandingan, sampel MWCNT teroksidasi (CNT-O), MWCNT yang difungsikan oleh doxorubicin (CNT-D), dan MWCNT yang difungsikan oleh label fluorescent (CNT-F) digunakan. Semua proses dan kondisi, sampel dan konsentrasi, adalah sama untuk tiga bahan.
Uji Kolorimetri Pelepasan Doksorubisin dari Permukaan CNT
Untuk mengevaluasi jumlah Dox bebas setelah imobilisasi pada CNM dan efektivitas pelepasan Dox, digunakan kemampuan Dox bebas untuk berfluoresensi pada panjang gelombang 495 nm [35]. Konsentrasi aktif Dox dalam Dox hidroklorida adalah 16,7% w /dengan . Untuk tujuan menggambar garis kalibrasi, Dox Teva 20 mg/ml dengan sepuluh pengenceran hingga 8 × 10
−3
mg/ml digunakan. Kemudian, fluoresensi Dox bebas diukur dalam supernatan dari kompleks DOX dengan CNT oleh pembaca pelat spektrofotometri Multiscan (Labsystem, Finland).
Konsentrasi Grup Fungsional dalam Partikel CNT-DOX, CNT-FITC
Untuk imobilisasi Dox, 1 g MWCNT dalam 1 ml dH2 O digunakan. Jumlah Dox-TEVA adalah 100 mg (16,7 mg Dox aktif) dalam 1 ml dH2 O. Jumlah Dox bebas dalam supernatan setelah reaksi adalah 0,37 mg atau 2,2% dari zat aktif. Jadi, kami membuat kesimpulan bahwa 16,23 mg DOX diimobilisasi pada 1 g CNTox. Untuk FITC persen imobilisasi rendah. Kemudian, 8,35 mg FITC diimobilisasi pada 1 g CNTox dalam 1 ml dH2 O. Efektivitas fungsionalisasi adalah 1,62% w /dengan untuk CNT-DOX dan 0,84% dengan /dengan untuk CNT-FITC. Perhitungan lebih lanjut dari konsentrasi CNT-Dox dan CNT-FITC didasarkan pada data ini.
Uji Sitotoksik Derivatif CNT pada Model Sel 2-D dan 3-D
Sitotoksisitas Dox, CNTs, CNT-FITC, dan CNT-Dox dievaluasi terhadap sel tumor HT29 menggunakan uji MTT. Uji MTT berdasarkan konversi garam 3-[4,5-dimetltiazol-2]-2,5-dipheniltetratetrazolium menjadi kristal formazan oleh enzim oksidoreduktase mitokondria yang bergantung pada NAD(P)H dalam sel hidup. Protokol dijelaskan oleh T. Mosmann [36]. Singkatnya, 1 × 10
4
HT29 diunggulkan di piring 96-sumur dan dikultur dalam media kultur penuh selama 12 jam. Kemudian, media kultur saat ini digantikan oleh media kultur yang mengandung CNTox (sampel #1), MWCNTs (sampel #2), CNT-Dox (sampel #3), Dox (sampel #4), dan CNT-FITC (sampel #5) . Konsentrasi sampel #1, 2, 3, 5 adalah 12,5–25–50–100–200 g/ml, konsentrasi stok sampel #4 adalah 20 μg/ml, konsentrasi akhir dari 1 hingga 10 μg/ml. Sel dikultur dalam medium penuh dan digunakan sebagai kontrol. Setelah 24 jam inkubasi, sel dianalisis dengan MTT dengan uji kolorimetri. Untuk 100 μl suspensi sel, kami menambahkan 20 l larutan MTT (5 mg/ml PBS, Sigma). Setelah itu, sel diinkubasi dengan MTT selama 4 jam dalam kondisi standar. Kemudian, sampel disentrifugasi di bawah 1500 g, selama 5 menit, dan supernatan diekstraksi. Secara keseluruhan, sumur ditambahkan 10 l DMSO (Sigma) untuk pengenceran kristal MTT dan 20 l 25 mM glisin. Absorbansi larutan yang bereaksi diukur pada 540 nm pada pembaca pelat spektrofotometri Multiscan (Labsystem, Finland).
Generasi Tumor Spheroid Multiseluler
Sel HT29 multi-seluler tumor spheroid (MTS) (kultur 3D) sebagai sistem model mikrometastasis tumor dikultur dengan metode mapan yang dijelaskan sebelumnya [33]. Secara singkat, suspensi sel dihitung menggunakan Trypan blue dan ditanam jumlah sel yang sama (5 × 10
4
sel/ml). Kultur sel 3D dipertahankan dalam media DMEM (Sigma, USA) dengan 10% FBS (Sigma, USA) dalam kondisi standar (kelembaban 95%, 5% CO2 di udara, 37 °C). Generasi MTS dilakukan oleh teknologi yang dikembangkan di laboratorium kami. Kultivasi sel tumor dipertahankan selama 24 jam dalam pelat 24-sumur yang dilapisi dengan agar-agar 1% dalam media kultur dengan 0,24% karboksi-metil-selulosa. Untuk menyelidiki ketergantungan ukuran dan jumlah MTS pada konsentrasi dan jenis CNT, MTS dihasilkan dengan adanya berbagai konsentrasi CNT. Sebelum pembuatan MTS ke kultur sel, larutan CNT dalam PBS ditambahkan dalam kultur ke konsentrasi akhir seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk uji MTT. Kultivasi lebih lanjut dilakukan selama 48 jam pada rotasi pelat yang konstan pada pengocok orbital (80 rpm). Pada tahap selanjutnya, pengambilan gambar foto mikro dilakukan dengan metode “dark field”. Secara keseluruhan, lebih dari 120 gambar telah dibuat. Kemudian, volume semua MTS yang ada pada file tersebut dihitung dengan menggunakan program Axio Vision Rel 4.7, Zeiss. Kami menggunakan rumus Rolf Bjerkvig:V = 0,4 ab
2
, di mana ukuran geometris bola (b < a ) [37]. Visualisasi hasil dilakukan pada mikroskop Stemy 2000C, Zeiss.
Analisis Dampak CNT pada Sistem Enzim Hepatik, Perputaran Protein, dan Komposisi Darah Seluler Di Vivo
Prosedur yang melibatkan hewan dan perawatannya sesuai dengan arahan Eropa 2010/63 UE, disetujui oleh Komite Etik Eksperimen Hewan setempat (Protokol 1 21.10.2016). Untuk menganalisis pengaruh zat yang diperoleh pada kondisi umum homeostasis organisme, serangkaian percobaan in vivo dilakukan. Studi in vivo menggunakan tikus dari garis Balb/2a. Tikus jantan dan betina sama dalam kelompok, berusia 6-8 minggu, sepuluh untuk setiap kelompok. Tikus ditempatkan di kandang dengan penutup kawat baja dan tempat tidur tongkol jagung dan dipelihara dalam suasana yang terkendali dengan siklus 12/12 gelap/terang, suhu 22 °C ± 3 °C, dan kelembaban 50–70%, dengan akses gratis untuk makanan dan air tawar. Dengan demikian, empat kelompok tikus terbentuk. Kelompok 1:hewan utuh diperlakukan dengan 200 l PBS, kontrol. Kelompok 2:mencit diberi CNTox dengan dosis 1,5 mg/kg. Kelompok 3:mencit diobati dengan CNT-DOX dengan dosis 1,5 mg/kg. Dan pada kelompok 4, tikus diberi doksorubisin dengan dosis 20 mg/kg. Tikus menerima CNT parenteral dalam 200 μl PBS, setiap 3 hari, selama 4 minggu. Doksorubisin diberikan secara intraperitoneal, setiap 3 hari sekali, dengan konsentrasi 20 mg/kg berat badan.
Analisis Biokimia Serum
Satu bulan kemudian, tikus ditarik dari percobaan. Sampel darah jantung segera diambil dari hewan yang mati. Darah diambil dari hewan pada waktu yang sama dari pukul 10 hingga 11 pagi. Untuk plasma, darah diinkubasi selama 40 menit pada 37 °C dan kemudian disentrifugasi (20 menit, 2000 rpm). Kemudian parameter biokimia, protein total, albumin, aspartat aminotransferase (AST) dan alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), ditentukan dalam plasma dengan kit diagnostik (Cormay, Warsawa, Polandia). Eksperimen dilakukan oleh protokol laboratorium terpadu pada penganalisis biokimia semi-otomatis FP-901M (Labsystems, Finlandia). Komposisi darah seluler ditentukan pada penganalisis hematologi Mindray BC-3000 Plus, China.
Analisis Statistik
Untuk analisis statistik kultur 3D, semua agregat sel diurutkan ke dalam kelompok menurut ukuran dari 1 × 10
−4
mm
3
hingga 1 × 10
−2
mm
3
dengan langkah 1 × 10
−3
mm
3
. Kemudian dihitung jumlah MTS pada masing-masing kelompok dan median volume MTS untuk masing-masing kelompok. Semua pengukuran diulang tiga kali. Untuk uji statistik mikro, variabel acak terdistribusi normal, kami menggunakan koefisien Student untuk populasi kecil. p . yang ditunjukkan nilainya adalah *р 0,05 atau **р 0.01.
Hasil dan Diskusi
Memindai Mikroskop Elektron MWCNT
Menurut protokol [38], diameter rata-rata CNT adalah 10–20 nm dan luas permukaan spesifik yang ditentukan oleh desorpsi argon adalah 200–400 m
2
/G. Kepadatan massal dalam 20–40 g/dm
3
. Secara khusus, aglomerat dalam bentuk tabung terjerat dengan dimensi 20–500 μm diperoleh selama produksi CNT industri yang menerapkan metode CVD (Gbr. 3).
Gambar SEM dari CNT, 1) skala 0,5 m; 2) skala 5 m
Zeta Potensi Suspensi Nanotube
CNTox dan CNT menunjukkan stabilitas yang signifikan terhadap agregasi, yang secara langsung bergantung pada nilai potensial zeta. CNT-DOX memiliki potensi zeta yang lebih kecil daripada CNTox dan CNT, dan reproduktifitas pengukuran yang tinggi, yang menunjukkan homogenitas partikel (Tabel 1). Nilai kecil dari potensi zeta CNT-FITC dapat menunjukkan ukuran partikel yang signifikan atau konsentrasinya yang kecil, seperti yang ditunjukkan oleh rasio kebisingan yang tinggi pada pengukuran.
Spektroskopi FTIR dari CNT, CNT-Dox, dan CNT-FITC
Ikatan antara CNTox dan doxorubicin (DOX) dan fluorescein (FITC) diperkirakan berdasarkan data spektral inframerah seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4.
Kehadiran pita kuat di = 3311 cm
−1
(CNT-O) dan = 3451 cm
−1
(CNT-D) yang dikaitkan dengan fluktuasi kopling CON-H, serta adanya pita kuat pada = 1634 cm
−1
(CNT-O) dan = 1631 cm
−1
(CNT-D) dikaitkan dengan getaran ikatan O-CNH, yang dengan jelas menunjukkan jenis ikatan amida antara CNT dan Dox. Juga, IR menunjukkan penyerapan ikatan C-H yang terletak di 2969–2834 cm
−1
dan pita lebar pada 1460–1407 cm
−1
dari fragmen C-O-H. Dengan demikian, kita dapat menyimpulkan bahwa sebagai hasil dari reaksi kimia, CNT difungsikan dengan obat antitumor (doxorubicin) dan label fluorescent (FITC).
Sitotoksisitas CNT pada Tahap Fungsionalisasi yang Berbeda pada Model Pertumbuhan Sel Monolayer dan Spheroids
Langkah selanjutnya adalah menentukan sitotoksisitas CNT teroksidasi (CNTox), CNT yang difungsikan dengan doxorubicin (CNT-Dox), dan label fluorescent (CNT-FITC). Hasil uji MTT pada kultur monolayer HT29 ditunjukkan pada Gambar. 5.
Viabilitas sel tumor HT29 dalam kultur monolayer setelah inkubasi selama 48 jam dengan CNT dan turunannya (CNT-Dox dan CNT-FITC). Signifikansi statistik:*р 0,05 atau **р 0,01
Hasilnya, terbukti bahwa CNTox, CNT-Dox, dan CNT-FITC memiliki efek sitotoksik sedang pada konsentrasi 12,5 μg/ml (81%). Peningkatan konsentrasi CNTox dari 25 menjadi 50 dan 100 g/ml menyebabkan penurunan viabilitas sel tumor yang bergantung pada dosis menjadi 71,8–69,6–62,5% dibandingkan dengan kontrol. Pada konsentrasi CNTox hingga 200 g/ml, viabilitas HT29 menurun hingga 39,2%. Pada saat itu, CNT-Dox pada konsentrasi rendah (12,5–50 g/ml) tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan secara statistik, dibandingkan dengan CNTox. Pada konsentrasi tinggi (200 μg/ml), CTN-Dox memiliki sitotoksisitas yang bahkan lebih sedikit daripada CNTox (50%). Pada saat yang sama, CNT, yang difungsikan dengan fluorescein, memiliki efek sitotoksik yang relatif lebih tinggi pada sel tumor. Setelah inkubasi dengan CNT-FITC dalam konsentrasi 25 g/ml, kelangsungan hidup sel HT29 berkurang menjadi 55% dan pada 100-200 g/ml menjadi 23 dan 7% masing-masing. Jadi, dalam hal itu, CNT memainkan peran substrat sel yang agak lembam. Lebih dari itu, CNT melumpuhkan Dox dan mengurangi sitotoksisitas Dox. Dalam penelitian sebelumnya [33], kami telah menunjukkan bahwa nanotube primer memiliki kualitas hidrofobik, efek sitotoksik moderat, dan merangsang pembentukan sejumlah besar agregat seluler. Menurut literatur [39], muatan permukaan CNT berubah selama oksidasi. CNT menjadi lebih hidrofilik, dan mengarah pada pembentukan agregat yang lebih kecil dan meningkatkan efek sitotoksik CNT. Data yang kami terima dalam penelitian sebelumnya menegaskan kecenderungan ini. CNTox mengurangi kelangsungan hidup sel tumor setidaknya 60% dibandingkan dengan kontrol, CNT-Dox pada 45%, dan CNT-FITC pada 97% (pada 200 μg/ml). Penjelasan dari data yang diperoleh mungkin dalam laporan dari penulis lain bahwa ligan fungsional, dalam banyak kasus, mengubah potensi zeta permukaan CNT, merangsang kelarutan CNT, dan meningkatkan penetrasi sel CNT [40]. Kemampuan CNT untuk membentuk agregat setelah oksidasi dan fungsionalisasi menurun, sedangkan permeabilitas melalui membran sel meningkat dan reaktivitas organel seluler meningkat. Lebih dari itu, CNT-Dox, pada konsentrasi tinggi, memiliki efek sitotoksik yang lebih rendah daripada CNTox. Pada saat yang sama, menurut data yang diperoleh, dapat diasumsikan bahwa ikatan peptida menjaga doksorubisin pada permukaan CNT. Ikatan peptida antara CNT dan Dox cukup stabil dalam kondisi kultur sel. Itu tidak rusak dan mengambil doxorubicin dalam bentuk tidak aktif. Pada saat yang sama, molekul fluorescein-natrium (C20 H12 O5 ), ligan dengan ukuran 332,311 g/mol, cukup mudah terdisosiasi dari permukaan CNT dan memasuki sel. Hasilnya, ada pelanggaran permanen terhadap struktur DNA, inti, dan mitokondria [41].
Untuk memverifikasi sitotoksisitas CNT dan turunannya serta dampaknya pada sifat perekat sel tumor, area koloni 2D sel HT29 dianalisis. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 6. Ditunjukkan bahwa CNT dan turunannya memiliki pengaruh pada kemampuan adhesi sel tumor dan pembentukan koloni sel tumor dalam kultur lapisan tunggal. Inkubasi sel tumor dengan CNTox (sampel #1) pada konsentrasi 12,5, 50,0, dan 200 g/ml menyebabkan penurunan tergantung dosis dari koloni sel 2D pada 55,2%, 57,8%, dan 78,3%, dibandingkan dengan kontrol. Pada saat yang sama, sampel CNT-Dox (sampel # 3) pada konsentrasi yang sama tidak menyebabkan efek seperti itu. Luas koloni 2D masing-masing berkurang 34,8%, 61,6%, dan 82,4%. CNT-FITC (sampel #5) menunjukkan pengaruh terbesar pada sel tumor dalam kultur lapisan tunggal. Luas koloni 2D setelah inkubasi dengan CNT-FITC menurun masing-masing sebesar 59,8%, 85,2%, dan 89,8%. Perlu dicatat bahwa hasil yang diperoleh memiliki kecenderungan yang sama dengan uji MTT. Tetapi hasil analisis MTT tidak menunjukkan efek sitotoksik yang signifikan. Perbedaan yang dihasilkan mungkin merupakan hasil dari efek non-sitotoksik CNT pada koloni sel, dan, sebagian, pengaruh anti-perekat. Sebelumnya, kami telah menunjukkan bahwa CNT memiliki kemampuan sitotoksik yang lebih sedikit daripada anti-adhesi. Menurut data kami, CNT merangsang migrasi sel tumor ke dalam fraksi suspensi dan pembentukan tumor spheroid (MTS) multiseluler. Sensitivitas sel terhadap agen antitumor dalam kultur monolayer dan spheroid berbeda. Itulah sebabnya pada langkah selanjutnya, kami menyelidiki pembentukan MTS oleh sel tumor HT29 dengan adanya CNTox, CNT-Dox, dan CNT-FITC. Konsentrasi CNT sama seperti pada percobaan sebelumnya. Pada Gambar 7, ditunjukkan bahwa CNTox (sampel #1) mampu merangsang pembentukan MTS. Peningkatan konsentrasi CNTox disertai dengan peningkatan volume median MTS yang bergantung pada dosis. Pada konsentrasi CNTox dari 12,5, 50, 200 μg/ml, volume rata-rata MTS meningkat dari 1,79 menjadi 2,18 dan 10,98 mm
3
; itu hampir sepuluh kali. Turunan CNT tidak menyebabkan efek seperti itu pada sel tumor. CNT-Dox (sampel # 3) merangsang pembentukan MTS dalam 2,83 kali. Pada saat yang sama, inkubasi kultur sel tumor 3D dengan CNT-FITC (sampel # 5) menyebabkan penurunan volume MTS 2,4 kali lipat.
Area koloni sel tumor HT29 dalam kultur monolayer yang diinkubasi dengan CNTox (#1), CNT-Dox (#3), CNT-FITC (#5). Signifikansi statistik:*р 0,05 atau **р 0,01
Median volume spheroid tumor multiseluler. MTS dihasilkan dengan adanya CNTox (sampel #1), CNT-Dox (sampel #3), CNT-FITC (sampel #5). Signifikansi statistik:*р 0,05 atau **р 0,01
Patut dicatat bahwa dalam sebagian besar percobaan, CNT-Dox tidak memiliki efek sitotoksik pada sel tumor, baik dalam kultur 2D maupun 3D, yang dapat dibandingkan dengan efek doksorubisin tunggal. The mechanism of cytotoxic action of doxorubicin is based on penetration into the cell nucleus and intercalation between nucleotide pairs, violation of replication and DNA repair, protein synthesis and, as a result, cell death. The cause of the reduction of cytotoxic effect of the CNT-Dox may be the binding of the doxorubicin with CNT surface through peptide bonds. It prevents Dox dissociation from CNT surface and Dox penetration into the cell and cellular organelles. This fact may let to deliver the compound to certain tissues without causing a negative effect on “non-target” objects.
In this case, the next step of the study was controlled release of doxorubicin. For peptide bonds breaking, we used the commonly known peptidase trypsin as the release agent. The effect of trypsin on the Dox release from the surface of the CNT was investigated by spectral analysis. Since the free doxorubicin has a fluorescence peak at 495 nm, bounded doxorubicin has no such ability. It was analyzed how the increasing of trypsin concentration affected on concentration of free doxorubicin. The results are shown in our previous work [42]. Shortly, it was demonstrated that increasing the concentration of 0.05% trypsin from 11 to 20% in culture medium contributed to an increasing the concentration of free doxorubicin from 3.13 to 6.55 μg/ml. A further increasing the concentration of trypsin to 60% did not lead to increasing in free doxorubicin. However, the concentration of trypsin by about 66% stimulated release again and led to increasing the concentration of doxorubicin in two times, to 11.38 μg/ml. Thus, it was concluded that 0.05% trypsin has several effective concentrations. Under these conditions, peptide bonds between doxorubicin and CNT were broken and doxorubicin was released. Therefore, to analyze how CNT-Dox influence the tumor cells after Dox release, we incubated tumor cells in the w/o fetal bovine serum (FBS) nutrient medium with trypsin and in the presence of CNT-Dox. The survival of tumor cells was determined using the MTT test. The ratio of the nutrient medium, trypsin, concentration of CNT-Dox, and doxorubicin are given in Table 2. The results of incubation HT29 during 48 h are demonstrated on Fig. 8. Cell viability in the presence of trypsin—blue columns, alone doxorubicin—orange columns, and CNT-Dox with trypsin—pink columns. In results, it has been found that the simultaneous use of trypsin and CNT-Dox significantly increased the cytotoxic effect of CNT and doxorubicin compared to the separately use of these substances. So doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decreasing the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control (Fig. 8, orange columns). Incubation of CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 t0 70% led to a dose-dependent decreasing in the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively (Fig. 8, pink columns). At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0% (Fig. 8, blue columns). Thus, we can conclude that we observe the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times.
Percentage of alive cells HT29 after 48 h of incubation in the presence of trypsin, doxorubicin, CNT-Dox. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01
As functional groups (Dox) were attached to CNTs surface by peptide bonds as, in vivo Dox release will be realized in organs of the gastrointestinal tract with an increased content of proteases, peptidases. In organism, proteases are used for various metabolic processes. Acid proteases secreted into the stomach (such as pepsin) and serine proteases present in duodenum (trypsin and chymotrypsin) enable us to digest the protein in food [43]. Other proteases are present in leukocytes (elastase, cathepsin G) and play several different roles in metabolic control. This is one of the fastest “switching on” and “switching off” regulatory mechanisms in the physiology of an organism. By complex cooperative action, the proteases may proceed as cascade reactions, which result in rapid and efficient amplification of an organism’s response to a physiological signal. Therefore, the authors suggest that CNT-Dox construction will be the most effective in the case of stomach, pancreas, liver, and small intestine cancer localization in case of parenteral administration of drug.
Influence of CNTs and Their Derivatives on Cell Blood Composition, Hepatic Enzyme System, and Proteins Turnover In Vivo
To determine the impact of the CNTox and CNT-Dox on the protein metabolism and the state of the hepatic enzyme system, the level of albumin (Al), total protein (Tp), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP) was determined. Data are given in Fig. 9a, b. As a result, it was noted that CNT-Dox and Dox have influence on the hepatic enzymes activity, namely on the AST and ALP. AST level increased in mice serum from 1 group for 21.6%, 2 group for 93.9%, and 3 group for 126.4% compared with control. At the same time, the activity of ALP increased in mice serum from 1 group for 23.5%, 2 group for 119.1%, and 3 group for 147.8%. CNTox administration did not show statistically significant changes in AST, ALT, and ALP levels. In addition, it should be noted that CNTox, Doxorubicin, and CNT-Dox slightly increased the level of total protein in the blood of experimental animals. So, we found that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox. To determine possible inflammatory processes and systemic effects of CNTox, CNT-Dox on the state of blood cells composition, it was analyzed the blood cell formula of the experimental animals. The results are shown in Table 3. Obtained data are in good agreement with the well-known manifestations of doxorubicin’s hematological toxicity:anemia (decreased red blood cells, hemoglobin, hematocrit), thrombopenia (platelet count), neutropenia (decrease in the number of granulocytes). Interestingly, that it was demonstrated the same direction of the changes of practically all hematological parameters in the 1 (CNTox), 2 (CNT-Dox), and 3 (Dox) groups of animals. However, the change in the 2 and 3 groups of animals was statistically significant accordingly to control and 1 group. In the 2 group (CNT-Dox), it was found pronounced decreasing of the monocyte content related to the system of phagocyte mononuclear cells and cell’s immune response (9.5% and 0.12 × 10
9
/l in control, 4.6% and 0.06 × 10
9
/l in 2 group, and 4.55 and 0.05 × 10
9
/l in 3 group). Animals of 2 and 3 groups demonstrated reducing the content of granulocytes (neutrophils) (12.6 and 0.16 × 10
9
/l in control and 8.5% and 0.2 × 10
9
/l in 2 group and 8.05 and 0.16 × 10
9
/l in 3 group). The number of lymphocytes, both in percentage and absolute, increased in 2 and 3 groups (77.9% and 0.97 × 10
9
/l in control and 86.9% and 2.0 × 10
9
/l in 2 group and 87.8% and 2.3 × 10
9
/l in 3 group). The main function of the lymphocytes is recognition of the antigen and participation in the adequate immunological response of the body. T lymphocytes perform regulatory and effectors functions. B lymphocytes take part in humoral immunity, providing immunoglobulins in response to stimulation of other people’s antigens. So, it can be assumed that an increase in the index of lymphocyte content in experimental 1, 2, and 3 groups can be associated with the introduction of foreign antibodies (CNTs) and/or tissue distraction [44]. Some decrease in the absolute number of leukocytes in 2 (1.2 × 10
9
/l) and 3 (0.85 × 10
9
/l) groups compared with the 1 group of animals (2.0 × 10
9
/l) can be regarded as the result of a gradual accumulation of the reversal of toxic effects of Dox. It is described the reaction of WBC in experimental animal groups as well-known toxic hematologic impact from doxorubicin in the development of leucopenia. The analysis of indicators reflecting the number and state of RBC (erythrocytes and hemoglobin) also showed the same trend of misbalance in the 2 and 3 groups of animals. Statistically significant thrombocytopenia and anemia are more indicative in animals of 2 and 3 groups:the number of erythrocytes (5.54 × 10
12
/l in control, 3.97 × 10
12
/l in 2 group, and 3.12 × 10
12
/l in 3 group), the amount of hemoglobin (78 g/dl for intact animals, 55.5 g/dl for 2 group, and 46.2 g/dl for 3 group), hemoglobin (25.25% for intact animals and 16.75% for 2 group and 15.12% for 3 group). The amount of erythrocytes decreased but the average content of hemoglobin in one erythrocyte did not decrease. And, as a result, concentration of hemoglobin per one erythrocyte increased. Analysis of the RBW counts let us suggest that in 2 and 3 group of animals, there are several processes:decreasing the formation of erythrocytes in the bone marrow, the acceleration of erythrocyte destruction, the violation of the structure of membranes of red blood cells, and molecular defects (oxidation) of hemoglobin. Thrombocytopenia (27 × 10
9
/l in intact animals, 14.0 × 10
9
/l in 2 group, and 12.05 × 10
9
/l in 3 group), a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia and granulocytopenia (neutropenia) are the predominant manifestations of doxorubicin hematologic toxicity and is the most common acute dose-limiting toxicity of this drug. The direction of changes in the platelet content in the blood of experimental animals treated with CNTox and CNT-Dox is the same; however, significantly more pronounced in the group of animals receiving free Dox.
Monitoring of clinical parameters following CNTox (1 group), CNT-DOX (2 group), free DOX (3 group) administration in Balb/2a mice. Mice were treated by CNTox, CNT-DOX, DOX every 3 days during 4 weeks, in concentrations:CNT—1.5 g/kg and Dox—20 mg/kg of weight. Each experiment was done in triplicate. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01. ALT alanine transferase, AST aspartate transferase, AP alkaline phosphatase
Thus, according to our results from in vivo experiments, it was demonstrated that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile and protein turnover. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. More than that, dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia) was shown for the group of animals receiving free Dox. This predominant manifestation of hematologic toxicity was less pronounced in the group of animals receiving free CNT-Dox and CNTs. So, we can assume that, in the case of parenteral administration of CNT-Dox under action of gastric juice peptidases, CNT-Dox particles breaks up into free CNT and Doxorubicin. After that, Doxorubicin enters to the stomach cells and partly in the bloodstream. That also causes the specified effect on blood cells composition. For modeling Dox release in vivo, trypsin were used in vitro.
One of the goals of this investigation was to minimize the side effects of carbon vehicle on the body. Previously, the authors demonstrated that CNTs may be a potential threat to tumor development due to its ability to stimulate cell migration and support cells in suspension fraction [33]. In this case, CNTs themselves play a role of artificial extra cellular matrix. Another way CNTs can stimulate suspension cells to aggregation. If this process will be coincident with antitumor drug accumulation on CNTs surface, CNTs will attract substrate-independent cells and kill them. Simultaneously, it was found that pure CNTs did not have statistically significant cytotoxicity to tumor cells. So, CNTs alone are not dangerous as cytotoxic agents and can act as carrier for antitumor drugs to target cells. Then, studies were conducted to the functionalization of the CNTs by antitumor antibodies. It was demonstrated that CNTs are able to carry on the surface not only the Dox but also specific tumor antibodies—anti EGFr [42]. Under the action of trypsin, Dox was released and realized strong cytotoxic effect on tumor cells. Recent studies have shown the synergy cytotoxic effect of CNTs and Doxorubicin after release from CNT-Dox construct in the presence of trypsin. Such effect was not demonstrated by CNTs and Dox separately. Therefore, the benefits from the use of CNTs seems in the usage CNTs as vehicle for antitumor antibody and drug. On the other hand, the negative effects of Doxorubicin, like many other early antitumor drugs, are totally cytotoxic effects. Binding of the Dox to the CNTs partially blocks it. This effect allows ensuring local accumulation of the Dox in the focus of tumor activity with subsequent release and action. Thus, greater efficacy can be achieved with a smaller dose of administration. This effect can be achieved only if there are tumor-specific antibodies on the surface of the CNTs. The possibility of creating such construct was demonstrated by the authors in previous work. Undoubtedly, that CNTs dissemination, accumulation, and Dox effective should be tested on mixed culture in vitro and on a tumor model in vivo. For this purpose, synthesized CNT-FITC was created and conducted. The ability of the CNTs to act as an extra-cellular matrix and the significance of this process for the “tumor-body” system should be tested on the animal model. The effectiveness of the drug will be investigated on the model of Ehrlich carcinoma and colon rectal carcinoma [44]. The distribution of CNTs in the tissues of the body will be investigated using the construct created by the CST-FITC, as was mentioned in this work. The accumulation of CNTs in the tissues of the organs of the gastrointestinal system, namely the stomach, liver, and intestines, will be analyzed by histological assay. These studies are already conducted by the authors.
According to Shang-Lin Wang [4] and our data, free doxorubicin causes similar side effects, but more pronounced than CNT-Dox. Other authors reported that toxicity effect of CNTs depends on way of administration, dose, and time of exposure and varies according to the size and type of the cells [45,46,47,48,49]. Settling of CNTs in the tissues of the liver, kidneys, and stomach with prolonged exposure can cause oxidative stress, DNA damages, compromise cell proliferation, necrosis of tissues, and chronic inflammation [50]. According to Manna [51], CNTs can cause oxidative stress and compromise cell proliferation. In the case of in vitro studies, the cytotoxicity of CNT highly depends on the degree of CNTs purification, functionalization, size, and surface charge [52,53,54,55]. According to our results and previous data, the obtained CNTs did not demonstrate a significant cytotoxic effect [33]. More than that, our data let us suggest that there is a combined cytotoxic effect of CNTs and DOX that occurs as in vitro. That is why we assumed that obtained CNTs can be used against tumor cells, in case of the target accumulation of CNTs/CNT-Dox in tumor tissue. However, mechanisms of the cytotoxic effect of CNTs are not completely clear. Some authors suggested that CNT particles activate NF-kappaB pathway depending on the dose and that the mechanism of activation was due to activation of stress-related kinases [51]. Other authors reported that CNTs have a direct pro-apoptotic effect in vitro in different cancer cell lines and tumor cells obtained from surgical specimens [56], CNTs able to modify fatty acids in cell membranes [57] or erythrocyte membrane damage [58]. For further investigation of accumulation CNTs in cells and tissue, we plan to use CNT-FITC composite.
Other unclear questions are as follows:what is the prolonged impact of CNTs/CNT-Dox on organism level and how does it stimulate accumulation CNTs/CNT-Dox in tumor tissue? To investigate the influence of chronical introduction of CNTs/CNT-Dox, long-time studies on model of transplanted or initiated tumors of various localizations will be realized. Other authors analyzed the distribution of nanotubes throughout the body of mice after pulmonary exposure [59]. In results, accumulation of MWCNTs was documented in several organs, including notably the white pulp of the spleen and the bone marrow. The CNTs usually deposit in the liver, spleen, or lungs after they have served their purpose from where they are expelled gradually out of the body through the renal excretion route [60]. Zhao and Liu reported that accumulation of CNTs in the body can lead to granulomatous inflammation or alveolar septal thickening. Zhuang Liu et al. reported that SWNT-PTX affords higher efficacy in suppressing tumor growth than clinical Taxol® in a murine 4T1 breast-cancer model, owing to prolonged blood circulation and tenfold higher tumor paclitaxel (PTX) uptake by SWNT delivery likely through enhanced permeability and retention [61]. Accumulation of CNTs in the target tissue can be enhanced by placing on the CNTs surface specific antibodies which over expressed by tumor cells. The possibility of using antibodies for the targeted delivery of nanostructured preparations has been described by many authors [62, 63].
Conclusion
In 2D culture CNTox concentration from 25 to 50 and 100 μg/ml led to dose-dependent decreasing the viability of tumor cells to 71.8–69.6–62.5% accordingly compared with control. At concentration of CNTox up to 200 μg/ml, the viability of HT29 decreased to 39.2%. At that time, CNT-Dox at concentrations 12.5–25–50 μg/ml did not show statistically significant cytotoxicity, compared with CNTox. At high concentrations (200 μg/ml), CTN-Dox had even less cytotoxicity than CNTox (50%). After incubation with CNT-FITC in concentration of 25 μg/ml, HT29 cell survival reduced to 55% and at 100–200 μg/ml to 23 and 7% respectively. In 3D culture, increasing of CNTox concentration is accompanied with dose-dependent increasing of median volume of MTS. At concentration CNTox from 12.5, 50, 200 μg/ml median volume of MTS increases from 1.79 to 2.18 and 10.98 mm
3
. CNTs-Dox and CNT-FITC did not cause such effect on tumor cells. Doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decrease in the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control. Incubation CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 to 70% led to a dose-dependent decreasing the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively. At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0%. So, the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin was observed. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times. In vivo, systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage, thrombocytopenia, a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia). Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox.
So, the possibility of targeted delivery and controlled release of any highly toxic drug with the use of CNT depends on strategies of reducing toxicity of CNTs and realizing potential of CNTs and anti-tumor drugs “in right place in right time.” According to the data obtained by authors and literature, it is possible. Our data support the assumption that this approach allows to reduce toxicity of the doxorubicin on the general biochemical indicators of blood and violations in the blood cells composition. At the same time, doxorubicin releasing is realized under certain conditions. And combined effect of CNTs and doxorubicin let us achieve greater efficacy in suppressing tumor cell growth in vitro.
Singkatan
Al:
Albumin
ALP:
Alkaline phosphatase
ALT:
Alanine aminotransferase
AST:
Aspartate aminotransferase
CNT-Dox:
Carbon nanotubes which were functionalized by doxorubicin
CNT-FITC:
Carbon nanotubes which were functionalized by fluorescein
