Persiapan Titik Karbon Neon Hijau Hemat Biaya untuk Bioimaging dan Pengiriman Obat Intraseluler yang Ditingkatkan
Abstrak
Doxorubicin terperangkap titik karbon (DOX-CDs) disiapkan untuk bioimaging dan peningkatan pengiriman obat intraseluler. CD disintesis melalui metode hidrotermal menggunakan sitrat dan urea di bawah 200 °C selama 1 jam. Kemudian, DOX berhasil terkonjugasi pada CD melalui interaksi fisikokimia. CD DOX menunjukkan struktur kristal yang baik, stabilitas air yang luar biasa, properti fotoluminesensi yang sangat baik, dan hasil kuantum yang tinggi sebesar 93%. Gambar fluoresen mengungkapkan bahwa DOX-CD dapat dengan mudah diambil oleh sel kanker untuk pelabelan sel. Lebih lanjut, perilaku pelepasan DOX yang dibantu pH endo-lisosom diamati dari DOX-CD, dan sitotoksisitas DOX-CD dikonfirmasi oleh uji MTS terhadap sel kanker ovarium H0-8910. Selain itu, CD menunjukkan sinyal fluoresen terang dalam uji pencitraan hewan dan menunjukkan toksisitas rendah setelah pemberian selama 7 dan 21 hari. Oleh karena itu, CD yang disiapkan dapat menjadi pemeriksaan pencitraan yang menjanjikan untuk pencitraan biomedis dan pengiriman obat intraseluler.
Pengantar
Doxorubicin (DOX) adalah obat kemoterapi antrasiklin yang banyak digunakan dalam pengobatan beberapa jenis kanker termasuk kanker payudara, paru-paru, lambung, ovarium, tiroid, multiple myeloma, sarkoma, dan kanker anak. Mekanisme kerja antikanker DOX dianggap mengganggu proses sintesis dan perbaikan DNA. Oleh karena itu, DOX perlu diangkut melintasi membran sel dan ke inti sel untuk mengganggu sintesis DNA selama pengobatan kanker. Namun, DOX bebas tidak dapat dengan mudah mendekati inti sel dan akan menyebabkan kardiotoksisitas in vivo yang parah, yang menghambat penerapannya sebagai terapi kanker [1, 2].
Baru-baru ini, nanocarrier multifungsi seperti liposom, misel, nanoemulsions, nanopartikel polimer, dan nanopartikel lainnya telah menarik perhatian yang luar biasa untuk signifikansi mereka pada pengiriman obat antikanker [3]. Di antara mereka, sebagai jenis baru dari keluarga titik kuantum, titik kuantum karbon (CD) telah menarik minat yang sangat besar di seluruh dunia sejak ditemukan pada tahun 2004 [4]. Secara khusus, CD fluoresen telah menjadi preferensi dalam pencitraan sel
2
, fotokatalisis, penghantaran obat, deteksi polutan dan ion logam berat, dan peralatan fotolistrik karena sifat unggulnya dalam berat dan ukuran kuasi-nol (<10 nm), stabilitas foto tinggi, spektrum eksitasi luas dan kontinu, panjang gelombang yang dapat disetel, biokompatibilitas yang memuaskan , toksisitas rendah, dan kinerja yang sangat baik pada fluoresensi [5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]. Misalnya, Yang dkk. telah berhasil menggabungkan DOX ke CD untuk pengobatan antikanker yang lebih baik, menyiratkan bahwa CD memiliki signifikansi besar pada pengiriman obat yang ditargetkan ke inti [1].
Sebelumnya, berbagai teknik telah diusulkan untuk menyiapkan CD termasuk berbagai bahan biomassa, karbonisasi, pasivasi, dan fungsionalisasi permukaan [14, 15]. Secara rinci, dapat diklasifikasikan sebagai dua metode utama. Salah satunya adalah pendekatan "top-down", pelepasan busur, metode ablasi laser, etsa elektrokimia, dan metode oksidasi, yang mengacu pada pemecahan skala besar struktur karbon menjadi nanopartikel karbon [16,17,18,19,20]. Metode lainnya adalah metode "bottom-up", yang mensintesis titik karbon dari prekursor molekuler, terutama termasuk pendekatan hidrotermal, metode ultrasonik, dan sintesis berbantuan gelombang [21,22,23,24]. Xu dkk. diperoleh titik karbon melalui pelepasan busur, oksidasi, ekstraksi, dan elektroforesis gel. Ming dkk. memperoleh titik karbon dengan elektrolisis. Yang dkk. mengoptimalkan metode hidrotermal asli untuk mensintesis titik karbon dengan fluoresensi yang berbeda [21]. Namun, metode ini terbatas karena proses sintesisnya yang rumit, prosedur yang memakan waktu, persyaratan fabrikasi yang ketat, dan bahan baku yang mahal [25]. Selain itu, penggunaan pelarut organik sebagai passivator untuk reaksi dapat meningkatkan toksisitas CD [26]. Selain itu, sebagian besar CD yang dilaporkan memancarkan fluoresensi biru di bawah eksitasi sinar UV yang secara serius menghambat potensi mereka di bidang pencitraan biomedis yang dikaitkan dengan gangguan autofluoresensi jaringan yang kuat.
Di sini, kami mensintesis CD fluoresen hijau melalui pirolisis termal terkontrol satu langkah yang hijau dan efisien dari natrium sitrat dihidrat dan urea. DOX terkonjugasi secara non-kovalen pada permukaan CD yang disiapkan untuk pengiriman obat melalui interaksi hidrofobik dan interaksi elektrostatik, serta π -π interaksi susun [27,28,29]. Morfologi dan struktur CD diselidiki dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) dan analisis difraksi sinar-X. Sifat optik dinilai dengan spektrometer UV-vis dan spektrum emisi photoluminescence (PL). Pelepasan obat berkelanjutan dilakukan dengan metode dialisis. Serapan seluler dan distribusi DOX-CD intraseluler diselidiki dengan mikroskop fluoresen. Efek antikanker DOX-CD dinilai dengan uji MTS standar. Pencitraan CD in vivo dilakukan pada tikus telanjang Balb/c. Akhirnya, toksisitas jangka panjang CD diselidiki dengan analisis histologis. Oleh karena itu, CD yang disiapkan akan menjadi agen potensial untuk pencitraan in vivo dan pengiriman obat yang ditargetkan.
Bahan dan Metode
Materi
Sodium sitrat dihidrat, urea, l-arginin, etilendiamin aseton, kina sulfat, fosfat-buffered saline (PBS), asam asetat, dinatrium hidrogen fosfat, dan paraformaldehida diperoleh dari Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai, Cina). MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit (MTS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/glukosa tinggi), larutan penisilin-streptomisin, dan larutan tripsin-EDTA dibeli dari Beyotime Biotechnology Co. Ltd (Shanghai, Cina). Fetal bovine serum (FBS) diperoleh dari Tianhang Biotechnology Co. Ltd (Hangzhou, China). Sel kanker ovarium HO-8910 dan sel endotel vena umbilikalis manusia EA.hy926 diperoleh dari Shanghai Institute of Nutrition and Health, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). Doksorubisin hidroklorida (DOX) dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina). Kantong dialisis (MWCO =1000 Da) dibeli dari SpectrumLabs (Los Angeles, CA, USA).
Sintesis CD dan DOX-CD
Secara singkat, natrium sitrat dehidrasi (0,2 mmoL) dan urea (5 mmoL) pertama-tama dilarutkan dalam 1 mL DI air. Kemudian, campuran dipindahkan ke dalam bejana kaca dan dikarbonisasi pada suhu 200 °C selama 1 jam. Setelah itu, 1 mL DI air dan aseton (v/v, 1/3) ditambahkan dan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit selama tiga kali.
DOX terkonjugasi pada CD dengan interaksi nonkovalen. Secara singkat, DOX·HCl (0,5 mg) ditambahkan ke 5 mL CD (5 mg/mL) dan kemudian diaduk selama 48 h dalam gelap. Solusi yang dihasilkan didialisis terhadap air DI dalam tas dialisis (MWCO =1000 Da) selama 24 h untuk mendapatkan DOX-CD. Terakhir, CD-DOX dibekukan-kering dan disimpan pada suhu 4 °C.
Karakterisasi CD dan DOX-CD
Morfologi ukuran CD dicirikan dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, FEI Tecnai G2 Spirit). Pengukuran emisi PL dilakukan pada spektrofotometer fluoresensi LS55 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Hasil kuantum (QY ) CD ditentukan dengan menggunakan larutan kina sulfat dalam H2 JADI4 sebagai referensi. Struktur kristal diamati oleh Bruker Tensor27 Fourier transform spektrofotometer inframerah (Pike Corporation, Madison, Wisconsin). Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan menggunakan spektrometer ESCALAB250Xi (Thermo, USA). Potensiometer Zeta diukur dengan potensiometer Zeta (Malvern Panalytical, Malvern, UK).
Studi Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan obat in vitro DOX dari DOX-CD diselidiki dengan menggunakan tas dialisis. Secara singkat, DOX-CD dimasukkan ke dalam tas dialisis dan direndam dalam PBS (pH 7.4 dan 5.0), masing-masing, kemudian ditempatkan dalam inkubator goyang (37 °C, 100 rpm). Pada waktu yang telah ditentukan, sampel 0,5 ml ditarik dan diganti dengan volume PBS yang sama. DOX yang dilepaskan direkam oleh intensitas fluoresensi pada 590 nm.
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Sitotoksisitas sel DOX-CD ditentukan dengan uji MTS terhadap sel kanker ovarium HO-8910 dan sel endotel vena umbilikalis EA.hy926 [30, 31]. Secara singkat, sel-sel diunggulkan dalam piring 96-sumur pada konsentrasi 0,5 × 10
5
sel / mL, dipertahankan selama 24 jam untuk memungkinkan perlekatan sel. Kemudian, DOX-CD dengan berbagai konsentrasi ditambahkan ke dalam masing-masing sumur. Setelah inkubasi 24 jam, media diaspirasi, dan 90 μL media dan 10 μL MTS ditambahkan ke masing-masing sumur. Setelah 4 h, absorbansi pada 490 nm diukur menggunakan pembaca pelat mikro (BioTek Epoch, Service Card). Viabilitas sel dinyatakan sebagai persentase sel yang bertahan hidup dan dilaporkan sebagai alat pengukuran rangkap tiga.
Studi Pencitraan Sel In Vitro
Sel kanker ovarium HO-8910 diinokulasi pada pelat 6-sumur dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam untuk perlekatan sel. Kemudian, sel-sel diinkubasi dengan DOX-CD untuk memungkinkan penyerapan seluler. Setelah inkubasi 4 jam, media dihilangkan, dan sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 10 menit. Akhirnya, morfologi dan distribusi fluoresensi sel divisualisasikan dengan mikroskop fluoresen (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Jerman).
Pencitraan Di Vivo
Eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan Hewan dari Universitas Kedokteran Xuzhou [32]. Tikus telanjang Balb / c digunakan untuk menilai potensi CD dalam pencitraan fluoresen. Secara singkat, mencit telanjang Balb/c disuntik secara subkutan dengan larutan berair CD (50 μL, 6 mg/mL) di tempat suntikan setelah injeksi intraperitoneal pentobarbital 2% untuk anestesi. Selanjutnya, biodistribusi CD dalam tubuh tikus juga diselidiki dengan menyuntikkan CD (5 mg/kg) melalui vena ekor. Organ yang berbeda (jantung, ginjal, limpa, hati, kandung kemih) dikumpulkan untuk penilaian fluoresensi pada berbagai titik waktu. Pencitraan fluoresensi hewan diambil pada sistem pencitraan Tanon-5200Multi Gel, dan waktu pemaparan adalah 1,0 s untuk semua gambar fluoresensi.
Studi Toksisitas Dalam Vivo
Tikus Kunming (betina, 7 minggu) digunakan untuk menyelidiki toksisitas CD jangka panjang in vivo. Mencit Kunming secara acak dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok CD dan kelompok kontrol. Tikus disuntik dengan PBS dan CD melalui vena ekor (6 mg/kg). Kemudian, organ utama termasuk jantung, paru-paru, ginjal, hati, dan limpa dikumpulkan setelah 7 dan 21 hari penyuntikan. Setelah itu, organ difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, diiris, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Akhirnya, bagian histologis diamati di bawah mikroskop optik (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Jerman).
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi CD dan DOX-CD
CD disiapkan melalui strategi satu langkah menggunakan natrium sitrat dehidrasi dan urea (natrium sitrat dehidrasi/urea =1/25) pada 200 ° C selama 1 jam. DOX terkonjugasi secara kovalen pada permukaan CD yang disiapkan untuk pengiriman obat (Skema 1). Seperti yang ditunjukkan pada gambar TEM (Gbr. 1a), CD menunjukkan morfologi bola yang seragam dengan diameter rata-rata 2,75 nm dan distribusi ukuran yang relatif sempit. Selain itu, struktur kristal CD dapat diamati dengan gambar TEM dengan resolusi tinggi (Gbr. 1a inset), menunjukkan kristal yang baik dengan pinggiran kisi yang terlihat.
Persiapan skema CD (a ) dan CD-DOX (b )
Karakterisasi CD. a Gambar TEM CD (inset, gambar TEM resolusi tinggi). b Distribusi ukuran CD. c Penyerapan UV-vis DOX, CD, dan DOX-CD dan gambar sisipan menunjukkan CD di bawah cahaya alami dan sinar UV. d Spektrum FTIR CD dan e Emisi PL CD dengan panjang gelombang eksitasi dari 340 nm ke 440 nm dalam peningkatan 20 nm. f Spektrum XPS CD
Struktur kimia CD dikarakterisasi dengan spektroskopi FTIR. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1d, puncak tajam pada 3499 cm
−1
dan 1729 cm
−1
ditugaskan untuk –OH dan –COOH masing-masing, sedangkan pada 780 cm
−1
dan 1372 cm
−1
dapat dikaitkan dengan N-H. Dapat disimpulkan bahwa gugus karboksil dan amino ada pada permukaan titik karbon sebagai gugus fungsi dan memodifikasi makromolekul biologis dengan fungsi tertentu, yang memberikan kemungkinan untuk penelitian aplikasi titik karbon lebih lanjut.
Selanjutnya, sifat optik CD diselidiki menggunakan absorbansi UV-vis dan spektroskopi PL. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c, CD menunjukkan puncak absorbansi pada 410 nm, dan DOX mengungkapkan puncak absorbansi pada 500 nm. Sedangkan, DOX-CD mempertahankan puncak absorbansi CD dan DOX masing-masing pada 410 nm dan 500 nm, menunjukkan keberhasilan konjugasi DOX pada CD. Selain itu, seperti yang ditunjukkan pada gambar inset Gambar 1c, larutan berair DOX-CD menunjukkan warna kuning muda dan transparan di bawah cahaya alami dan kacang berubah menjadi hijau terang di bawah eksitasi UV. Selanjutnya, hasil kuantum fluoresensi dihitung menjadi 93% dengan kina sulfat digunakan sebagai referensi (QY =54%). Karena CD tereksitasi pada panjang gelombang dari 340 hingga 440 nm, puncak PL menunjukkan hampir tidak ada pergeseran, yang menunjukkan sifat emisi CD yang tidak bergantung pada eksitasi. Panjang gelombang eksitasi maksimum dan puncak PL dari CD masing-masing adalah 400 dan 525 nm. Perilaku PL bebas eksitasi dapat dihasilkan dari keadaan permukaan CD yang seragam [33].
Selain itu, komposisi unsur CD ditentukan oleh XPS. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1f, spektrum XPS telah menentukan bahwa CD terutama terdiri dari karbon (C ), nitrogen (N ), dan oksigen (O ) dan rasio atom yang sesuai adalah 78,39%, 7,52%, dan 14,1%, secara terpisah. Tiga puncak khas C1S , T1S , dan O1S dapat diamati pada masing-masing 284,8, 399,5, dan 532,6 eV. Untuk lebih spesifik, C1S spektrum menampilkan 3 puncak pada 284,8, 286,7, dan 288,3 eV, yang mewakili keberadaan ikatan C–C, C–N, C–O, atau C=O, secara terpisah (Gambar S1A). Spektrum resolusi tinggi untuk N1S mengungkapkan puncak pada 399,5 eV, yang ditugaskan ke C-N. Selain itu, O1s spektrum juga mengkonfirmasi adanya ikatan C=O dan C–O masing-masing pada 531,9 dan 532,6 eV (Gambar S1B).
Intensitas fluoresensi CD mempertahankan stabilitas yang luar biasa baik pada suhu 4 °C dan suhu kamar (Gambar S2A). Penurunan intensitas fluoresen pada 4 °C dalam 2 minggu selama kurang dari 10% dapat diabaikan. Oleh karena itu, diharapkan titik karbon memiliki stabilitas jangka panjang untuk digunakan sebagai agen pencitraan biomedis.
Gambar S2B mengilustrasikan bahwa intensitas PL CD menurun dalam larutan berair dengan pH tinggi (> 10) atau rendah (<3). Namun demikian, intensitas PL stabil dalam larutan berair pH 3-10. CD yang telah disiapkan yang diterapkan dalam biomarking dan bioimaging harus diinkubasi bersama dengan sel, di mana kondisi pH sekitar netral (pH =6–8), yang menjamin stabilitas PL. Secara teoritis, ini menunjukkan bahwa CD yang disiapkan dapat memancarkan fluoresensi dengan stabilitas tinggi dalam sel untuk biomarking dan bioimaging.
Untuk memperjelas stabilitas fluoresen CD, uji anti-photobleaching fluoresensi dilakukan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S2C, dibandingkan dengan titik-titik kuantum (CdTe) dan pewarna fluoresen tradisional (DAPI), titik-titik karbon menunjukkan tidak hanya intensitas fluoresensi yang lebih tinggi, tetapi juga ketahanan photobleaching yang sangat baik. Selain itu, CD juga terdispersi dengan baik dalam berbagai larutan seperti air DI, media PBS, media FBS, media DMEM, dan media CM1-1, mengharapkan stabilitas yang sangat baik dalam sistem darah (Gambar S3).
CD menunjukkan nilai potensial zeta 31.1 mV (Gambar S4), yang dapat dianggap berasal dari keberadaan gugus fungsi oksigen dan karboksil pada permukaan partikel ini. Potensial DOX bermuatan positif dapat secara fisik melekat pada permukaan CD melalui interaksi elektrostatik dengan gugus karboksil dan interaksi hidrofobik. DOX-CD menampilkan nilai potensial zeta 9,7 mV, mengkonfirmasikan pembuatan kompleks DOX-CD. Selanjutnya, CD berisi sp
2
-jaringan karbon yang dapat memuat struktur aromatik DOX melalui π . yang kuat -π interaksi. Efisiensi enkapsulasi optimum dan efisiensi pemuatan obat diselidiki oleh berbagai konsentrasi DOX. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S5, efisiensi enkapsulasi maksimum dihitung sebagai 50,82% dengan efisiensi pemuatan yang sesuai sebesar 6,82% pada 0,1 mg/mL DOX.
Melepaskan CD DOX Obat In Vitro
Perilaku pelepasan DOX in vitro dari DOX-CD dilakukan di PBS untuk menyelidiki pelepasan DOX yang sensitif terhadap pH. Untuk menunjukkan hal ini, DOX-CD diinkubasi pada nilai pH yang berbeda (pH 7.4, 6.0, dan 5.0) dan pelepasan DOX dipantau. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, DOX-CD menunjukkan profil pelepasan berkelanjutan pada pH 7.4, 6.0, dan 5.0 selama periode istirahat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pelepasan DOX bergantung pada pH. Hanya 13% DOX yang dilepaskan dalam waktu 8 jam ketika CD-DOX diinkubasi pada pH 7,4. Namun, ketika nilai pH diturunkan menjadi 6,0 atau 5,0, masing-masing lebih dari 35% atau 65% DOX dilepaskan dari CD-DOX, menunjukkan sensitivitas CD-DOX terhadap pH rendah. Ini menunjukkan bahwa jumlah DOX yang dilepaskan meningkat pada pH yang lebih rendah, yang dikaitkan dengan peningkatan protonasi –NH2 kelompok pada DOX dalam lingkungan asam. Oleh karena itu, CD-DOX dapat mencegah kebocoran DOX prematur selama sirkulasi darah dan meningkatkan pelepasan obat intraseluler. Ini sangat bermanfaat untuk pengobatan kanker yang efektif.
Profil pelepasan DOX in vitro dari DOX-CD pada pH 5.0, 6.0, dan 7.4
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Masalah biokompatibilitas sangat penting untuk CD untuk aplikasi dalam pencitraan biomedis dan pengiriman obat. Sitotoksisitas CD pada berbagai konsentrasi dilakukan terhadap sel kanker ovarium HO-8910 dan sel endotel vena umbilikalis EA.hy926. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 3a, baik sel HO-8910 dan EA.hy926 mempertahankan viabilitas tinggi di atas 85% bahkan pada konsentrasi tinggi 5 mg/mL, menunjukkan biokompatibilitas yang sangat baik dan sitotoksisitas CD yang rendah.
Sitotoksisitas sel in vitro. a Biokompatibilitas CD terhadap sel HO-8910 dan EA.hy926. b Sitotoksisitas sel DOX-CD dan CD terhadap sel tumor HO-8910. Nilai dinyatakan sebagai mean ± SD, (n =3)
Ketika digabungkan dengan DOX, DOX-CD menunjukkan viabilitas sel yang bergantung pada konsentrasi DOX terhadap sel kanker ovarium HO-8910. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3b, viabilitas sel DOX-CD secara signifikan lebih rendah daripada CD bebas DOX, terutama ketika konsentrasi DOX di atas 0,05 mg/mL, menunjukkan bahwa efek antikanker yang sangat baik dari DOX-CD.
Studi Penyerapan dan Pelabelan Seluler In Vitro
Untuk mengevaluasi kemampuan penyerapan intraseluler DOX-CD, pencitraan seluler diselidiki pada sel HO-8910. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 4, fluoresensi hijau dan merah yang jelas diamati di dalam sel kanker yang dikaitkan dengan keberadaan CD dan DOX, masing-masing. Terutama, sinyal fluoresensi hijau intensif terutama terlokalisasi di sitoplasma, menunjukkan distribusi intraseluler CD. Sebaliknya, sinyal merah secara signifikan lebih kuat di inti sel dibandingkan dengan sitoplasma, menunjukkan bahwa DOX dapat terdiskonjugasi dengan CD dan pindah langsung ke inti sel yang dikaitkan dengan afinitas tinggi dengan DNA. Dapat dijelaskan bahwa nilai pH yang rendah (5.0) pada endosom dan lisosom dapat membantu pelepasan DOX dari CD-DOX. Oleh karena itu, DOX-CD bisa menjadi agen yang menjanjikan untuk pelabelan sel dan pengiriman obat intraseluler.
Penyerapan seluler DOX-CD in vitro oleh sel HO-8910. Bilah skala =50 μm
Studi Pencitraan Hewan di Vivo
Seekor tikus telanjang diberikan secara subkutan dengan larutan berair CD (50 μL, 6 mg/mL). Tikus kemudian dibius dengan injeksi intrapertoneal 1% pentobarbital dan dicitrakan oleh sistem pencitraan Tanon-5200Multi Gel di bawah lampu eksitasi 488 nm dan filter emisi 535 nm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, fluoresensi hijau yang kuat diamati di tempat yang diberikan, menyiratkan bahwa fluoresensi CD dapat secara efektif menembus kulit dan jaringan tikus. Selain itu, tikus tetap sehat setelah disuntik, menunjukkan bahwa CD memiliki biokompatibilitas yang sangat baik dan toksisitas rendah untuk hewan. Mempertimbangkan semua hasil, CD mampu sebagai probe pendaran yang luar biasa untuk bioimaging in vitro dan in vivo.
Uji hewan in vivo. a Pencitraan fluoresen hewan dengan CD. b Pencitraan ex vivo tikus setelah injeksi CD intravena pada periode waktu yang berbeda
Selanjutnya, jalur biodistribusi dan ekskresi CD dilakukan dengan menyuntikkan nanoprobe melalui vena ekor. Pada titik waktu yang berbeda (0, 0,5, 1, 3 h), berbagai organ dibedah untuk pencitraan fluoresensi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, ginjal dan kandung kemih mengungkapkan sinyal fluoresensi yang jauh lebih kuat dibandingkan dengan organ lain termasuk jantung, limpa, dan hati setelah injeksi. Selain itu, sinyal fluoresensi di ginjal meningkat secara signifikan dalam 0,5 jam setelah injeksi dan secara bertahap menurun setelah 1 jam. Kemudian, sinyal fluoresensi dalam kandung kemih secara bertahap meningkat dari 0,5 jam menjadi 1 jam, menunjukkan bahwa CD dikirim ke kandung kemih dari ginjal. Hasilnya menunjukkan bahwa CD dapat dikeluarkan dan dibersihkan oleh ginjal dan sistem kandung kemih.
Uji Toksisitas Jangka Panjang Di Vivo
Selanjutnya, studi toksisitas jangka panjang in vivo juga dilakukan untuk menyelidiki sepenuhnya potensi penggunaan CD dalam penelitian klinis. Tikus Kunming disuntik melalui vena ekor dengan PBS dan CD, dan organ utama (jantung, paru-paru, ginjal, hati, limpa) dikumpulkan setelah 7 dan 21 hari untuk analisis histologis. Selanjutnya, gambaran jaringan histologis dicitrakan dengan mikroskop untuk mengevaluasi perbedaan patologis antara kelompok eksperimen dan kelompok kontrol. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, tidak ada kerusakan organ dan lesi inflamasi yang diamati pada organ utama hewan yang diberi CD, menunjukkan bahwa CD yang disiapkan aman untuk penggunaan klinis dan studi in vivo. Oleh karena itu, CD hijau hasil sintesis bersifat biokompatibel sebagai biomarker dan probe bioimaging.
Analisis histologis organ utama setelah 7 dan 21 hari pemberian CD. Bilah skala =100 μm
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, pekerjaan ini telah menunjukkan persiapan CD fluorescent hijau yang hemat biaya dengan QY tinggi dari 93% untuk bioimaging dan pengiriman obat intraseluler ditingkatkan. DOX berhasil terkonjugasi pada CD untuk membentuk DOX-CD dengan struktur kristal yang baik, stabilitas air yang luar biasa, dan sifat fotoluminesensi yang sangat baik. DOX-CD dapat merespon lingkungan pH intraseluler untuk mendorong pelepasan intraseluler yang dipicu oleh asam. Dikaitkan dengan sensitivitas pH, DOX-CD menunjukkan penghambatan efektif terhadap proliferasi sel HO-8910. CD DOX menunjukkan kemampuan pelabelan sel yang sangat baik dan merespons pH endo-/lisosom untuk melepaskan DOX di dalam sel. CD bertindak sebagai probe fluoresen baik in vitro maupun in vivo. Akhirnya, tidak ada efek toksik yang luar biasa yang diamati dari tikus yang diobati dengan CD dengan analisis histologis. Namun demikian, penelitian tersebut menunjukkan bahwa CD yang disiapkan dengan metode hemat biaya mungkin memiliki potensi besar dalam pencitraan biomedis dan pengiriman obat intraseluler.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan file informasi tambahannya.
