Titik Karbon dari Kulit Phellodendri Chinensis Carbonisata Melindungi Ginjal dari Cedera Ginjal Akut Induksi Racun Ular Deinagkistrodon acutus

Abstrak

Latar Belakang

Sebagai nanomaterial yang muncul, titik karbon (CDs) telah menjadi sorotan besar untuk aplikasi biomedis. Namun, sedikit informasi yang tersedia tentang bioaktivitas mereka dalam mencegah cedera ginjal akut (AKI) yang diinduksi racun ular.

Metode

Studi ini melaporkan pengembangan proses pirolisis satu langkah hijau untuk sintesis CDs menggunakan Kulit Phellodendri Chinensis (PCC) sebagai precursornya tunggal, dan potensi aplikasi mereka sebagai pelindung terhadap AKI yang diinduksi racun ular Deinagkistrodon acutus (D. acutus) diselidiki untuk pertama kalinya. Model AKI didirikan dengan menyuntikkan racun D. acutus ke dalam rongga perut tikus dan potensi efek pelindung PCC Carbonisata-CDs (PCCC-CDs) terhadap abnormalitas ginjal termasuk disfungsi, reaksi inflamasi, kerusakan jaringan, dan trombositopenia pada enam titik waktu (1, 3, dan 12 jam, dan 1, 2, dan 5 hari) diselidiki.

Hasil

Hasil ini menunjukkan bahwa PCCC-CDs secara signifikan mencegah disfungsi ginjal (mengurangi konsentrasi kreatinin serum (SCR), nitrogen urea darah (BUN), protein total urin (UTP), dan mikroalbuminuria (MALB)) dan produksi kemioatrakan (protein kemioatrakan monosit 1 (MCP-1)), sitokin pro-inflamasi (interleukin (IL)-1β), dan sitokin anti-inflamasi (IL-10) sebagai respons terhadap suntikan intraperitoneal racun D. acutus. Efek bermanfaat PCCC-CDs pada tikus yang terracun mirip dengan pada perubahan histology ginjal dan trombositopenia.

Kesimpulan

Hasil ini menunjukkan efek pelindung yang luar biasa dari PCCC-CDs terhadap AKI yang diinduksi racun D. acutus, yang tidak hanya akan memperluas aplikasi biomedis CDs tetapi juga memberikan target potensi untuk pengembangan obat terapeutik baru untuk AKI yang diinduksi gigitan ular D. acutus.

Pendahuluan

Deinagkistrodon acutus (D. acutus), termasuk dalam keluarga Viperidae, dianggap sebagai salah satu ular darat paling berbahaya di China [1]. Veninasi oleh D. acutus terkait dengan serangkaian gejala seperti hemorrhage, trombositopenia, dan kemungkinan kerusakan langsung pada ginjal [2, 3]. Cedera ginjal akut (AKI) adalah efek sistemik paling serius dan komplikasi umum veninasi oleh D. acutus yang langsung mengarah pada disfungsi ginjal yang berkelanjutan dan morbitas tinggi [4, 5]. Perawatan topikal saat ini melibatkan penggunaan antivenin hiperimun dari kuda sebagai obat penawal. Namun, efektivitasnya terbatas dalam neutralizing kerusakan jaringan lokal, terutama dalam kejadian AKI, dan memiliki beberapa efek tidak memuaskan seperti reaksi anafilaktik dan pirogenik [6]. Selain itu, biaya yang relatif tinggi dan stabilitas buruk antivenin juga berkontribusi pada perawatan yang tidak memuaskan bagi orang yang digigit D. acutus, terutama di hutan atau daerah pedesaan [7,8,9]. Oleh karena itu, terdapat kebutuhan mendesak untuk obat komplementer yang efektif, aman, dan terjangkau untuk pengobatan AKI yang diinduksi racun D. acutus.

Titik karbon (CDs), kelas baru dari nanomaterial karbon dengan ukuran < 10 nm, ditemukan secara tidak sengaja oleh pemisahan dan pemurnian nanotubus karbon tunggal dinding pada 2004 [10] dan telah menarik minat besar selama satu dekade terakhir karena properti baru yang luar biasa seperti kompatibilitas biologis yang signifikan, toksisitas rendah, kelarutan air yang tinggi, dan bahan bana yang melimpah [11,12,13]. Kedatangan CDs telah berkontribusi pada penelitian pengembangan berbagai sistem “canggih” nanos terutama termasuk untuk bioimaging [14], biomedicine [15], pengiriman obat [16], dan fotokatalisis [17].

Pentingnya, pengembangan CDs dengan potensi bioaktivitas inherent menyediakan banyak strategi untuk penemuan generasi baru obat untuk kontrol atau pengobatan beberapa penyakit yang efektif karena keuntungan luar biasa yang disebutkan di atas. Dalam beberapa bioaktivitas seperti antibakteri untuk mengobati keratitis bakteri [18], hemostatik [19], seperti peroksidase [20], anticancer, antiviral, dan anti-inflamasi [21] telah dilaporkan. Efek ini telah menarik perhatian ilmuwan untuk mempelajari aplikasi farmasial dan biomedis tambahan dari CDs. Terutama, aktivitas meredakan dari CDs yang berasal dari Schizonepetae Spica Carbonisata [22] pada hemorrhage yang diinduksi racun D. acutus telah memberikan perspektif baru pada penelitian efek bermanfaat CDs pada AKI yang diinduksi gigitan ular D. acutus, yang masih kurang dipahami hingga saat ini.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CDs disintesis oleh pirolisis langsung PCC (sejenis obat tradisional China, yang telah digunakan selama > 1000 tahun) menggunakan perawatan pirolisis satu langkah. PCCC-CDs adalah CDs hypotoxic dengan diameter antara 1,2 hingga 4,8 nm. PCCC-CDs telah dilaporkan memiliki efek hemostatik yang luar biasa, yang tidak hanya memperluas aplikasi biomedis CDs tetapi juga membuka jalan untuk penguraian dasar materi hemostatik PCCC [23]. Perhatikan, PCCC, obat tradisional China yang dipersiapkan oleh pemrosesan arang, pertama kali dicatat dalam Taiping Holy Prescriptions for Universal Relief (978–992 M, di China). Profil keamanan dan efektivitas terapeutik yang memuaskan PCCC, seperti hemostasis dan anti-inflamasi, mendorong aplikasi klinisnya berlanjut selama lebih dari 1000 tahun, yang diakui dalam Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (PPRC, 2015). Namun, studi bioaktivitas tambahan dari PCCC-CDs telah menjadi tantangan. Terutama, terdapat sedikit informasi tentang inhibisi AKI yang diinduksi veninasi D. acutus.

Selain itu, veninasi gigitan ular telah dilaporkan mungkin membahayakan fisiologi ginjal secara langsung melalui komponen nefrotoksis atau dengan aktivasi atau modulasi mediator imun dan inflamasi [24]. Efek ini terutama pada parameter biomedis [25] (konsentrasi kreatinin serum (SCR), nitrogen urea darah (BUN), protein total urin (UTP), dan mikroalbuminuria (MALB)), sitokin inflamasi (interleukin (IL)-1β), sitokin anti-inflamasi (IL-10), dan protein kemioatrakan monosit 1 (MCP-1), perubahan histology ginjal, dan jumlah trombosit (PLT). Dalam studi saat ini, kami menyintesis PCCC-CDs menggunakan metode pirolisis satu langkah hijau dan, untuk pertama kalinya, menyelidiki efek pelindung mereka terhadap perkembangan abnormalitas ini dalam AKI yang diinduksi suntikan intraperitoneal tikus dengan racun D. acutus.

Bahan dan Metode

Bahan Kimia

Bahan PCC dibeli dari Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China), dan PCCC disiapkan dalam laboratorium kami. Selang dialisis dengan bobot molekul 1000 Da dibeli dari Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). Cell counting kit (CCK)-8 dibeli dari Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Jepang). Racun ular liofilisasi D. acutus disediakan oleh An Ren Snake Farm (Yujiang County, Yingtan, Jiangxi, China) untuk penggunaan eksperimental. Reagen kimia grade analitis lainnya diperoleh dari Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China). Kit enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tikus MCP-1, IL-10, dan IL-1β dibeli dari Cloud-Clone Crop. (Wuhan, China). Semua eksperimen dilakukan menggunakan air deionisasi (DW).

Hewan Laboratorium

Manajemen dan protokol penelitian hewan didukung dan disetujui oleh Komite Etika Percobaan Hewan Institusional Universitas Beijing untuk Obat Tradisional China. Tikus Kunming jantan (berat 30,0 ± 2,0 g) dibeli dari Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., dengan sertifikat kelayakan hewan laboratorium, dan ditempatkan dalam kandang pada suhu dan kelembaban konstan pada siklus terang/gelap 12 jam dengan akses liburan ke makanan dan air.

Persiapan Larutan Racun

Racun liofilisasi dilarutkan dalam saline normal dengan pengadukan ringan selama 20 menit (konsentrasi akhir: 5 mg/mL) dan disimpan pada −20 °C hingga diperlukan.

Persiapan PCCC-CDs

PCCC disiapkan menggunakan metode pirolisis satu langkah dengan PCC sebagai precursornya tunggal sesuai metode sebelumnya [23]. Singkatnya, sampel PCC ditempatkan dalam salib porcelana terpisah dan dipanaskan selama 1 jam pada 350 °C dalam tungku yang telah dipanaskan sebelumnya. Setelah pendingin ke 30 °C, sisa hitam homogen yang diperoleh digiling menjadi bubuk halus dan direbus dua kali dalam air masing-masing pada 100 °C selama 1 jam. kemudian, larutan dikumpulkan dengan menyaring suspensi melalui selulosa asetat membran 0,22 μm. Impuritas non-karbon dihapus dengan dialisis terhadap DW selama 72 jam (bobot molekul yang dipertahankan: 1000 Da). Larutan PCCC-CDs dikonsentrasi dan disimpan pada 4 °C hingga digunakan. Diagram alur dalam Gambar 1 mengilustrasikan proses di atas.

Karakterisasi PCCC-CDs

Morfologi CDs diteliti menggunakan transmisi mikroskop elektron (TEM, JEM-2100 electron, JEOL, Jepang) dengan energi elektron 200 kV. Detail struktural diperiksa menggunakan high-resolution TEM (HRTEM) menggunakan Tecnai G2 20 electron microscope (FEI, USA). Spektrum ultraviolet-visible (UV-Vis) dan properti fluoresensi dicatat dan diukur menggunakan UV-Vis (CECIL, Cambridge, Inggris) dan fluoresensi (F-4500, Tokyo, Jepang) spektroskopi, masing-masing. Spektroskopi transformasi Fourier inframerah (FTIR) digunakan untuk menganalisis informasi grup fungsi permukaan pada jendela spektral antara 400 dan 4000 cm⁻¹.

Uji Sitotoksisitas

Baris sel hepatosit manusia L02 dan baris sel ginjal embrio manusia 293 T digunakan untuk menilai potensi sitotoksisitas PCCC-CDs menggunakan uji CCK-8. Sel L02 dikultur dalam medium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) yang mengandung 10% serum bayi sapi (FBS) sementara sel 293 T tumbuh dalam Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) dengan glukosa tinggi, yang mengandung 10% FBS. Kedua baris sel diinkubasi pada 37 °C dalam atmosfer 5% CO₂ yang lembab.

Sel L02 dan 293 T ditanam dengan densitas 2,0 × 10⁴ sel/lubang dalam kultur 96-lubang dan dikultur pada 37 °C dalam atmosfer 5% CO₂ yang lembab selama 24 jam. Kemudian kedua jenis sel diobati dengan 100 μL berbagai konsentrasi (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39, dan 19,5 μg/mL) dari larutan PCCC-CD dalam medium bebas serum dan diinkubasi selama 24 jam lagi. Selanjutnya, medium yang mengandung PCCC-CDs dibuang dan sel dicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS) dua kali. Sitotoksisitas ditentukan dengan membaca plate pada 450 nm segera setelah menambahkan 10 μL reagennya CCK-8 dan diinkubasi selama 4 jam pada 37 °C.

Model AKI Induksi Racun D. acutus dan Perawatan

Model AKI Induksi Racun D. acutus

Model AKI tikus didirikan dengan menyuntikkan racun ular D. acutus intraperitoneally ke dalam tikus. Tikus dibagi secara acak menjadi lima grup masing-masing 36 hewan: kontrol; model; dan grup perawatan PCCC-CDs dosis tinggi, sedang, dan rendah. Grup model menerima racun D. acutus sebesar 1 mg/kg (0,15 mg/mL, 0,2 mL) berat badan dan 0,5 mL saline normal intraperitoneally, sementara grup perawatan PCCC-CDs dosis tinggi, sedang, dan rendah menerima volume yang setara dari racun ular dan ekstrak PCCC-CD dengan dosis 8,0, 4,0, dan 2,0 mg/kg, masing-masing. Tikus yang disuntik intraperitoneally hanya dengan saline normal (NS) sebagai kontrol. Enam tikus dari setiap grup disembelih 1, 3, dan 12 jam setelah administrasi NS, racun D. acutus, dan PCCC-CDs sesuai jadwal yang dijelaskan di atas, sementara tikus disembelih pada hari 1, 2, dan 5 terus diadminister NS, racun ular D. acutus, dan PCCC-CDS dua kali sehari.

Analisis Konsentrasi UTP dan MALB

Setelah administrasi perawatan masing-masing, hewan dalam grup kontrol, model, dan PCCC-CDs- (4,0 mg/kg) diobati segera ditempatkan dalam kandang metabolisme yang sesuai untuk pengumpulan urin hingga periode inkubasi berakhir (24 jam). Konsentrasi UTP dan MALB dianalisis menggunakan analyzer biokimia otomatis.

Analisis Penanda Fungsi Ginjal

Fungsi ginjal dievaluasi dengan mengukur tingkat SCR dan BUN. Sebelum tikus di-eutanasia, sampel darah diambil dari plexus retro-orbital dan kemudian ditempatkan dalam tabung plastik selama paling tidak 4 jam pada 4 °C. Serum diperoleh melalui sentrifugasi pada 750×g selama 15 menit, dan tingkat BUN dan SCR dianalisis menggunakan analyzer biokimia otomatis.

Deteksi Tingkat Sitokin Inflamasi

Ginjal kanan tikus diambil, cepat dikeku dalam dry ice dan disimpan pada −80 °C hingga digunakan dalam prosedur berikutnya. Sampel jaringan (100 mg) dari berbagai grup dihomogenkan dengan PBS pada es dan kemudian disentrifugasi pada 750×g selama 15 menit. Susupan dikumpulkan untuk menentukan tingkat MCP-1, IL-10, dan IL-1β menggunakan kit ELISA masing-masing sesuai petunjuk produsen.

Histology Ginjal

Sampel jaringan ginjal kiri tikus diperbaiki dalam formalin neutral-buffered 10% pada 4 °C selama lebih dari 48 jam, di-dehidrasi, diembed dalam paraffin, dipotong menjadi irisan, dan kemudian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Perubahan morfologi dibandingkan antara grup kontrol, model, dan PCCC-CDs yang diobati.

Aktivitas Trombositopenia

PLT dilakukan pada darah yang diambil dari tikus dari plexus retro-orbital dan terdeteksi menggunakan analyzer hematologi otomatis (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Jepang).

Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, versi 13.0). Data yang berdistribusi normal dan variansi homogen diekspresikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). One-way analysis of variance (ANOVA) diikuti oleh uji least significant difference (LSD) digunakan untuk perbandingan multiple. P < 0,05 dianggap secara statistik signifikan.

Hasil

Karakterisasi PCCC-CDs

TEM digunakan untuk mengamati secara langsung morfologi dan distribusi ukuran PCCC-CDs (Gambar 2a, c, dan d). CDs yang disiapkan bersifat bola dan seragam dalam ukuran, sebagian besar pada 2,84 ± 0,89 nm tanpa aglomerasi yang terlihat. Citra HRTEM menunjukkan fringe lattice (0,24 nm) dari CDs, yang sesuai dengan karbon grafit seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2b.

Seperti yang digambarkan dalam Gambar 3a, CDs menunjukkan fluoresensi biru yang jelas dengan puncak maksimum pada 445 nm setelah eksitasi 370 nm. Oleh karena itu, informasi optik PCCC-CDs yang ditampilkan dalam spektrum UV-Vis menunjukkan puncak serap yang kuat pada 265 nm yang sesuai dengan transisi π-π* molekul organik terkonjugasi pada permukaan CDs (Gambar 3b).

Selain itu, grup fungsi CDs yang diformulasikan diidentifikasi berdasarkan spektrum FTIR secara rinci, seperti yang digambarkan dalam Gambar 3c. Puncak pada 3433 cm⁻¹ ditugaskan pada pita serap gerangan O–H dan N–H sementara gerangan C–H muncul pada 2923 cm⁻¹ dan 2853 cm⁻¹. Selain itu, puncak serap pada 1624 cm⁻¹ menunjukkan kehadiran C=O. Ikatan C–O–C diamati pada 1109 cm⁻¹, dan puncak pada 1400 cm⁻¹ diatribusikan pada gerangan C–N. Temuan ini konsisten dengan laporan sebelumnya.

Sitotoksisitas In Vitro

Untuk menilai sitotoksisitas, sel L02 dan 293 T diekspos pada berbagai konsentrasi PCCC-CDs selama 24 jam dan keberadaan diperiksa menggunakan uji CCK-8. Seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 4a, keberadaan sel L02 yang diobati PCCC-CDs > 85% dibandingkan dengan sel kontrol, bahkan pada konsentrasi sebesar 5 mg/mL. Demikian pula, PCCC-CDs tidak mempengaruhi pertumbuhan sel 293 T pada konsentrasi hingga sekitar 2500 μg/mL (Gambar 4b). Hasil ini mengindikasikan bahwa PCCC-CDs menunjukkan sitotoksisitas rendah.

Efek PCCC-CDs pada Konsentrasi UTP dan MALB

Dibandingkan dengan tingkat UTP dalam grup kontrol (0,98 ± 0,38 mg/L), tingkat UTP secara signifikan meningkat dalam grup yang diobati racun D. acutus (3,08 ± 0,92 mg/L, P < 0,01) dan PCCC-CDs (2,36 ± 0,83 mg/L, P < 0,05) (Gambar 5a). Selanjutnya, tingkat UTP menurun setelah perawatan PCCC-CD dibandingkan dengan tingkat setelah administrasi racun (P < 0,05). Selain itu, tingkat MALB jelas meningkat 24 jam setelah suntikan intraperitoneal racun D. acutus (17,78 ± 5,96 mg/L, P < 0,01) dibandingkan dengan grup kontrol (2,02 ± 0,91 mg/L). Sebaliknya, tikus yang diobati PCCC-CD menunjukkan kecenderungan penurunan dalam tingkat MALB (14,25 ± 4,16 mg/L, Gambar 5b).

PCCC-CDs Meredakan Disfungsi Ginjal pada Tikus AKI Induksi Racun D. acutus

Fungsi ginjal dievaluasi dengan mengukur tingkat BUN dan SCR, yang ditampilkan dalam Gambar 6 dan 7. Tikus yang diobati racun D. acutus memiliki tingkat BUN (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 hari], P < 0,01; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 hari], P < 0,01; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 hari], P < 0,01) dan SCR (12,83 ± 1,43 μmol/L [1 hari], P < 0,01; 13,48 ± 2,26 μmol/L [2 hari]; P < 0,01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 hari], P < 0,01) yang jauh lebih tinggi dibandingkan tikus yang diobati NS (BUN: 8,95 ± 1,04 [1 hari], 9,53 ± 1,40 [2 hari], dan 9,07 ± 1,57 [5 hari] mmol/L; SCR: 9,40 ± 0,89 [1 hari], 10,27 ± 2,04 [2 hari], dan 9,85 ± 1,99 [5 hari] μmol/L) dari hari 1 hingga 5 (Gambar 6a dan 7a). Perhatikan, dibandingkan dengan grup model, perawatan dengan dosis rendah PCCC-CDs secara signifikan menghambat peningkatan tingkat SCR (9,77 ± 0,79 μmol/mL, P < 0,01) dan BUN (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), sementara dosis tinggi (9,62 ± 1,87 μmol/mL, P < 0,01) dan sedang (10,75 ± 1,48 μmol/mL, P < 0,05) menghambat peningkatan SCR (Gambar 7b) namun tidak BUN (Gambar 6b) yang diinduksi racun D. acutus pada hari 1. Tingkat SCR (Gambar 7c) dari grup PCCC-CD dosis tinggi, sedang, dan rendah berkurang (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75, dan 10,68 ± 1,41 μmol/mL, masing-masing; P < 0,05) dibandingkan dengan grup model pada hari 2. Selanjutnya, dibandingkan dengan grup model, tingkat BUN berkurang secara signifikan dalam grup PCCC-CDs dosis tinggi (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) dan dosis rendah (10,72 ± 2,04 mmol/L, P < 0,05) namun tidak dalam grup dosis sedang (Gambar 6c) pada hari 2. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 6d dan 7d, efek inhibisi diamati pada tingkat kedua indeks pada dosis tinggi (12,28 ± 1,65 mmol/L, P < 0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), masing-masing) dan sedang (12,40 ± 1,33 mmol/L, P < 0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), masing-masing) PCCC-CDs. Selain itu, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kontrol dan grup PCCC-CDs yang diobati dalam SCR.

PCCC-CDs Menghambat Sekreksi Sitokin

Efek tiga konsentrasi PCCC-CDs pada produksi kemioatrakan (MCP-1) dan sitokin pro-inflamasi (IL-1β) serta anti-inflamasi (IL-10) sebagai respons terhadap suntikan racun D. acutus diselidiki. Gambar 8 menunjukkan bahwa suntikan racun meningkatkan IL-1β yang dilepaskan dalam model tikus (1 jam: 58,19 ± 5,35 ng/mL, P < 0,01; 3 jam: 56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0,01; 12 jam: 49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05; hari 1: 41,09 ± 4,82 ng/mL, P < 0,05; hari 2: 47,96 ± 8,33 ng/mL, P < 0,05; hari 5: 45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0,05) dibandingkan dengan tingkat dalam tikus yang diobati NS (1 jam: 35,96 ± 4,72 ng/mL, 3 jam: 34,94 ± 2,58 ng/mL, 12 jam: 36,42 ± 5,25 ng/mL, hari 1: 34,47 ± 3,67 ng/mL, hari 2: 39,84 ± 3,71 ng/mL, hari 5: 36,82 ± 8,27 ng/mL). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 8b–d, perbandingan dengan grup yang diinduksi racun D. acutus menunjukkan bahwa paparan 1, 3, dan 12 jam dengan dosis tinggi (50,09 ± 7,68 ng/mL, P < 0,05 [1 jam]; 40,36 ± 8,51 ng/mL, P < 0,01 [3 jam]; 39,87 ± 4,64 ng/mL, P < 0,05 [12 jam], masing-masing) dan dosis rendah (46,64 ± 3,83 ng/mL, P < 0,01 [1 jam]; 37,65 ± 9,61 ng/mL, P < 0,01 [3 jam]; 38,75 ± 6,64 ng/mL, P < 0,05 [12 jam], masing-masing) PCCC-CDs secara signifikan menurunkan tingkat IL-1β. Selain itu, dosis sedang PCCC-CDs secara signifikan mengurangi tingkat IL-1β (41,50 ± 11,08 ng/mL, P < 0,01) dibandingkan dengan tikus yang diobati racun pada 3 jam namun tidak pada titik waktu lainnya.

Tingkat sitokin anti-inflamasi IL-10 secara dramatis meningkat dalam grup yang diobati racun D. acutus pada berbagai titik waktu (23,27 ± 0,72 ng/mL, P < 0,01; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05; 21,76 ± 1,99 ng/mL, P < 0,05; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0,01; 3 jam, 12 jam, hari 1, dan hari 2, masing-masing) dibandingkan dengan grup yang diobati NS (Gambar 9). Kontras tajam, perawatan dengan dosis tinggi dan sedang PCCC-CDs (17,17 ± 4,04 dan 17,25 ± 5,64 ng/mL, masing-masing, keduanya P < 0,05) menghambat sekresi IL-10 yang diinduksi racun pada 3 jam sementara dosis rendah PCCC-CDs menghambat tingkat pada 3 jam, 12 jam, dan hari 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11, dan 18,31 ± 2,14 ng/mL, masing-masing, semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara grup PCCC-CDs yang diobati dan grup NS.

Selain itu, Gambar 10 menunjukkan bahwa suntikan racun D. acutus secara signifikan meningkatkan peluncuran MCP-1 dalam grup model (1 jam: 197,45 ± 22,34 ng/mL, P < 0,01; 3 jam: 182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0,01; 12 jam: 169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0,01; 24 jam: 142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0,05) dibandingkan dengan kontrol yang diobati NS (1 jam: 115,82 ± 14,80 ng/mL; 3 jam: 106,46 ± 13,76 ng/mL; 12 jam: 120,35 ± 15,75 ng/mL; dan 24 jam: 108,81 ± 25,60 ng/mL). Lebih menakjubkan lagi, perawatan tikus yang terracun dengan tiga dosis PCCC-CD menghambat peningkatan tingkat MCP-1. Dosis sedang (3 jam: 136,84 ± 39,94 ng/mL, P < 0,01; 12 jam: 127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0,01) dan dosis rendah (1 jam: 152,13 ± 18,89 ng/mL, P < 0,05; 3 jam: 129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0,01; 12 jam: 118,75 ± 19,96 ng/mL, P < 0,01) PCCC-CDs menghambat peningkatan tingkat MCP-1 pada 1, 3, dan 12 jam, kecuali dosis sedang, pada 1 jam (178,20 ± 22,79 ng/mL). Perawatan dengan dosis tinggi PCCC-CDs secara efektif menurunkan tingkat MCP-1 hanya pada 3 jam (131,42 ± 24,62 ng/mL, P < 0,01).

Sebaliknya, tingkat IL-1β, IL-10, dan MCP-1 dalam grup PCCC-CDs yang diobati pada titik waktu tertentu tidak secara signifikan berbeda dari grup model, dan menunjukkan kecenderungan menurun.

Efek PCCC-CDs pada Inhibisi Trombositopenia

Trombosit memiliki peran spesifik dalam patogenesis AKI; oleh karena itu, jumlah trombosit diselidiki dan hasilnya ditampilkan dalam Gambar 11 [26]. Dibandingkan dengan nilai trombosit grup kontrol (1 jam: [1228 ± 51] × 10⁹; 3 jam: [1120 ± 36] × 10⁹; 12 jam: [1245 ± 111] × 10⁹; hari 1: [1177 ± 69] × 10⁹; hari 2: [1195 ± 51] × 10⁹; dan hari 5: [1181 ± 46] × 10⁹), penurunan drastis terjadi secepat 1 jam setelah administrasi racun D. acutus, dengan titik terendasnya terjadi pada 3 jam. Selanjutnya, trombosit secara bertahap meningkat hingga hari 5 (1 jam: [354 ± 70] × 10⁹, P < 0,01; 3 jam: [315 ± 77] × 10⁹, P < 0,01; 12 jam: [435 ± 91] × 10⁹, P < 0,01; hari 1: [663 ± 226] × 10⁹, P < 0,01; hari 2: [941 ± 248] × 10⁹, P < 0,05; hari 5: [1083 ± 89] × 10⁹). Perhatikan, bahkan pada interval waktu ini, nilai trombosit jauh lebih rendah dibandingkan tikus kontrol. Selain itu, administrasi PCCC-CDs dengan dosis 8 mg/kg secara signifikan menghambat trombositopenia yang diinduksi racun pada 1 jam ([435 ± 91] × 10⁹, P < 0,05), 3 jam ([599 ± 290] × 10⁹, P < 0,05), 12 jam ([929 ± 92] × 10⁹, P < 0,01), hari 1 ([1028 ± 248] × 10⁹, P < 0,01), dan hari 2 ([1183 ± 89] × 10⁹, P < 0,01). Efek inhibi ini juga diamati pada dosis 2 mg/kg PCCC-CDs pada 3 jam dan hari 2 serta 4 mg/kg PCCC-CDs pada hari 2, selain meningkatkan trombosit. Meskipun tidak ada perbedaan signifikan antara grup model dan dosis sedang, kecenderungan meningkat diamati pada titik waktu lain yang berbeda.

Pengamatan Histopatologis

Kerusakan ginjal dalam grup racun dievaluasi secara histologis. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 12a, dibandingkan dengan grup yang diobati NS, yang menunjukkan glomerulus dan selularitas tubulus normal, perubahan yang mencolok diamati dalam parenkim ginjal grup yang diobati racun D. acutus. Perubahan ini termasuk hemorrhage yang mencolok, dilatasi tubulus ginjal, dan degenerasi. Perawatan bersama dengan PCCC-CDs mencegah kerusakan ginjal yang diinduksi racun D. acutus, dan pemeriksaan histopatologis arsitektur jaringan ginjal hampir normal dengan hemostasis ringan, dilatasi tubulus ginjal, dan degenerasi.

Diskusi

Sebagai nanomaterial yang muncul, CDs mulai menempati posisi penting sebagai materi inovatif untuk nanosistem generasi mendatang. Dibandingkan dengan titik kuantum berbasis logam berat tradisional, CDs adalah kandidat yang baik untuk aplikasi biomedis karena karakteristik unik mereka yang memiliki potensi keuntungan yang besar dalam pengembangan obat baru dengan toksisitas yang relatif rendah [27, 28].

Partikel PCCC-CDs yang dihasilkan adalah semi-bola dan terdistribusi dengan baik dalam air, dengan banyak grup fungsi yang ada pada permukaan. Observasi ini konsisten dengan temuan yang telah dilaporkan sebelumnya [23]. Selain itu, CDs yang disiapkan menunjukkan sitotoksisitas rendah terhadap sel L02 dan 237 T, yang mengindikasikan kesesuaiannya untuk aplikasi biomedis.

Studi saat ini adalah pertama, sejauh pengetahuan kami, untuk mendemonstrasikan bioaktivitas yang luar biasa dari PCCC-CDs pada AKI yang diinduksi gigitan ular D. acutus. D. acutus secara luas disebut “five pacer” atau “hundred pacer” dalam obat tradisional Cina karena deskripsi folklor bahwa orang atau hewan yang digigit D. acutus tidak dapat berjalan lebih dari 100 langkah. Lebih dari 90% populasi D. acutus ditemukan di China, dan frekuensi kondisi kritis bahkan kematian terkait gigitan ular ini lebih tinggi dibandingkan banyak ular beracun lainnya [29]. AKI adalah efek sistemik paling serius dan komplikasi umum, yang mengarah pada ischemia ginjal sekunder dan gagal. Pengetahuan yang lebih baik tentang informasi yang relevan mengenai AKI yang diinduksi veninasi D. acutus akan berkontribusi pada pengembangan pendekatan terapeutik baru. Namun, dibandingkan dengan pengetahuan yang cukup tersedia tentang nefrotoksis racun ular secara umum [30, 31], informasi tentang AKI yang diinduksi racun D. acutus sangat jarang, yang mendorong kami untuk menyelidiki obat potensial ini yang masih dalam tahap awal pengembangan.

Dalam studi ini, kami mendirikan model AKI dengan menyuntikkan racun D. acutus intraperitoneally ke dalam tikus untuk menilai patogenesis kompleks dan multifactorial dari AKI yang diinduksi racun. Selanjutnya, model ini menyediakan alat untuk menyelidiki efek pelindung PCCC-CDs terhadap AKI yang diinduksi racun D. acutus.

Eksperimen saat ini telah menunjukkan perkembangan AKI yang substansial dengan perubahan yang berbeda dalam sitokin inflamasi dan indeks biokimia serum dan urin, serta bukti histopatologis dari kerusakan ginjal setelah suntikan intraperitoneal racun ular [31]. Temuan ini mengindikasikan faktor-faktor yang mungkin terutama berkontribusi pada toksisitas racun adalah [32] (1) sitotoksisitas langsung racun terhadap ginjal dan (2) reaksi inflamasi ginjal.

Secara spesifik, ketidakcukupan ginjal dikonfirmasi sekitar 24 jam setelah suntikan racun berdasarkan oliguria yang dikaitkan dengan proteinuria dan peningkatan biomarker serum (SCR dan BUN). Kami lebih lanjut memastikan keterlibatan ginjal dalam grup yang diobati racun D. acutus menggunakan analisis biokimia, yang menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam tingkat UTP dan MALB dibandingkan dengan grup kontrol. Temuan ini mengindikasikan keberadaan gangguan glomerulus dan reabsorpsi tubulus dalam grup yang diobati racun [33], yang didukung oleh bukti perubahan histopatologis. Sebaliknya, penurunan yang signifikan dalam tingkat UTP dan MALB diamati dalam grup yang diobati PCCC-CD dosis sedang. Selain itu, indikator biokimia serum (SCR dan BUN) adalah parameter vital lainnya yang digunakan untuk menentukan kenaikan disfungsi ginjal dalam AKI dan mereka tetap menjadi indikator klinis dalam diagnosisnya [34]. Suntikan racun ular dari hari 1 hingga 5 juga secara dramatis meningkatkan tingkat SCR dan BUN, sedangkan perawatan dengan PCCC-CDs membalikkan efek ini, resulting in pemulihan yang lebih cepat dibandingkan dengan grup kontrol. Yang lebih penting, perubahan yang jelas dalam jaringan ginjal, hemorrhage yang mencolok, dilatasi tubulus ginjal, dan degenerasi lebih lanjut mengindikasikan kerusakan langsung pada ginjal oleh racun. Efek meredakan PCCC-CDs pada perubahan histopatologis telah ditunjukkan dalam studi ini. Hasil ini menunjukkan bahwa PCCC-CDs menghambat manifestasi abnormal dari penanda biokimia urin dan serum yang terkait dengan disfungsi ginjal serta kerusakan histology ginjal. Selain itu, efek ini mungkin dapat diatribusikan pada perbaikan nefrotoksis langsung racun D. acutus oleh PCCC-CDs [35]. Efek pelindung PCCC-CDs dibuktikan oleh inhibisi kerusakan ginjal langsung yang diinduksi racun D. acutus.

Respons inflamasi yang intens adalah fitur umum yang diinduksi oleh veninasi hewan beracun seperti ular dan ulat [35,36,37]. Tanda inflamasi sistemik dengan infiltrasi sel mononuklear, leukositosis neutrofilik, degenerasi sel epitel tubulus, dan nekrosis juga telah ditunjukkan dalam gangguan ginjal yang diinduksi suntikan racun ular. MCP-1 adalah protein molekula kecil yang memerankan peran vital dalam merekrut dan mengaktifkan leukosit selama respons inflamasi [38]. Selain itu, fagosit mononuklear dan limfosit dapat berkontribusi pada cedera sel ginjal akut melalui mekanisme berbeda seperti sekresi mediator pro-inflamasi, yang kemudian dapat menginduksi sel ginjal residen untuk mengekspresi kemiokin [39]. Keterlibatan MCP-1, sitokin inflamasi (IL-1β) dan sitokin anti-inflamasi (IL-10) dalam respons inflamasi dalam patogenesis AKI pada tikus yang disuntik hanya dengan racun D. acutus telah ditunjukkan dalam studi saat ini. Observasi ini mengindikasikan bahwa mekanisme yang mendasari AKI yang diinduksi racun D. acutus mungkin terkait dengan respons inflamasi ginjal. Bukti bahwa paparan PCCC-CDs secara signifikan menurunkan tingkat IL-1β, IL-10, dan MCP-1 mengindikasikan bahwa CDs mungkin menunjukkan perlindungan ginjal dengan menekan reaksi inflamasi ginjal.

Selanjutnya, trombosit memerankan peran penting dalam proses hemostatik dan inflamasi akut dan terkait dengan berbagai patologi inflamasi [40, 41]. Mereka sangat sensitif dan merespons dengan cepat terhadap perubahan biologis ketika organisme terluka atau berdarah, sebagai sel pertama yang tiba di lokasi cedera akut untuk berinteraksi dengan sel endotel dan leukosit [42]. Trombosit terlibat dalam patogenesis AKI [43], dan dianggap sebagai penanda prognosis yang secara signifikan terkait dengan hasil yang lebih buruk dari AKI [44]. Studi ini memberikan bukti bahwa racun D. acutus secara mencolok menurunkan jumlah trombosit, yang konsisten dengan hasil studi yang melaporkan bahwa trombositopenia dapat diinduksi oleh racun ular [34, 45]. Kami amati bahwa paparan PCCC-CDs secara signifikan meningkatkan jumlah trombosit, yang konsisten dengan temuan studi sebelumnya [23].

Abnormalitas AKI yang diinduksi racun D. acutus, sejauh pengetahuan kami, ditunjukkan untuk pertama kalinya dalam studi saat ini dan terutama mencakup disfungsi ginjal yang terkait dengan proteinuria, oliguria, tingkat BUN dan SCR yang meningkat, kerusakan ginjal patologis, respons inflamasi, dan trombositopenia.

Secara menakjubkan, PCCC-CDs telah menunjukkan aktivitas pelindung terhadap AKI yang diinduksi racun D. acutus dengan menekan gangguan terkait, seperti yang dibuktikan dalam studi ini untuk pertama kalinya. Studi ini adalah evaluasi awal dari efek bermanfaat PCCC-CDs pada AKI yang diinduksi racun D. acutus, dan penyelidikan lebih lanjut mengenai mekanisme yang mendasarinya akan menjadi fokus studi masa depan.

Kesimpulan

Efek pelindung yang luar biasa dari PCCC-CDs terhadap AKI yang diinduksi racun D. acutus telah ditunjukkan dalam studi ini, untuk pertama kalinya, sejauh pengetahuan kami. Efek terkait AKI terutama manifests sebagai disfungsi ginjal, kerusakan ginjal patologis, respons inflamasi, dan trombositopenia. Hasil ini mengindikasikan bahwa PCCC-CDs memiliki potensi aplikasi sebagai obat komplementer untuk pengobatan abnormalitas yang diinduksi AKI oleh racun D. acutus. Selanjutnya, ini memberikan strategi baru untuk studi bahan aktif formulasi obat tradisional China, dan lebih memperluas aplikasi biomedis CDs.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini termasuk dalam artikel yang dipublikasikan ini.

Singkatan

AKI:

Acute kidney injury

BUN:

Blood urea nitrogen

CDs:

Carbon dots

D. acutus:

Deinagkistrodon acutus

HE:

Haematoxylin and eosin

IL:

Interleukin

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Monocyte chemotactic protein 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots

PLT:

Platelet counts

SCR:

Serum creatinine

UTP:

Urinary total protein