Efek Perlindungan Titik Karbon Berasal dari Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata terhadap Deinagkistrodon acutus Venom-Induced Acute Kidney Injury
Abstrak
Latar Belakang
Sebagai bahan nano yang muncul, titik karbon (CD) telah menjadi fokus perhatian yang luar biasa untuk aplikasi biomedis. Namun, sedikit informasi yang tersedia tentang bioaktivitasnya dalam menghambat cedera ginjal akut (AKI) yang disebabkan oleh bisa ular.
Metode
Studi ini melaporkan pengembangan proses pirolisis satu langkah hijau untuk mensintesis CD menggunakan Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) sebagai satu-satunya prekursor, dan aplikasi potensialnya sebagai pelindung terhadap Deinagkistrodon acutus (D. acutus) AKI yang diinduksi racun diselidiki untuk pertama kalinya. Model AKI dibuat dengan menyuntikkan D. tajam racun ke dalam rongga perut tikus dan efek perlindungan potensial dari PCC Carbonisata-CDs (PCCC-CDs) pada kelainan ginjal termasuk disfungsi, reaksi inflamasi, kerusakan jaringan, dan trombositopenia pada enam titik waktu (1, 3, dan 12 jam, dan 1, 2, dan 5hari) diselidiki.
Hasil
Hasil ini menunjukkan bahwa PCCC-CD secara signifikan menghambat disfungsi ginjal (penurunan serum kreatinin (SCR), nitrogen urea darah (BUN), protein total urin (UTP), dan konsentrasi mikroalbuminuria (MALB)) dan produksi kemoatraktan (protein kemotaksis monosit). 1 (MCP-1)), sitokin proinflamasi (interleukin (IL)-1β), dan sitokin antiinflamasi (IL-10) sebagai respons terhadap injeksi intraperitoneal D. tajam bisa ular. Efek menguntungkan dari PCCC-CD pada tikus yang terkena racun serupa dengan perubahan histologi ginjal dan trombositopenia.
Kesimpulan
Hasil ini menunjukkan efek perlindungan yang luar biasa dari PCCC-CD terhadap AKI yang diinduksi oleh D. tajam racun, yang tidak hanya akan memperluas aplikasi biomedis CD tetapi juga memberikan target potensial untuk pengembangan obat terapeutik baru untuk AKI yang diinduksi oleh D. tajam racun gigitan ular.
Pengantar
Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , milik keluarga Viperidae, dianggap sebagai salah satu ular terestrial paling berbahaya di Cina [1]. Racun oleh D. tajam dikaitkan dengan serangkaian gejala seperti perdarahan, trombositopenia, dan kemungkinan kerusakan langsung pada ginjal [2, 3]. Cedera ginjal akut (AKI) adalah efek sistemik yang paling serius dan komplikasi umum keracunan oleh D. tajam yang secara langsung menyebabkan disfungsi ginjal persisten dan morbiditas yang tinggi [4, 5]. Pengobatan topikal saat ini melibatkan penggunaan antivenin hiperimun yang diturunkan dari kuda sebagai penangkal. Namun, efektivitasnya terbatas dalam menetralisir kerusakan jaringan lokal, terutama pada terjadinya AKI, dan memiliki beberapa efek yang tidak memuaskan seperti reaksi anafilaksis dan pirogenik [6]. Selain itu, biaya yang relatif tinggi dan stabilitas antivenin yang buruk juga berkontribusi pada pengobatan yang tidak memuaskan pada orang yang digigit oleh D. tajam , terutama di alam liar atau pedesaan [7,8,9]. Oleh karena itu, sangat dibutuhkan obat komplementer yang efektif, aman, dan terjangkau untuk pengobatan D. tajam AKI yang diinduksi racun.
Titik karbon (CD), kelas baru bahan nano karbon dengan ukuran < 10 nm, secara kebetulan ditemukan dengan pemisahan dan pemurnian tabung nano karbon berdinding tunggal pada tahun 2004 [10] dan telah menarik banyak minat selama dekade terakhir karena sifatnya yang luar biasa. sifat baru seperti biokompatibilitas yang cukup besar, toksisitas rendah, kelarutan air yang tinggi, dan bahan baku yang melimpah [11,12,13]. Munculnya CD telah memberikan kontribusi untuk penelitian tentang pengembangan berbagai "pintar" nanosystems terutama termasuk untuk bioimaging [14], biomedis [15], pengiriman obat [16], dan fotokatalisis [17].
Sebagai catatan, pengembangan CD dengan potensi bioaktivitas yang melekat memberikan banyak strategi untuk penemuan obat generasi baru untuk pengendalian atau pengobatan yang efektif dari beberapa penyakit karena keuntungan yang disebutkan di atas. Dalam beberapa bioaktivitas seperti antibakteri untuk mengobati keratitis bakteri [18], hemostatik [19], aktivitas seperti peroksidase [20], antikanker, antivirus, dan anti-inflamasi [21] telah dilaporkan. Efek ini telah menarik perhatian para ilmuwan untuk mempelajari aplikasi farmasi dan biomedis tambahan dari CD. Terutama, aktivitas pengurangan CD yang berasal dari Schizonepetae Spica Carbonisata [22] pada D. tajam perdarahan akibat racun telah memberikan perspektif baru dalam penyelidikan efek menguntungkan CD pada AKI yang diinduksi oleh D. tajam gigitan ular, yang masih kurang dipahami sampai sekarang.
Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CD disintesis dengan pirolisis langsung PCC (sejenis obat tradisional Tiongkok, yang telah digunakan selama> 1000 tahun) menggunakan perlakuan pirolisis satu langkah. PCCC-CD adalah CD hipotoksik dengan diameter mulai dari 1,2 hingga 4,8 nm. PCCC-CD telah dilaporkan memiliki efek hemostatik yang luar biasa, yang tidak hanya memperluas aplikasi biomedis dari CD tetapi juga memelopori penjelasan dari bahan dasar hemostatik PCCC [23]. Sebagai catatan, PCCC, obat tradisional Tiongkok yang dibuat dengan pemrosesan arang, pertama kali dicatat di Resep Suci Taiping untuk Bantuan Universal (978–992 AD, di Cina). Profil keamanan dan kemanjuran terapeutik PCCC yang memuaskan, seperti hemostasis dan anti-inflamasi, mendorong penerapan klinisnya yang berkelanjutan selama lebih dari 1000 tahun, yang diakui dalam Farmakope Republik Rakyat Tiongkok (PPRC, 2015). Namun, studi tentang bioaktivitas tambahan yang mendasari PCCC-CD telah menjadi tantangan. Terutama, ada sedikit informasi tentang penghambatan AKI yang diinduksi oleh D. tajam racun.
Selain itu, gigitan ular telah dilaporkan dapat membahayakan fisiologi ginjal secara langsung melalui komponen nefrotoksik atau dengan aktivasi atau modulasi mediator imun dan inflamasi [24]. Efek ini terutama pada parameter biomedis [25] (kreatinin serum (SCR), nitrogen urea darah (BUN), protein total urin (UTP), dan konsentrasi mikroalbuminuria (MALB), sitokin inflamasi (interleukin (IL)-1β), sitokin anti inflamasi (IL-10), dan monosit chemotactic protein 1 (MCP-1), perubahan histologi ginjal, dan jumlah trombosit (PLT). Dalam penelitian ini, kami mensintesis PCCC-CD menggunakan metode pirolisis satu langkah hijau dan, untuk pertama kalinya, menyelidiki efek perlindungannya terhadap perkembangan kelainan ini pada AKI yang diinduksi oleh injeksi intraperitoneal tikus dengan D. tajam racun.
Materi dan Metode
Bahan kimia
Bahan PCC dibeli dari Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China), dan PCCC disiapkan di laboratorium kami. Membran dialisis dengan berat molekul 1000 Da dibeli dari Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). Kit penghitungan sel (CCK)-8 dibeli dari Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Jepang). Racun ular lyophilized dari D. tajam disediakan oleh Peternakan Ular An Ren (Kabupaten Yujiang, Yingtan, Jiangxi, Cina) untuk penggunaan eksperimental. Reagen kimia kelas analitik lainnya diperoleh dari Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, Cina). Kit MCP-1, IL-10, dan IL-1β enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) tikus dibeli dari Cloud-Clone Crop. (Wuhan, Cina). Semua eksperimen dilakukan menggunakan air deionisasi (DW).
Hewan
Manajemen hewan dan protokol penelitian didukung dan disetujui oleh Komite Kelembagaan Etik Eksperimen Hewan dari Universitas Pengobatan Tiongkok Beijing. Tikus Kunming jantan (beratnya 30,0 ± 2,0 g) dibeli dari Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., dengan sertifikat kesesuaian hewan laboratorium, dan disimpan di kandang pada suhu dan kelembaban konstan pada cahaya 12 jam/ siklus gelap dengan ad libitum akses ke makanan dan air.
Persiapan Solusi Racun
Racun lyophilized dilarutkan dalam salin normal dengan pencampuran ringan selama 20 min (konsentrasi akhir:5 mg/mL) dan disimpan pada 20 °C sampai dibutuhkan.
Persiapan CD-PCCC
PCCC disiapkan menggunakan metode pirolisis satu langkah dengan PCC sebagai satu-satunya prekursor sesuai dengan metode sebelumnya [23]. Secara singkat, sampel PCC ditempatkan dalam cawan lebur porselen terpisah dan dipanaskan selama 1 jam pada 350 °C dalam tungku yang telah dipanaskan sebelumnya. Setelah didinginkan hingga 30 °C, residu hitam homogen yang diperoleh digiling menjadi bubuk halus dan direbus dua kali dalam air pada suhu 100 °C selama 1 jam per waktu. Kemudian, larutan dikumpulkan dengan menyaring terlebih dahulu suspensi melalui membran selulosa asetat 0,22 μm. Kotoran non-karbon dihilangkan dengan dialisis terhadap DW selama 72 h (berat molekul yang dipertahankan:1000 Da). Solusi PCCC-CD dipekatkan dan disimpan pada suhu 4 °C sampai digunakan. Diagram alir pada Gambar 1 mengilustrasikan proses di atas.
Ilustrasi proses pembentukan titik karbon (CD) dari Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) dengan perlakuan pirolisis
Karakterisasi CD-PCCC
Morfologi CD dipelajari menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM, elektron JEM-2100, JEOL, Jepang) dengan energi elektron 200 kV. Detail struktural diperiksa menggunakan TEM resolusi tinggi (HRTEM) menggunakan mikroskop elektron Tecnai G2 20 (FEI, USA). Spektrum ultraviolet-tampak (UV-Vis) dan sifat fluoresensi dicatat dan diukur masing-masing menggunakan spektroskopi UV-Vis (CECIL, Cambridge, UK) dan fluoresensi (F-4500, Tokyo, Jepang). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) digunakan untuk menganalisis informasi gugus fungsi permukaan pada jendela spektral antara 400 dan 4000 cm
− 1
.
Uji Sitotoksisitas
Hepatosit L02 manusia dan garis sel 293 T ginjal embrio manusia digunakan untuk menilai potensi sitotoksisitas PCCC-CD menggunakan uji CCK-8. Sel L02 dikultur dalam media Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) sedangkan sel 293 T ditumbuhkan dalam media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM) dengan glukosa tinggi, yang mengandung 10% FBS. Kedua garis sel diinkubasi pada suhu 37 °C dalam 5% CO2 .
Sel L02 dan 293 T diunggulkan dengan kepadatan 2,0 × 10
4
sel/sumur dalam pelat 96-sumur dan dikultur pada 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 selama 24 jam. Kemudian kedua jenis sel diperlakukan dengan 100 μL konsentrasi yang berbeda (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39, dan 19,5 μg/mL) larutan PCCC-CD dalam medium bebas serum dan diinkubasi selama 24 jam. H. Selanjutnya, media yang mengandung PCCC-CD dihilangkan dan sel-sel dicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS) dua kali. Sitotoksisitas ditentukan dengan membaca pelat pada 450 nm segera setelah menambahkan 10 L reagen CCK-8 dan diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 °C.
D. tajam AKI dan Pengobatan yang Diinduksi Racun
D. tajam Model AKI yang Diinduksi Racun
Model tikus AKI dibuat dengan menyuntikkan tikus secara intraperitoneal dengan D. tajam bisa ular. Tikus secara acak dibagi menjadi lima kelompok berikut 36 hewan masing-masing:kontrol; model; dan kelompok perlakuan PCCC-CD dosis tinggi, sedang, dan rendah. Grup model menerima D. tajam racun pada 1 mg/kg (0,15 mg/mL, 0,2 mL) berat badan dan 0,5 mL normal saline intraperitoneal, sedangkan kelompok perlakuan PCCC-CD dosis tinggi, sedang, dan rendah menerima volume racun ular dan PCCC yang setara Ekstrak -CD dengan dosis masing-masing 8.0, 4.0, dan 2.0 mg/kg. Tikus yang disuntik secara intraperitoneal dengan hanya normal saline (NS) sebagai kontrol. Enam mencit dari masing-masing kelompok dikorbankan 1, 3, dan 12 jam setelah pemberian NS, D. tajam racun, dan PCCC-CD pada jadwal yang dijelaskan di atas, sementara tikus yang dikorbankan pada hari 1, 2, dan 5 terus diberikan dengan NS, D. tajam racun ular, dan PCCC-CD dua kali sehari.
Analisis Konsentrasi UTP dan MALB
Setelah pemberian masing-masing perlakuan, hewan dalam kelompok kontrol, model, dan PCCC-CDs- (4,0 mg/kg) segera ditempatkan di kandang metabolik yang sesuai untuk pengumpulan urin sampai masa inkubasi berakhir (24 jam). Konsentrasi UTP dan MALB dianalisis menggunakan penganalisis biokimia otomatis.
Analisis Biomarker Fungsi Ginjal
Fungsi ginjal dinilai dengan mengukur kadar SCR dan BUN. Sebelum mencit di-eutanasia, sampel darah diambil dari pleksus retro-orbital dan kemudian ditempatkan ke dalam tabung plastik setidaknya selama 4 jam pada suhu 4 °C. Serum diperoleh dengan sentrifugasi pada 750×g selama 15 menit, dan tingkat BUN dan SCR dianalisis menggunakan penganalisis biokimia otomatis.
Deteksi Tingkat Sitokin Inflamasi
Ginjal kanan tikus dikeluarkan, dengan cepat dibekukan dalam es kering dan disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan dalam prosedur berikut. Sampel jaringan (100 mg) dari kelompok yang berbeda dihomogenisasi dengan PBS di atas es dan kemudian disentrifugasi pada 750×g selama 15 menit. Supernatan dikumpulkan untuk menentukan kadar MCP-1, IL-10, dan IL-1β menggunakan kit ELISA masing-masing sesuai dengan instruksi pabrik.
Histologi Ginjal
Sampel jaringan ginjal kiri tikus difiksasi dalam formalin buffer netral 10% pada suhu 4 °C selama lebih dari 48 jam, didehidrasi, dimasukkan ke dalam parafin, dipotong menjadi beberapa bagian, dan kemudian diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H&E). Perubahan morfologi dibandingkan antara kontrol, model, dan kelompok yang diobati dengan PCCC-CD.
Aktivitas Trombositopenia
PLT dilakukan pada darah yang diambil dari tikus dari pleksus retro-orbital dan dideteksi menggunakan penganalisis hematologi otomatis (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Jepang).
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Paket Statistik untuk Ilmu Sosial (SPSS, versi 13.0). Data terdistribusi normal dan varians homogen dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji perbedaan paling signifikan (LSD) digunakan untuk beberapa perbandingan. P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi CD-PCCC
TEM digunakan untuk mengamati langsung morfologi dan distribusi ukuran PCCC-CD (Gbr. 2a, c, dan d). CD yang disiapkan berbentuk bulat dan berukuran seragam, dengan sebagian besar pada 2,84 ± 0,89 nm tanpa agregasi yang berbeda. Gambar HRTEM menunjukkan pinggiran kisi (0,24 nm) dari CD, yang berhubungan dengan karbon grafit seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b.
a dan c Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari titik karbon Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD), b Gambar TEM resolusi tinggi dari CD-PCCC, d Distribusi ukuran CD-PCCC
Seperti yang digambarkan pada Gambar. 3a, CD menunjukkan fluoresensi biru yang jelas dengan puncak maksimum pada 445 nm setelah eksitasi 370 nm. Dengan demikian, informasi optik pada PCCC-CD yang ditampilkan dalam spektrum UV-Vis menunjukkan puncak serapan yang kuat pada 265 nm sesuai dengan transisi -π* dari molekul organik terkonjugasi pada permukaan CD (Gbr. 3b).
Sifat optik titik karbon Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD). a Spektrum fluoresensi, b spektrum ultraviolet-tampak (UV-Vis) dan c Spektrum inframerah transformasi Fourier (FTIR)
Selain itu, gugus fungsi dari CD yang diformulasikan diidentifikasi berdasarkan spektrum FTIR secara rinci, seperti yang digambarkan pada Gambar. 3c. Puncaknya pada 3433 cm
− 1
ditetapkan pada pita serapan getaran ulur O–H dan N–H sedangkan getaran regangan C–H muncul pada 2923 cm
− 1
dan 2853 cm
− 1
. Selain itu, puncak serapan pada 1624 cm
− 1
menunjukkan adanya C=O. Ikatan C–O–C diamati pada 1109 cm
− 1
, dan puncaknya pada 1400 cm
− 1
dikaitkan dengan peregangan C-N. Temuan ini konsisten dengan laporan sebelumnya.
Sitotoksisitas In Vitro
Untuk menilai sitotoksisitas, sel T L02 dan 293 diekspos ke berbagai konsentrasi PCCC-CD selama 24 jam dan viabilitas diperiksa menggunakan uji CCK-8. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 4a, viabilitas sel L02 yang diobati dengan PCCC-CD adalah> 85% dibandingkan dengan sel kontrol, bahkan pada konsentrasi setinggi 5 mg/mL. Demikian pula, PCCC-CD tidak mempengaruhi pertumbuhan sel 293 T pada konsentrasi hingga sekitar 2500 μg/mL (Gbr. 4b). Hasil ini menunjukkan bahwa PCCC-CD menunjukkan sitotoksisitas yang rendah.
Viabilitas sel dengan uji CCK-8 dari (a ) sel L02 dan (b ) 293 T sel diinkubasi dengan PCCC-CD selama 4 h
Pengaruh CD-PCCC pada Konsentrasi UTP dan MALB
Dibandingkan dengan tingkat UTP pada kelompok kontrol (0,98 ± 0,38 mg/L), tingkat UTP meningkat secara signifikan pada D. tajam racun beracun (3.08 ± 0.92 mg/L, P < 0.01) dan PCCC-CD (2.36 ± 0.83 mg/L, P < 0,05) kelompok (Gbr. 5a). Selanjutnya, tingkat UTP menurun setelah pengobatan PCCC-CD dibandingkan dengan tingkat setelah pemberian racun (P < 0,05). Selain itu, tingkat MALB jelas meningkat 24 jam setelah injeksi intraperitoneal D. tajam racun (17,78 ± 5,96 mg/L, P <-0,01) dibandingkan dengan kelompok kontrol (2,02 ± 0,91 mg/L). Sebaliknya, tikus yang diobati dengan PCCC-CD menunjukkan kecenderungan penurunan tingkat MALB (14,25 ± 4,16 mg/L, Gambar 5b).
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) pada total protein urin (UTP) dan mikroalbuminuria (MALB) dalam urin. a UTP dan b MALB. Tikus diobati dengan normal saline (NS), D.acutus racun (Dav, 1 mg/kg) dan PCCC-CD (4 mg/kg) + Dav (1 mg/kg). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari enam hewan dari setiap kelompok. *p < 0,05 dan ** p < 0,01 dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diobati dengan NS.
#p < 0,05 dibandingkan dengan grup Dav
PCCC-CD Meredakan Disfungsi Ginjal di D. tajam Tikus AKI yang Diinduksi Racun
Fungsi ginjal dinilai dengan mengukur tingkat BUN dan SCR, yang ditunjukkan pada Gambar. 6 dan 7. Tikus yang diobati dengan D. tajam racun memiliki tingkat BUN yang jauh lebih tinggi (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 hari], P < 0.01; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 hari], P < 0.01; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 hari], P < 0.01) dan SCR (12.83 ± 1.43 μmol/L [1 hari], P < 0.01; 13,48 ± 2,26 μmol/L [2 hari]; P < 0.01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 hari], P < 0,01) dibandingkan tikus yang diberi NS (BUN:8,95 ± 1,04 [1 hari], 9,53 ± 1,40 [2 hari], dan 9,07 ± 1,57 [5 hari] mmol/L; SCR:9,40 ± 0,89 [1 hari] , 10,27 ± 2,04 [2 hari], dan 9,85 ± 1,99 [5 hari] mol/L) dari hari 1 hingga 5 (Gbr. 6a dan 7a). Sebagai catatan, dibandingkan dengan kelompok model, pengobatan dengan PCCC-CD dosis rendah secara signifikan menghambat peningkatan kadar SCR (9,77 ± 0,79 μmol/mL, P < 0,01) dan BUN (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), sedangkan tinggi (9,62 ± 1,87 μmol/mL, P < 0,01) dan sedang (10,75 ± 1,48 μmol/mL, P <-0,05) dosis menghambat peningkatan SCR (Gbr. 7b) tetapi tidak BUN (Gbr. 6b) yang diinduksi oleh D. tajam racun pada hari 1. Tingkat SCR (Gbr. 7c) dari kelompok perlakuan PCCC-CD dosis tinggi, sedang, dan rendah menurun (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75, dan 10,68 ± 1,41 μmol/mL, masing-masing; P < 0,05) dibandingkan dengan kelompok model pada hari 2. Selanjutnya, dibandingkan dengan kelompok model, kadar BUN menurun secara signifikan pada tinggi- (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) dan dosis rendah (10,72 ± 2,04 mmol/L, P < 0,05) kelompok PCCC-CD tetapi bukan kelompok dosis sedang (Gbr. 6c) pada hari 2. Seperti yang ditunjukkan pada Gbr. 6d dan 7d, efek penghambatan diamati pada tingkat kedua indeks tinggi (12,28 ± 1,65 mmol/L, P < 0.01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), masing-masing) dan sedang (12,40 ± 1,33 mmol/L, P < 0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), masing-masing) dosis PCCC-CD. Selain itu, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kelompok kontrol dan kelompok yang diobati dengan PCCC-CD di SCR.
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - titik karbon (PCCC-CD) pada nitrogen urea darah (BUN). a Perubahan konsentrasi BUN pada 1 h, 3 h, 12 h, 1day, 2day dan 5day. Tingkat BUN di (b ) 1 hari (c ) 2 hari (h ) 5 hari. Tikus dirawat dengan normal saline (NS), D.acutus racun (Dav, 1 mg/kg) dan dosis tinggi (H), sedang (M) dan rendah (L) dari PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari enam hewan dari setiap kelompok. *p < 0,05 dan ** p < 0,01 dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diobati dengan NS.
#p < 0,05 dibandingkan dengan grup Dav
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) pada serum kreatinin (SCR). a Perubahan konsentrasi SCR pada 1 h, 3h, 12 h, 1day, 2days, dan 5days. Tingkat SCR di (b ) 1 hari (c ) 2 hari (h ) 5 hari. Tikus diobati dengan normal saline (NS), D.acutus racun (Dav, 1 mg/kg) dan dosis tinggi (H), sedang (M), dan rendah (L) dari PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari enam hewan dari setiap kelompok. *p < 0,05 dan ** p < 0,01 dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diberi saline normal (NS).
#p < 0,05 dibandingkan dengan grup Dav
PCCC-CD Menghambat Sekresi Sitokin
Efek dari tiga konsentrasi PCCC-CD pada produksi sitokin kemoatraktan (MCP-1) dan proinflamasi (IL-1β) dan anti-inflamasi (IL-10) sebagai respons terhadap injeksi D. tajam racun diselidiki. Gambar 8 menunjukkan bahwa injeksi racun meningkatkan IL-1β yang dilepaskan pada model tikus (1 h:58.19 ± 5.35 ng/mL, P < 0.01; 3 j:56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0.01; 12 h:49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05; hari 1:41.09 ± 4.82 ng/mL, P < 0,05; hari 2:47,96 ± 8,33 ng/mL, P < 0,05; hari 5:45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0,05) dibandingkan dengan kadar pada tikus yang diberi NS (1 h:35,96 ± 4,72 ng/mL, 3 h:34,94 ± 2,58 ng/mL, 12 h:36,42 ± 5,25 ng/mL, hari 1:34,47 ± 3,67 ng /mL, hari 2:39,84 ± 3,71 ng/mL, hari 5:36,82 ± 8,27 ng/mL). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8b-d, perbandingan dengan D. tajam kelompok yang diinduksi racun menunjukkan bahwa paparan 1-,3-, dan 12-jam terhadap tinggi- (50.09 ± 7.68 ng/mL, P < 0,05 [1 jam]; 40.36 ± 8.51 ng/mL, P < 0,01 [3 jam]; 39.87 ± 4.64 ng/mL, P < 0,05 [12 jam], masing-masing) dan rendah (46,64 ± 3,83 ng/mL, P < 0,01 [1 jam]; 37,65 ± 9,61 ng/mL, P < 0,01 [3 j]; 38.75 ± 6.64 ng/mL, P < 0,05 [12 jam], masing-masing) dosis PCCC-CD secara signifikan menurunkan kadar IL-1β. Selain itu, PCCC-CD dosis menengah secara signifikan mengurangi tingkat IL-1β (41,50 ± 11,08 ng/mL, P < 0.01) dibandingkan dengan tikus yang diberi racun pada 3 jam tetapi tidak pada titik waktu lain.
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) pada tingkat IL-1β di jaringan ginjal. a Perubahan level IL-1β pada 1 h, 3 h, 12 h, 1day, 2days, dan 5days. Tingkat IL-1β dalam (b ) 1 jam, (c ) 3 jam, (h ) 12 jam, (e ) 1 hari, (f ) 2 hari, dan (g ) 5 hari. Tikus diobati dengan normal saline (NS), D.acutus racun (Dav, 1 mg/kg) dan dosis tinggi (H), sedang (M), dan rendah (L) dari PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari enam hewan dari setiap kelompok. *p < 0,05 dan ** p < 0,01 dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diobati dengan normal saline (NS).
#p < 0,05 dibandingkan dengan grup Dav
Tingkat sitokin anti-inflamasi IL-10 meningkat secara dramatis di D. tajam kelompok yang diberi racun pada titik waktu yang berbeda (23.27 ± 0.72 ng/mL, P < 0.01; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05; 21,76 ± 1,99 ng/mL, P < 0,05; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0.01; 3 h, 12 h, hari 1, dan hari 2, masing-masing) dibandingkan dengan kelompok yang diobati dengan NS (Gbr. 9). Sebaliknya, pengobatan dengan PCCC-CD dosis tinggi dan sedang (17,17 ± 4,04 dan 17,25 ± 5,64 ng/mL, keduanya P < 0,05) menghambat sekresi IL-10 yang diinduksi racun pada 3 jam sementara PCCC-CD dosis rendah menghambat kadarnya pada 3 h, 12 h, dan hari 1 (17.17 ± 5.24, 17.83 ± 4.11, dan 18.31 ± 2.14 ng/ mL, masing-masing, semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kelompok yang diobati dengan PCCC-CD dan NS.
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) terhadap kadar IL-10 pada jaringan ginjal. a Perubahan level IL-10 pada 1 h, 3h, 12h, 1day, 2days, dan 5days. Tingkat IL-10 dalam (b ) 1 jam, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 hari, (f ) 2 hari dan (g ) 5 hari. Tikus diobati dengan normal saline (NS), D.acutus racun (Dav, 1 mg/kg) dan dosis tinggi (H), sedang (M), dan rendah (L) dari PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari enam hewan dari setiap kelompok. *p < 0,05 dan ** p < 0,01 dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diobati dengan normal saline (NS).
#p < 0,05 dibandingkan dengan grup Dav
Selain itu, Gambar 10 menunjukkan bahwa injeksi D. tajam racun secara signifikan meningkatkan pelepasan MCP-1 pada kelompok model (1 h:197.45 ± 22.34 ng/mL, P < 0.01; 3 j:182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0.01; 12 h:169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0.01; 24 h:142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0.05) dibandingkan dengan kontrol yang diberi perlakuan NS (1 h:115.82 ± 14.80 ng/mL; 3 h:106.46 ± 13.76 ng/mL; 12 h:120.35 ± 15.75 ng/mL; dan 24 h:108.81 ± 25.60 ng/ ml). Lebih luar biasa, pengobatan tikus berbisa dengan tiga dosis PCCC-CD menghambat peningkatan kadar MCP-1. Medium- (3 h:136.84 ± 39.94 ng/mL, P < 0.01; 12 h:127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0.01) dan rendah- (1 h:152.13 ± 18.89 ng/mL, P < 0,05; 3 h:129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0.01; 12 h:118,75 ± 19,96 ng/mL, P < 0.01) dosis PCCC-CD menghambat peningkatan kadar MCP-1 pada 1, 3, dan 12 h, kecuali untuk dosis sedang, pada 1 h (178.20 ± 22.79 ng/mL). Pengobatan dengan PCCC-CD dosis tinggi menurun secara efektif pada level MCP-1 hanya pada 3 h (131,42 ± 24,62 ng/mL, P < 0.01).
Pengaruh Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) pada tingkat MCP-1 di jaringan ginjal. a Level MCP-1 berubah dalam 1 h, 3 h, 12h, 1day, 2days, dan 5days. Level MCP-1 dalam (b ) 1 jam, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 hari, (f ) 2 hari, dan (g ) 5 hari. Tikus diobati dengan normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS).
#p < 0.05 compared with Dav group
In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.
Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia
PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10
9
; 3 h:[1120 ± 36] × 10
9
; 12 h:[1245 ± 111] × 10
9
; day 1:[1177 ± 69] × 10
9
; day 2:[1195 ± 51] × 10
9
; and day 5:[1181 ± 46] × 10
9
), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10
9
, P < 0.01; 3 h:[315 ± 77] × 10
9
, P < 0.01; 12 h:[435 ± 91] × 10
9
, P < 0.01; day 1:[663 ± 226] × 10
9
, P < 0.01; day 2:[941 ± 248] × 10
9
, P < 0,05; day 5:[1083 ± 89] × 10
9
). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10
9
, P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10
9
, P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10
9
, P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10
9
, P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10
9
, P < 0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.
Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. a PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS).
#p < 0.05 compared with Dav group
Histopathological Observations
The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.
Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days
Discussion
As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].
The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.
The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.
In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.
Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.
Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.
An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.
Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].
The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.
Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.
Conclusion
The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.
Ketersediaan Data dan Materi
All data generated or analysed during this study are included in this published article.
