Nanoprobe AGuIX Berlabel 64Cu: Radioterapi Terpandu PET dan Radiosensitasi pada Tikus HepG2 dengan Tumor

Abstrak

Radioterapi untuk kanker hati dibatasi oleh toleransi hati yang rendah terhadap radiasi ionis, menjadikan radiosensitiser esensial untuk menurunkan dosis yang diperlukan. Nanopartikel AGuIX—pengikat ultra-kecil berbasis gadolinium—secara unik cocok untuk menyampaikan radioisotop atau fluorofor untuk citra SPECT, PET, fluorescensi, dan citra multimodal, sementara nomor atom yang tinggi mereka juga memberikan properti sensibilisasi tumor. Memahami biodistribusi dan farmakokinetik mereka adalah sangat penting untuk mengukur retensi tumor selama radioterapi. Dalam studi ini, kami secara efisien melabel AGuIX dengan 64Cu melalui chelator DOTA intrinsiknya. Data biodistribusi mengungkapkan akumulasi yang jelas dari 64Cu-AGuIX dalam xenograft HepG2 pada tikus nude, menunjukkan janjinya sebagai probe teranostik untuk radioterapi terpandu citra dalam kanker sel hati (HCC). TEM mengonfirmasi penyerapan nanopartikel dalam sel HepG2. Eksperimen radiasi menunjukkan penurunan yang signifikan dalam penyerapan 18F-FDG dalam tumor yang diiradiasi 1 jam setelah injeksi AGuIX, memberikan bukti konsep bahwa AGuIX berfungsi sebagai radiosensitiser yang terlihat PET untuk radioterapi kanker hati.

Latar Belakang

Karsinoma sel hati (HCC) termasuk salah satu malignitas paling umum di dunia, dengan 782.500 kasus baru dan 745.500 kematian yang dilaporkan pada 2012, di mana 70–90 % adalah HCC. Sebagian besar pasien berada pada stadium lanjut, membatasi opsi pengobatan hanya 20–25 % kasus. Akibatnya, radioterapi telah menjadi komponen kunci dalam manajemen multidiscipliner HCC. Namun, jaringan hati normal membatasi peningkatan dosis, karena penyakit hata yang diinduksi radiasi (RILD) merupakan risiko yang parah. Radiosensitiser yang secara preferensial mengakumulasi dalam jaringan tumor dapat meningkatkan pembunuh sel tumor pada dosis yang lebih rendah, sehingga mengurangi toksisitas jaringan normal.

AGuIX, nanopartikel berbasis gadolinium baru (~5 nm diameter) yang pertama kali dijelaskan pada 2013, dibuang dengan cepat melalui ginjal dan dapat difungsikan dengan label radioaktif atau fluoresen untuk citra SPECT, PET, MRI, atau fluorescensi. Konten gadolinium yang tinggi memberikan kemampuan sensibilisasi tumor pada AGuIX, yang telah ditunjukkan in vitro di berbagai baris sel dengan rasio peningkatan sensibilisasi (SER) yang berkisar dari 1,1 hingga 2,5. Karena AGuIX menunjukkan latar belakang hati yang rendah namun penyerapan tumor yang tinggi—berkat efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR)—ia adalah kandidat yang menarik untuk radiosensitasi HCC.

Meskipun banyak pekerjaan pralinis tentang AGuIX untuk radioterapi terpandu MRI, farmakokinetiknya masih tidak terkarakterisasi sepenuhnya. Data biodistribusi yang tepat sangat penting untuk mengoptimalkan jadwal dosing dan memprediksi jendela terapeutik. Emitor positron 64Cu (T1/2 = 12,4 jam) menawarkan fleksibilitas temporal untuk citra agen yang dibuang cepat dan lambat. Di sini kami melaporkan biodistribusi in vivo pertama dan citra PET dari 64Cu-label AGuIX pada tikus nude yang membawa tumor HepG2, dan kami mengevaluasi efek radiosensitasi menggunakan 18F-FDG PET/CT.

Metode

Informasi Umum

Nanopartikel AGuIX (sub-5 nm, dehidrasi, bola) diperoleh dari Nano-H (Lyon, Prancis) dan dihidrasi ulang dalam air sterilis yang dirawat DEPC. Sel kanker hati manusia HepG2 (ATCC) dibudidayakan dalam MED yang dilengkapi dengan 10 % FCS. Isotop 64Cu diperoleh dari Universitas Wisconsin. Tikus nude BALB/c jantan athymic (6 minggu, 16–18 g) digunakan, dengan semua protokol disetujui oleh Komite Pengawasan dan Penggunaan Hewan Laboratorium di Universitas Virginia.

Mikroskopi Elektron Transmisi (TEM)

AGuIX (0,5 mM) diinkubasi dengan sel HepG2 selama 1 jam, diikuti oleh pencucian dengan 0,1 M PBS dan sentrifugasi. Pellet sel difiksasi dalam 4 % formaldehida dan 1 % gluteraldehida untuk citra TEM.

Radiolabeling 64Cu

AGuIX (10 µmol) dicampur dengan 100 µl 0,5 M NH4OAc (pH 5,5) dan diinkubasi selama 5 menit. 1–3 mCi dari 64CuCl2 (0,1 N HCl) ditambahkan, dan campuran dipanaskan pada 37 °C selama 1 jam. Produk difurnirkan melalui filtrais Amicon 3 kDa. Kemurnian radiokimia dikonfirmasi dengan iTLC (20 mM asam sitrat) dan konsisten melebihi 98 %. Aktivitas spesifik bervariasi dari 3–10 MBq µmol–1, dengan hasil akhir 50–100 MBq per sintesis.

Model Tumor

Sel HepG2 (5 × 10^6) disuspendi dalam 0,1 ml HBSS dan disuntik subkutan ke pinggir kanan setiap tikus nude. Tumor terasa setelah ~2 minggu.

Biodistribusi 64Cu-AGuIX

Sepuluh tikus (5 jantan, 4 betina) menerima injeksi intraperitoneal ~0,9 MBq 64Cu-AGuIX (0,2 ml). Pada 9, 21, dan 40 jam setelah injeksi, tikus diutanasikan, dan organ (jantung, otot, paru-paru, ginjal, tilus, hati, tumor) dipanen, ditimbang, dan dihitung dalam penghitung gamma. Data diekspresikan sebagai % injeksi dosis per gram (% ID/g).

Citra Mikro-PET

Setiap tikus yang membawa tumor menerima 22,2 MBq 64Cu-AGuIX secara intraperitoneal. Citra PET diambil pada 9 jam dan 21 jam di bawah anestesi isoflurane, menggunakan sistem SuperArgus (Sedecal, Spanyol).

Iradiasi dan 18F-FDG PET/CT

Dua belas tikus dibagi menjadi tiga grup (n = 4). Citra PET dasar dilakukan 30 menit setelah injeksi vena tali 16,4 ± 4,7 MBq 18F-FDG. Grup menerima baik larutan garam, 1 mg, atau 10 mg AGuIX secara intraperitoneal 1 jam sebelum iradiasi. Iradiasi disampaikan pada 250 kV, 8 mA, filter Al 2-mm (1,2 Gy min–1) untuk total 6 Gy; protokol diulang hari berikutnya. 24 jam setelah dosis kedua, citra PET 18F-FDG kedua (11,1 ± 1,0 MBq) dilakukan. Nilai penyerapan standar (SUVmax) diukur dalam tumor dan dinormalisasi ke SUVave hati untuk mendapatkan rasio T/L.

Analisis Statistik

Semua eksperimen dilakukan tiga kali. Data disajikan sebagai rata-rata ± SE. Signifikansi dievaluasi dengan uji t dua sisi yang tidak berpasangan atau satu arah ANOVA (p < 0,05 dianggap signifikan).

Hasil dan Pembahasan

Sementara citra MRI yang ditingkatkan kontras dapat mendeteksi AGuIX, PET menawarkan sensitivitas dan akurasi kuantitatif yang lebih tinggi, memungkinkan deteksi konsentrasi nanomolar yang di bawah ambang MRI. Di sini kami menunjukkan bahwa 64Cu-label AGuIX memberikan batas tumor yang jelas dan retensi yang lama dalam xenograft HepG2, mendukung penggunaannya untuk radioterapi terpandu PET.

Studi TEM

Insibasi sel HepG2 dengan 0,5 mM AGuIX selama 1 jam menghasilkan penyerapan sitoplasma, seperti yang divisualisasikan pada pembesaran ×6 500 dan ×52 000 (Gambar 1). Nanopartikel mempertahankan morfologi yang terdistribusi dengan baik, yang menunjukkan stabilitas dan kompatibilitas seluler.

Lokasi AGuIX dalam sel HepG2. a. Citra TEM (× 6500) yang menggambarkan penyerapan. b. Tampilan diperbesar (× 52000) yang menunjukkan distribusi sitoplasma.

Radiolabeling

Kelasi satu langkah dari 64Cu ke AGuIX melalui DOTA bawaan mencapai >98 % hasil radiokimia. Aktivitas spesifik yang dihasilkan adalah 3–10 MBq µmol–1, dengan aktivitas produk akhir 50–100 MBq per sintesis.

Studi Biodistribusi

Setelah injeksi intraperitoneal, 64Cu-AGuIX menunjukkan penyerapan tumor yang kuat (7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23, 6,84 ± 1,40 % ID/g pada 9, 21, dan 40 jam, masing-masing). Organ non-target mempertahankan <1 % ID/g, mengonfirmasi pembuangan yang cepat. Penyerapan ginjal secara signifikan lebih rendah (~5 % ID/g) daripada yang dilaporkan untuk administrasi intravena, kemungkinan karena penyerapan peritoneal yang berkelanjutan. Data ini mendukung penggunaan 64Cu-AGuIX sebagai alat kuantitatif untuk membimbing dosing radiosensitiser.

Biodistribusi 64Cu-AGuIX pada tikus yang membawa tumor (% ID/g pada 9, 21, dan 40 jam). Rata-rata ± SD, n = 3.

Citra Mikro-PET

Sinyal tumor yang jelas diamati pada 9 jam, dengan kontras yang lebih tinggi pada 21 jam seiring penurunan aktivitas latar belakang (Gambar 3). Data ini menguatkan temuan biodistribusi dan menunjukkan keberlanjutan praktis perencanaan perawatan terpandu PET.

Citra mikro-PET tikus yang membawa tumor. Panel atas (tampilan koronal) dan panel bawah (tampilan transverse) pada 9 jam dan 21 jam setelah injeksi. Tumor ditunjukkan oleh panah merah.

Evaluasi 18F-FDG PET/CT Xenograft yang Diiradiasi

Semua tikus yang diiradiasi menunjukkan penurunan penyerapan 18F-FDG dalam tumor. Rasio SUVmax (B/A) adalah 1,03 ± 0,03 (larutan garam), 1,04 ± 0,04 (1 mg AGuIX), dan 1,24 ± 0,02 (10 mg AGuIX). Grup 10 mg menunjukkan peningkatan yang signifikan secara statistik dalam rasio penyerapan tumor-ke-hati dibandingkan grup 1 mg dan larutan garam (p < 0,001), mengonfirmasi radiosensitasi yang bergantung pada dosis. Tidak ada perbedaan yang diamati antara 1 mg AGuIX dan larutan garam, yang menunjukkan bahwa dosis yang lebih tinggi diperlukan untuk manfaat klinis.

Citra 18F-FDG PET sebelum dan setelah iradiasi untuk larutan garam (kiri), 1 mg AGuIX (tengah), dan 10 mg AGuIX (kanan). Citra berbagi skala warna yang sama.

Analisis kuantitatif: T/L (B) – rasio SUVave tumor-ke-hati sebelum iradiasi; T/L (A) – setelah iradiasi; T/L (B/A) – rasio keduanya. Grup 1 mg dan 10 mg AGuIX ditunjukkan.

Meskipun penyerapan ginjal dari AGuIX yang berlabel radioaktif dapat tinggi setelah injeksi intravena, pengiriman intraperitoneal mengurangi paparan ini, menghasilkan retensi tumor yang sosten dengan paparan ginjal minimal. Studi dosimetri di masa depan akan klarifikasi toleransi radiasi spesifik organ dan mendukung translasi klinis.

Kesimpulan

Kami berhasil melabel AGuIX dengan 64Cu, mencapai >98 % kemurnian dan penyerapan tumor yang besar yang bertahan selama >40 jam dalam xenograft HepG2. Citra PET menunjukkan batas tumor yang jelas dan memberikan readout kuantitatif untuk perencanaan perawatan. Studi radiosensitasi menggunakan 18F-FDG PET mengonfirmasi bahwa dosis intraperitoneal 10 mg AGuIX meningkatkan efek terapeutik radioterapi 6 Gy dalam model HCC. Temuan ini memvalidasi AGuIX sebagai probe teranostik ganda-fungsi untuk radioterapi terpandu citra dan menekankan kebutuhan akan dosimetri komprehensif sebelum aplikasi klinis.