Evaluasi Novel 64Cu-Labeled Theranostic Gadolinium Berbasis Nanoprobe pada Tikus Telanjang yang Dibawa Tumor HepG2
Abstrak
Terapi radiasi kanker hati dibatasi oleh toleransi hati yang rendah terhadap radiasi. Radiosensitizer dapat secara efektif mengurangi dosis radiasi yang dibutuhkan. Nanopartikel AGuIX adalah nanopartikel kecil berbasis gadolinium multifungsi yang dapat membawa radioisotop atau penanda fluoresen untuk tomografi terkomputasi emisi foton tunggal (SPECT), tomografi emisi positron (PET), pencitraan fluoresensi, dan bahkan pencitraan multimodalitas. Selain itu, karena nomor atom gadolinium yang tinggi, ia juga dapat berfungsi sebagai sensitizer radiasi tumor. Sangat penting untuk menentukan biodistribusi dan farmakokinetik nanopartikel berbasis gadolinium ini untuk mengukur besarnya dan durasi retensi mereka dalam lingkungan mikro tumor selama radioterapi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami berhasil memberi label AGuIX dengan
64
Cu melalui chelator built-in yang nyaman. Studi biodistribusi menunjukkan bahwa radiotracer
64
Cu-AGuIX terakumulasi ke tingkat tinggi dalam xenograft HepG2 tikus telanjang, menunjukkan bahwa itu akan menjadi nanoprobe theranostik potensial untuk radioterapi yang dipandu gambar di HCC. Kami juga menggunakan mikroskop elektron transmisi untuk mengkonfirmasi penyerapan AGuIX dalam sel HepG2. Dalam studi terapi radiasi, penurunan
18
Penyerapan F-FDG diamati pada xenograft dari tikus telanjang yang diiradiasi dengan AGuIX, yang disuntikkan 1 jam sebelumnya. Hasil ini memberikan bukti konsep bahwa AGuIX dapat digunakan sebagai radiosensitizer teranostik untuk pencitraan PET guna memandu radioterapi untuk kanker hati.
Latar Belakang
Karsinoma hepatoseluler (KHS) adalah salah satu tumor ganas yang paling umum di dunia. Terdapat 782.500 kasus kanker hati yang baru terdiagnosis dan 745.500 kematian akibat kanker hati pada tahun 2012, dimana 70 sampai 90% adalah kanker hati [1]. Sebagian besar pasien HCC diklasifikasikan sebagai stadium lanjut atau stadium terminal saat pertama kali didiagnosis, sehingga hanya 20-25% pasien yang cocok untuk pengobatan kuratif [2, 3]. Oleh karena itu, pengobatan kanker hati memerlukan pengobatan multidisiplin yang komprehensif yang mencakup radioterapi sebagai teknik klinis utama yang layak [4].
Salah satu keterbatasan utama radioterapi untuk pasien HCC adalah toksisitas terkait radiasi terhadap jaringan hati normal di sekitarnya. Dengan meningkatnya dosis, kejadian komplikasi radioterapi, termasuk penyakit hati yang diinduksi radiasi (RILD), merupakan ancaman serius bagi kehidupan pasien [5]. Salah satu strategi untuk menghindari masalah ini adalah dengan menggunakan radiosensitizer yang dapat terakumulasi dalam jaringan tumor untuk meningkatkan sensitivitas sel tumor terhadap radiasi sehingga sel tumor lebih mungkin untuk dibunuh oleh dosis radiasi yang lebih rendah [6].
Pada tahun 2013, Mignot dkk. membangun jenis baru nanopartikel gadolinium multifungsi, AGuIX, yang berdiameter kecil (sekitar 5 nm), dilaporkan cepat diekskresikan oleh ginjal [7], dan dapat dikonjugasikan ke label radioaktif atau fluoresen untuk SPECT, PET, MRI, atau pencitraan fluoresensi. Karena nanopartikel ini membawa gadolinium dalam jumlah tinggi (nomor atom 64), mereka dapat digunakan sebagai sensitizer radioterapi tumor [8]. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa nanopartikel AGuIX meningkatkan sensitivitas sel tumor terhadap terapi radiasi di berbagai sel tumor (termasuk garis sel tahan radiasi) in vitro. Rasio peningkatan kepekaan (SER) diamati dalam kisaran 1,1 hingga 2,5 [8]. Mengingat latar belakang hati AGuIX yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan serapan tumor yang tinggi dari AGuIX di sebagian besar model tumor karena efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), jenis nanopartikel ini memiliki potensi besar untuk dikembangkan menjadi sensitizer radioterapi yang ideal untuk HCC. [9].
Nanopartikel AGuIX ini terutama telah dikembangkan untuk radioterapi yang dipandu MRI (RT); namun, farmakokinetik AGuIX belum sepenuhnya dipahami. Untuk menentukan secara kuantitatif efek dosis untuk terapi radiasi, sangat penting untuk menentukan biodistribusi dan farmakokinetik nanopartikel ini.
64
Cu, salah satu radioisotop yang paling umum digunakan dalam positron emission tomography (PET), memiliki karakteristik peluruhan (T1/2 = 12.4 h) yang memberikan fleksibilitas untuk mencitrakan molekul kecil dan protein serta nanopartikel besar yang membersihkan secara lambat. Dalam penelitian ini, kami memberi label radio pada AGuIX dengan
64
Cu untuk evaluasi awal biodistribusi in vivonya pada tikus telanjang yang mengandung tumor HepG2 untuk lebih akurat mengukur besarnya dan durasi retensinya dalam lingkungan mikro tumor. Untuk melakukan studi pembuktian konsep lebih lanjut dengan AGuIX sebagai sensitizer radiasi pada tikus telanjang yang mengandung tumor HepG2, kami menggunakan
18
F-FDG PET/CT, teknologi pencitraan yang terbukti secara klinis untuk metabolisme tumor guna memantau respons terapi dan untuk mengevaluasi metabolisme glukosa tumor HepG2 sebelum dan sesudah radioterapi dengan atau tanpa AGuIX.
Metode
Informasi Umum
Nanopartikel gadolinium (AGuIX) terdehidrasi, bulat, dan sub-5 nm diperoleh dari Nano-H (Lyon, Prancis) dan digunakan tanpa pemurnian. Nanopartikel terdiri dari atom gadolinium yang melekat pada cangkang polisiloksan melalui khelator DOTA bawaan. Nanopartikel direhidrasi dalam air steril yang diolah dengan DEPC (Invitrogen, USA) dan disimpan pada suhu 4 °C hingga digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Megestrol asetat dibeli dari Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA). Garis sel HCC manusia, HepG2, diperoleh dari Koleksi Kultur Tipe Amerika (Koleksi Budaya Tipe Amerika, Universitas Virginia, VA, AS).
64
Isotop Cu dibeli dari Universitas Wisconsin. Bahan kimia dan reagen lainnya dibeli dari Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA) dan digunakan tanpa pemurnian atau pemrosesan lebih lanjut. Tikus telanjang athymic jantan berusia enam minggu BALB/c dengan berat antara 16 dan 18 g dibeli dari Charles River. Penelitian pada hewan telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee di University of Virginia.
Transmission Electron Microscopy (TEM)
Nanopartikel AGuIX pada konsentrasi 0,5 mM dalam larutan di atas diinkubasi dengan sel HepG2 selama 1 jam [10]. Kemudian, nanopartikel residu dicuci dengan 0,1 M larutan buffer fosfat dan dimurnikan dengan sentrifugasi. Pelet sel dengan nanopartikel diwarnai dengan formaldehida 4% dan glutaraldehid 1% dalam 0,1 M Pb untuk pencitraan.
64
Pelabelan Radio Cu
Nanopartikel AGuIX diberi radiolabel dengan
64
isotop Cu. Kami pertama-tama mencampur 200 μl larutan nanopartikel AGuIX (10 μmol AGuIX) dengan 100 μl 0,5 M NH4 Buffer OAc (pH = 5,5). Setelah inkubasi selama 5 menit, 1-3 mCi
64
CuCl2 dalam 0,1 N HCl ditambahkan, dan campuran reaksi diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam. Campuran reaksi kemudian disterilkan dengan penyaringan melalui 3k Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck Millipore). Kemurnian radiokimia ditentukan oleh iTLC menggunakan 20 mM asam sitrat sebagai fase gerak seperti yang dijelaskan sebelumnya [11].
Model Tumor
Sel HepG2 ditumbuhkan dalam MEM yang mengandung 1 mM natrium piruvat, 1 mM asam amino nonesensial, dan 10% FCS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA). Sel dipertahankan dalam atmosfer udara/CO yang dilembabkan2 (19/1), dan disubkultur setiap 2-3 hari.
Sel HepG2 (5 × 10
6
) dikumpulkan dalam 0,1 ml HBSS, dan suspensi sel ini kemudian disuntikkan secara subkutan ke sisi kanan setiap tikus telanjang menggunakan jarum ukuran 27. Telinga tikus telanjang yang menerima suntikan sel ditandai untuk identifikasi. Umumnya, tumor padat mulai terlihat 2 minggu setelah injeksi sel HepG2.
Biodistribusi pada Tikus Pengidap Tumor
64
Cu-AGuIX
Tikus telanjang yang mengandung tumor (5 jantan dan 4 tikus betina) secara acak dibagi menjadi tiga kelompok dan disuntikkan secara intraperitoneal dengan
64
Cu-AGuIX, dengan aktivitas sekitar 0,9 MBq, dalam volume 0,2 mL. Mencit dikorbankan dengan dislokasi serviks di bawah anestesi dengan inhalasi isofluoran pada 9, 21, dan 40 jam setelah injeksi. Organ yang diinginkan (jantung, otot, paru-paru, ginjal, limpa, hati, tumor, dll.) dibedah dan ditimbang, dan 100 L darah diambil dari rongga ventrikel. Aktivitas untuk setiap sampel ditentukan dengan menggunakan penghitung (CRC-7, Capintec Inc., NJ, USA). Distribusi radioaktivitas di berbagai jaringan dan organ dihitung dan dinyatakan sebagai persentase dosis injeksi per gram (% ID/g).
Pencitraan Mikro-PET dari
64
Cu-AGuIX di Tikus Telanjang
64
Cu-AGuIX (22,2 MBq) dalam larutan saline 0,2 mL disuntikkan secara intraperitoneal pada setiap tikus telanjang yang mengandung tumor. Setiap hewan ditempatkan rawan di tempat tidur sistem PET (SuperArgus, Sedecal, Spanyol). Gambar PET diperoleh untuk periode waktu yang berbeda pada 9 dan 21 jam setelah injeksi
64
Cu-AGuIX di bawah anestesi 4-5% isofluran untuk induksi dan 1-2% untuk pemeliharaan, keduanya seimbang dengan oksigen.
Pengaturan Iradiasi dan
18
F-FDG PET Evaluasi Xenografts
Untuk studi pencitraan PET untuk mengevaluasi radiosensitisasi AGuIX selama terapi radiasi, 12 tikus telanjang yang mengandung tumor HepG2 dibagi menjadi tiga kelompok, dengan empat tikus secara acak ditugaskan per kelompok. Untuk pencitraan PET dasar, tikus disuntik dengan
18
F-FDG (16,4 ± 4,7 MBq) melalui vena ekor dan disimpan di bawah anestesi umum selama 10 menit pencitraan statis PET pada 30 menit pi. (pasca-injeksi) dengan pemindai PET hewan kecil (Madiclab, Shandong, CN). Gambar PET direkonstruksi menggunakan algoritme OSEM 3D, ukuran voxel 0,91 × 0,90 × 0,90 mm, dan resolusi spasial di tengah bidang pandang 1,3 mm.
Untuk studi iradiasi, masing-masing kelompok menerima suntikan melalui vena ekor dengan 0,1 mL salin normal, 1 mg (0,1 mL) AGuIX, dan 10 mg (0,1 mL) AGuIX. Pada 1 jam setelah injeksi, mencit telanjang ini diiradiasi menggunakan sumber sinar-X (X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, USA), yang dioperasikan pada 250 kV dan 8 mA, dengan 2- mm Al filter pada laju dosis 1,2 Gy/mnt untuk dosis total 6 Gy. Pada hari berikutnya, protokol iradiasi yang sama diulangi dengan tikus. Pada 1 hari setelah dua perlakuan iradiasi, tikus-tikus ini dicitrakan dengan
18
F-FDG (11.1 ± 1.0 MBq) PET menggunakan protokol yang sama seperti pemindaian PET pertama. Nilai serapan standar maks (SUVmax) ditentukan dengan menggambar region of interest (ROI) di area tumor (Madiclab, Shandong, CN).
Analisis Statistik
Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standard error (SE). Perbedaan yang signifikan secara statistik dihitung menggunakan t . dua sisi yang tidak berpasangan uji atau analisis varians satu arah; p nilai < 0.05(*) dan < 0.01(**) dianggap signifikan.
Hasil dan Diskusi
Sementara MRI yang ditingkatkan kontras telah banyak digunakan dalam radioterapi berpemandu gambar berbasis AGuIX, batas deteksi konsentrasi nanopartikel menjadi perhatian karena pengukuran waktu yang lebih lama dari farmakokinetik nanopartikel. Dengan kapasitas kuantitatif yang jauh lebih sensitif dan lebih tinggi, PET memperluas rentang dinamis konsentrasi ke konsentrasi nanomolar yang jauh lebih rendah yang tidak terdeteksi oleh MRI yang ditingkatkan kontras. Dalam laporan ini, kami menjelaskan pelabelan dan evaluasi biodistribusi dan farmakokinetik AGuIX dengan
64
Cu untuk radioterapi dengan panduan pencitraan PET yang potensial.
Studi TEM
Untuk studi inkubasi sel, konsentrasi 0,5 mM nanopartikel AGuIX dipilih berdasarkan data yang dipublikasikan dan nanopartikel AGuIX diinkubasi dengan sel HepG2 selama 1 jam [10]. Penyerapan ke dalam sitoplasma sel HepG2 diamati (Gbr. 1). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang diterbitkan sebelumnya di mana nanopartikel AGuIX diinkubasi dengan jenis garis sel lainnya [12, 13]. Kami juga mengamati bahwa AGuIX menunjukkan bentuk dispersi yang sangat baik dalam sel HepG2, menunjukkan bahwa AGuIX stabil dalam sel.
Lokalisasi AGuIX dalam sel HepG2. a . Gambar TEM (× 6500) menggambarkan penyerapan AGuIX ke dalam sel HepG2. b . Gambar TEM yang diperbesar (× 52000) menunjukkan distribusi nanopartikel AGuIX di sitoplasma
Pelabelan radio
Pelabelan mudah dilakukan dengan bentuk AGuIX saat ini dengan chelator DOTA bawaan dalam satu langkah untuk hasil radiokimia> 98%. Menggunakan uji iTLC untuk mengidentifikasi nanopartikel berlabel radio yang dipertahankan di tempat aslinya, pelabelan menghasilkan aktivitas spesifik dan kemurnian radiokimia masing-masing sekitar 3–10 MBq/μmol dan 98%. Rata-rata 50–100 MBq produk akhir diperoleh dari setiap sintesis.
Studi Biodistribusi
64
Nanopartikel Cu-AGuIX disuntikkan secara intraperitoneal, biodistribusi ditentukan pada tikus telanjang yang mengandung tumor HepG2, dan dibandingkan dengan yang dilaporkan sebelumnya. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2, biodistribusi di setiap organ/jaringan disajikan sebagai persentase aktivitas yang diberikan (dosis injeksi) per gram jaringan (% ID/g). Hasilnya jelas menunjukkan bahwa
64
Cu-AGuIX terakumulasi dalam tumor dengan retensi yang sangat baik dari 9, 21, dan 40 jam pi. dengan serapan masing-masing 7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6.23, dan 6.84 ± 1,40% ID/g. Retensi jangka panjang ini dapat dikaitkan dengan penyerapan nanopartikel AGuIX di dalam sel dan dengan demikian terkait dengan
64
Cu tinggal di dalam sel. Sesuai dengan laporan lain [11, 14], meskipun radiolabeling dan rute injeksi isotop yang berbeda digunakan,
64
Nanoprobe radiolabel Cu menunjukkan serapan yang jauh lebih rendah (lebih rendah dari 1% ID / g) di organ dan jaringan normal lainnya dan pembersihan cepat. Secara kolektif, data ini menunjukkan potensi penggunaan
64
AGuIX berlabel Cu sebagai alat untuk mengukur biodistribusi dan farmakokinetik AGuIX untuk membantu memandu rencana radioterapi di mana nanopartikel ini digunakan sebagai radiosensitizer. Dalam penelitian ini, serapan ginjal jauh lebih rendah daripada yang dilaporkan orang lain karena penelitian ini menggunakan injeksi intraperitoneal [11, 14].
Biodistribusi
64
Cu-AGuIX pada tikus telanjang yang mengandung tumor HepG2. Serapan radioaktivitas di setiap jaringan/organ ditampilkan dalam %ID/g pada 9, 21, dan 40 jam setelah injeksi
64
intraperitoneal Cu-AGuIX (rata-rata ± SD, n = 3)
Pencitraan Mikro-PET pada Tikus Telanjang
Pencitraan mikro-PET menunjukkan bahwa penyerapan
64
. yang tinggi Cu-AGuIX diamati pada tumor, ginjal dan hati pada tikus telanjang yang mengandung tumor (Gbr. 3). Tumor terlihat jelas setelah pemberian
64
Cu-AGuIX pada 9 jam dan bahkan menjadi lebih jelas hingga 21 jam setelah injeksi saat latar belakang berkurang.
Gambar mikro-PET tikus tumor. Gambar PET (atas, tampak koronal; bawah, tampak melintang) tikus telanjang dengan tumor (panah merah ) diperoleh pada 9 jam (kiri) dan 21 jam (kanan) setelah injeksi intraperitoneal
64
Cu-AGuIX
18
F-FDG PET/CT Evaluasi Xenograft Teriradiasi dengan atau Tanpa AGuIX
Untuk mengevaluasi respons radioterapi yang berbeda dengan atau tanpa pemberian AGuIX,
18
Pencitraan F-FDG PET/CT dilakukan untuk memantau perubahan metabolik setelah iradiasi dengan atau tanpa injeksi AGuIX pada dua dosis yang berbeda. Penurunan
18
Serapan F-FDG dalam xenograft diamati pada semua tikus yang diiradiasi (Gbr. 3). SUVmax (B/A), indikator utama efektivitas radiosensitisasi, adalah 1,03 ± 0,03, 1,04 ± 0,04, dan 1,24 ± 0,02 untuk tikus yang menerima salin normal, 1 mg AGuIX, dan 10 mg AGuIX (Gbr. 2). 4). Untuk kelompok AGuIX 10 mg, T/L (B/A) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok AGuIX 1 mg (p < 0.001, uji sampel independen) dan dengan kelompok salin normal (p < 0,001, uji sampel independen). Tidak ada perbedaan yang signifikan untuk T/L (B/A) antara kelompok yang menerima 1 mg AGuIX dan salin normal (p = 0.83, uji sampel independen) (Gbr. 5). Hasil ini menunjukkan bahwa metabolisme glukosa xenograft ditekan sebagian besar pada tikus yang diiradiasi yang menerima injeksi AGuIX 10 mg; meskipun radioterapi dapat menyebabkan peradangan yang juga dapat menyebabkan penyerapan FDG. Dalam penelitian ini, kami memilih dosis radiasi yang sama dan titik waktu yang sama pasca terapi RT untuk semua kelompok untuk mengimbangi kesalahan sistemik. Oleh karena itu, tingkat peradangan yang disebabkan oleh RT harus hampir sama untuk ketiga kelompok dan kontribusi terhadap penyerapan FDG yang disebabkan oleh peradangan harus pada tingkat yang sama juga. Probe pencitraan PET lainnya dapat digunakan untuk menghindari masalah ini. Meskipun demikian, temuan ini memberikan bukti konsep bahwa AGuIX dapat digunakan sebagai sensitizer radiasi tumor pada tikus pembawa tumor HepG2.
18
Gambar PET F-FDG tikus sebelum dan sesudah radiasi.
18
Gambar PET F-FDG dibandingkan di setiap panel sebelum (kiri) dan 1 hari (kanan) setelah iradiasi, dan ketiga panel menunjukkan gambar tikus yang disuntik dengan injeksi vena ekor normal saline (panel kiri), 1 mg AGuIX ( panel tengah), dan 10 mg AGuIX (panel kanan), masing-masing. Skala warna yang sama diterapkan pada setiap gambar
18
Evaluasi kuantitatif F-FDG PET sebelum dan sesudah iradiasi. T/L (B), rasio SUVmax (tumor) terhadap SUVave (hati) sebelum penyinaran; T/L (A), rasio SUVmax (tumor) terhadap SUVave (hati) setelah iradiasi; T/L (B/A), rasio T/L (B) terhadap T/L (A); AGuIX (1 mg), 1 mg AGuIX yang disuntikkan; AGuIX (10 mg), 10 mg AGuIX disuntikkan
Terakhir, dosis radiasi yang diserap dari probe pencitraan nuklir itu sendiri juga menjadi perhatian kritis ketika mempertimbangkan untuk beralih ke penggunaan klinis. Bentuk nanopartikel AGuIX saat ini telah diselidiki secara menyeluruh untuk metabolisme dan toksisitas in vivo dan disetujui untuk studi manusia oleh FDA [15]. Dengan memberi label
68
Ga (~ 1 jam peluruhan waktu paruh) atau
89
Zr (waktu paruh peluruhan 78 jam), hasil studi biodistribusi pada tikus dengan injeksi intravena menunjukkan serapan yang sangat tinggi di ginjal pada lebih dari 20% ID/g mulai dari 30 menit hingga
68
Ga hingga hingga 72 jam sebelum
89
Zr [11, 14]. Meskipun ekskresi cepat oleh ginjal umumnya bermanfaat, karena sensitivitas ginjal terhadap radiasi, apakah ginjal dapat mentolerir pengambilan yang tinggi ini dan mekanisme retensi untuk jangka waktu yang lama tidak diketahui. Dalam penelitian ini, serapan ginjal berada pada ~ 5% ID/g, lebih rendah daripada di hati dan tumor selama seluruh periode penelitian. Perbedaan ini mungkin diasumsikan karena rute injeksi yang berbeda. Dengan injeksi intraperitoneal, nanopartikel AGuIX terus menerus diserap oleh peritoneum, sedangkan dengan injeksi intravena, nanopartikel diekskresikan dengan cepat oleh ginjal. Karena sensitivitas radiasi setiap organ dan jaringan berbeda, penentuan akhir dari probe teranostik radioaktif untuk diterjemahkan ke dalam penggunaan klinis memerlukan studi dosimetri yang lebih rinci.
Kesimpulan
Nanopartikel AGuIX telah berhasil diberi label dengan
64
Cu dengan hasil tinggi. Studi biodistribusi menunjukkan bahwa radiotracer
64
Cu-AGuIX menunjukkan akumulasi tinggi pada tumor dan dipertahankan untuk waktu yang lama dalam xenograft HepG2 dari tikus telanjang, menunjukkan bahwa mereka adalah nanoprobe theranostic potensial untuk radioterapi yang dipandu gambar di HCC. Pengurangan signifikan
18
Pengambilan F-FDG setelah radioterapi pada kelompok tikus telanjang tumor yang disuntik dengan AGuIX memberikan bukti bahwa AGuIX dapat digunakan sebagai sensitizer radiasi tumor untuk meningkatkan radioterapi pada tikus yang mengandung tumor HepG2. Penyelidikan lebih lanjut pada dosimetri diperlukan untuk menentukan toksisitas radiasi untuk terjemahan potensial ke dalam aplikasi klinis.
