Nanoneedles Bebas Pelarut, Fungsionalisasi Folat untuk Pengiriman Terpadu 10-Hidroksikamptotesin
Abstrak
Formulasi nanopartikel tradisional untuk obat anti-kanker hidrofobik sering mengandalkan pelarut organik, yang menimbulkan kekhawatiran mengenai toksisitas residu. Kami menyajikan sintesis sepenuhnya hijau dari nanoneedles 10-hidroksikamptotesin (HCPT) yang dimodifikasi folat (HFNDs) yang menghilangkan pelarut organik sambil mencapai muatan obat tinggi (70,2 %) dan kemampuan target yang kuat. In vitro, HFNDs menunjukkan penyerapan seluler yang superior pada sel HeLa dibandingkan nanoneedles chitosan-HCPT yang tidak ditargetkan, dan uji MTT mengungkapkan sitotoksisitas yang ditingkatkan pada dosis HCPT yang setara. Citra dalam tubuh mengonfirmasi akumulasi tumor yang lebih diutamakan oleh HFNDs, dan studi terapi pada xenograft HeLa menunjukkan penekanan tumor yang signifikan dengan toksisitas sistemik minimal. Pendekatan bebas pelarut ini menawarkan platform yang menjanjikan untuk pengiriman terapi kimia dan citra yang aman serta efisien.
Latar Belakang
Selama dua dekade terakhir, penelitian telah difokuskan untuk mengatasi keterbatasan farmakokinetik kemoterapi konvensional melalui sistem pengiriman berbasis nanopartikel yang menyediakan sirkulasi yang lama, target aktif, dan kemampuan citra multimodal [1, 2]. Kemajuan terbaru menyoroti pentingnya bentuk partikel, dengan struktur nano rasio aspek tinggi yang menunjukkan penyerapan seluler yang ditingkatkan dan penetrasi tumor [10, 26]. Namun, sebagian besar strategi ini masih bergantung pada pelarut organik untuk melarutkan obat hidrofobik, yang menyebabkan kekhawatiran residu pelarut yang dapat terakumulasi dalam tubuh dan menimbulkan risiko keamanan [27]. Studi kami mengatasi kesenjangan ini dengan mengembangkan nanoneedles yang dimodifikasi folat dan termuat HCPT melalui metode sepenuhnya hijau dan bebas pelarut, sehingga menggabungkan muatan obat tinggi, pengiriman yang ditargetkan, dan potensi citra.
Metode
Bahan-bahan
Semua reagen adalah kelas analitik dan digunakan sebagaimana adanya. Air deion digunakan selama proses. FA diperoleh dari Bio Basic Inc.; HCPT (> 99 % kemurnian) dari Lishizhen Pharmaceutical Co.; chitosan (Mw = 70 kDa, 90 % deasetilasi) dari Zhejiang Aoxing; NHS dan EDC dari Sigma-Aldrich.
Sintesis Konjugat FA-Chitosan
FA (10 mg), chitosan (20 mg), EDC (4 mg), dan NHS (4 mg) diaduk dalam 2 mL PBS (pH 5.5) pada suhu ruang selama 12 jam. Larutan didialisis terhadap buffer pH 10 untuk menghilangkan FA berlebih, lalu difugasi (5 000 rpm) dan dioksidasi beku selama 24 jam untuk menghasilkan bubuk CS-FA.
Persiapan HFNDs
HCPT (10 µg) dilarutkan dalam 200 µL NaOH 0,1 M (larutan A); CS-FA (10 µg) dalam 200 µL HCl 0,1 M (larutan B). Larutan A dan B ditetapkan secara titik-titik ke dalam 1 mL air murni di bawah pengadukan kuat selama 30 detik, lalu di-sonikasi (200 W, mandi es) selama 6 menit. Suspensi yang dihasilkan difugasi (10 000 rpm, 5 menit) dan dioksidasi beku selama 24 jam. Untuk perbandingan, chitosan tunggal menggantikan CS-FA dalam larutan B untuk menghasilkan nanoneedles yang tidak ditargetkan (NDs).
Karakterisasi
SEM (UV-70, 15 kV) digunakan untuk memvisualisasikan morfologi. Ukuran partikel dan potensial zeta diukur dengan Malvern Zetasizer Nano-ZS. XRD (X’pert PRO) menilai kristalinitas. Konten FA diukur secara kuantitatif dengan UV pada 281 nm; pemuatan HCPT dengan fluoresens pada 383 nm. Efisiensi pemuatan dan penangkapan dihitung menggunakan persamaan (1)–(4) di bawah ini.
Pemuatan obat % = (berat HCPT dalam HFNDs / berat HFNDs) × 100 % (1)
Efisiensi penangkapan % = (berat obat dalam HFNDs / berat obat yang diumpankan) × 100 % (2)
FA % dalam konjugasi = (berat FA dalam konjugasi / berat konjugasi) × 100 % (3)
Pemuatan FA % = (1 - pemuatan HCPT %) × FA % dalam konjugasi × 100 % (4)
Studi Pelepasan Obat In Vitro
HFNDs didisperapkan dalam 10 mL PBS dan ditempatkan dalam kantong dialisis 3 kDa MWCO, lalu direndam dalam 200 mL PBS (pH 7.4) pada 37 °C, 100 rpm. Sampel dikumpulkan selama 48 jam dan dianalisis dengan spektroskopi fluoresens.
Citra Konfokal Sel
Sel HeLa ditanam dan diinkubasi 24 jam sebelum terpapar HFNDs selama 8 jam. Citra dilakukan pada mikroskop konfokal Leica (pengikiran HCPT 382 nm, emisi 500–550 nm).
Penyerapan Seluler diukur oleh Fluoresens
Setelah 6 jam inkubasi dengan NDs atau HFNDs (dosis HCPT yang setara), sel dicuci, dicerna dengan tripsin/EDTA, dan di-sonikasi. Konten HCPT diukur secara kuantitatif dengan fluoresens pada 382 nm.
Uji Sitotoksisitas
Uji MTT dilakukan pada sel HeLa yang ditanam dalam plate 96-lubang. Setelah 24 jam paparan obat, 20 µL MTT 5 mg/mL ditambahkan selama 4 jam, diikuti dengan 150 µL DMSO. Absorbansi dibaca pada 570 nm.
Biodistribusi
NDs dan HFNDs yang dimuat DiR disuntikkan IV ke tikus telanjang yang membawa tumor HeLa. Citra fluoresens dilakukan dengan sistem Maestro pada 1, 4, 8, 12, dan 24 jam. Citra ekskor pada tumor dan organ utama dilakukan pada 24 jam.
Penekanan Tumor In Vivo
Ketika volume tumor mencapai sekitar 60 mm³, tikus menerima suntikan IV garam fisiologis, HCPT bebas, NDs, atau HFNDs (80 µg HCPT per tikus) setiap 3 hari. Volume tumor (0,5 × L × W²) dan berat badan dipantau selama 21 hari. Setelah kematian, tumor ditimbang dan diwarnai H&E untuk histologi.
Analisis Statistik
Data dianalisis dengan uji t Student dua arah; *p* < 0,05 menunjukkan signifikansi (kepercayaan 95 %).
Hasil dan Pembahasan
Sintesis Konjugat FA-Chitosan
FA kovalent terhubung ke chitosan melalui amidasi yang diarahkan EDC/NHS (Gambar 1). Spektra FT-IR (Gambar 2) menunjukkan gerakan C=O yang kuat pada 1605 cm⁻¹, yang mengonfirmasi pembentukan ikat amid. Kuantifikasi UV menghasilkan pemuatan FA sebesar 23,4 ± 2,5 % dalam konjugat.
Persiapan HFNDs
Ketidakterlarutan air HCPT dan keasupan asam chitosan dieksploitasi: HCPT dilarutkan dalam NaOH dan CS-FA dalam HCl. Netralisasi kedua larutan menghasilkan pelarut buruk untuk kedua spesies, yang memicu penurunan HCPT dan pelingkungan CS-FA yang bersamaan ke dalam nanoneedles (Gambar 3a). Ultrasa dan stabilisasi sterik CS-FA mencegah pertumbuhan kristal massa, menghasilkan nanoneedles rasio aspek tinggi (Gambar 3b-c). Pengujian desain eksperimen (Tabel 1) mengoptimalkan rasio HCPT:CS-FA, daya ultrasonik, pH, dan konsentrasi untuk mencapai morfologi yang diinginkan.
Analisis SEM (Gambar 4) menunjukkan bahwa CS-FA berlebih melapisi permukaan partikel, sementara CS-FA yang tidak cukup menyebabkan aglomerasi. pH netral sangat penting untuk mempertahankan integritas nanoneedles, dan daya ultrasonik mempengaruhi aglomerasi dan fragmentasi. Konsentrasi campuran yang lebih tinggi mengurangi ukuran partikel, sebagaimana dikonfirmasi oleh DLS (Gambar 4f). HFNDs yang dioptimalkan menampilkan panjang rata-rata sekitar 800 nm, lebar sekitar 80 nm, diameter hidrodinamik 104,3 ± 5,7 nm, dan potensial zeta +16,3 ± 1,9 mV. Dispersi 2 wt % tetap stabil selama ≥ 2,5 hari.
Pemuatan obat adalah 70,2 ± 3,1 % dan efisiensi penangkapan 83,1 %. FA menyumbang 7,0 % dari massa total, dihitung dari persentase FA konjugat.
Analisis XRD
Pola XRD (Gambar 5) mengonfirmasi bahwa HCPT tetap kristal dalam HFNDs, sementara chitosan semi-kristal memberikan puncak lebar. Sebaliknya, kristal HCPT massa (Gambar 6) berbentuk batang dan lebih dari 10 µm panjang, yang menekankan peran CS-FA dalam memodulasi laju pertumbuhan HCPT.
Studi Pelepasan Obat In Vitro
HCPT bebas melepaskan 30 % dalam 1 jam dan hampir 100 % pada 18 jam. HFNDs menunjukkan pelepasan yang jauh lebih lambat dan berkelanjutan selama 48 jam (Gambar 7), yang disebabkan oleh halangan difusi kulit CS-FA. Profil ini ideal untuk mempertahankan konsentrasi terapeutik sambil meminimalkan toksisitas terkait puncak.
Penyerapan Seluler
Citra konfokal (Gambar 8) mengungkapkan fluoresens HCPT yang lebih kuat pada sel HeLa yang treated dengan HFNDs dibandingkan NDs yang tidak ditargetkan, yang menunjukkan penyerapan yang dimediasi folat. Fluoresens kuantitatif (Gambar 9) memperkuat laju internalisasi yang lebih tinggi untuk HFNDs, memvalidasi strategi target.
Uji Sitotoksisitas
Hasil MTT (Gambar 10) menunjukkan bahwa HFNDs mencapai pembunuhan sel yang lebih besar dari HCPT bebas atau NDs pada konsentrasi HCPT yang setara, yang menekankan manfaat ganda dari pengiriman yang ditargetkan dan pelepasan berkelanjutan. Sitotoksisitas yang ditingkatkan disebabkan oleh internalisasi yang efisien melalui reseptor dan profil pelepasan obat seluler yang panjang.
Biodistribusi
Citra in vivo (Gambar 11a) menunjukkan sinyal tumor yang kanibal untuk DiR-NDs, sementara DiR-HFNDs menunjukkan akumulasi yang signifikan dan bergantung pada waktu, mencapai puncak pada 12 jam. Analisis ekskor (Gambar 11b-c) mengonfirmasi fluoresens tumor yang lebih tinggi untuk HFNDs, yang menunjukkan targetisasi tumor yang berhasil melalui folat.
Penekanan Tumor In Vivo
HFNDs mencapai penekanan pertumbuhan tumor yang paling signifikan, dengan berat tumor akhir yang jauh lebih rendah dari HCPT bebas atau NDs (Gambar 12c). Histologi (Gambar 12d) mengungkapkan nekrosis yang luas pada tumor yang treated dengan HFND. Pentingnya, HFNDs tidak menyebabkan penurunan berat badan atau toksisitas nyata, yang berbeda dengan efek samping yang ditunjukkan oleh HCPT bebas (Gambar 12b). Temuan ini menunjukkan bahwa HFNDs menggabungkan aktivitas anti-tumor yang kuat dengan profil keamanan yang menguntungkan.
Kesimpulan
Kami memperkenalkan rute sepenuhnya hijau dan bebas pelarut untuk menghasilkan nanoneedles HCPT yang fungsionalisasi folat yang menggabungkan muatan obat tinggi, penyerapan seluler yang ditargetkan, dan pelepasan berkelanjutan. Data in vitro dan in vivo mengonfirmasi aktivitas anti-kanker yang superior dan toksisitas sistemik yang lebih rendah dibandingkan formulasi konvensional. Platform ini merupakan contoh bagaimana kimia yang bertanggung jawab terhadap lingkungan dapat dimanfaatkan untuk memajukan terapeutik berbasis nanopartikel.
